CN105785052B - 基于凝集素磁珠的结合珠蛋白异质体诊断肝癌试剂盒 - Google Patents

基于凝集素磁珠的结合珠蛋白异质体诊断肝癌试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于凝集素磁珠的结合珠蛋白异质体诊断肝癌试剂盒，该试剂盒包括ELISA酶标板、磁珠‑AAL、Hp‑ELISA酶标板，其利用了肝癌患者的单位Hp岩藻糖含量增多，Hp与AAL的亲和力提高这一原理，建立了磁珠‑AAL‑Hp‑ELISA检测方法来分析血清中Hp岩藻糖的表达水平；辅以常规Hp‑ELISA的蛋白检测方法，来确定血清中Hp的蛋白含量，从而完成正常人和肝癌病人血清中单位Hp蛋白中结合岩藻糖的含量(Fuc‑Hp指数)的定量，最后根据Fuc‑Hp的检测数据和临床资料的回顾性研究，建立了肿瘤判别诊断函数，可用于肝癌的早期诊断。

Description

基于凝集素磁珠的结合珠蛋白异质体诊断肝癌试剂盒
技术领域
本发明属于生物医学领域，涉及一种基于凝集素磁珠的结合珠蛋白异质体诊断肝癌试剂盒。
背景技术
原发性肝癌(HCC)是中国常见的恶性肿瘤之一，早期诊断率不高，预后差，5年生存率低。多数的原发性肝癌病人是由慢性乙肝表面抗原携带者演变而来，发病隐匿，出现临床症状后就医时已属晚期，丧失了治疗的良机。肝穿活检和病理学检查是肝硬化和肝癌诊断的金标准，但是作为一项创伤性检查，受各方面因素的影响，不适用于高危人群的筛查。血清学指标检测仍是临床上最方便、经济的检查手段。
糖蛋白聚糖存在着宏观和微观的不均一性，其与功能表达相关联，并与肝病发生发展有着密切的联系。在癌症的发生过程中，如能关注糖基化的变化，可以提升诊断的特异性和敏感性。结合珠蛋白(Haptoglobin，Hp)这一高丰度蛋白是我们之前运用传统的双向电泳(2-DE)技术在肝病发展过程中发现的一个差异蛋白，最初采用糖染色和蛋白染色相结合的MP(Multiplexed Proteomics technology)技术，发现在肝病中其糖的变化与蛋白的变化趋势不一致，说明Hp聚糖在肝癌的发生过程中有着一定作用。进而发现在肝癌患者血清中，单位Hp上的岩藻糖含量升高。岩藻糖修饰能赋予聚糖很多独特的功能特性，其在输血反应、凝集素介导的白细胞和内皮的粘附、宿主和微生物相互作用和个体发育等方面发挥重要作用。此外，岩藻糖还参与构成某些重要粘附分子的聚糖结构，与肿瘤转移关系密切。
因此，本领域技术人员致力于开发一种能快速有效检测单位Hp岩藻糖含量的方法及其试剂盒，用于肝癌高发现场或者肝病人群大规模筛查，实现早期干预治疗，降低肝癌病死率。
发明内容
AAL(橘果粉孢凝集素)是一种亲和α连接岩藻糖(TerminalαFuc和±Sia-Lex)的植物凝集素。在前期研究工作中，我们发现肝癌患者血清单位Hp亲和AAL能力显著增强，说明了肝癌患者的单位Hp岩藻糖含量增多。
进而，本发明应用AAL对岩藻糖化聚糖的高亲和性，通过基于磁珠的AAL-Hp-ELISA检测，提供了一种快速检测Hp异质体的试剂盒及其方法，并将其命名为Fuc-Hp检测系统。
为实现上述目的，本发明提供了一种基于凝集素磁珠的结合珠蛋白异质体诊断肝癌试剂盒，所述试剂盒包括：ELISA酶标板、磁珠-AAL、Hp-ELISA酶标板；其中所述ELISA酶标板为空白ELISA酶标板，所述磁珠-AAL为结合有AAL的磁珠，所述Hp-ELISA酶标板为包被有Hp抗体的ELISA酶标板。
所述ELISA酶标板可选自市售的常规ELISA酶标板，优选为96孔ELISA酶标板。
优选地，所述磁珠-AAL中磁珠与AAL的质量比为180-220:1，最佳为200:1。
优选地，所述Hp抗体为人Hp抗体。
优选地，所述磁珠-AAL的制备方法包括步骤：
1)将磁珠置于EDC溶液中反应；
2)反应完成后，移除上清并用缓冲液清洗磁珠；
3)取一定量的AAL置于偶联液中，加入磁珠反应；
4)反应完成后，封闭未反应的活化基团。
优选地，步骤1)中所述EDC溶液的浓度为8-12mg/ml，最佳为10mg/ml；步骤1)的的反应时间为30-50分钟，最佳为40分钟。
优选地，步骤3)中所述偶联液为0.1M磷酸钠、0.15M NaCl，pH＝7.5的溶液。
优选地，步骤1)和步骤3)中加入的磁珠与AAL的质量比为180-220:1，最佳为200:1。
优选地，步骤4)中所述封闭使用的封闭液为用偶联液配制的20mg/ml BSA和20mg/ml甘氨酸的溶液。
在本发明的另一种实施方式中，所述Hp-ELISA酶标板可拆分为ELISA酶标板和Hp抗体试剂，在此种情况下，所述Hp-ELISA酶标板可在需要时由操作人员自行制备。
在本发明的又一种实施方式中，所述磁珠-AAL可拆分为磁珠、AAL及其制备相关试剂，在此种情况下，所述磁珠-AAL可在需要时由操作人员自行制备。
进一步，本发明可根据每个血清样品中Hp结合AAL的实际OD值与相同血清样品中Hp蛋白的实际OD值的比值结合临床统计数据来预测和诊断肝癌。
优选地，所述基于凝集素磁珠的结合珠蛋白异质体诊断肝癌试剂盒还包括HCC预测模型：
P＝exp(-2.554+2.009×Fuc-Hp)/[1+exp(-2.554+2.009×Fuc-Hp)]；
Fuc-Hp值的计算方法为：每个血清样品中Hp结合AAL的实际OD值与相同血清样品中Hp蛋白的实际OD值的比值，所述血清样品中Hp结合AAL的实际OD值通过磁珠-AAL-Hp-ELISA检测得到，血清样品中Hp蛋白的实际OD值通过常规Hp-ELISA检测得到，该模型区分肝癌病人和正常人的阈值为1.0154，大于1.0154为肝癌，小于1.0154为正常。
优选地，所述基于凝集素磁珠的结合珠蛋白异质体诊断肝癌试剂盒还包括封闭剂，该封闭剂优选为含3％(质量百分比)BSA的PBST溶液。
优选地，所述基于凝集素磁珠的结合珠蛋白异质体诊断肝癌试剂盒还包括PBST缓冲液，其为含0.05％(质量百分比)吐温20的pH 7.2-7.4的PBS溶液。
优选地，所述基于凝集素磁珠的结合珠蛋白异质体诊断肝癌试剂盒还包括样品稀释液，该样品稀释液优选为0.1M Tris-HCl、0.15M NaCl、1mM CaCl2、1mM MgCl2、pH 7.5的溶液。
优选地，所述基于凝集素磁珠的结合珠蛋白异质体诊断肝癌试剂盒还包括HPR标记的Hp抗体。
优选地，所述基于凝集素磁珠的结合珠蛋白异质体诊断肝癌试剂盒还包括TMB显色液。
优选地，所述的用于诊断肝癌的试剂盒还包括采集血样装置及操作说明书。
本发明的诊断肝癌试剂盒的使用方法包括步骤：
1)制备磁珠-AAL-ELISA酶标板；
2)利用磁珠-AAL-Hp-ELISA检测获得血清样品中Hp结合AAL的实际OD值；
3)利用常规Hp-ELISA检测获得同一血清样品中Hp蛋白的实际OD值；
4)将Hp结合AAL的实际OD值与Hp蛋白的实际OD值的比值作为Fuc-Hp值代入预测模型中计算，获得P值，将P值与阈值做比较获得诊断结果。
其中所述磁珠-AAL-Hp-ELISA检测的原理如图1所示，将连接有AAL的磁珠加入ELISA酶标板，并通过外加磁场使磁珠固定贴附于酶标板的底部，加入血清样品，其中的Hp蛋白与磁珠上的AAL结合，再加入标记HRP的Hp抗体，形成磁珠-AAL-抗原-HRP标Hp抗体复合物，再加入显色剂后可测得OD值。
在本发明的一种优选实施方式中，采用的ELISA酶标板为96孔酶标板，所述磁珠-AAL中磁珠与AAL的质量比为200:1，所述磁珠-AAL的加入量为100μg/孔。
本发明根据前期的蛋白质组学工作确定单位Hp亲和AAL能力显著增强，说明肝癌患者的单位Hp岩藻糖含量增多，因此建立并优化了磁珠-AAL-Hp-ELISA检测方法来分析血清中Hp岩藻糖的表达水平；并辅以常规Hp-ELISA的蛋白检测方法，来确定血清中Hp的蛋白含量，从而完成正常人和肝癌病人血清中单位Hp蛋白中结合岩藻糖的含量(Fuc-Hp指数)的定量，最后根据Fuc-Hp的检测数据和临床资料的回顾性研究，建立了肿瘤判别诊断函数，可用于肝癌的早期诊断。
进一步，本发明还确定了最优的磁珠与AAL的比例、凝集素浓度和血清样品的上样比例；并选择了合适的样品稀释液，构建了可用于临床血清样品筛查的Fuc-Hp半定量检测系统。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明通过磁珠-AAL-Hp-ELISA检测和常规Hp-ELISA检测，分别形成磁珠-AAL-抗原-HRP标Hp抗体和Hp抗体-抗原-HRP标Hp抗体复合物，获得Hp结合AAL的吸光度与Hp蛋白的吸光度比值Fuc-Hp(指数)，通过对临床资料进行回顾性研究，建立肿瘤判别诊断函数，获得受试者工作曲线(ROC)以及判别阈值，该函数对于HCC的诊断灵敏度和特异度分别为76.1％和85.3％，准确性80％，AUC为0.852。
本发明所述的方法及试剂盒具有高通量性，较高特异性，检测快速准确等突出优点，对肝癌的诊断具有重要的临床价值，适用于肝癌高发现场或者肝病人群大规模筛查，检测迅速便捷，对于提高肝癌的诊断率，实现早期干预治疗，降低肝癌病死率具有非常重要的意义。
附图说明
图1为磁珠-AAL-Hp-ELISA检测原理示意图；
图2为Fuc-Hp检测系统定量40例正常人和40例HCC病人纵向散点图；
图3为Fuc-Hp检测系统构建ROC曲线图。
具体实施方式
一种基于凝集素磁珠的快速检测Hp异质体的肝癌诊断试剂盒，包含如下组分：
1、96孔ELISA酶标板和96孔Hp-ELISA酶标板；
2、磁珠-AAL，其中磁珠：AAL(质量比mg:mg)＝200:1；
3、封闭剂(含3％BSA的PBST)；
4、样品稀释液(0.1M Tris-HCl,0.15M NaCl,1mM CaCl2,1mM MgCl2,pH 7.5)；
5、HRP标记的Hp抗体和TMB显色液(R&D systems DHAPG0)；
6、HCC预测模型：
P＝exp(-2.554+2.009×Fuc-Hp)/[1+exp(-2.554+2.009×Fuc-Hp)]；
其中，Fuc-Hp值的计算方法为：每个血清样品中Hp结合AAL的实际OD值与相同血清样品中Hp蛋白的实际OD值的比值，所述血清样品中Hp结合AAL的实际OD值通过磁珠-AAL-Hp-ELISA检测得到，血清样品中Hp蛋白的实际OD值通过常规Hp-ELISA检测得到，该模型区分肝癌和正常人的阈值为1.0154，P值大于1.0154时诊断为肝癌，P值小于1.0154时诊断为正常。
7、采集血样装置及操作说明书。
一、磁珠-AAL的制备
将20mg磁珠在10mg/ml的反应缓冲液中(EDC溶液)反应40分钟，移除上清并用缓冲液清洗磁珠；取0.1mg AAL置于偶联液中(0.1M磷酸钠、0.15M NaCl、pH＝7.5)，加入磁珠反应并封闭未反应的活化基团(封闭液：偶联液配制的20mg/ml BSA和20mg/ml甘氨酸溶液)，再次用缓冲液清洗磁珠后，即可获得结合有AAL的磁珠(磁珠-AAL)。
二、磁珠-AAL-ELISA酶标板的制备
1)在96孔ELISA酶标板中加入含有3％BSA的PBST封闭，200μL/孔，4℃过夜，吸除孔内液体；
2)采用PBST(含0.05％Tween 20的PBS，pH 7.2-7.4)洗板4次，每次浸泡2分钟，300μL/孔，甩干，并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干；
3)在上述96孔ELISA酶标板中加入磁珠-AAL，100μg/孔；
4)将上述96孔ELISA酶标板置于磁力工作台上，吸除孔内液体后，用PBST(含0.05％Tween 20的PBS，pH 7.2-7.4)洗板4次，每次浸泡2分钟，300μL/孔，甩干，并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干。
三、磁珠-AAL-Hp-ELISA检测
1)将血清样品用样品稀释液稀释50倍后加入实施例1制备的磁珠-AAL-ELISA酶标板中，100μL/孔，室温孵育1小时，并设空白对照组；
2)将上述磁珠-AAL-ELISA酶标板置于磁力工作台上，吸除孔内液体后，采用PBST(含0.05％Tween 20的PBS，pH 7.2-7.4)洗板4次，每次浸泡2分钟，300μL/孔，甩干，并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干；
3)加入HRP标记Hp抗体，100μL/孔，室温孵育1小时；
4)将上述磁珠-AAL-ELISA酶标板置于磁力工作台上，吸除孔内液体后，采用PBST(含0.05％Tween 20的PBS，pH 7.2-7.4)洗板4次，每次浸泡2分钟，300μL/孔，甩干，并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干；
5)在上述磁珠-AAL-ELISA酶标板中加入TMB显色液，100μL/孔，孵育15分钟，加入终止液，100μL/孔，混匀后在450nm处检测OD值。
四、常规Hp-ELISA检测
1)在包被有Hp抗体的96孔酶标板(Hp-ELISA酶标板)中加入稀释液200μL/孔，再加入血清样品20μL/孔，室温孵育1小时，并设空白对照组；
2)吸除孔内液体后，采用PBST(含0.05％Tween 20的PBS，pH 7.2-7.4)洗板4次，每次浸泡2分钟，300μL/孔，甩干，并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干；
3)加入HRP标记Hp抗体，200μL/孔，室温孵育1小时；
4)吸除孔内液体后，采用PBST(含0.05％Tween 20的PBS，pH 7.2-7.4)洗板4次，每次浸泡2分钟，300μL/孔，甩干，并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干；
5)加入TMB显色液，100μL/孔，孵育15分钟，加入终止液，100μL/孔，混匀后在450nm处检测OD值。
五、Fuc-Hp半定量检测ELISA数据分析
1)数据：每个血清样品的OD值应减去空白孔的OD值为实际OD值。每个血清样品Hp结合AAL的实际OD值(磁珠-AAL-Hp-ELISA)与此相同血清样品Hp蛋白的实际OD值(Hp-ELISA)的比值即为Fuc-Hp值(指数)。
2)按照上述HCC预测模型计算P值，将P值与阈值比较，大于1.0154为肝癌患者，小于1.0154为正常人。
3)采用上述实施例中的试剂盒和检测方法，联合并行分析80例血清样品(正常人和肝癌患者各40例，均经临床确诊)中Hp的岩藻糖和蛋白的表达水平，计算得到Fuc-Hp含量，图2所示为40例正常人和40例HCC病人纵向散点图。采用SPSS软件logistic回归分析建立的上述HCC预测模型进行检测区分肝癌和正常人的阈值为1.0154。
本发明试剂盒的灵敏度和特异度分别为76.1％和85.3％，准确性80％，AUC为0.852，其ROC曲线见图3。因此，本发明具有检测快速，较高特异度和准确性，对肝癌的预测具有重要临床价值。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (8)

1.一种基于凝集素磁珠的结合珠蛋白异质体诊断肝癌试剂盒，其特征在于包括：ELISA酶标板、磁珠-AAL、Hp-ELISA酶标板以及HCC预测模型：
P＝exp(-2.554+2.009×Fuc-Hp)/[1+exp(-2.554+2.009×Fuc-Hp)]；
其中，Fuc-Hp值的计算方法为：每个血清样品中Hp结合AAL的实际OD值与相同血清样品中Hp蛋白的实际OD值的比值，所述血清样品中Hp结合AAL的实际OD值通过磁珠-AAL-Hp-ELISA检测得到，血清样品中Hp蛋白的实际OD值通过常规Hp-ELISA检测得到，该模型区分肝癌病人和正常人的阈值为1.0154，大于1.0154为肝癌，小于1.0154为正常；
所述磁珠-AAL的制备方法包括步骤：
1)将磁珠置于EDC溶液中反应；
2)反应完成后，移除上清并用缓冲液清洗磁珠；
3)取一定量的AAL置于偶联液中，加入磁珠反应；
4)反应完成后，封闭未反应的活化基团。
2.如权利要求1所述的基于凝集素磁珠的结合珠蛋白异质体诊断肝癌试剂盒，其特征在于所述磁珠-AAL中磁珠与AAL的质量比为180-220:1。
3.如权利要求1所述的基于凝集素磁珠的结合珠蛋白异质体诊断肝癌试剂盒，其特征在于所述磁珠-AAL拆分为磁珠、AAL及磁珠-AAL的制备相关试剂。
4.如权利要求1所述的基于凝集素磁珠的结合珠蛋白异质体诊断肝癌试剂盒，其特征在于还包括封闭剂，所示封闭剂为含3％BSA的PBST溶液。
5.如权利要求1所述的基于凝集素磁珠的结合珠蛋白异质体诊断肝癌试剂盒，其特征在于还包括样品稀释液，所示样品稀释液为0.1M Tris-HCl、0.15M NaCl、1mM CaCl2、1mMMgCl2、pH 7.5的溶液。
6.如权利要求1所述的基于凝集素磁珠的结合珠蛋白异质体诊断肝癌试剂盒，其特征在于还包括含0.05％吐温20的pH 7.2-7.4的PBS溶液。
7.如权利要求1所述的基于凝集素磁珠的结合珠蛋白异质体诊断肝癌试剂盒，其特征在于还包括HPR标记的Hp抗体。
8.如权利要求1所述的基于凝集素磁珠的结合珠蛋白异质体诊断肝癌试剂盒，其特征在于还包括采集血样装置及操作说明书。
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