CN110286235A

CN110286235A - 一种用于肝癌早期筛查和诊断的联合检测血清标志物、试剂盒及检测方法

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Publication number: CN110286235A
Application number: CN201910621860.XA
Authority: CN
Inventors: 张建营; 叶华; 代丽萍; 王晓; 王鹏; 史健翔; 王科妍; 杨倩
Original assignee: Zhengzhou University
Current assignee: Zhengzhou University
Priority date: 2019-07-10
Filing date: 2019-07-10
Publication date: 2019-09-27
Anticipated expiration: 2039-07-10
Also published as: CN110286235B

Abstract

本发明涉及一种用于肝癌早期筛查和诊断的联合检测血清标志物、包含该联合检测血清标志物的试剂盒以及检测方法，属于生物医学技术领域。本发明基于癌症驱动基因在肿瘤发生和发展中所起的作用，定制138个癌症驱动基因编码的人类蛋白质芯片，通过蛋白质芯片初步筛选出肝癌的早期检测血清标志物，再经过ELISA实验进行验证，最终筛选出可用于肝癌早期筛查和诊断的一组肝癌联合检测血清标志物，其包括PTEN、PTCH1、IDH1、SRSF2、MSH2和NPM1共6种基因编码的蛋白，可辅助肝癌的临床诊断，具有灵敏度高、特异性强、成本低等优点。

Description

一种用于肝癌早期筛查和诊断的联合检测血清标志物、试剂盒及检测方法

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种用于肝癌早期筛查和诊断的联合检测血清标志物、包含该联合检测血清标志物的试剂盒以及检测方法。

背景技术

原发性肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，严重威胁着人们的生命健康。肝癌起病隐匿，预后差。手术切除和肝移植等方式被认为是肝癌根治性治疗的手段，但大多数患者在初次诊断时，便已进入肝癌晚期，因而失去了治疗的机会，其中最主要的原因是早期肝癌患者通常无明显症状，或者体积很小，影像学检查较难察觉，而甲胎蛋白(AFP)作为主要的血清标记物，又存在敏感性低的缺点，已不再作为肝癌的筛查指标。公布号CN105092842A的中国发明专利公开了一种用于诊断肝癌的联合型代谢标志物，包括色氨酸、谷氨酰胺和2-羟基丁酸，通过检测来自受试者的血清样品中上述联合标志物各自的相对浓度，基于二元逻辑回归方程计算联合标志物变量P，再基于确定的截点值判断受试者是否患有肝癌，该标志物可应用于辅助肝癌的临床诊断，与传统的临床诊断标志物甲胎蛋白(AFP)相互补充可以早期判别肝癌，但其应用有一定的局限性。因此国内外研究者们在肝癌肿瘤标志物层面进行了大量研究，致力于为肝癌的分子诊断以及术后个体化治疗方案的制定等提供重要的理论依据。

近年来，在人类肿瘤学的研究领域内，许多研究已经发现癌症患者血清中含有一组独特的诱发自身抗体反应的细胞蛋白，被称为肿瘤相关抗原(tumor-associatedantigen，TAA)，其诱导产生的抗体称为抗TAA-抗体(autoantibody)。其中肿瘤相关抗原p62能够激发人体产生免疫反应，产生自身抗体，具有重要意义的是抗p62自身抗体在肝癌患者循环系统出现的时间：使用从慢性肝炎发展到肝硬化再到肝癌的序列血清，发现抗p62自身抗体在患者的慢性肝炎阶段没有出现，在肝硬化的前期、中期也没有出现，而在肝硬化阶段的晚期肝癌发生前的一段时间含量急剧升高，而此时尚未出现肝癌的临床症状和体征，临床上尚不能发现肝癌，并且这一现象在多个肝癌患者的序列血清中得到重复。这就说明，抗p62自身抗体是一个有潜力的能够早期诊断肝癌的血清学标志物。随后对小样本的肝癌、肝硬化、慢性肝炎患者和正常人的血清检测抗p62自身抗体进行检测，结果显示这种自身抗体的特异度很高，但是灵敏度尚不能达到20％。显然，如果单独以抗p62自身抗体作为诊断肝癌的标志物，诊断价值较低。研究者在接下来的工作中，试图寻找更加灵敏和特异的抗TAA自身抗体，可是结果不够理想。在2003年的一项使用7种抗TAA自身抗体检测肝癌的研究中，单个指标的灵敏度不超过20％，但是通过并联这7种TAA自身抗体，检测的灵敏度可以达到56.9％，而诊断的特异度仍然很高。说明联合多个TAA自身抗体具有较高的诊断价值，是一种有应用潜力的策略。

十余年来的后续研究一直试图寻找诊断肝癌更加敏感特异的抗TAA自身抗体，优化诊断肝癌的组合。寻找有价值的TAA自身抗体，常用的方法有两种：一是重组cDNA表达文库血清学筛选(serological analysis of recombinant cDNA expression libraries，SEREX)；另一种是蛋白质组学技术。与SEREX相比，蛋白组学技术能够对多个肿瘤血清进行筛选，并且能够筛选出具有翻译后修饰的TAA。在肿瘤的发生发展过程中，涉及到几十万个基因的突变，但仅有某些关键基因突变才可引起肿瘤的发生发展，这些关键基因被称为癌症驱动基因。研究认为不同类型的肿瘤发生时，一般都包含2-8个驱动基因，正是因为这些基因的突变才可导致肿瘤的优势生长，这些基因可以通过调节细胞周期、细胞生存和基因组维持3个细胞核心过程，被分为12个信号通路。目前在多种肿瘤的全基因组测序研究中共发现138个癌症驱动基因(参见Vogelstein B.Science.(2013)339(6127):1546-1558)，包括74个抑癌基因和64个癌症基因。这些基于癌症驱动基因编码的蛋白亦可诱发机体在其循环血液中产生相应的自身抗体，通过对癌症驱动基因编码蛋白及其诱发的血清中的自身抗体的研究可在一定程度上揭示肿瘤的发生发展或预后等。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于肝癌早期筛查和诊断的联合检测血清标志物，辅助肝癌的临床诊断。

同时，本发明还提供一种包含上述联合检测血清标志物的试剂盒。

最后，本发明提供一种灵敏度高、特异性强、成本低且可辅助肝癌临床诊断的检测方法。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：

一种用于肝癌早期筛查和诊断的联合检测血清标志物，包括PTEN、PTCH1、IDH1、SRSF2、MSH2和NPM1基因编码的蛋白。

进一步的，所述联合检测血清标志物由PTEN、PTCH1、IDH1、SRSF2、MSH2和NPM1共6种基因编码的蛋白组成。

所述PTEN基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

所述PTCH1基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。

所述IDH1基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。

所述SRSF2基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列。

所述MSH2基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。

所述NPM1基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列。

一种用于肝癌早期筛查和诊断的试剂盒，包含上述联合检测血清标志物。具体包括PTEN、PTCH1、IDH1、SRSF2、MSH2和NPM1基因编码的蛋白。

更进一步的，所述PTEN、PTCH1、IDH1、SRSF2、MSH2和NPM1基因编码的蛋白包被于固相载体上。

所述固相载体的材质为聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺、纤维素等。

所述固相载体的存在形式为凹孔平板、试管、球粒等。

进一步的，所述试剂盒还包括阳性对照血清、阴性对照血清、封闭液、样本稀释液、第二抗体、第二抗体稀释液、洗涤液、显色液、终止液中的任意一种或几种的组合。上述试剂在实际应用中可根据需要进行选择。

一种使用上述联合检测血清标志物的检测方法，包括以下步骤：

1)对上述联合检测血清标志物分别进行包被，封闭后清洗；

2)与待检测血清进行一抗孵育，清洗，再进行二抗孵育，再清洗；

3)显色系统显色后终止反应，测定吸光度值；

4)以OD₄₅₀-OD₆₂₀为相对OD值，然后扣去空白对照，将各个指标(即血清标志物)的吸光度值代入以下公式，计算预测概率P值大小；

P＝1/(1+Exp(-(3.504-6.810×OD_PTEN-3.616×OD_PTCH1+20.294×OD_IDH1-9.224×OD_SRSF2-11.667×OD_MSH2+3.770×OD_NPM1)))；

式中OD_PTEN、OD_PTCH1、OD_IDH1、OD_SRSF2、OD_MSH2、OD_NPM1分别为各个指标的相对OD值减去空白对照后的吸光度值；

当P值≥0.5时，初步判定为疑似肝癌样品；

当P值＜0.5时，初步判定为正常样品。

所述二抗孵育中使用的二抗为HRP标记的鼠抗人IgG。

本发明的有益效果：

本发明基于癌症驱动基因在肿瘤发生和发展中所起的作用，定制138个癌症驱动基因编码的人类蛋白质芯片，共包含180个人源重组蛋白质，用以筛选潜在的可用于诊断或其他表征癌症的标志物。本发明先通过蛋白质芯片初步筛选出肝癌的早期检测血清标志物，再经过ELISA实验进行验证，最终筛选出可用于肝癌早期筛查和诊断的一组肝癌联合检测血清标志物，其包括PTEN、PTCH1、IDH1、SRSF2、MSH2、NPM1共6种基因编码的蛋白，可辅助肝癌的临床诊断，具有较好的参考价值。

本发明中包含上述6种血清蛋白标志物的试剂盒可用于肝癌的早期筛查和诊断，其检测方法具有灵敏度高、特异性强、成本低等特点，且操作简单、快捷，可为肝癌的早期诊断提供依据。

附图说明

图1为实验例中基于focused array人蛋白质芯片检测原理图；

图2为实验例中蛋白质芯片筛选出的11个TAA单独诊断肝癌ROC曲线分析图；

图3为实验例中蛋白质芯片筛选出的11个TAA的SNR值散点图；

图4为实验例中间接ELISA检测原理图；

图5为实验例中ELISA验证11个TAA单独诊断肝癌ROC曲线分析图；

图6为实验例中ELISA验证11个TAA的OD值散点分布图；

图7为实验例中ELISA验证6个TAAs联合诊断肝癌在训练集数据中的ROC曲线图；

图8为实验例中ELISA验证6个TAAs联合诊断肝癌在验证集数据中的ROC曲线图。

具体实施方式

下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。除特殊说明外，以下实施例及实验例中所用设备和试剂均从商业途径获得。

实施例1

本实施例中用于肝癌早期筛查和诊断的联合检测血清标志物，由PTEN、PTCH1、IDH1、SRSF2、MSH2和NPM1共6种基因编码的蛋白组成。其中PTEN基因编码的蛋白具有如SEQID NO.2所示的氨基酸序列，PTCH1基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，IDH1基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列，SRSF2基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列，MSH2基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列，NPM1基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列。

实施例2

本实施例中用于肝癌早期筛查和诊断的试剂盒，包含上述实施例1的联合检测血清标志物，包被于聚氯乙烯的凹孔平板上。并且，试剂盒内还包括一定量的阳性对照血清、阴性对照血清、封闭液、样本稀释液、第二抗体、第二抗体稀释液、洗涤液、显色液和终止液，阳性对照血清为ELISA实验OD值较高的并经Western Blot实验验证为相应抗体阳性的血清，阴性对照血清为正常对照人群中ELISA实验OD值处于均值附近的且经Western Blot验证为阴性的血清，第二抗体为HRP标记的鼠抗人IgG。

实施例3

本实施例的检测方法使用上述实施例1的联合检测血清标志物，具体步骤如下：

1)包被：对联合检测血清标志物分别进行包被(包被浓度见下表1)，100μL/孔，4℃过夜。

2)封闭：2％BSA的PBST(PBS，Tween20)溶液，200μL/孔，4℃过夜。

3)清洗：350μL/孔PBST清洗3次。

4)一抗孵育：待测血清与含1％BSA的PBST 1:100稀释后，100μL/孔，37℃半水浴1h。

5)清洗：350μL/孔PBST清洗5次。

6)二抗孵育：HRP标记的鼠抗人IgG与含1％BSA的PBST 1:10000稀释后，100μL/孔，37℃半水浴1h。

7)清洗：350μL/孔PBST清洗5次。

8)显色：TMB显色系统，A液(索莱宝，北京)与B液1:1混合后100μL/孔，室温避光，达到预期颜色。

9)终止：10％的浓硫酸50μL/孔终止后10min内测吸光度。

10)判定：以OD₄₅₀-OD₆₂₀为相对OD值，然后扣去空白对照，将各个指标(即血清标志物)的吸光度值代入以下公式，计算预测概率P值大小；

当P值≥0.5时，初步判定为疑似肝癌样品；

当P值＜0.5时，初步判定为正常样品。

结果显示，待测血清的P值大于0.5，初步判定为疑似肝癌样品。

由于本实施例的方法测定的结果只能作为中间结果的信息，不能直接判定患者是否患有肝癌，因此后续还需要结合临床症状、影像学及组织病理学等信息，最终判定患者的患病情况。

实验例

1血清样本的准备

1.1用于进行蛋白芯片实验的血清样本

收集在北京佑安医院和郑州大学第一附属医院原发性肝癌病人(肝癌经病理诊断)，病人同意以及机构审查委员会和医院伦理委员会批准。所有标本均用红头采血管采集研究对象全血5～10mL，在室温放置2小时后，1000g离心15分钟，取上清液，每个样本分装若干份贴好标签于-80℃低温冰箱保存，避免反复冻融。

根据流行病学分析，最终收集97例原发性肝癌血清以及同时期体检的50例佑安医院正常对照血清进行初步芯片筛选。97例原发性肝癌患者中，共有男性79(81.44％)例，女性18(18.56％)例，平均年龄为56.76±9.34岁，年龄范围为37-78岁；50例正常血清中，有男性23(46.0％)例，女性27(54.0％)例，平均年龄为40.5±12.97，年龄范围为20-71岁。所有肝癌患者血清都是在患者最初诊断为肝癌尚未接受任何放化疗及手术治疗时收集的。正常人血清来自参加年度健康体检，无任何恶性肿瘤症状的体检人群。

1.2用于进行ELISA实验验证的血清样本

(1)收集自北京佑安医院和郑州大学第一附属医院的血清样本(详见上述1.1部分)。

(2)来自郑州大学第一附属医院肝胆外科(135例原发性肝癌)和郑州市金水区心血管调查项目(134例正常人)，135例原发性肝癌患者中，共有男性105例(77.78％)，女性30例(22.22％)，平均年龄为55.3±11.1岁，年龄范围为25-87岁；134例正常血清中，有男性105(78.4％)例，女性29(21.6％)例，平均年龄为55.3±10.7，年龄范围为34-87岁。所有肝癌患者血清都是在患者最初诊断为肝癌尚未接受任何放化疗及手术治疗时收集的。

2用于筛选肝癌诊断标志物的蛋白芯片定制

将138个癌症驱动基因(参见Vogelstein B.Science.(2013)339(6127):1546-1558)编码的蛋白(共180个人源重组蛋白质)固定于蛋白芯片上，用于肿瘤标志物的筛选。用于筛选肿瘤标志物的蛋白芯片为在广州博翀生物科技有限公司定制的HuProtTM人类蛋白质芯片。

3蛋白芯片实验

实验原理参见图1。

3.1实验所需试剂：

1)封闭液：3mL 10％BSA，加入7mL 1×PBS溶液，混匀，置于冰上。

2)血清孵育液：1mL 10％BSA，加入9mL 1×PBST溶液，混匀，置于冰上。

3)清洗液：1×PBST，存放于4℃冰箱。

4)二抗孵育液：包括荧光标记抗人IgM二抗(cy5标记，呈现红色)和荧光标记抗人IgG二抗(cy3标记，呈现绿色)。

3.2蛋白芯片具体实验步骤

(a)复温：将芯片从-80℃冰箱取出，于4℃冰箱复温半小时，然后于室温复温15min。

(b)封闭：复温后的芯片，14blocks围栏固定，向每个block中加入封闭液，并放置在侧摆摇床上，室温封闭3小时。

(c)血清样本孵育：封闭完成后，倒尽封闭液体，然后迅速加入预先准备好的血清孵育液，每张芯片孵育14个样本(样本先放在4℃层析柜冻融，以1:50比例稀释)，每个血清样本的上样体积为200μL，侧摆摇床20rpm，4℃过夜孵育。

(d)清洗：将芯片及芯片夹一同取出，吸去样本，然后迅速加入等体积的PBST，如此循环数次，保证在拆除芯片夹时血清样本间无交叉污染。拆除芯片夹后，将芯片置于加有清洗液的芯片清洗盒，水平摇床，室温80rpm，清洗3次，每次10min。

(e)二抗孵育：将芯片转移到加入了3mL二抗孵育液的孵育盒中，侧摆摇床40rpm，避光，室温60min。

(f)清洗：将芯片取出(注意不能触及或划破芯片的上表面)，置于加入有清洗液的芯片清洗盒，至于水平摇床上，80rpm清洗3次，每次10min。完成后用ddH₂O清洗2次，每次10min。

(g)干燥：将芯片置于芯片干燥机离心干燥。

(h)扫描：按照扫描仪的操作规范和使用说明操作。

(i)数据提取：将芯片图像和结果每个阵列整体对齐，按下自动对齐按钮，提取数据并保存。

(j)进行数据预处理。

(k)进行数据分析，获得最终的肝癌血清标志物，该蛋白质芯片实验筛选出以下血清蛋白标志物：癌症驱动基因GNA11、PTEN、PTCH1、IDH1、survivin、SRSF2、MSH2、NPM1、PAX5、GNAS和p53编码的蛋白(图2为上述蛋白芯片筛选出的11个TAA单独诊断肝癌的ROC曲线分析图，图中1-11依次为GNA11、PTEN、PTCH1、IDH1、survivin、SRSF2、MSH2、NPM1、PAX5、GNAS、p53编码的蛋白单独诊断肝癌的ROC曲线；图3为上述11个TAA的SNR值散点图，图中N表示Normal，即健康正常血清，H表示hepatocellular carcinoma，即肝癌病例)。其中，GNA11、PTEN、PTCH1、IDH1、SRSF2、MSH2、NPM1、PAX5、GNAS、survivin和p53基因编码的蛋白依次具有如SEQ ID NO.1～11所示的氨基酸序列。

4ELISA实验验证

实验原理参见图4。

具体实验步骤如下：

a)包被：按照表1中浓度进行包被100μL/孔，4℃过夜。

b)封闭：2％BSA(索莱宝，北京，分析纯)的PBST(PBS，Tween20索莱宝，北京)溶液，200μL/孔，4℃过夜。

c)清洗：350μL/孔PBST清洗3次。

d)一抗孵育：血清与含1％BSA的PBST 1:100稀释后，100μL/孔，37℃半水浴1h。

e)清洗：350μL/孔PBST清洗5次。

f)二抗孵育：HRP标记的鼠抗人IgG(奥科，武汉)与含1％BSA的PBST 1:10000稀释后，100μL/孔，37℃半水浴1h。

g)清洗：350μL/孔PBST清洗5次。

h)显色：TMB显色系统，A液(索莱宝，北京，分析纯)与B液1:1混合后100μL/孔，室温避光，达到预期颜色(约需5-15min)。

i)终止：10％的浓硫酸50μL/孔后10min内测吸光度。

j)测吸光度：以OD450-OD620为相对OD值，然后扣去空白对照，调整IgG做归一化处理，然后进行后续数据处理(数据处理方法详见下述“5数据处理”部分b)-d)所示)。

其中，上述经蛋白芯片实验筛选出的11个TAA进行ELISA实验验证时各自的包被浓度如下表1所示，ELISA实验的96孔板排布表如下表2所示。表2中阳性质控为ELISA实验OD值较高的并经Western Blot实验验证为相应抗体阳性的血清，阴性质控为正常对照人群中ELISA实验OD值处于均值附近的且经Western Blot验证为阴性的血清，空白为血清稀释液，IgG1～IgG8为梯度稀释的人IgG抗体，浓度依次为10、20、50、100、150、200、250、300ng/ml。

表1 11个TAA各自的包被浓度

表2 ELISA实验的96孔板排布

实验结果：采用ELISA方法对11个TAA进行检测，结果见图5和图6。图5为ELISA验证实验中11个TAA单独诊断肝癌的ROC曲线分析图，图中1-11依次为GNA11、PTEN、PTCH1、IDH1、survivin、SRSF2、MSH2、NPM1、PAX5、GNAS、p53编码的蛋白单独诊断肝癌的ROC曲线；图6为ELISA验证实验中11个TAA的OD值散点分布图，图中N表示Normal，即健康正常血清，H表示hepatocellular carcinoma，即肝癌病例。从图5可以看出，单个指标诊断肝癌ROC曲线下面积为0.574～0.752，保证特异度最低90％时，灵敏度范围为18.5％～41.8％。其中SRSF2的曲线下面积最大，为0.752，灵敏度达到41.8％，特异度为90.2％；PTEN的ROC曲线下面积次之，为0.725，灵敏度达22.8％，特异度为90.2％；NPM1的ROC曲线下面积最小，为0.574，灵敏度达22.8％，特异度为90.2％。从图6可以看出，11个指标OD值分布于0～1之间，中位OD值基本上均分布于0.2～0.4之间，健康对照与肝癌病例之间差异均有统计学意义。

5数据处理

通过使用focused array人蛋白质芯片在肝癌组和NC正常对照组，通过统计学数据分析筛选出差异表达蛋白，具体方法如下：

(1)通过Focused Array蛋白质芯片实验获得芯片初筛结果。

(2)稳定性分析：在实验过程中，根据不同时间、不同芯片、不同位置，将测试样本test进行重复，用以评价不同芯片在不同时间的稳定性。

(3)数据分析及结果：剔除高背景、极端样本干扰后的样本，将IgG和IgM响应类型的各180个蛋白进行一致的统计学分析，分析逻辑如下：

a)为消除同一张芯片内不同蛋白点之间由于背景值不一致导致的信号不均一的情况，故通过背景归一化方法进行处理，实现方式为每个蛋白的前景值与背景值比值，即F/B，并此基础上定义SNR(信噪比)，即两个重复蛋白的F/B的均值，进行后续统计学分析。

b)假设需要比对的样本分别来自完全相同的两个总体，并通过F检验确定所需比对两组方差是否齐性，然后把F检验结果选择对应t检验，并且t检验结果以P-value进行表征。定义，当p-value<0.05时，拒绝原假设，即两者存在显著性差异。

c)对于任一蛋白，计算癌症组与正常组的组间的差异倍数，即fold change，用以表示两组间差异。

d)对于任一蛋白，根据所比对两组的诊断意义，首先，定义cutoff＝1.5为阳性判断阈值，即样本在蛋白上的SNR≥1.5时，该蛋白为阳性蛋白；然后，以对照组为基础，设置合适的cutoff阈值，在此cutoff阈值下计算癌症组与对照组阳性率之差，并且以最大的差值作为该蛋白在所比较的癌症组中的阳性率，用以寻找癌症组针对对照组特异的高响应蛋白，最后，定义阳性率不得低于15％。

e)基于以上逻辑，进行肝癌组(收集自北京佑安医院和郑州大学第一附属医院的97例原发性肝癌患者血清)和佑安对照组(50例佑安医院正常血清)比对，筛选出肝癌组明显高于对照组的差异蛋白作为肝癌候选标志物，最终经芯片选定了11种血清蛋白标志物(GNA11、PTEN、PTCH1、IDH1、SRSF2、MSH2、NPM1、PAX5、GNAS、survivin和p53)来评价肝癌的诊断价值。其中，GNA11基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，PTEN基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，PTCH1基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，IDH1基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列，SRSF2基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列，MSH2基因编码的蛋白具有如SEQ IDNO.6所示的氨基酸序列，NPM1基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列，PAX5基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列，GNAS基因编码的蛋白具有如SEQID NO.9所示的氨基酸序列，survivin基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列，p53基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列。上述11种基因的信息来源见下表3。

表3 11种基因的信息来源

基因名称	Uniprot数据库登录号	NCBI参考序列登录号
			GNA11	P29992	NM_002067
PTEN	P60484	NM_000314
			PTCH1	Q13635	NM_000264
IDH1	O75874	NM_001282387
			SRSF2	Q01130	NM_001195427
MSH2	P43246	NM_000251
			NPM1	P06748-2	NM_199185
PAX5	Q02548	NM_016734
			GNAS	Q5JWF2	NM_080425
Survivin	O15392-3	NM_001012270
			TP53	P04637	NM_000546

(4)对经蛋白质芯片筛选出的11种血清蛋白标志物进行ELISA实验验证：包括对送检芯片样本验证以及送检芯片之外重新收集的样本进行验证，既实现了蛋白芯片的验证又保证了推广性。

(5)实验结果：经蛋白质芯片筛选出的11种血清蛋白标志物进行ELISA实验验证，对所有验证人群利用随机抽样的方法，抽取总人群的70％作为训练集，利用二元logistics回归构建疾病预测模型，分别用逐步向前(Forward：conditional)、逐步向后(Backward：conditional)以及直接输入法(Enter)三种方法筛选指标，分别有6种、9种、11种蛋白进入模型，其所对应的ROC曲线下面积(AUC)、灵敏度(Se)、特异度(Sp)如下表4所示。

表4 不同筛选方法筛选出的模型指标

对以上所构建的模型的诊断价值以及经济效益分析，含有6个指标(PTEN、PTCH1、IDH1、SRSF2、MSH2、NPM1)的模型效果最佳，在剩余的30％人群(验证集)中进行验证，如图7、8所示，其联合诊断肝癌ROC曲线下面积达0.854，95％CI为0.785～0.923，保证特异度90.0％时，灵敏度为46.9％，一致率达到70.4％。

<110> 郑州大学

<120> 一种用于肝癌早期筛查和诊断的联合检测血清标志物、试剂盒及检测方法

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1 .0

<211> 359

<212> PRT

<213> 人

<221> GNA11基因编码的蛋白

<400> 1

MTLESMMACC LSDEVKESKR INAEIEKQLR RDKRDARREL KLLLLGTGES GKSTFIKQMR 60

IIHGAGYSEE DKRGFTKLVY QNIFTAMQAM IRAMETLKIL YKYEQNKANA LLIREVDVEK 120

VTTFEHQYVS AIKTLWEDPG IQECYDRRRE YQLSDSAKYY LTDVDRIATL GYLPTQQDVL 180

RVRVPTTGII EYPFDLENII FRMVDVGGQR SERRKWIHCF ENVTSIMFLV ALSEYDQVLV 240

ESDNENRMEE SKALFRTIIT YPWFQNSSVI LFLNKKDLLE DKILYSHLVD YFPEFDGPQR 300

DAQAAREFIL KMFVDLNPDS DKIIYSHFTC ATDTENIRFV FAAVKDTILQ LNLKEYNLV 359

<211> 403

<212> PRT

<213> 人

<221> PTEN基因编码的蛋白

<400> 2

MTAIIKEIVS RNKRRYQEDG FDLDLTYIYP NIIAMGFPAE RLEGVYRNNI DDVVRFLDSK 60

HKNHYKIYNL CAERHYDTAK FNCRVAQYPF EDHNPPQLEL IKPFCEDLDQ WLSEDDNHVA 120

AIHCKAGKGR TGVMICAYLL HRGKFLKAQE ALDFYGEVRT RDKKGVTIPS QRRYVYYYSY 180

LLKNHLDYRP VALLFHKMMF ETIPMFSGGT CNPQFVVCQL KVKIYSSNSG PTRREDKFMY 240

FEFPQPLPVC GDIKVEFFHK QNKMLKKDKM FHFWVNTFFI PGPEETSEKV ENGSLCDQEI 300

DSICSIERAD NDKEYLVLTL TKNDLDKANK DKANRYFSPN FKVKLYFTKT VEEPSNPEAS 360

SSTSVTPDVS DNEPDHYRYS DTTDSDPENE PFDEDQHTQI TKV 403

<211> 1447

<212> PRT

<213> 人

<221> PTCH1基因编码的蛋白

<400> 3

MASAGNAAEP QDRGGGGSGC IGAPGRPAGG GRRRRTGGLR RAAAPDRDYL HRPSYCDAAF 60

ALEQISKGKA TGRKAPLWLR AKFQRLLFKL GCYIQKNCGK FLVVGLLIFG AFAVGLKAAN 120

LETNVEELWV EVGGRVSREL NYTRQKIGEE AMFNPQLMIQ TPKEEGANVL TTEALLQHLD 180

SALQASRVHV YMYNRQWKLE HLCYKSGELI TETGYMDQII EYLYPCLIIT PLDCFWEGAK 240

LQSGTAYLLG KPPLRWTNFD PLEFLEELKK INYQVDSWEE MLNKAEVGHG YMDRPCLNPA 300

DPDCPATAPN KNSTKPLDMA LVLNGGCHGL SRKYMHWQEE LIVGGTVKNS TGKLVSAHAL 360

QTMFQLMTPK QMYEHFKGYE YVSHINWNED KAAAILEAWQ RTYVEVVHQS VAQNSTQKVL 420

SFTTTTLDDI LKSFSDVSVI RVASGYLLML AYACLTMLRW DCSKSQGAVG LAGVLLVALS 480

VAAGLGLCSL IGISFNAATT QVLPFLALGV GVDDVFLLAH AFSETGQNKR IPFEDRTGEC 540

LKRTGASVAL TSISNVTAFF MAALIPIPAL RAFSLQAAVV VVFNFAMVLL IFPAILSMDL 600

YRREDRRLDI FCCFTSPCVS RVIQVEPQAY TDTHDNTRYS PPPPYSSHSF AHETQITMQS 660

TVQLRTEYDP HTHVYYTTAE PRSEISVQPV TVTQDTLSCQ SPESTSSTRD LLSQFSDSSL 720

HCLEPPCTKW TLSSFAEKHY APFLLKPKAK VVVIFLFLGL LGVSLYGTTR VRDGLDLTDI 780

VPRETREYDF IAAQFKYFSF YNMYIVTQKA DYPNIQHLLY DLHRSFSNVK YVMLEENKQL 840

PKMWLHYFRD WLQGLQDAFD SDWETGKIMP NNYKNGSDDG VLAYKLLVQT GSRDKPIDIS 900

QLTKQRLVDA DGIINPSAFY IYLTAWVSND PVAYAASQAN IRPHRPEWVH DKADYMPETR 960

LRIPAAEPIE YAQFPFYLNG LRDTSDFVEA IEKVRTICSN YTSLGLSSYP NGYPFLFWEQ 1020

YIGLRHWLLL FISVVLACTF LVCAVFLLNP WTAGIIVMVL ALMTVELFGM MGLIGIKLSA 1080

VPVVILIASV GIGVEFTVHV ALAFLTAIGD KNRRAVLALE HMFAPVLDGA VSTLLGVLML 1140

AGSEFDFIVR YFFAVLAILT ILGVLNGLVL LPVLLSFFGP YPEVSPANGL NRLPTPSPEP 1200

PPSVVRFAMP PGHTHSGSDS SDSEYSSQTT VSGLSEELRH YEAQQGAGGP AHQVIVEATE 1260

NPVFAHSTVV HPESRHHPPS NPRQQPHLDS GSLPPGRQGQ QPRRDPPREG LWPPPYRPRR 1320

DAFEISTEGH SGPSNRARWG PRGARSHNPR NPASTAMGSS VPGYCQPITT VTASASVTVA 1380

VHPPPVPGPG RNPRGGLCPG YPETDHGLFE DPHVPFHVRC ERRDSKVEVI ELQDVECEER 1440

PRGSSSN 1447

<211> 414

<212> PRT

<213> 人

<221> IDH1基因编码的蛋白

<400> 4

MSKKISGGSV VEMQGDEMTR IIWELIKEKL IFPYVELDLH SYDLGIENRD ATNDQVTKDA 60

AEAIKKHNVG VKCATITPDE KRVEEFKLKQ MWKSPNGTIR NILGGTVFRE AIICKNIPRL 120

VSGWVKPIII GRHAYGDQYR ATDFVVPGPG KVEITYTPSD GTQKVTYLVH NFEEGGGVAM 180

GMYNQDKSIE DFAHSSFQMA LSKGWPLYLS TKNTILKKYD GRFKDIFQEI YDKQYKSQFE 240

AQKIWYEHRL IDDMVAQAMK SEGGFIWACK NYDGDVQSDS VAQGYGSLGM MTSVLVCPDG 300

KTVEAEAAHG TVTRHYRMYQ KGQETSTNPI ASIFAWTRGL AHRAKLDNNK ELAFFANALE 360

EVSIETIEAG FMTKDLAACI KGLPNVQRSD YLNTFEFMDK LGENLKIKLA QAKL 414

<211> 221

<212> PRT

<213> 人

<221> SRSF2基因编码的蛋白

<400> 5

MSYGRPPPDV EGMTSLKVDN LTYRTSPDTL RRVFEKYGRV GDVYIPRDRY TKESRGFAFV 60

RFHDKRDAED AMDAMDGAVL DGRELRVQMA RYGRPPDSHH SRRGPPPRRY GGGGYGRRSR 120

SPRRRRRSRS RSRSRSRSRS RSRYSRSKSR SRTRSRSRST SKSRSARRSK SKSSSVSRSR 180

SRSRSRSRSR SPPPVSKRES KSRSRSKSPP KSPEEEGAVS S 221

<211> 934

<212> PRT

<213> 人

<221> MSH2基因编码的蛋白

<400> 6

MAVQPKETLQ LESAAEVGFV RFFQGMPEKP TTTVRLFDRG DFYTAHGEDA LLAAREVFKT 60

QGVIKYMGPA GAKNLQSVVL SKMNFESFVK DLLLVRQYRV EVYKNRAGNK ASKENDWYLA 120

YKASPGNLSQ FEDILFGNND MSASIGVVGV KMSAVDGQRQ VGVGYVDSIQ RKLGLCEFPD 180

NDQFSNLEAL LIQIGPKECV LPGGETAGDM GKLRQIIQRG GILITERKKA DFSTKDIYQD 240

LNRLLKGKKG EQMNSAVLPE MENQVAVSSL SAVIKFLELL SDDSNFGQFE LTTFDFSQYM 300

KLDIAAVRAL NLFQGSVEDT TGSQSLAALL NKCKTPQGQR LVNQWIKQPL MDKNRIEERL 360

NLVEAFVEDA ELRQTLQEDL LRRFPDLNRL AKKFQRQAAN LQDCYRLYQG INQLPNVIQA 420

LEKHEGKHQK LLLAVFVTPL TDLRSDFSKF QEMIETTLDM DQVENHEFLV KPSFDPNLSE 480

LREIMNDLEK KMQSTLISAA RDLGLDPGKQ IKLDSSAQFG YYFRVTCKEE KVLRNNKNFS 540

TVDIQKNGVK FTNSKLTSLN EEYTKNKTEY EEAQDAIVKE IVNISSGYVE PMQTLNDVLA 600

QLDAVVSFAH VSNGAPVPYV RPAILEKGQG RIILKASRHA CVEVQDEIAF IPNDVYFEKD 660

KQMFHIITGP NMGGKSTYIR QTGVIVLMAQ IGCFVPCESA EVSIVDCILA RVGAGDSQLK 720

GVSTFMAEML ETASILRSAT KDSLIIIDEL GRGTSTYDGF GLAWAISEYI ATKIGAFCMF 780

ATHFHELTAL ANQIPTVNNL HVTALTTEET LTMLYQVKKG VCDQSFGIHV AELANFPKHV 840

IECAKQKALE LEEFQYIGES QGYDIMEPAA KKCYLEREQG EKIIQEFLSK VKQMPFTEMS 900

EENITIKLKQ LKAEVIAKNN SFVNEIISRI KVTT 934

<211> 265

<212> PRT

<213> 人

<221> NPM1基因编码的蛋白

<400> 7

MEDSMDMDMS PLRPQNYLFG CELKADKDYH FKVDNDENEH QLSLRTVSLG AGAKDELHIV 60

EAEAMNYEGS PIKVTLATLK MSVQPTVSLG GFEITPPVVL RLKCGSGPVH ISGQHLVAVE 120

EDAESEDEEE EDVKLLSISG KRSAPGGGSK VPQKKVKLAA DEDDDDDDEE DDDEDDDDDD 180

FDDEEAEEKA PVKKGQESFK KQEKTPKTPK GPSSVEDIKA KMQASIEKGG SLPKVEAKFI 240

NYVKNCFRMT DQEAIQDLWQ WRKSL 265

<211> 391

<212> PRT

<213> 人

<221> PAX5基因编码的蛋白

<400> 8

MDLEKNYPTP RTSRTGHGGV NQLGGVFVNG RPLPDVVRQR IVELAHQGVR PCDISRQLRV 60

SHGCVSKILG RYYETGSIKP GVIGGSKPKV ATPKVVEKIA EYKRQNPTMF AWEIRDRLLA 120

ERVCDNDTVP SVSSINRIIR TKVQQPPNQP VPASSHSIVS TGSVTQVSSV STDSAGSSYS 180

ISGILGITSP SADTNKRKRD EGIQESPVPN GHSLPGRDFL RKQMRGDLFT QQQLEVLDRV 240

FERQHYSDIF TTTEPIKPEQ TTEYSAMASL AGGLDDMKAN LASPTPADIG SSVPGPQSYP 300

IVTGRDLAST TLPGYPPHVP PAGQGSYSAP TLTGMVPGSE FSGSPYSHPQ YSSYNDSWRF 360

PNPGLLGSPY YYSAAARGAA PPAAATAYDR H 391

<211> 1037

<212> PRT

<213> 人

<221> GNAS基因编码的蛋白

<400> 9

MGVRNCLYGN NMSGQRDIPP EIGEQPEQPP LEAPGAAAPG AGPSPAEEME TEPPHNEPIP 60

VENDGEACGP PEVSRPNFQV LNPAFREAGA HGSYSPPPEE AMPFEAEQPS LGGFWPTLEQ 120

PGFPSGVHAG LEAFGPALME PGAFSGARPG LGGYSPPPEE AMPFEFDQPA QRGCSQLLLQ 180

VPDLAPGGPG AAGVPGAPPE EPQALRPAKA GSRGGYSPPP EETMPFELDG EGFGDDSPPP 240

GLSRVIAQVD GSSQFAAVAA SSAVRLTPAA NAPPLWVPGA IGSPSQEAVR PPSNFTGSSP 300

WMEISGPPFE IGSAPAGVDD TPVNMDSPPI ALDGPPIKVS GAPDKRERAE RPPVEEEAAE 360

MEGAADAAEG GKVPSPGYGS PAAGAASADT AARAAPAAPA DPDSGATPED PDSGTAPADP 420

DSGAFAADPD SGAAPAAPAD PDSGAAPDAP ADPDSGAAPD APADPDAGAA PEAPAAPAAA 480

ETRAAHVAPA APDAGAPTAP AASATRAAQV RRAASAAPAS GARRKIHLRP PSPEIQAADP 540

PTPRPTRASA WRGKSESSRG RRVYYDEGVA SSDDDSSGDE SDDGTSGCLR WFQHRRNRRR 600

RKPQRNLLRN FLVQAFGGCF GRSESPQPKA SRSLKVKKVP LAEKRRQMRK EALEKRAQKR 660

AEKKRSKLID KQLQDEKMGY MCTHRLLLLG AGESGKSTIV KQMRILHVNG FNGEGGEEDP 720

QAARSNSDGE KATKVQDIKN NLKEAIETIV AAMSNLVPPV ELANPENQFR VDYILSVMNV 780

PDFDFPPEFY EHAKALWEDE GVRACYERSN EYQLIDCAQY FLDKIDVIKQ ADYVPSDQDL 840

LRCRVLTSGI FETKFQVDKV NFHMFDVGGQ RDERRKWIQC FNDVTAIIFV VASSSYNMVI 900

REDNQTNRLQ EALNLFKSIW NNRWLRTISV ILFLNKQDLL AEKVLAGKSK IEDYFPEFAR 960

YTTPEDATPE PGEDPRVTRA KYFIRDEFLR ISTASGDGRH YCYPHFTCAV DTENIRRVFN 1020

DCRDIIQRMH LRQYELL 1037

<211> 137

<212> PRT

<213> 人

<221> Survivin基因编码的蛋白

<400> 10

MGAPTLPPAW QPFLKDHRIS TFKNWPFLEG CACTPERMAE AGFIHCPTEN EPDLAQCFFC 60

FKELEGWEPD DDPMQRKPTI RRKNLRKLRR KCAVPSSSWL PWIEASGRSC LVPEWLHHFQ 120

GLFPGATSLP VGPLAMS 137

<211> 393

<212> PRT

<213> 人

<221> p53基因编码的蛋白

<400> 11

MEEPQSDPSV EPPLSQETFS DLWKLLPENN VLSPLPSQAM DDLMLSPDDI EQWFTEDPGP 60

DEAPRMPEAA PPVAPAPAAP TPAAPAPAPS WPLSSSVPSQ KTYQGSYGFR LGFLHSGTAK 120

SVTCTYSPAL NKMFCQLAKT CPVQLWVDST PPPGTRVRAM AIYKQSQHMT EVVRRCPHHE 180

RCSDSDGLAP PQHLIRVEGN LRVEYLDDRN TFRHSVVVPY EPPEVGSDCT TIHYNYMCNS 240

SCMGGMNRRP ILTIITLEDS SGNLLGRNSF EVRVCACPGR DRRTEEENLR KKGEPHHELP 300

PGSTKRALPN NTSSSPQPKK KPLDGEYFTL QIRGRERFEM FRELNEALEL KDAQAGKEPG 360

GSRAHSSHLK SKKGQSTSRH KKLMFKTEGP DSD 393

Claims

1.一种用于肝癌早期筛查和诊断的联合检测血清标志物，其特征在于：所述联合检测血清标志物包括PTEN、PTCH1、IDH1、SRSF2、MSH2和NPM1基因编码的蛋白；

所述PTEN基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；

所述PTCH1基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；

所述IDH1基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；

所述SRSF2基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列；

所述MSH2基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列；

所述NPM1基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的用于肝癌早期筛查和诊断的联合检测血清标志物，其特征在于：所述联合检测血清标志物由PTEN、PTCH1、IDH1、SRSF2、MSH2和NPM1共6种基因编码的蛋白组成。

3.一种用于肝癌早期筛查和诊断的试剂盒，其特征在于：包含如权利要求1-2中任一项所述的用于肝癌早期筛查和诊断的联合检测血清标志物。

4.根据权利要求3所述的用于肝癌早期筛查和诊断的试剂盒，其特征在于：所述联合检测血清标志物包被于固相载体上。

5.根据权利要求4所述的用于肝癌早期筛查和诊断的试剂盒，其特征在于：所述固相载体的材质为聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺、纤维素中的任意一种。

6.根据权利要求3-5中任一项所述的用于肝癌早期筛查和诊断的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括阳性对照血清、阴性对照血清、封闭液、样本稀释液、第二抗体、第二抗体稀释液、洗涤液、显色液、终止液中的任意一种或几种的组合。

7.一种使用如权利要求1-2中任一项所述的用于肝癌早期筛查和诊断的联合检测血清标志物的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)对上述联合检测血清标志物进行包被，封闭后清洗；

3)显色系统显色后终止反应，测定吸光度值；

4)以OD₄₅₀-OD₆₂₀为相对OD值，然后扣去空白对照，将各个指标的吸光度值代入以下公式，计算预测概率P值大小；

当P值≥0.5时，初步判定为疑似肝癌样品；

当P值＜0.5时，初步判定为正常样品。