CN113945713A - 用于多种肿瘤标志物联合检测的生物芯片及其制备与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于多重肿瘤标志物检测的新型生物芯片及其制备与应用。所述肿瘤标志物包括但不限于：AFP、AFP‑L3、GPC3、GP73和OPN等。所述生物芯片以混合巯基化合物和N,N‑碳酰二咪唑修饰的金箔芯片为固相载体，表面点阵固定有抗多重标志物的多克隆捕获抗体探针，通过加入抗标志物的特异性单克隆检测抗体，以实现待测样本中标志物的联合检测。本发明的生物芯片可以准确地检测出待测样本标志物如肝癌标志物，具有高通量、高灵敏度、高选择性、高稳定性和高特异性等优点，适用于大规模的人群筛查和临床患者辅助诊断，尤其适用于肝癌高发地区。

Description

用于多种肿瘤标志物联合检测的生物芯片及其制备与应用
技术领域
本发明属于生物医学技术检测领域，涉及用于多种肿瘤标志物联合检测的生物芯片及其制备与应用，具体涉及一种用于肝癌血清标志物联合检测的蛋白芯片及其制备与应用，特别涉及一种16-巯基十六碳酸(16-MHDA)、6-巯基己酸(6-MHA)和N,N-碳酰二咪唑(CDI)修饰的肝细胞癌(HCC)患者血清五种肝癌标志物检测用蛋白芯片及其制备与应用。
背景技术
蛋白质作为生命的基础物质，是生命活动的主要承担者，能够最直接地反映细胞和组织的功能状态。因此，临床上多采用组织或体液蛋白质作为机体器官功能变化的检测指标。长期以来，针对肝癌的血清蛋白标志物不断被研究和发现，除传统肝癌标志物甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)外，其它研究也较为广泛，且显现其较高诊断价值的标志物包括甲胎蛋白异质体(lens culinaris-agglutinin-reactive fraction of AFP，AFP-L3)、磷脂酰肌醇3(glypican 3，GPC3)、高尔基蛋白73(golgi protein 73，GP73)和骨桥蛋白(osteopontin，OPN)等。由于受检测平台内在通量的缺陷，目前临床上对肝癌的实验室诊断多使用上述单一肿瘤标志物的检测。然而，单独应用肿瘤标志物对肝癌患者进行临床诊断存在诸多不足，如单一肿瘤标志物检测敏感性和特异性不足，因此，人们开始对多肿瘤标志物联合检测肝癌价值的进行研究评估，且越来越多的证据表明，多种标志物联合检测能显著提高肝癌的诊断效率等。
目前，国内外检测肝癌血清标志物的方法主要包括放射免疫法(RIA)、免疫组织化学法(IHC)、酶联免疫吸附法(ELISA)、质谱法和电泳免疫分析法等。尽管这些方法具有灵敏度好、可靠性高等优点，但缺点也十分明显，如检测试剂盒价格昂贵和加工工艺复杂、仪器操作繁琐、耗时、劳动密集、具有放射性污染等，更重要的是，这些方法不适用于大规模样本对多种不同蛋白质标志物的同时检测。
生物芯片法对患者血清样本体积的需求量极少，配合能够实施大规模筛查且经济高效的同步检测高通量平台，微量稀释血样就能够实现多种血清标志物的同时检测，这对于一些特殊人群(例如仅能提供稀少样本的凝血功能障碍患者)具有重大意义。而且，与组织活检相比，生物芯片法采用的液体活检具有相当大的优势，如易于操作，避免切取肿瘤组织样本存在的组织异质性问题。但是，目前的生物芯片仍存在成本高、灵敏度低、准确度低等缺陷。
N,N-碳酰二咪唑(CDI)在有机合成中主要被用作甲酰基转移试剂和羧酸的活化试剂。由于CDI反应活性高、廉价、反应后处理简单，因此，与同类试剂二环己基碳二亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐相比，CDI更具有潜在的应用价值。CDI已被应用在纤维素结合胺类，含有羟基磁性氧化铁纳米颗粒上固定化卵清蛋白和亲水性胰蛋白酶固定化微反应器等领域中。目前为止，CDI还未曾发现被应用到金箔芯片的表面化学修饰上。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于多种标志物联合检测的生物芯片及其制备与应用，尤其提供一种适用于普通人群筛查及肝癌患者血清检测的五种肝癌标志物水平的组合蛋白芯片及其制备和使用。本发明提供的生物芯片，通过自组装方式获得，采用不同链长的巯基酸(16-MHDA和6-MHA)和CDI三种自组装分子附着在金箔表面，获得单层覆盖的自组装单层，由于CDI反应活性高，与不同链长的巯基酸(16-MHDA和6-MHA)共同提供更好的表面覆盖。不同链长的巯基酸可以为生物分子有效固定提供最佳位点，有效减小结合物(如蛋白和巯基酸)由于空间位阻而发生的构象变化，可以提供更高更有效的分子反应速率。CDI作为零长度的修饰偶联剂，不在巯基酸和蛋白质之间产生额外的结构，能使偶联反应更加直接有效，是十分有价值的偶联试剂。此外，CDI廉价、反应后处理简单，与同类试剂如二环己基碳二亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐相比，CDI更具有潜在的应用价值。通过本发明独特修饰方法获得的生物芯片具有广泛应用前景。
本发明一方面是提供一种组合物，所述组合物包括16-MHDA、6-MHA、CDI，其摩尔比为(0.2-1.8):(6-14):(2-10)；优选地为，(0.5-1.2):(8-12):(4-8)；进一步优选地，为1:10:6。
在一具体实施方式中，所述组合物包括0.01mol/L的混合巯基酸溶液和1.0mg/mLCDI的丙酮溶液；其中，混合巯基酸溶液中，16-MHDA、6-MHA的摩尔比为(0.2-1.8):(6-14)；优选地，为(0.5-1.2):(8-12)；进一步优选地，为1:10。
本发明另一方面提供如上所述的组合物在修饰基片制备固相载体中的应用。
本发明另一方面提供一种共修饰的固相载体，所述固相载体包含16-MHDA、6-MHA和CDI修饰。
本发明另一方面提供一种共修饰的固相载体的制备方法，所述固相载体以金箔芯片为基底，通过包含16-MHDA、6-MHA和CDI的如上所述组合物进行表面修饰，制备而成。
在一具体实施方式中，所述方法具体以混合巯基酸溶液先修饰芯片，然后以CDI的丙酮溶液为修饰液进行修饰。在一具体实施方式中，所述方法具体以浓度为0.01mol/L的混合巯基酸溶液和1.0mg/mL CDI的丙酮溶液为修饰液，其中，混合巯基酸溶液中，16-MHDA/6-MHA的摩尔比为(0.2-1.8):(6-14)。在一具体实施方式中，所述方法具体以浓度为0.01mol/L的混合巯基酸溶液和1.0mg/mL CDI的丙酮溶液为修饰液，其中，混合巯基酸溶液中，16-MHDA/6-MHA的摩尔比为(0.5-1.2):(8-12)。在一具体实施方式中，所述方法具体以浓度为0.01mol/L的混合巯基酸溶液和1.0mg/mL CDI的丙酮溶液为修饰液，其中，混合巯基酸溶液中，16-MHDA/6-MHA的摩尔比为1:10。在一具体实施方式中，所述方法具体以浓度为0.01mol/L的混合巯基酸溶液和1.0mg/mL CDI的丙酮溶液为修饰液，先将混合巯基酸溶液加到芯片上，孵育一段时间，清洗干净，然后再加入CDI，其中，混合巯基酸溶液中，16-MHDA/6-MHA的摩尔比为1:10；所述孵育的时间可以是10-48小时，例如10-12、12-14、14-16、16-18、18-20、22-24、26-28、30-32、34-36、36-38、38-40、40-42、42-44、44-46、46-48小时。
本发明中，在修饰前还包括对金箔芯片进行清洗、干燥的步骤，所述清洗、干燥的方法为：将NH3、H2O2及H2O按体积比1：1：5混合构成TL1清洗液，将金箔芯片浸入盛有TLI清洗液的不锈钢清洗盒内，82℃水浴6分钟，取出之后用超纯水冲洗，再用无水乙醇清洗、氮气吹干。
本发明另一方面提供如上所述的共修饰的固相载体或由所述方法制备得到的共修饰的固相载体在制备体外诊断产品中的应用。
本发明另一方面提供一种体外诊断产品，所述体外诊断产品包含如上所述的共修饰的固相载体或由所述方法制备得到的共修饰的固相载体。所述体外诊断产品为生物芯片或检测试剂盒、或蛋白质阵列；当所述体外诊断产品为生物芯片时，所述生物芯片还包括在所述固相载体表面点阵固定的待测标志物的捕获抗体探针。本发明中，所述体外诊断产品为肝癌标志物诊断产品，所述肝癌标志物包括AFP、AFP-L3、GPC3、GP73、OPN中的一种或几种。
本方法所述体外诊断产品中，所述生物芯片还包括在如上所述的固相载体表面点阵固定待测标志物的捕获抗体探针。
本发明还提供如上所述的体外诊断产品在制备用于待测标志物检测的产品中的应用。
本发明另一方面提供一种用于肝细胞肝癌患者血清五种肿瘤标志物联合检测的试剂盒，所述试剂盒内包含有如上所述的生物芯片。
本发明中，所述待测标志物包括但不限于是肿瘤标志物，包括AFP、AFP-L3、GPC3、GP73、OPN中的一种或几种。
本发明另一方面提供一种所述生物芯片(包括蛋白芯片)的使用方法，包括如下步骤：
步骤1、样本稀释
利用PBST-BSA溶液对待测样本进行稀释；
步骤2、检测抗体的孵育
将步骤1经稀释后的样本点样于如上所述的生物芯片和空白对照的孔中，然后置于湿盒内，室温下，孵育2h，用PBST缓冲液清洗，并在氮气流下吹干；向各孔中滴加检测抗体，室温下，孵育2h，PBST缓冲液漂洗，氮气流下吹干；
其中，所述PBST缓冲液是由浓度0.01mol/L、pH＝7.4的PBS缓冲液与Tween20混合配制而成的，在所述PBST缓冲液中Tween20的体积浓度为0.1％；
步骤3、显色抗体的孵育与显色
向经过上述步骤2处理后的孔中滴加Cy3标记的IgG显色抗体液，然后置于湿盒内，室温下孵育2h，用PBST缓冲液清洗，在氮气流下吹干，采用荧光芯片扫描仪进行检测。
与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
1.本发明以金箔芯片作为基底，以16-MHDA、6-MHA和CDI为修饰液，制备新型化学修饰的固相载体。与传统玻璃片和硅片相比，金箔与化学物质的结合更加牢固，多克隆抗体探针不易洗脱、芯片几何图片佳、敏感性高，且惰性金箔的生物亲和度较低，不易与基因或者蛋白质等物质产生非特异性吸附。
2.16-MHDA、6-MHA和CDI修饰是一种新型分子自组装单层化学修饰方法，未见其应用于金箔芯片的报道。该修饰在金箔固相载体表面使用长短不同的两种巯基试剂进行化学修饰，与生物靶分子结合分层排布，并使用CDI替代N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)活化两种巯基试剂(巯基酸溶液)，利用16-MHDA和6-MHA末端的羧基与蛋白质的游离氨基在CDI的活化介导下形成十分稳定的酰胺键，操作简单、结合稳定。可以更有效地吸附包被抗体在芯片的表面，并且使抗体的稳定性增加，有效控制分子结合的空间位阻效应，提高检测灵敏度。
3.本发明在试验条件一致的条件下能够同时检测多种标志物，检测样本来源广泛，包括但不限于血清。检测的标志物种类不限，优选五种肝癌标志物AFP、AFP-L3、GPC3、GP73、OPN的联合检测，通过该检测可有效用于肝癌的诊断和治疗评估等。
4.本发明可以使用多阵列芯片模式(如2*96(8行12列)孔芯片模式)，可以同时检测多个样品(对同一样品进行多个重复检测，或对同一对象不同时间点获取的样品进行检测，或对多个不同来源的样品进行检测，以获得动态值)，实现高通量检测，整体上降低检测成本和提高检测效率，操作简便，样本用量小，互不交叉污染。
5.在芯片的制备工艺上，控制温度为室温，且环境干燥，这样修饰得到的固相载体在进一步用于芯片制备时，制备的生物芯片可以改善点样的形态，使抗体在固相载体上的分布更加均匀。同时，室温过夜孵育有利于抗体更有效地固定在玻片上。除此以外，丙酮清洗、氮气吹干的方式进行进一步后处理。实验表明，用这种方法所制备固相载体在进一步用于芯片制备时，使得抗体更有效地固定在芯片表面，并有效地增加芯片的稳定性。
6.本发明将相关指标高度集成，制备方法操作简便，成本低，制备得到的产品准确度高，稳定性好，特异性强，保存期长，灵敏度高，可重复性好，应用过程标本用量少，可高通量检测，既提高了劳动效率，使癌症患者在临床症状出现前从普查中便能诊断并接受治疗，能在普通实验室推广和规模化等优点，适用于大规模的人群筛查和临床患者辅助诊断，尤其是肝癌高发地区。
附图说明
图1为蛋白质金箔芯片点样布阵示意图。
图2为蛋白芯片的免疫学表征。a为通过芯片扫描仪的扫描照片；b为以人IgG梯度浓度为横坐标，所得荧光强度平均值为纵坐标绘制的荧光强度曲线图。
图3为五种肝癌标志物在37℃、25℃和4℃温度条件下的荧光强度检测；a为37℃温度条件，b为25℃温度条件，c为4℃温度条件。
图4为不同浓度捕获抗体和检测抗体的荧光强度随抗体浓度变化曲线。
图5为血清最佳稀释度优化；左图为荧光检测图(上4排为AFP阳性混合血清检测结果；下四排为AFP阴性混合血清检测结果)；右图为荧光密度比(阳性血清荧光值/阴性血清荧光比值)折线图(纵坐标从下至上依次为0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4))。
图6为五种肝癌标志物免疫阻断实验荧光扫描图和荧光数据直方图；上图中每组从左至右依次分别代表1、2、3、4、5、6号管，每组两个平行重复。
图7为AFP、AFP-L3、GPC3、GP73和OPN五种肝癌标志物在蛋白芯片上的检测限；其中，上图为芯片扫描仪扫描照片，a为AFP，b为AFP-L3，c为GPC3，d为GP73，e为OPN，每组设两个平行重复，从左至右依次为12级浓度的肿瘤标志物蛋白，即0.0019、0.0039、0.0078、0.0156、0.0313、0.0625、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0；下图为统计结果。
图8为血清标本在单侧芯片上的检测分布和荧光信号；左图为人肝细胞癌血清检测扫描图，右图为人正常血清检测扫描图。
图9为AFP、AFP-L3、GPC3、GP73和OPN五种肝癌标志物在肝癌组和对照组中的检测荧光值水平。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的实施例作详细说明，下述实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
本发明首先提供了N,N-碳酰二咪唑(CDI)在修饰基片制备固相载体中的应用，所述固相载体可以是适用于生物芯片的固相载体。所述基片可以是金箔、玻璃片基、高分子聚合物片基、NC膜。作为优选，本发明所述基片为金箔。
在一具体实施方式中，本发明提供一种组合物，所述组合物包括16-MHDA、6-MHA、CDI，其摩尔比为(0.2-1.8):(6-14):(2-10)；优选地为，(0.5-1.2):(8-12):(4-8)；进一步优选地，为1:10:6。
本发明中，所述组合物还可以配制成独立包装的两大组分，即混合巯基酸溶液和CDI的丙酮溶液(修饰液)；其中混合巯基酸溶液中，16-MHDA、6-MHA的摩尔比为(0.2-1.8):(6-14)；优选地，为(0.5-1.2):(8-12)；进一步优选地，为1:10，其中，16-MHDA和6-MHA的总摩尔浓度0.005～0.02mol/L；优选地，为0.01mol/L；CDI的丙酮溶液中CDI浓度为0.5-2mg/mL，优选地为1.0mg/mL。
本发明还提供了如上所述的组合物在修饰基片制备固相载体或制备体外诊断产品中的应用。
本发明还提供了一种共修饰的固相载体，其特征在于，所述固相载体包含16-MHDA、6-MHA和CDI修饰；所述共修饰的固相载体适用于生物芯片制备。
本发明还提供了所述共修饰的固相载体的制备方法，所述固相载体以金箔芯片为基底，通过16-MHDA、6-MHA和CDI进行表面修饰，制备而成。
在一具体实施方式中，所述共修饰的固相载体的制备是指：以混合巯基酸溶液先修饰芯片，然后以CDI的丙酮溶液为修饰液进行修饰。在一具体实施方式中，所述方法具体以浓度为0.01mol/L的混合巯基酸溶液和1.0mg/mL CDI的丙酮溶液为修饰液，其中，混合巯基酸溶液中，16-MHDA/6-MHA的摩尔比为(0.2-1.8):(6-14)。在一具体实施方式中，所述方法具体以浓度为0.01mol/L的混合巯基酸溶液和1.0mg/mL CDI的丙酮溶液为修饰液，其中，混合巯基酸溶液中，16-MHDA/6-MHA的摩尔比为(0.5-1.2):(8-12)。在一具体实施方式中，所述方法具体以浓度为0.01mol/L的混合巯基酸溶液和1.0mg/mL CDI的丙酮溶液为修饰液，其中，混合巯基酸溶液中，16-MHDA/6-MHA的摩尔比为1:10。在一具体实施方式中，所述方法具体以浓度为0.01mol/L的混合巯基酸溶液和1.0mg/mL CDI的丙酮溶液为修饰液，先将混合巯基酸溶液加到芯片上，孵育一段时间，清洗干净，然后再加入CDI，其中，混合巯基酸溶液中，16-MHDA/6-MHA的摩尔比为1:10；所述孵育的时间可以是10-48小时，例如10-12、12-14、14-16、16-18、18-20、22-24、26-28、30-32、34-36、36-38、38-40、40-42、42-44、44-46、46-48小时。在一具体实施方式中，所述共修饰的固相载体的制备具体是指：以浓度为0.01mol/L的混合巯基酸溶液和1.0mg/mL CDI的丙酮溶液为修饰液，进行表面修饰制备而成；其中，所述混合巯基酸溶液中，16-MHDA/6-MHA的摩尔比为1:10；金箔芯片浸入上述混合巯基酸溶液，然后，置于干燥的孵育盒中，室温下，孵育24小时。取出后用乙醇清洗、氮气吹干；随后再浸入CDI丙酮溶液内，置于干燥的孵育盒中，室温下，孵育12小时，取出后用丙酮清洗、氮气吹干，阴凉、干燥，得到所述共修饰的固相载体。
本发明共修饰的固相载体的制备中，在修饰之前还包括对金箔芯片进行清洗、吹干的步骤，其中，进行清洗、吹干的方法为：将NH3、H2O2及H2O按体积比1：1：5混合构成TL1清洗液，将金箔芯片浸入盛有TLI清洗液的不锈钢清洗盒内，82℃水浴6分钟，取出之后用超纯水冲洗，再用无水乙醇清洗、氮气吹干。
本发明还提供了所述固相载体在制备体外诊断产品中的应用，所述体外诊断产品为生物芯片或检测试剂盒、或蛋白质阵列。
在一具体实施方式中，本发明还提供了所述固相载体在制备生物芯片中的应用。所述生物芯片选自蛋白芯片、DNA芯片；优选蛋白芯片。所述蛋白芯片可用于蛋白质表达谱分析，研究蛋白质与蛋白质的相互作用，甚至DNA－蛋白质、RNA－蛋白质的相互作用，筛选药物作用的蛋白靶点等。
本发明还提供了一种体外诊断产品，所述体外诊断产品包含如上所述的共修饰的固相载体或由如上所述方法制备得到的固相载体。
进一步地，所述体外诊断产品为生物芯片或检测试剂盒、或蛋白质阵列。
进一步地，所述体外诊断产品为肝癌标志物诊断产品，所述肝癌标志物包括AFP、AFP-L3、GPC3、GP73、OPN中的一种或几种。
本发明中，当所述体外诊断产品为生物芯片时，所述生物芯片包含如上所述的固相载体。
进一步地，本发明所述的生物芯片还包括在固相载体表面点阵固定的待测标志物的捕获抗体探针。所述捕获抗体探针通过全自动点样仪完成点样操作，固定在载体上。
进一步地，本发明所述的生物芯片还包括在固相载体表面点阵固定的待测标志物的捕获抗体探针。每种捕获抗体分别抗一种标志物。所述待测标志物点阵于固相载体的微孔中，所述微孔设置为圆形、星形、三角形、圆角矩形、椭圆形、矩形中的一种或几种。相邻两微孔的间距为1-5倍微孔的最大直径。
进一步地，采用所述生物芯片时，通过检测试剂检测待测标志物，每一种检测试剂对应一种标志物。当待检标志物为蛋白时，检测试剂为抗体，且每一种检测抗体分别抗一种相应的标志物且对应于相应的捕获抗体，并与捕获抗体分别结合于该蛋白标志物的不同抗原表位，对待测标志物进行联合定性或定量测定。
作为本发明更进一步地改进，所述生物芯片为长方体结构，其上表面上设置有16个点样模块，所述的点样模块上设置有5～8行、6～8列圆形的点样点凹槽，所述的标志物抗体固定于上述点样点凹槽内。
所述生物芯片中，所述待测标志物可以是酶、抗原、抗体、多肽、基因、受体、配体、细胞因子(所述基因包括单双链DNA和RNA)等；所述待测标志物可以是肿瘤标志物。所述待测标志物可以来源于血清、血浆、淋巴、间质液、尿液、渗出液、细胞溶解液、分泌液、组织提取物等。对应地，所述生物芯片为蛋白芯片或基因芯片，优选蛋白芯片或蛋白联合检测芯片。
在一具体实施方式中，所述生物芯片上包含待测标志物的捕获抗体，所述待测标志物至少包括：五种肿瘤标志物为甲胎蛋白(AFP)、甲胎蛋白异质体(lens culinaris-agglutinin-reactive fraction of AFP，AFP-L3)、磷脂酰肌醇3(glypican 3，GPC3)、高尔基蛋白73(golgi protein 73，GP73)和骨桥蛋白(osteopontin，OPN)中的一种。相应地，所述捕获抗体探针为特异性多克隆捕获抗体探针抗AFP多克隆捕获抗体探针、LCA凝集素、抗AFP-L3多克隆捕获抗体探针、抗GPC3多克隆捕获抗体探针、抗GP73多克隆捕获抗体探针、抗OPN多克隆捕获抗体探针，具体可选自兔抗人AFP IgG多克隆捕获抗体、LCA凝集素、兔抗人GPC3IgG多克隆捕获抗体、兔抗GP73IgG多克隆捕获抗体、羊抗人OPN IgG多克隆捕获抗体。
作为本发明更进一步地改进，所述生物芯片还可以包含选自下组中的一个或多个标志物的捕获抗体探针：癌胚抗原(CEA)，癌抗原CA125，癌抗原CA19-9，癌抗原CA153，前列腺特异性抗原fPSA和tPSA，神经原特异性烯醇化酶(NSE)，降钙素(PCT)，铁结合蛋白(Ferritin)、β2－微球蛋白(beta2-Microglobin)、β人绒毛膜促性腺激素(HCGb)、胃蛋白酶原(Pepsinogen1和2)、甲状腺球蛋白(Thyroglobulin)、催乳素(Prolactin)和人附睾分泌蛋白4(HE4)，CA242，IL-1beta，IL-6，CA72-4，IL-11，IL-8，IL-18，PGI，PGII，MCP1，MCP3，MCP4，CK19，VEGF，NGAL，RANTES，MMP1，MMP7，MMP9，TIMP-1，IGFBP2，TNF-alpha，GMCSF，VDBP，TTR，AEG-1，ADAM10，ADAM17，Nardilysin，ProApoA1，ApoA1，HCG beta，CA50。
所述生物芯片可以设置多个检测亚区，每个检测亚区用于检测一份样本。所述检测亚区之间设置有凸起作为物理隔断。
在一具体实施方式中，本发明提供的生物芯片为适于肝癌多种标志物检测的蛋白芯片，其特点在于：所述蛋白芯片是在上述固相载体表面使用长短不同的两种巯基试剂进行化学修饰，并使用CDI活化巯基试剂，有效分层偶联生物靶分子，提高检测敏感度。
在一具体实施方式中，本发明所述蛋白芯片的固相载体为16-巯基十六碳酸(16-MHDA)、6-巯基己酸(6-MHA)和N,N-碳酰二咪唑(CDI)修饰的金箔芯片，用于共价结合特异性多克隆捕获抗体为探针；所述蛋白芯片是在固相载体表面点阵固定有五种肝细胞肝癌标志物特异性多克隆捕获抗体探针，通过加入抗五种肝细胞肝癌标志物特异性单克隆捕获抗体及荧光标记抗抗体，实现人血清中五种肝细胞肝癌标志物的联合检测。所述五种特异性多克隆捕获抗体探针分别为兔抗人AFP IgG多克隆捕获抗体、兔抗GP73IgG多克隆捕获抗体、兔抗人GPC3IgG多克隆捕获抗体、羊抗人OPN IgG多克隆捕获抗体和LCA凝集素(抗甲胎蛋白异质体AFP-L3多克隆抗体)。
在一具体实施方式中，本发明提供如上所述的固相载体或所述的生物芯片(包含蛋白芯片)在用于待测标志物检测中的应用。所述固相载体为16-MHDA、6-MHA和CDI化学修饰的金箔芯片，以固定特异性多克隆捕获抗体探针；所述待测标志物为肿瘤标志物，包括AFP、AFP-L3、GPC3、GP73、OPN中的一种或几种。
在一具体实施方式中，本发明提供一种生物芯片(包含蛋白芯片)的制备方法，包括如下步骤：
(1)对金箔芯片进行表面化学修饰，获得固相载体
配制修饰液：以浓度为0.01mol/L的混合巯基酸溶液(16-MHDA/6-MHA＝1:10)、1.0mg/mL CDI的丙酮溶液为修饰液；
对金箔芯片进行清洗：对金箔芯片进行清洗后，氮气吹干；具体的，清洗的方法为：将NH3、H2O2及H2O按体积比1：1：5混合配制成TL1清洗液，将金箔芯片浸入盛有TL1清洗液的不锈钢清洗盒内，82℃水浴6分钟，取出之后用超纯水冲洗，再用无水乙醇清洗。
分子自组装单层芯片制备：干燥后的金箔芯片浸入所述混合巯基酸溶液，置于干燥的孵育盒中，室温下，孵育24小时。取出后用乙醇清洗、氮气吹干，得到分子自组装单层芯片；
分子自组装单层芯片修饰：随后再浸入CDI的丙酮溶液，置于干燥的孵育盒中，室温下，孵育12小时，取出后用丙酮和PBST缓冲液清洗、氮气吹干，得到修饰后的分子自组装单层芯片，于阴凉、干燥处备用。
(2)固定抗五种肝癌标志物多克隆捕获抗体作为探针
(2.1)PBST缓冲液配制：由1000mL浓度0.01mol/L、pH＝7.4的PBS缓冲液与1mLTween20混合配制而成。
PBST-BSA缓冲液配制：1.0g BSA和1.0mL Tween 20溶于1000mL浓度为0.01M、pH＝7.4的PBS缓冲液中，置于水平摇床，摇晃混匀，获得0.01mol/L PBST-BSA缓冲液(pH＝7.4)。
(2.2)多克隆捕获抗体溶液配制：然后将抗五种肝癌标志物多克隆捕获抗体分别溶于所述PBST-BSA缓冲液中，并使各多克隆捕获抗体的终浓度为50μg/mL，获得相应的多克隆捕获抗体溶液；
其中，肿瘤标志物为AFP、AFP-L3、GPC3、GP73、OPN。
(2.3)蛋白芯片制备：将各多克隆捕获抗体溶液点样于步骤(1)获得的固相载体上，在第1～5孔中分别点样一种多克隆捕获抗体溶液，并在第6孔点样PBST-BSA溶液作为空白对照，每孔加样1μL，然后置于湿盒中，室温下，孵育2小时。取出后用PBST缓冲液清洗、氮气吹干，即获得用于肝细胞肝癌患者血清五种肿瘤标志物联合检测的蛋白芯片。
本发明还提出了所述蛋白芯片的使用方法，包括如下步骤：根据实际情况对待测样本进行稀释，然后将样本点样于含上述蛋白芯片中，置于湿盒内，于一定温度下孵育，滴加显色抗体液，置于湿盒内，于一定温度下孵育，显色，并进行检测。
其中，每种标志物和对照可重复多次点样。例如，每种标志物重复3次点样，每种对照重复3次点样。
在一具体实施方式中，本发明提出的所述生物芯片(包含蛋白芯片)的使用方法，包括如下步骤：
步骤a血清稀释
利用上述步骤(2.1)配制的PBST-BSA溶液对患者血清进行10倍稀释，所得稀释血清可直接用于蛋白芯片的点样检测；
步骤b检测抗体的孵育
将经步骤a的稀释血清点样于含上述蛋白芯片(含各种特异性抗体探针，实验组)及作为空白对照的PBST-BSA溶液的孔中，每孔加样1μL。然后置于湿盒内，室温下，孵育2h，然后用PBST缓冲液清洗，并在氮气流下吹干；(按照与待测血清相同的方式，对健康人血清进行稀释与检测，作为阴性对照)。
其中，每种标志物和对照可重复多次点样。例如，每种肿瘤标志物重复3次点样，每种对照标志物重复3次点样，且处于一张基片上。
所述PBST缓冲液是由浓度0.01mol/L、pH＝7.4的PBS缓冲液与Tween20混合配制而成的，在所述PBST缓冲液中Tween20的体积浓度为0.1％。
步骤3、显色抗体的孵育与显色
向经过上述步骤2处理后的实验组和对照组的孔中滴加Cy3标记的IgG显色抗体液(5μg/mL，0.01mol/L PBST-BSA缓冲液，pH 7.4)，每孔加样1μL，然后置于湿盒内，室温下孵育2h，然后用PBST缓冲液清洗，在氮气流下吹干，并推入荧光芯片扫描仪进行检测；
本发明的一种生物芯片，尤其是检测肝癌五种标志物的芯片和方法，用于检测体外样品中相关生物标志物的存在及含量，AFP、AFP-L3、GPC3、GP73、OPN五种因子的表达量在健康个体和患病个体中的差异具有统计学意义，因此样本如血液样本中的AFP、AFP-L3、GPC3、GP73、OPN五种因子可以作为肝癌相关的生物标志物，用于指导临床早期诊断和治疗。
由于本发明利用了CDI修饰基片，进一步是应用了16-MHDA、6-MHA和CDI共修饰基片，得到的固相载体用于生物芯片的制备，进而用于标志物如肝癌五种标志物的检测，制备方法简单、便利、成本低，基于该特别修饰的固相载体的检测方法及试剂盒具有高灵敏度、高特异性、高通量、标本用量少、稳定性好、检测迅速、高准确度等突出优点，能够准确定量检测肝癌生物标志物并区分生物标志物表达的差异性，以期指导临床用于早期筛查诊断，疾病分型，动态观察肿瘤标志物的血清学表达情况，肿瘤不同治疗方法的选择参考，肿瘤治疗疗效的预测评估，健康人群的体检、建立基线资料等。
本发明进一步提出了一种试剂盒，所述试剂盒包含如上所述的固相载体或生物芯片。
作为优选，所述试剂盒还包括样本稀释液、阳性对照，阴性对照，待测标志物标准品、样本稀释液、洗涤液等。
其中，所述样本稀释液可以是一种稳定剂如蛋白稳定剂。
其中，所述阳性对照，阴性对照便于标准化检测。所述阳性对照可以采用不同浓度的双阳性对照，并考虑同时使用两者的不同强度信号来标准化不同的微阵列，可以进一步改善芯片的准确度、敏感度和重复性。
其中，0.01mol/L PBST-BSA缓冲液(pH 7.4)为空白对照。
其中，所述样本处理液，用于裂解细胞沉淀物，包含蛋白酶抑制剂混合物的RIPA缓冲液。
作为优选地，各液体为瓶装，用纸质模版固定于包装盒内，各部分由纸质模版固定于一包装盒内，不限放置方式，检查时配套使用。
在一具体实施方式中，本发明提出的试剂盒是适用于人类血清五种肝细胞肝癌标志物联合检测的试剂盒，其特点在于，所述试剂盒包含上述蛋白芯片，浓度0.01mol/L、pH＝7.4的PBS缓冲液；PBST缓冲液；0.1M碳酸氢钠缓冲液；Cy3显色抗体溶液，肺癌标志物标准品。
其中，所述PBST缓冲液是由1000mL浓度0.01M、pH＝7.4的PBS缓冲液与1mLTween20混合配制而成的，在所述PBST缓冲液中Tween 20的体积浓度为0.1％。
其中，所述Cy3显色抗体溶液是由Cy3标记的驴抗小鼠IgG抗体溶于PBST-BSA缓冲液形成抗体终浓度为5μg/mL所获得。
所述PBST-BSA溶液的制备方法为：1.0g BSA和1.0mL Tween 20溶于1000mL浓度为0.01M、pH＝7.4的PBS缓冲液中，置于水平摇床，摇晃混匀，获得0.01mol/L PBST-BSA缓冲液(pH＝7.4)。
本发明所述的生物芯片或试剂盒通过类似于夹心法ELISA的检测方法，捕获抗体与样品中的目标抗原结合，经过筛选的检测抗体与目标抗原的另一区域结合形成稳定的化合物。用芯片扫描仪对反应结束的芯片进行扫描成像。通过梯度稀释的肿瘤标志物的标准样品的数码信号绘制每种肿瘤标志物的信号与浓度标准曲线，然后通过相应的标准曲线通过比较未知样品和标准样本的信号来确定样品中的目标抗原的浓度，计算出每个肿瘤标志物在未知样品中的浓度。
下述实施例中所用材料和试剂的来源与准备如下：
1、金箔芯片
以来自德国乌尔姆Interactiva公司的金箔芯片为基础平面，该芯片以玻璃片为基底，表面覆盖一层0.1μm厚度的纯金(纯度99.9％)，其上被覆50μm的TEFLON膜阵列(96孔×2，8行×12列)，阵列孔径为1.25mm，每孔溶剂最大可容纳1μL。
2、表面化学修饰
16-MHDA、6-MHA和CDI购自Sigma-Aldrich公司(美国)。
以浓度为0.01mol/L的混合巯基酸溶液(16-MHDA/6-MHA＝1:10(摩尔比))、1.0mg/mL CDI的丙酮溶液为修饰液。
3、抗体类试剂
兔抗人AFP IgG多克隆抗体、小鼠抗人AFP IgG单克隆抗体和抗甲胎蛋白异质体AFP-L3单克隆抗体购自北京义翘神州生物有限公司(中国)。
兔抗人GP73IgG多克隆抗体购自abcam公司(英国)，小鼠抗人GP73IgG单克隆抗体购自美国Thermo Fisher Scientific。
兔抗人GPC3IgG多克隆抗体、小鼠抗人GPC3IgG单克隆抗体购自abcam公司(英国)；
羊抗人OPN IgG多克隆抗体购自R&D Systems(美国)，小鼠抗人OPN IgG单克隆抗体购自abcam公司(英国)。
LCA凝集素(抗甲胎蛋白异质体AFP-L3多克隆抗体)购自美国VectorLaboratories Inc.公司。
人IgG抗体、Cy3标记的驴抗小鼠IgG抗体和Cy3标记的驴抗人IgG抗体购自中国上海生工。
4、缓冲液
PBS粉末、Tween 20及胎牛血清(BSA)粉末均购自Sigma公司。
PBST缓冲液：将商品化PBS粉末溶解在去离子水中，形成浓度0.01mol/L、pH＝7.4的PBS缓冲液；
PBST-BSA溶液：向1000mL浓度为0.01mol/L、pH＝7.4的PBS缓冲液中加入1.0g BSA和1.0mL Tween-20，混匀，获得0.01mol/L PBST-BSA缓冲液(pH＝7.4)，其中Tween 20的体积浓度为0.1％。
5、实验样本(血清样本)稀释
收集临床上96例肝细胞癌患者手术前及96例正常人血清样本，所有血清分装，并储存在-80℃冰箱内，以保持蛋白活性，避免反复冻融。
利用上述PBST-BSA缓冲液对血清样本进行10倍稀释，所得稀释血清可直接用于蛋白芯片的点样检测。
实施例1、分子自组装单层形成和探针固化
对金箔芯片进行清洗：将NH3、H2O2及H2O按体积比1：1：5混合构成TLI清洗液，放置不锈钢清洗盒内。将金箔芯片浸入盛有TL1清洗液的不锈钢清洗盒内，82℃水浴6分钟，取出之后用超纯水冲洗4次，再用无水乙醇浸泡清洗(3min/次×2次)、氮气吹干，干燥后置于干净密闭芯片盒中，保存待用。
分子自组装单层芯片制备：将上述干燥的金箔芯片浸泡在16-MHDA和6-MHA组成的混合巯基酸溶液(0.01mol/L的混合巯基酸溶液(16-MHDA/6-MHA摩尔比＝1:10)，室温下，孵育24小时后取出，并用无水乙醇漂洗，于氮气流下吹干，得到分子自组装单层芯片；
分子自组装单层芯片修饰：将上述分子自组装单层芯片浸泡于孵育盒中作为修饰液的1.0mg/mL CDI的丙酮溶液中，室温下，孵育12小时后取出，并用丙酮和PBST缓冲液先后漂洗，最后在氮气流下缓慢吹干，即完成修饰，获得固相载体芯片置阴凉、干燥，得到修饰后的分子自组装单层芯片，备用。该修饰后芯片可保存数月。
实施例2、芯片的免疫学表征
取实施例1制备的修饰后的分子自组装单层芯片1张，由左至右，依次滴加100μg/mL-0.1μg/mL的11级梯度稀释工作浓度[0.01mol/L PBST-BSA缓冲液(pH＝7.4)]的人IgG溶液(最右侧滴加0.01mol/L PBST-BSA缓冲液作为空白对照；三行是每组三个平行)，室温，摇晃孵育2小时，PBST缓冲液漂洗，氮气流下吹干；向已经包被人IgG的芯片上滴加1μL的Cy3标记驴抗人IgG抗体(5μg/mL)，避光、室温孵育2小时，用PBST缓冲液漂洗，氮气吹干。
通过芯片扫描仪LuxscanTM 10K-A(博奥有限公司，中国)对以上芯片进行扫描检测，其中，扫描参数设定为PMT 90/power650，将激发波长设置为532nm或者635nm；结果显示于图2(a)。图2(b)是以人IgG梯度浓度为横坐标，所得荧光强度平均值为纵坐标绘制的荧光强度曲线图。
实施例3、质控实验
(一)抗体偶联反应温度质控
取3张实施例1制备的修饰后的分子自组装单层芯片，每张芯片上由左至右，分别依次滴加1.0μl(本发明如无特别说明，在芯片上滴加的液体量总是恒定的，均为1.0μl)体积的50μg/mL抗五种肝癌标志物(AFP、AFP-L3、GPC3、GP73和OPN)的多克隆捕获抗体和1.0μl0.01mol/L PBST-BSA缓冲液(pH 7.4)(空白对照)，并将3张芯片分别置于4℃、25℃(室温)和37℃环境温度中均摇晃孵育2小时，随后同时取出3张芯片，分别用PBST缓冲液漂洗，氮气吹干。
每张芯片上均从左至右依次滴加1.0μl 50μg/mL五种肿瘤标志物的重组蛋白，再分别放回4℃、25℃(室温)和37℃环境温度中，孵育2小时后PBST缓冲液漂洗，氮气流下吹干；每张芯片上由左至右依次滴加1.0μl 50μg/mL抗五种肿瘤标志物的单克隆检测抗体，放回4℃、25℃(室温)和37℃环境温度中，摇晃孵育2小时后PBST缓冲液漂洗，氮气流下吹干；最后滴加1.0μl 5.0μg/mL的Cy3标记的驴抗小鼠IgG抗体(显色抗体液)，分别放回4℃、25℃(室温)和37℃环境温度中，均避光摇晃孵育1小时后PBST缓冲液漂洗，氮气流下吹干。
通过芯片扫描仪LuxscanTM 10K-A(博奥有限公司，中国)对以上芯片进行扫描检测，结果显示于图3(每组三个空代表三个平行实验)。结果显示25℃和37℃环境下五种肿瘤标志物检测的荧光强度几乎一致，但25℃环境下检测芯片背景较之37℃环境下芯片具有更整洁，信号强度更加均一，而4℃环境下五种肿瘤标志物的荧光强度明显弱于25℃和37℃环境下的荧光强度。因此，本发明最终设定室温(25℃)为实验的最佳反应温度。
(二)捕获抗体最适工作浓度质控
抗五种肿瘤标志物AFP、AFP-L3、GPC3、GP73和OPN的最适捕获抗体工作浓度。本实施例以AFP捕获抗体工作浓度为例予以说明。
取实施例1制备的修饰后的分子自组装单层芯片1张，由左至右，依次滴加1.0μl100μg/mL-0.1μg/mL的11级工作浓度的抗AFP多克隆捕获抗体和1.0μl 0.01mol/L PBST-BSA缓冲液(pH 7.4)(空白对照，最右侧)，室温，摇晃孵育2小时，PBST缓冲液漂洗，氮气流下吹干。其中，每组三个孔代表三个平行实验。
向所有芯片试验孔中无差别滴加1.0μl 50μg/mL AFP重组蛋白，室温摇晃孵育2小时，PBST缓冲液漂洗，氮气流下吹干；向所有芯片试验孔中无差别滴加1.0μl 50μg/mL抗AFP单克隆检测抗体，室温，摇晃孵育2小时，PBST缓冲液漂洗，氮气流下吹干；向所有芯片试验孔中无差别滴加1μL Cy3标记的驴抗小鼠IgG抗体(显色抗体液)，室温，避光摇晃孵育1小时，PBST缓冲液漂洗，氮气流下吹干。
通过芯片扫描仪LuxscanTM 10K-A(博奥有限公司，中国)对以上芯片进行扫描检测。结果显示于图4；其中，图4的A、B、C、D、E分别为AFP、AFP-L3、GPC3、GP73、OPN五种标志物的检测荧光图，其中每幅图的上方图中，左边为捕获抗体质控的检测荧光图(对应下图Poly折线图)，右边为检测抗体质控的检测荧光图(对应下图Mono折线图)；下方图为对应的荧光值折线图。
结果表明，在重组蛋白、显色抗体和检测抗体浓度不变的条件下，随着捕获抗体浓度的逐次降低，芯片的荧光强度信号呈现线性减弱。综合上述实施例3(一)抗五种肿瘤标志物捕获抗体的工作浓度结果，发现抗五种肿瘤标志物捕获抗体在100μg/mL-12.5μg/mL范围内均具有强度显著的可视化荧光信号。
(三)检测抗体最适工作浓度质控
抗五种肿瘤标志物AFP、AFP-L3、GPC3、GP73和OPN检测抗体的最适工作浓度。本实施例以AFP检测抗体工作浓度为例予以说明。
取实施例1制备的修饰后的分子自组装单层芯片1张，由左至右，依次无差别滴加1.0μl50μg/mL的抗AFP多克隆捕获抗体和1.0μl 0.01mol/L PBST-BSA缓冲液(pH 7.4)(空白对照)，室温，摇晃孵育2小时，PBST缓冲液漂洗，氮气流下吹干。
向所有芯片试验孔中无差别滴加1.0μl 50μg/mL AFP重组蛋白，室温摇晃孵育2小时，PBST缓冲液漂洗，氮气流下吹干；向所有芯片试验孔中滴加1.0μl 100μg/mL-0.1μg/mL的11级工作浓度的AFP单克隆检测抗体，室温，摇晃孵育2小时，PBST缓冲液漂洗，氮气流下吹干；向所有芯片试验孔中无差别滴加1μL Cy3标记的驴抗小鼠IgG抗体(显色抗抗体液)，室温，避光摇晃孵育1小时，PBST缓冲液漂洗，氮气流下吹干。
通过芯片扫描仪LuxscanTM 10K-A(博奥有限公司，中国)对以上芯片进行扫描检测，结果显示于图4。结果表明，在重组蛋白、显色抗体和捕获抗体浓度不变的条件下，随着检测抗体浓度的逐次降低，芯片的荧光强度信号呈现线性减弱。综合上述实施例3(一)抗五种肿瘤标志物检测抗体的工作浓度的结果，发现抗五种肿瘤标志物检测抗体在100μg/mL-12.5μg/mL范围内均具有强度显著的可视化荧光信号。
(四)血清最佳稀释度质控
本发明利用0.01mol/L PBST-BSA缓冲液(pH 7.4)将3例已知AFP阳性血清的混合血清和3例健康人AFP阴性血清的混合血清分别稀释为7级浓度(1:1、1:2、1:4、1:8、1:10、1:20、1:40)，并以0.01mol/L PBST-BSA溶液(pH 7.4)为空白对照。取实施例1制备的修饰后的分子自组装单层芯片2张(图5左图上方四行是第1张芯片测定的AFP阳性血清荧光检测结果，下方四行是第2张芯片测定的AFP阴性血清荧光检测结果)，每张芯片的每个纵列上设置4个芯片复孔，共计4行8列；分别无差别滴加1.0μl 50μg/mL的抗AFP多克隆捕获抗体，室温，摇晃孵育2小时，PBST缓冲液漂洗，氮气流下吹干。
将1.0μl的7级稀释度血清和PBST-BSA溶液(空白对照)依次滴加到对应芯片实验孔中，室温孵育2小时，PBST缓冲液漂洗，氮气流下吹干；向所有芯片试验孔中无差别滴加1.0μl 50μg/mL抗AFP单克隆检测抗体，室温，摇晃孵育2小时，然后用PBST缓冲液漂洗，氮气流下吹干；向所有芯片试验孔中无差别滴加1.0μL Cy3标记的驴抗小鼠IgG抗体(显色抗抗体液)，室温下，避光，摇晃孵育1小时，然后用PBST缓冲液漂洗，氮气流下吹干。
通过芯片扫描仪LuxscanTM 10K-A(博奥有限公司，中国)对以上芯片进行扫描检测，结果显示于图5。左图为荧光检测图；右图为荧光密度比(纵坐标从下至上依次为0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4倍))。“荧光密度比”是指阳性血清测定结果除以同一稀释度的阴性血清的测定结果的比值。结果表明，1:8-1:20的血清稀释度均达到设定标准(荧光密度比值高于3倍)，最终选择1:10为最佳血清稀释度。
(五)标志物免疫阻断实验
五种肿瘤标志物AFP、AFP-L3、GPC3、GP73和OPN免疫学阻断实验。本实施例以AFP检测为例予以说明。
任取3例已知AFP阴性血清进行混合，所得血清进行1:10稀释后置于1号管中(阴性对照)，同样地，任取3例已知AFP阳性的血清进行混匀，所得血清进行1:10稀释后置于2号管中(阳性对照)；取混合阳性血清置于另外4根空白管，编号为3-6，按照1:10的比例进行稀释；3-6号管血清分别使用不同浓度的抗AFP多克隆抗体进行预处理(即预先加入血清等体积的0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml和100μg/ml的抗AFP多克隆抗体进行预处理)，室温，摇晃孵育2小时，使其与血清中存在的AFP充分反应并结合。
取实施例1制备的修饰后的分子自组装单层芯片1张，无差别滴加1.0μl 50μg/ml抗AFP多克隆捕获抗体(0.01mol/L PBST-BSA缓冲液，pH 7.4)，1-6号血清在每个纵列上设置2个芯片复孔，共计2行6列；由左至右，依次将1-6号血清分别加样到芯片表面，室温，摇晃孵育2小时，然后用PBST缓冲液漂洗，氮气流下吹干；向所有芯片试验孔中无差别滴加1.0μl50μg/mL抗AFP单克隆检测抗体，室温，摇晃孵育2小时，然后用PBST缓冲液漂洗，氮气流下吹干；向所有芯片试验孔中无差别滴加1.0μL Cy3标记的驴抗小鼠IgG抗体(显色抗抗体液)，室温避光孵育1小时，然后用0.01mol/L PBST缓冲液漂洗，氮气流下吹干。
通过芯片扫描仪LuxscanTM 10K-A(博奥有限公司，中国)对以上芯片进行扫描检测，结果显示于图6(每组从左至右依次为1、2、3、4、5、6号管)。结果显示，随着用于预处理的AFP、AFP-L3、GPC3、GP73和OPN等相应阻断抗体浓度的提高，上述标志物芯片检测荧光强度逐渐减低，说明五项肿瘤标志物可以被其对应的特异性抗体不同程度地阻断。
(六)蛋白质标志物检测限测定
五种肿瘤标志物AFP、AFP-L3、GPC3、GP73和OPN检测限确定。本实施例以AFP检测为例予以说明。
取实施例1制备的修饰后的分子自组装单层芯片1张，由左至右，依次滴加1.0μl50μg/mL的抗AFP多克隆捕获抗体和0.01mol/L PBST-BSA缓冲液(空白对照)，室温，摇晃孵育2小时，PBST缓冲液漂洗，氮气流下吹干；向所有芯片试验孔中无差别滴加1.0μl 4.0μg/mL-0.0019μg/mL的12级浓度AFP重组蛋白，室温摇晃孵育2小时，PBST缓冲液漂洗，氮气流下吹干；向所有芯片试验孔中无差别滴加1.0μl 50μg/mL的抗AFP单克隆检测抗体，室温，摇晃孵育2小时，PBST缓冲液漂洗，氮气流下吹干；向所有芯片试验孔中无差别滴加1μL Cy3标记的驴抗小鼠IgG显色抗抗体液，室温，摇晃孵育1小时，PBST缓冲液漂洗，氮气流下吹干。
通过芯片扫描仪LuxscanTM 10K-A(博奥有限公司，中国)对以上芯片进行扫描检测，结果显示于图7。结果表明，即便当AFP、AFP-L3、GPC3、GP73和OPN浓度分别不低于0.0039μg/mL、0.0039μg/mL、0.0039μg/mL、0.0039μg/mL、0.0078μg/mL时，荧光值均大于其对照荧光平均值的2+2SD。因此，可以确定本发明化学修饰的蛋白芯片对AFP、AFP-L3、GPC3、GP73和OPN的最低检测限制浓度分别为3.9ng/mL、3.9ng/mL、3.9ng/mL、3.9ng/mL和7.8ng/mL。
实施例4、蛋白芯片联合检测肝癌患者血清中五种肝癌标志物
在实施例1构建的修饰后的分子自组装单层固相载体上，包被抗AFP、AFP-L3、GPC3、GP73和OPN多克隆捕获抗体探针，浓度均为50μg/mL，体积1.0μl，按图1分布图示点样，置于湿盒内，室温下，摇晃孵育2小时，构建组合蛋白芯片，PBST溶液清洗、氮气吹干后备用。
取两张芯片，其中一张依次加入96例肝细胞癌血清1.0μl(图8左图)，另一张依次加入96例正常对照血清(图8右图)1.0μl，室温摇晃孵育2小时，PBST缓冲液漂洗，氮气流下吹干；向所有芯片试验孔中滴加1.0μl 50μg/mL工作浓度的相应的单克隆检测抗体，室温，摇晃孵育2小时，PBST缓冲液漂洗，氮气流下吹干；向所有芯片试验孔中无差别滴加1μL Cy3标记的驴抗小鼠IgG抗体(显色抗体液)，室温，避光摇晃孵育1小时，PBST缓冲液漂洗，氮气流下吹干。
通过芯片扫描仪LuxscanTM 10K-A(博奥有限公司，中国)对以上芯片进行扫描检测，结果显示于图8，左图为肝细胞癌血清检测扫描图，右图为正常人血清检测扫描图。图9为96例肝细胞癌血清与96例正常对照血清检测荧光均值散点图。结果显示，与对照组血样相比，HCC患者血清AFP、AFP-L3、GPC3、GP73和OPN标志物检测荧光强度均值明显增加，差异均具有高度显著性，分别为P＜0.0001、P＜0.0001、P＜0.0001、P＝0.0003和P＝0.0012(均＜0.05)。
表1为单一标志物单一和组合标志物条件下最优组合的AUC值、P值、约登指数最大时的敏感性和特异性、阳性预测值和阴性预测值和约登指数。结果表明，基于肝癌标志物AFP、AFP-L3、GPC3、GP73和OPN的联合检测，可显著提高肝癌诊断的敏感性和特异性。本发明的蛋白芯片适用于人类血清肿瘤学筛查及患者肿瘤的大规模筛查、治疗评价、复发或进展监控以及生存期预警。
表1
Figure BDA0003251890640000181
以上仅为本发明的示例性实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (12)

1.一种共修饰的固相载体，其特征在于，所述固相载体包含16-MHDA、6-MHA和CDI修饰。
2.一种共修饰的固相载体的制备方法，其特征在于，所述方法以金箔芯片为基底，通过16-MHDA、6-MHA和CDI进行表面修饰，制备得到所述共修饰的固相载体。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述方法具体以浓度为0.005-0.02mol/L的混合巯基酸溶液和0.5-2.0mg/mL CDI的丙酮溶液为修饰液进行表面修饰；其中，混合巯基酸溶液中，16-MHDA、6-MHA的摩尔比为(0.2-1.8):(6-14)。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在修饰前还包括对金箔芯片进行清洗、干燥的步骤，所述清洗、干燥的步骤为：将NH3、H2O2及H2O按体积比1：1：5混合配制TL1清洗液，将金箔芯片浸入TLI清洗液中，82℃水浴6分钟，取出，超纯水冲洗，再用无水乙醇清洗、氮气吹干。
5.如权利要求1所述的固相载体或由权利要求2～4之任一项所述方法制备得到的固相载体在制备体外诊断产品中的应用。
6.一种体外诊断产品，其特征在于，所述体外诊断产品包含如权利要求1所述的共修饰的固相载体或由权利要求2～4之任一项所述方法制备得到的固相载体。
7.如权利要求6所述的体外诊断产品，其特征在于，所述体外诊断产品为生物芯片或检测试剂盒、或蛋白质阵列；当所述体外诊断产品为生物芯片时，所述生物芯片还包括在所述固相载体表面点阵固定的待测标志物的捕获抗体探针。
8.如权利要求6所述的体外诊断产品，其特征在于，所述体外诊断产品为肝癌标志物诊断产品，所述肝癌标志物包括AFP、AFP-L3、GPC3、GP73、OPN中的一种或几种。
9.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括16-MHDA、6-MHA、CDI，其摩尔比为(0.2-1.8):(6-14):(2-10)。
10.如权利要求11所述的组合物，其特征在于，所述组合物包括0.005-0.02mol/L的混合巯基酸溶液和0.5-2.0mg/mL CDI的丙酮溶液；其中，混合巯基酸溶液中，16-MHDA、6-MHA的摩尔比为(0.2-1.8):(6-14)。
11.如权利要求11或12所述的组合物在修饰基片制备固相载体或制备体外诊断产品中的应用。
12.一种权利要求7所述体外诊断产品的使用方法，其特征在于，当所述体外诊断产品为生物芯片时，包括如下步骤：
步骤1、样本稀释
利用PBST-BSA溶液对待测样本进行稀释；
步骤2、检测抗体的孵育
将步骤1经稀释后的样本点样于所述生物芯片和空白对照的孔中，每孔加稀释血清1μL，然后置于湿盒内，室温孵育2h，用PBST缓冲液清洗，并在氮气流下吹干；向各孔中滴加检测抗体，室温孵育2h，PBST缓冲液漂洗，氮气流下吹干；
其中，所述PBST缓冲液是由浓度0.01mol/L、pH＝7.4的PBS缓冲液与Tween20混合配制而成的，在所述PBST缓冲液中Tween20的体积浓度为0.1％；
步骤3、显色抗体的孵育与显色
向经过上述步骤2处理后的孔中滴加Cy3标记的IgG显色抗体液，每孔加样1μL，然后置于湿盒内，室温下孵育2h，用PBST缓冲液清洗，在氮气流下吹干，采用荧光芯片扫描仪进行检测。
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