CN116794313A - 基于流式细胞仪同时检测三项肿瘤标志物的试剂盒及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种基于流式细胞仪同时检测三项肿瘤标志物的试剂盒及方法，通过专门针对CEA、CA125、CA153抗体设置合适的微球、抗体标记物，结合1.5步孵育法，生物素体系，并在反应缓冲液中添加合适的阻断剂、封闭剂，使样品中的CA153更好地与微球和抗体标记物结合，减少CA153对CEA、CA125的交叉影响，从而基于流式细胞仪同时检测CEA、CA125、CA153三项肿瘤标志物时，能显著提高检测的准确性，CEA的检测灵敏度达到0.3ng/mL，CA125的检测灵敏度达到0.5U/mL，CA153的检测灵敏度达到0.5U/mL，满足临床所需。

Description

基于流式细胞仪同时检测三项肿瘤标志物的试剂盒及方法
技术领域
本发明涉及流式细胞技术领域，具体涉及基于流式细胞仪同时检测三项肿瘤标志物的试剂盒及方法。
背景技术
肿瘤标志物检测为近年来在体检中增加的筛查类项目，通过对肿瘤形成过程中机体对癌细胞产生的反应或癌细胞释放的物质进行检验，发现肿瘤疾病。肿瘤标志物检测的意义在于肿瘤的早期发现；肿瘤普查和筛查；肿瘤的诊断、鉴别诊断与分期；肿瘤患者手术、化疗、放疗疗效监测；肿瘤复发的指标；肿瘤的预后判断；寻找不知来源的转移肿瘤的原发灶。用于临床诊断的肿瘤标志物包括癌胚抗原、酶、激素、糖蛋白、癌基因和细胞表面肿瘤抗原等6大类。其中癌胚抗原（CEA）、癌抗原125、癌抗原153等都可用于肿瘤的辅助诊断，比如可用于检测乳腺癌等。
癌胚抗原（CarcinoembryonicAntigen，CEA）是一种结构复杂的酸性糖蛋白，主要存在于成人癌组织以及胎儿的胃肠管组织中，是一种较广谱的肿瘤标志物。
糖类抗原125（CarbohydrateAntigen125，CA125）是一种大分子糖蛋白，是用卵巢浆液性囊腺癌细胞株（OVCA433）作为抗原制备的单克隆抗体OC125所发现的，存在于上皮性卵巢癌组织中，是目前临床常用的检测卵巢癌的肿瘤标志物。
糖类抗原153（CarbohydrateAntigen153，CA153）是肿瘤细胞产生的一种糖蛋白特异的抗原，在进入血液之后，肿瘤患者的血液中能够检测到CA153的升高，CA153是乳腺癌最重要的特异性标志物，30%-50%的乳腺癌患者的CA153明显升高，其含量的变化与治疗效果密切相关，是乳腺癌患者诊断和监测术后复发、观察疗效的最佳指标，CA153动态测定有助于II期和III期乳腺癌病人治疗后复发的早期发现，当CA153大于100U/mL时，可认为有转移性病变。
由于同一肿瘤可含有一种或多种标志物，而不同或同种肿瘤的不同组织类型既可有共同的也可有不同的标志物。因此，选择一些特异性较高的肿瘤标志物联合测定某一肿瘤，有利于提高肿瘤检测的敏感性和特异性。大量研究表明多肿瘤标志物蛋白质联合检测可以提高对肿瘤诊断的敏感性和特异性。比如CEA，CA125，CA153三项联检可以提高乳腺癌的诊断效果。
流式细胞仪能在细胞水平上检测肿瘤标志物的水平，通过流式微球技术利用球形基质作为载体，以流式细胞术作为检测平台，可以在较短时间内对生物分子进行大规模检测。该系统主要基于流式荧光编码微球，可实现同步检测多靶标，具有较为广阔的应用空间，因此有望通过流式细胞仪实现CEA，CA125，CA153的三项联检。但是目前基于流式细胞仪进行多靶标联检，依然存在灵敏度低的问题。
因此，急需找到一种基于流式细胞仪同时高灵敏度、高准确性检测CEA、CA125、CA153三项肿瘤标志物的试剂盒及其检测方法，以避免现有技术中存在的上述问题。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了基于流式细胞仪同时检测三项肿瘤标志物的试剂盒及方法，通过专门针对CEA、CA125、CA153抗体设置合适的微球、抗体标记物，结合1.5步孵育法，生物素体系，并在反应缓冲液中添加合适的阻断剂、封闭剂，使样品中的CA153更好地与微球和抗体标记物结合，减少CA153对CEA、CA125的交叉影响，从而基于流式细胞仪同时检测CEA、CA125、CA153三项肿瘤标志物时，能显著提高检测的准确性，CEA的检测灵敏度达到0.3ng/mL，CA125的检测灵敏度达到0.5U/mL，CA153的检测灵敏度达到0.5U/mL，满足临床所需。
一方面，本发明提供了一种基于流式细胞仪同时检测三项肿瘤标志物的试剂盒，所述试剂盒包括：
第一溶液：偶联抗体的微球溶液，所述偶联抗体的微球溶液包括偶联CEA抗体的微球溶液，偶联CA125抗体的微球溶液和偶联CA153抗体的微球溶液；所述偶联CA153抗体的微球粒径大于偶联CEA抗体、CA125抗体的微球粒径；偶联CA153抗体的微球带有羧基修饰官能团；偶联CEA抗体、CA125抗体的微球带有氨基修饰官能团；
第二溶液：标记CA153抗体的溶液；
第三溶液：标记CEA抗体的溶液和标记CA125抗体的溶液；
第四溶液：反应缓冲液；
所述三项肿瘤标志物包括CEA、CA125和CA153。
在一些方式中，第一溶液、第二溶液、第三溶液，第四溶液单独分装储存。
本发明经研究发现，基于传统的流式细胞仪技术虽然也能在一定程度上实现CEA、CA125和CA153的同时检测，但通常检测灵敏度非常低，通常仅能达到CEA2ng/mL，CA125 5U/mL，CA153 4U/mL的水平，且存在非常严重的交叉影响，容易出现假阳性；而当CEA、CA125同时检测时，则灵敏度显著提高，可见其交叉影响可能主要是由CA153引起。
CA153为黏蛋白1（MUC-1）遗失在血液中的可溶性碎片，正常情况下仅在质膜顶端表达，糖基化正常或者仅有少量糖基化，而当发生癌变时，MUC-1表达升高且极性消失从而扩展到整个质膜表面，甚至是细胞浆中，此时糖基化严重，导致检测准确性下降，因此即使单独检测时，对试剂盒的要求也比较高。当CA153与其他肿瘤标志物（如CEA和CA125）基于流式细胞仪进行联检时，由于CA153的原因，当CA153浓度越高（糖基化越严重），发现其检测结果的准确度和精确度大大降低（CA125虽然也存在糖基化现象，但其对检测结果影响并不明显），三种标志物联合检测的性能指标难以达到罗氏试剂盒检测单项肿瘤标志物的性能指标，因此限制了制备多联检试剂盒进行推广应用。在乳腺癌中，CA153抗原通常被异常地糖基化、超量表达并释放进血循环。本发明推测可能是由于CA153的糖基化比较严重，糖基化会导致抗原表位遮挡，抗体结合困难的原因，当基于流式细胞仪进行CEA、CA125和CA153联检时，很难保证检测结果的准确性。
CA125虽然也存在糖基化现象，但大量实验结果证明，其对检测结果影响并不明显，基本可以忽略。
因此基于流式细胞仪同时检测CEA、CA125和CA153时，为了提高检测灵敏度，必须对检测试剂和检测工艺都进行特定处理，才能消除影响，提高检测灵敏度。
因此，一方面，本发明针对偶联CEA、CA125和CA153抗体的微球分别进行特定的选择和设计，使偶联CA153抗体的微球粒径大于偶联CEA抗体、CA125抗体的微球粒径，使通过流式细胞仪检测时，能通过微球粒径+微球携带的不同强度的荧光两方面进行区分，提高检测的准确度和灵敏度。
偶联CEA、CA125和CA153抗体的微球分别具有不同的荧光强度，能够通过流式细胞仪对CEA、CA125和CA153进行区分，但是由于高糖基化的CA153抗体存在的干扰，通过荧光强度进行区分效果不理想。由于流式细胞仪还能够区分不同大小尺寸的微球，因此针对偶联CA153抗体的微球，可以设置与偶联CEA、CA125抗体的微球不一样的尺寸，从而使CA153与CEA、CA125完全区分开，提高CA153检测结果的准确性。
同时，对检测样本进行稀释，也能消除CA153带来的影响，但是稀释样本就会导致CEA和CA125含量也同时降低，从而导致CEA和CA125的检测灵敏度降低，因此需要选择合适的样本稀释度，既能降低CA153的影响，又能尽量减少对CEA和CA125的检测灵敏度的影响，同时还需要进一步优化检测试剂和工艺流程来提高检测灵敏度。本发明经过对微球上偶联的官能团进行比较，发现用带有羧基修饰官能团的微球偶联CA153抗体，带有氨基修饰官能团的微球偶联CEA抗体、CA125抗体，能显著提高同时检测CEA、CA125和CA153时的灵敏度，降低交叉影响。
进一步地，所述第四溶液中的反应缓冲液含有阻断剂，所述阻断剂包括小鼠IgG、山羊IgG、TRU-Block（购于meridian，货号A66800H）、TRU-Block3（购于meridian，货号A66803H）、MAK33（购自罗氏，型号 11939661103）。
在反应缓冲液中添加阻断剂，能有效阻止血液样品中的内源性抗体或病人样本中的其它结合蛋白，多反应抗体，自身抗体（异嗜性抗体）和人抗动物抗体的干扰，从而能够减少干扰因子对检测结果的干扰，消除假阳性。
但是单独添加一种阻断剂，难以实现理想的检测效果，为了消除假阳性，提高同时检测CEA、CA125和CA153时的准确性，必须选择更合适的阻断剂配方。本发明通过选择多种阻断剂进行组合，并搭配小鼠IgG、山羊IgG，能保证更精准地检测CEA、CA125和CA153。
进一步地，所述第一溶液中的偶联抗体微球溶液还包括封闭液，所述封闭液包括十二水合磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、ProClin300缓冲液、BSA（购至sigma，型号A1933）和马血清（购至sigma，型号12449C）。
在偶联抗体微球溶液中添加封闭液，可以封闭微球上的部分抗体结合位点，有效控制微球的抗体包被量，使其达到最佳抗体量，从而提高CEA、CA125和CA153的检测灵敏度。
本发明筛选了最佳的封闭液，使微球的抗体包被量控制在85%，显著提高了CEA、CA125和CA153的检测灵敏度。
在一些方式中，本发明提供的试剂盒不仅适用于血液样本，还适用于尿液、唾液、痰液、肺泡灌洗液、胸腹水、透析液、阴道分泌液、穿刺组织块等样本。
进一步地，所述第二溶液中的标记CA153抗体采用生物素标记；所述第三溶液中还包括标记的抗生物素抗体。
由于CA153的糖基化严重，且在血液样本中的含量通常较高，因此当基于流式细胞仪进行CEA、CA125和CA153三项联检时，容易存在互相干扰导致检测结果存在误差。本发明对标记CA153抗体采用生物素标记，与标记CEA抗体和标记CA125抗体能更好地区分开，从而帮助消除CA153抗体对CEA和CA125检测过程中的干扰，能帮助有效提高检测准确性。
进一步地，所述第一溶液中还含有CA153抗体。
在一些方式中，所述第一溶液中偶联CA153抗体的微球溶液，偶联CA125抗体的微球溶液、偶联CEA抗体的微球溶液和CA153抗体之间的质量比为（1~4）：1：1：1。
在血液样本中，一旦含有CA153，通常CA153的含量较高，采用流式细胞仪进行检测时，由于参与反应的抗原抗体比例不合适而导致的假阴性或弱阳性的现象（即HOOK效应），从而导致其检测结果偏离罗氏检测单项CA153的检测结果或者与实际样本中的真实CA153含量存在较大的偏差，另外，稀释样本需要兼顾CEA和CA125两个指标的检测灵敏度。本发明经研究证明，通过在第一溶液中添加CA153抗体来中和掉部分CA153，在兼顾到其它指标性能的同时，也起到了对CA153进行单独稀释的效果，可以使血液样本中的CA153检测结果更加接近真实值（由于样品中CA153的浓度较高通常会使检测值偏低，添加一定量的CA153抗体能使检测结果更准确），与罗氏检测单项CA153的检测结果更加接近。
进一步地，所述第三溶液中的标记CEA抗体和标记CA125抗体采用藻红蛋白标记；抗生物素抗体采用藻红蛋白标记。
在一些方式中，所述标记CEA抗体溶液、标记CA125抗体溶液和标记的抗生物素抗体溶液的质量比为（1~10）：（1~10）：（2~10）。
另一方面，本发明提供了一种基于流式细胞仪同时检测三项肿瘤标志物样本的前处理方法，所述方法采用如上所述试剂盒进行前处理，包括以下步骤：步骤（1）：取待测样品，分别加入第一溶液、第二溶液和第四溶液，孵育；步骤（2）：加入第三溶液，孵育；步骤（3）：加入清洗液清洗，离心，待检测。
进一步地，步骤（1）所述待测样品需采用稀释液稀释10~30倍，所述稀释液包括三羟甲基氨基甲烷、氯化钠、ProClin300缓冲液和BSA；步骤（3）所述清洗液包括BSA、吐温-20。
另一方面，本发明提供了一种基于流式细胞仪同时检测三项肿瘤标志物的方法，采用如上所述试剂盒进行检测，包括以下步骤：（1）取稀释后的待测样品，分别加入第一溶液、第二溶液和第四溶液，孵育；（2）加入第三溶液，孵育；（3）加入清洗液清洗，离心，流式细胞仪检测。
本发明提供的基于流式细胞仪同时检测三项肿瘤标志物的方法，在样本进行流式细胞仪检测前，需要进行1.5步孵育法，从而保证检测结果的准确性。
本发明在样本前处理过程中，试过多种孵育法，包括：
一步孵育法：将第一溶液、第二溶液、第三溶液和样本全部放在一起孵育；
两步孵育法：将第一溶液、第二溶液和样本先孵育，清洗，然后加入第三溶液，孵育，清洗；
1.5步孵育法：将第一溶液、第二溶液和样本先孵育，加入第三溶液，孵育，清洗。
本发明经大量实验研究证明，1.5步孵育法能获得更好的样本前处理效果，检测结果更加精准，其原因可能是1.5步孵育法能使CA153先提前完成孵育，降低了对CEA和CA125的交叉影响。
进一步地，步骤（1）所述待测样品需采用稀释液稀释10~30倍，所述稀释液包括三羟甲基氨基甲烷、氯化钠、ProClin300缓冲液和BSA；步骤（3）所述清洗液包括BSA、吐温-20。
通过选择合适的样本稀释倍数，既能降低CA153的影响，又能尽量减少对CEA和CA125的检测灵敏度的影响。
进一步地，所述孵育时间为30min。
本发明对不同清洗液进行对比，筛选到最适合的清洗液配方，有助于提高检测效果。
由于CA153在检测前需要用样品稀释液对样本进行稀释，选择合适的稀释倍数，获得更准确的检测结果，同时也能保证CEA和CA125的检测灵敏度。
再一方面，本发明提供了一种基于流式细胞仪同时检测三项肿瘤标志物的系统，所述系统包括标志物检测模块、数据输入界面、数据输出界面和数据分析模块；所述标志物检测模块用如上所述的试剂盒，或采用如上所述的方法进行检测，得到标志物的检测值，数据输入界面用于输入三种标志物的检测值，数据分析模块用于分析标志物的检测值，所述标志物为CEA、CA125、CA153；待数据分析模块分析后，数据输出界面用于输出CEA、CA125、CA153在待测样品中的浓度。
再一方面，本发明提供了一种封闭剂在制备提高基于流式细胞仪同时检测CEA、CA125和CA153的检测灵敏度的制剂的用途，所述封闭液包括十二水合磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、 ProClin300缓冲液、BSA和马血清。
再一方面，本发明提供了阻断剂在用于制备于流式细胞仪同时检测血液样品中三项肿瘤标志物并消除假阳性的制剂上的用途，所述阻断剂包括小鼠IgG、山羊IgG、TRU-Block、TRU-Block3和MAK33，其中，所述的三项肿瘤标志物为CEA、CA125和CA153。
再一方面，本发明提供了阻断剂在用于制备于流式细胞仪同时检测三项肿瘤标志物并消除类风湿因子1500U/mL，HAMA 2000IU/mL干扰而造成假阳性的制剂上的用途，所述阻断剂包括小鼠IgG、山羊IgG、TRU-Block、TRU-Block3和MAK33，其中，所述的三项肿瘤标志物为CEA、CA125和CA153。
再一方面，本发明提供了一种生物素在制备提高基于流式细胞仪同时检测CEA、CA125和CA153的检测灵敏度的制剂的用途。
再一方面，本发明提供了一种生物素在制备提高CA153检测准确度和精密度方面的用途。
本发明构建的基于流式细胞仪同时检测CEA、CA125和CA153三项肿瘤标志物的试剂盒及其检测方法，具有以下有益效果：
1、实现了基于流式细胞仪同时高灵敏度检测CEA、CA125和CA153，使CEA的检测灵敏度从2ng/mL提高到0.3ng/mL，CA125的检测灵敏度从5U/mL提高到0.5U/mL，CA153的检测灵敏度从4U/mL提高到0.5U/mL；
2、使偶联CA153抗体的微球尺寸与偶联CEA、CA125抗体的微球尺寸不同，从而使流式细胞仪通过微球尺寸使CA153与CEA、CA125完全区分开，消除CA153对CEA、CA125的干扰，并提高CA153检测结果的准确性；
3、分别针对CEA、CA125和CA153抗体选择带有不同基团修饰的微球，偶联CA153抗体的微球带有羧基修饰官能团，偶联CEA抗体、CA125的微球带有氨基修饰官能团，提高基于流式细胞仪同时检测CEA、CA125和CA153的灵敏度；
4、通过在反应缓冲液中添加阻断剂，能够减少干扰因子对检测结果的干扰，提高检测灵敏度和准确性；
5、在第一溶液中添加CA153抗体，有助于提高高浓度样本检测结果的准确性，与罗氏检测单项CA153的检测结果更加接近；
6、在偶联抗体微球溶液中添加封闭液，有效控制微球的抗体包被量，提高CEA、CA125和CA153的检测灵敏度；
7、对标记CA153抗体采用生物素标记，并提高CA153的检测灵敏度及准确度；
8、在检测前用样品稀释液对样本进行稀释，选择合适的稀释倍数，获得更准确的检测结果，同时也能保证CA153、CEA和CA125的检测灵敏度；
9、采用1.5步孵育法进行样本前处理，从而保证检测结果的准确性。
附图说明
图1为实施例1中的CEA蛋白检测过程原理示意图，其中，11为第一荧光微球，12为偶联微球的CEA抗体，13为待测样本，14为CEA抗体，15为藻红蛋白；
图2为实施例1中的CA153蛋白检测过程原理示意图，其中，21为第三荧光微球，22为偶联微球的CA153抗体，13为待测样本，24为CA153抗体，25为生物素，15为藻红蛋白，27为抗生物素抗体；
图3为实施例1中的CEA的线性回归图；
图4为实施例1中的CA125的线性回归图；
图5为实施例1中的CA153的线性回归图；
图6为实施例1中的CEA的校准曲线图；
图7为实施例1中的CA125的校准曲线图；
图8为实施例1中的CA153的校准曲线图；
图9为实施例1中的CEA的本试剂盒测值和罗氏测值相关性曲线；
图10为实施例1中的CA125的本试剂盒测值和罗氏测值相关性曲线；
图11为实施例1中的CA153的本试剂盒测值和罗氏测值相关性曲线。
具体实施方式
为了更为具体地描述本发明，下面结合附图及具体实施方式对本发明的技术方案进行详细说明。这些说明仅仅是表明本发明是如何实现的，并不能限定本发明的具体范围。本发明的范围在权利要求中限定。
以下实施例中使用到的材料和生产厂家见表1。
表1、材料和生产厂家
实施例1：本发明提供的试剂盒及其检测方法
一、溶液、校准品的配制
本实施例提供的基于流式细胞仪同时检测CEA、CA125和CA153三项肿瘤标志物的试剂盒包括第一溶液、第二溶液、第三溶液、第四溶液，还可以包括校准品。
1、第一溶液的配制
取0.5mL标记别藻蓝蛋白的粒径为4μm的氨基修饰的聚苯乙烯微球溶液（简称Y1水平微球，购自Spherotech，型号APAK-3567，荧光强度为580000），加入0.1mL的CEA抗体溶液（与微球偶联的CEA抗体，其中含有CEA抗体100μg，溶剂为PBS），再加入100ugEDC，加入2mL封闭剂，孵育2.5h，制得偶联CEA抗体的微球溶液1mL，控制每毫升CEA抗体微球溶液中含有1×107个偶联CEA抗体的荧光微球。
取0.5mL标记别藻蓝蛋白的粒径为4μm的氨基修饰的聚苯乙烯微球溶液（简称Y2水平微球，购自Spherotech，型号APAK-3567，荧光强度为61000），加入0.1mL的CA125抗体溶液（与微球偶联的CA125抗体，其中含有CA125抗体100μg，溶剂为PBS），再加入100ugEDC，加入2mL封闭剂，孵育2.5h，制得偶联CA125抗体的微球溶液1mL，控制每毫升CA125抗体微球溶液中含有1×107个偶联CA125抗体的荧光微球。
取0.5mL标记别藻蓝蛋白的粒径为5μm的羧基修饰的聚苯乙烯微球溶液（简称L3水平微球，购自Spherotech，型号CPAK-5067，荧光强度为190000），加入0.1mL的CA153抗体（与微球偶联的CA153抗体，其中含有CA153抗体100μg，溶剂为PBS）再加入100ugEDC，加入3mL封闭剂，孵育2.5h，制得偶联CA153抗体的微球溶液1mL，控制每毫升CA153抗体微球溶液中含有1×107个偶联CA153抗体的荧光微球。
分别取偶联CEA抗体的微球溶液1mL、偶联CA125抗体的微球溶液1mL，和偶联CA153抗体的微球溶液1mL混合，加入197mL反应缓冲液，并添加5-15μg CA153抗体，制得200mL第一溶液。
封闭剂的配制方法为：分别取十二水合磷酸氢二钠36.32g，磷酸二氢钠2.4g、氯化钠80g，加入10mL ProClin300缓冲液，25g的BSA（购至sigma，型号A1933）和 3mg的马血清（购至sigma，型号12449C），加蒸馏水补足1000mL，pH6.9±0.1。
2、第二溶液的配制
取0.1mL CA153抗体溶液（其中含有CA153抗体500μg，溶剂为PBS），加入5.5659μL生物素溶液（其中含有生物素5.5659μg，溶剂为DMSO），混合均匀后震荡孵育以得到0.1055mL生物素标记的CA153抗体溶液，其中CA153抗体和生物素的摩尔比为3:1；使用稀释液稀释200倍，制得21.11mL第二溶液，其中含有8μg/mL的CA153抗体。
3、第三溶液的配制
取1mL CA125抗体溶液（其中含有CA125抗体200μg，溶剂为PBS），加入0.5mL藻红蛋白溶液（其中含有藻红蛋白600μg，溶剂为PBS），混合均匀后震荡孵育以得到1.5mL标记CA125抗体溶液。
取1mL CEA抗体溶液（其中含有CEA抗体200μg，溶剂为PBS），加入0.5mL藻红蛋白溶液（其中含有藻红蛋白600μg，溶剂为PBS），混合均匀后震荡孵育以得到1.5mL标记CEA抗体溶液。
取1mL抗生物素抗体溶液（其中含有抗生物素抗体200μg，溶剂为PBS），加入0.5mL藻红蛋白溶液（其中含有藻红蛋白600μg，溶剂为PBS），混合均匀后震荡孵育以得到1.5mL标记抗生物素抗体溶液。
分别取标记CA125抗体溶液1mL、标记CEA抗体溶液1mL和标记抗生物素抗体溶液1mL混合，加入197mL反应缓冲液，制得200mL第三溶液。
4、第四溶液的配制
反应缓冲液：取三羟甲基氨基甲烷（简称Tris，购自sigma）6g，ProClin300试剂（购自sigma）1mL，吐温-20试剂（购自sigma）1mL，加入30 ug/mL小鼠IgG（购自艾吉姆，型号A10004）和30ug/mL山羊IgG（购自LAMPIRE，型号7402505），加入40ug/mLTRU-Block（购于meridian，货号A66800H）、加入40 ug/mLTRU-Block3（购于meridian，货号A66803H）和40ug/mL MAK33阻断剂（购自罗氏，型号11939661103），待完全溶解后定容至1000毫升，调节pH值至8.0，得到反应缓冲液。
5、稀释液
取3.0275g三羟甲基氨基甲烷（简称Tris）和9.0g氯化钠，溶于800毫升纯水，并加入1mL ProClin300缓冲液（sigma），调节pH值至7.4，加入20克牛血清白蛋白（简称为BSA），待完全溶解后定容至1000毫升，调节pH值至7.4，得到稀释液。
6、清洗液
取0.24g磷酸二氢钾、3.632g十二水合磷酸氢二钠、8g氯化钠和0.2g氯化钾，溶于800毫升纯水，调节pH值至7.4，加入2.5g牛血清白蛋白（简称为BSA）、1ml ProClin300缓冲液和0.5ml Tween 20溶液，待完全溶解后定容至1000毫升，调节pH值至7.4，得到清洗液。
7、校准品的配制
将CEA蛋白、CA125蛋白、CA153蛋白校准品配制成混合溶液，作为校准工作液的储备液，校准品采用纯水配制，从而配制校准品。
CEA蛋白、CA125蛋白、CA153蛋白在校准品中具有8个系列浓度（S1~S8），如表2所示：
表2、CEA、CA125、CA153蛋白在校准品中的8个系列浓度
试剂盒的制备：2.0毫升第一溶液装入第一包装瓶，2.0毫升第二溶液装入第二包装瓶，2.0毫升第三溶液装入第三包装瓶，50毫升第四溶液装入第四包装瓶，100毫升清洗液装入第五包装瓶，校准品装入第六包装瓶，将第一包装瓶、第二包装瓶、第三包装瓶、第四包装瓶、第五包装瓶、第六包装瓶装入包装盒中以得到试剂盒。其中试剂盒为100人份/盒。试剂盒中可以放入校准品，也可以不放入。
二、检测方法
本实施例提供的基于流式细胞仪同时检测CEA、CA125和CA153三项肿瘤标志物的试剂盒的检测方法如下：
（1）样品稀释：取待测血液样品（血清）5μL，加入稀释液0.1mL，混匀，制得稀释样本；
（2）取稀释样本25μL至样本管，加入第一溶液25μL、第二溶液25μL、反应缓冲液25μL，样本管放入振荡器震荡30秒以上，室温避光孵育30min；
（3）加入第三溶液25μL，样本管放入振荡器震荡30秒以上，室温避光孵育30min；
（4）加入清洗液1000μL，清洗一次，通过涡旋将荧光微球重悬（必须充分混合均匀，震荡器震荡30秒以上）；离心机在离心速率为400g下离心5分钟，弃掉上清；向样本管中加入150μL-300μL清洗液，通过涡旋将荧光微球重悬（必须充分混合均匀，震荡器震荡30秒以上），最后将样本管放入流式细胞仪（购自贝克曼库尔特生物科技（苏州）有限公司，型号DxFLEX）进行检测。
本实施例提供的检测方法中，样品中的CEA蛋白检测过程原理如图1所示，偶联微球的CEA抗体12负载于第一荧光微球11，CEA抗体14由藻红蛋白15标记，偶联微球的CEA抗体12先与待测样本13之间特异性结合，然后与藻红蛋白15标记的CEA抗体14之间特异性结合。
样品中的CA125蛋白检测过程原理与CEA蛋白检测过程原理类似，其中的负载CA125蛋白的荧光微球为第二荧光微球。
样品中的CA153蛋白检测过程原理如图2所示，偶联微球的CA153抗体22负载于第三荧光微球21，CA153抗体24由生物素25标记，首先偶联微球的CA153抗体22与待测样本13之间特异性结合，生物素25标记的CA153抗体24与藻红蛋白15标记的抗生物素抗体27结合，然后生物素25标记的CA153抗体24与待测样本13之间特异性结合，通过生物素25实现了CA153信号的联级放大。
三、检测结果分析
1、线性验证
将含有1000ng/mL的CEA样本、含5000U/mL的CA125样本和含300U/mL的CA153样本分别按照表2稀释成8个不同浓度的样本，每个浓度测试3次，分别求出检测结果的均值。以稀释浓度为自变量，以检测结果均值为因变量求出线性回归方程。计算线性回归的相关系数，线性回归方程见图3-图5，其中图3为CEA的线性回归图，图4为CA125的线性回归图，图5为CA153的线性回归图。
其中，CEA的线性回归方程为y=0.9813x-0.128，R2=0.9989；CA125的线性回归方程为y=1.0118x-20.027，R2=0.998；CA153的线性回归方程为y=1.0374x-1.3699，R2=0.9988。
2、批间差试验
取三个批次的试剂盒分别为I、II和III，每个批次10份，按照说明书步骤操作，分别重复检测同1份参考品，计算30次测量结果的平均值M和标准差SD，计算变异系数CV。批间差的试验结果详见表3。
表3、批间差试验结果
通过表3可知，三个批次试剂盒的CEA、CA125和CA153的批间差的变异系数CV均在10%以内。
3、校准曲线的制备
分别按照表2配制校准曲线样品，每个浓度测试3次，分别求出检测结果的均值。以校准曲线样品浓度为自变量，以荧光强度为因变量，进行对数拟合制备校准曲线。计算校准曲线的相关系数，校准曲线见图6-图8，其中图6为CEA的校准曲线图，图7为CA125的校准曲线图，图8为CA153的CA153的校准曲线图。
参照图6-图8，CEA校准曲线的线性相关性R2为0.9989；CA125校准曲线的线性相关性R2为0.9993；CA153校准曲线的线性相关性R2为0.9996。
4、重复性验证
采用本实施例提供的试剂盒及其检测方法，检测2份不同浓度水平的参考品，按照参考品测试步骤进行10次平行检测，计算变异系数，重复性的试验结果见表4。
表4、重复性验证
通过表4可知，高、低浓度水平的参考品，变异系数均在4%以内。
5、与罗氏测试的比较
罗氏（Roche）试剂盒是本领域测试肿瘤标志物的较高质量的试剂盒，但是罗氏试剂盒还无法实现通过化学发光仪同时检测CEA、CA125和CA153三项肿瘤标志物，因为CEA、CA125和CA153同时检测容易存在交叉影响，市面上很少有联检试剂盒；罗氏试剂盒仅能分别针对CEA、CA125和CA153设置单独检测肿瘤标志物CEA的试剂盒（型号：Elecsys CEA;REF:11731629322 ;LOT:(10)62773003）、单独检测肿瘤标志物CA125的试剂盒（型号：Elecsys CA125Ⅱ; REF:11776223190 ;LOT:(10)61059703）和单独检测肿瘤标志物CA153的试剂盒（型号：Elecsys CA153Ⅱ; REF:03045838122;LOT:(10)67129401）。
针对同样的样本，分别采用本实施例提供的试剂盒和罗氏试剂盒进行检测，检测结果如表5所示。
表5、本实施例提供的试剂盒和罗氏试剂盒检测结果比较
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通过表5中的数值绘制本试剂盒测值和罗氏测值的相关性曲线图见图9~图11，其中，图9为CEA的本试剂盒测值和罗氏测值相关性曲线；图10为CA125的本试剂盒测值和罗氏测值相关性曲线；图11为CA153的本试剂盒测值和罗氏测值相关性曲线。
根据图9，对于肿瘤标志物CEA，本试剂盒测值和罗氏测值的相关性R2为0.9961；根据图10，对于肿瘤标志物CA125，本试剂盒测值和罗氏测值的相关性R2为0.9946；根据图11，对于肿瘤标志物CA153，本试剂盒测值和罗氏测值的相关性R2为0.9752。
可见本实施例提供的试剂盒对肿瘤标志物CEA、肿瘤标志物CA125和肿瘤标志物CA153的测值和罗氏不同试剂盒分别单独对肿瘤标志物CEA、肿瘤标志物CA125和肿瘤标志物CA153的测值相关性均在0.9以上，说明本发明提供的试剂盒的性能指标和罗氏试剂盒的性能指标非常相近，能够实现同时高灵敏度检测三种肿瘤标志物，提高了检测效率。
6、与质谱检测结果的比较
针对同样的样本，分别采用本实施例提供的试剂盒和质谱分析仪进行检测，质谱仪（购自岛津，型号LC-MS/8040），采用0.1%甲酸水和0.1%甲酸乙腈作为流动相，使用ESI离子源，雾化气压（GS1）：45Psi，辅助气压：45Psi，气帘气压：35Psi，温度：650℃，喷雾电压：5000V（正离子模式），梯度洗脱，检测结果如表6所示。
表6、本实施例提供的试剂盒和质谱检测结果比较
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实施例2：阻断剂提高准确性的效果
未添加阻断剂时，会存在比较严重的非特异结合问题。为了降低样本中非特异性结合造成的假阳性或假阴性检测结果，提高检测的准确性和特异性。需要在反应缓冲液中添加阻断剂。本实施例采用实施例1提供的试剂盒对CEA、CA125和CA153接近空白限（不含有三种肿瘤标志物的PBS缓冲液）的样本中加入干扰物质（类风湿因子1500IU/mL，HAMA1000ng/mL），同时检测CEA、CA125和CA153三项肿瘤标志物，其中在第四溶液的反应缓冲液中，分别采用了如下所示的不同阻断剂：考察采用不同阻断剂对空白限检测结果的影响，每组进行三次重复。检测结果如表7-1和7-2所示。
表7-1、阻断剂去干扰检测结果（阻断剂的浓度按照实施例1）
注：或/是指有时无法检出。
结论：由表7-1可以看出，在没有添加阻断剂直接检测时，测试不准确。加入阻断剂后，空白基质样本测值降低，与罗氏测值接近，与质谱检测值较一致，且在加入小鼠IgG、山羊IgG、TRU-Block、TRU-Block3和MAK33后，效果最佳，检测结果最准确。
相对于不添加阻断剂的空白对照，在反应缓冲液中添加阻断剂能有效降低空白基质样本测值，提高CEA、CA125和CA153三项肿瘤标志物的检测准确性；同时，选用不同的阻断剂也会直接影响检测结果，其原因可能是不同的阻断剂对不同杂质的阻断效果有区别，更重要的是不同阻断剂组合，在高浓度血液样本中，有助于消除假阳性，消除CA153糖基化所带来的交叉影响，为了能尽量消除血液样品中的干扰因子对CEA、CA125和CA153的影响，并尽量消除CA153糖基化带来的交叉影响，防止错检漏检，需要选择合适的阻断剂来提高检测结果的准确性。
采用不同组合的阻断剂相比单独一种阻断剂，也具有提高消除假阳性，提高准确性的效果，但并非任意阻断剂组合都能取得理想的消除干扰和假阳性的作用，本实施例经过对不同组合方式的阻断剂检测结果进行验证，结果证明，针对空白限样本，采用小鼠IgG+山羊IgG+TRU-Block+TRU-Block3+ MAK33的组合方式，在联合检测CEA、CA125和CA153三项肿瘤标志物的空白限时，具有显著的提高检测结果准确性，消除假阳性的效果。
另外需要说明的是，针对空白样本，在靠近最低检测限时有时难以检出，结果为“/”，有时会有检测值。
本实施例还采用实施例1提供的试剂盒对非特异性样本（血液样本）中的CEA、CA125和CA153三项肿瘤标志物进行同时检测，其中在第四溶液的反应缓冲液中，分别采用了如下所示的不同阻断剂：考察采用不同阻断剂对检测结果的影响，每组进行三次重复。检测结果如表7-2所示。
表7-2、阻断剂对非特异性样本检测结果的影响
结论：由表7-2可以看出，在没有添加阻断剂直接检测时，导致了样本测值异常偏高问题。加入阻断剂后，样本测值降低，与罗氏测值接近，与质谱检测值较一致，且在加入小鼠IgG、山羊IgG、TRU-Block、TRU-Block3和MAK33后，效果最佳，检测结果最准确。与表7-1中的样本相比，血液由于其成分复杂，存在的干扰因子更多，除了以上明确的类风湿因子1500U/mL，HAMA 2000IU/mL外，可能还含有其它干扰因子。
实施例3：微球对检测灵敏度的影响
1、 微球粒径的影响
由于CEA、CA125和CA153共同检测过程中存在明显的交叉影响，其原因可能是由于CA153引起的，因此本实施例考虑采用不同的微球与CA153抗体偶联，通过流式细胞仪针对不同尺寸微球能优先进行区分，从而能够增加CEA、CA125和CA153的区分度，减少交叉影响。本实施例采用以下4种方式进行微球的选择：
1） CEA抗体、CA125抗体和CA153抗体全部采用同一种微球（粒径4μm，Y微球，偶联羧基修饰官能团，购自Thermo，型号FM4CR01B）偶联，通过微球携带的不同强度的荧光进行区分；
2）CA153抗体偶联微球（粒径5μm，L微球，偶联羧基修饰官能团，购自Spherotech，型号CPAK-5067），CA125和CEA抗体偶联微球（粒径4μm，Y微球，偶联羧基修饰官能团，购自Thermo，型号FM4CR01B），从微球粒径、微球携带的不同强度的荧光进行区分；
3）CA125抗体偶联微球（粒径5μm，L微球，偶联羧基修饰官能团，购自Spherotech，型号CPAK-5067），CA153抗体和CEA抗体偶联微球（粒径4μm，Y微球，偶联羧基修饰官能团，购自Thermo，型号FM4CR01B），从微球粒径、微球携带的不同强度的荧光进行区分；
4）CEA抗体偶联微球（粒径5μm，L微球，偶联羧基修饰官能团，购自Spherotech，型号CPAK-5067），CA153抗体和CA125抗体偶联微球（粒径4μm，Y微球，偶联羧基修饰官能团，购自Thermo，型号FM4CR01B），从微球粒径、微球携带的不同强度的荧光进行区分；
采用低浓度校准品（S3）进行检测，检测结果如表8-1和8-2所示。
表8-1、微球的影响
表8-2、微球的影响
注：其中的空白值（MFI）为空白基质的检测值，信噪比为测试值（MFI）和空白值（MFI）的比值。
由表8-1和8-2可以看出，相比于第1种方式，当采用第2种方式，采用粒径不同的微球偶联CA153抗体，能显著提高CA153的信噪比（信噪比差异大，容易区分），显著提高检测灵敏度或者特异性，使CA153与CEA、CA125更好地区分开，减少交叉影响，更好地保证检测结果的准确性。
当采用第3种方式，使CA125与CEA、CA153更好地区分开，并不能提高信噪比，无法起到减少交叉影响的效果；当采用第4种方式，使CEA与CA125、CA153更好地区分开，也并不能提高信噪比，不能起到减少交叉影响的效果。可见三项同时检测时，主要是CA153存在明显的干扰影响，其原因可能是因为CA153存在高度糖基化的现象而造成的。
2、微球偶联官能团的影响
由于CA153检测样本需要稀释，导致了CEA和CA125的检测灵敏度降低，需要对CEA和CA125的检测灵敏度进行优化，按照上述第2种方式选择相应粒径的微球，再进一步选择偶联不同官能团的微球对CEA和CA125进行检测灵敏度的优化，将CEA微球和CA125微球偶联基团由羧基修饰调整为氨基修饰（粒径4μm，购自Spherotech，型号APAK-3567），CA153微球偶联基团由羧基修饰调整为羟基修饰官能团（粒径5μm，购自Sigma，型号15647），采用校准品（S3）进行检测，检测结果的荧光值如表9所示。
表9、不同微球的检测灵敏度
从不同微球检测同一样本时CEA、CA125、CA153的荧光值可以看出，不同微球修饰的官能团会直接影响信噪比；CEA选用氨基修饰微球时信噪比更高，灵敏度会较高；CA125选用氨基修饰微球时信噪比更高，灵敏度会较高；CA153选用羧基修饰微球时信噪比更高，灵敏度会较高。因此CEA选用氨基修饰微球，CA125选用氨基修饰微球，CA153选用羧基修饰微球。
实施例4：生物素标记提高CA153的检测灵敏度
本发明一开始将CA153抗体和CEA抗体、CA125抗体全部都采用藻红蛋白标记，发现CEA、CA125和CA153同时检测时会存在严重干扰，尤其是在高浓度血液样本中，导致CA153的检测结果明显偏低，因此尝试采用生物素对CA153抗体信号进行联级放大，从而显著提高了CA153的检测灵敏度。本实施例分别采用上述两种不同标记方式，按照实施例1提供的方法，分别对高浓度样本和低浓度样本进行检测，每个样本重复检测5次，取平均值，检测结果如表10所示。
表10、生物素标记对检测结果的影响
由表10可知，当检测低浓度血液样本时，不论是直接采用藻红蛋白标记，还是采用生物素标记，检测结果差别不大；而当检测高浓度血液样本时，采用藻红蛋白标记时，CA153的检测结果明显偏低，还不到罗氏试剂盒检测结果的一半，其原因可能是由于CA153糖基化非常严重，进行三项联检时，导致了严重的交叉影响，使检测结果严重偏低；而当改用生物素进行联级信号放大后，能使CA153的检测结果准确性显著提升，因此优选采用生物素标记CA153，从而使信号得到联级放大，保证了检测结果的精准性，消除了CA153糖基化带来的影响。
实施例5：微球溶液中添加抗体的效果
本实施例按照实施例1提供的方法进行检测，其中在第一溶液中分别添加CA153抗体，和不添加CA153抗体，采用样本进行检测，每个样本重复检测3次，取平均值，考察添加CA153抗体对CA153检测效果的影响。表11-1为校准曲线浓度值和对应的荧光值，表11-2为添加抗体对CA153检测结果的影响。
表11-1、校准曲线浓度和荧光值
表11-2、添加抗体对CA153检测结果的影响
根据表11-2可以看出，添加抗体有助于提高高浓度样本检测结果的准确性，其原因是在高浓度的糖基化CA153包裹下，容易出现难以有效检测的问题，当添加少量CA153抗体时，可以中和其中的部分CA153，改善了高浓度的糖基化CA153包裹的问题，可以使血液样本中的CA153荧光信号值升高，通过校准曲线方程计算，检测结果更加接近真实值。由表11-1和表11-2可以看出，添加CA153抗体对低浓度样本的检测结果准确性没有影响，其原因是低浓度的荧光信号值虽然有降低，通过标准曲线方程计算，检测结果依然接近准确值。
实施例6：不同封闭剂对检测结果的影响
在微球与抗体偶联的过程中，由于微球表面存在剩余的未占据的结合位点，为防止非特异性物质的结合，因此需要在偶联抗体微球溶液中添加封闭液，封闭微球上剩余的抗体结合位点，有效控制非特异性物质的结合，从而提高CEA、CA125和CA153的检测灵敏度和特异性。本实施例按照实施例1提供的方法对同一样本进行三种肿瘤标志物的检测，并分别采用如表12所示的5种封闭液，并以未添加封闭剂作为阴性对照，每个样本重复检测5次，取平均值，考察不同封闭液对检测结果的影响。
其中自制封闭剂配制方法共三种：
1）含有马血清：取36.32g十二水合磷酸氢二钠，2.4g磷酸二氢钠和80g氯化钠，溶于800毫升纯水，并加入10mL ProClin300缓冲液（sigma），调节pH值至6.9，加入25g牛血清白蛋白（简称为BSA），2mL马血清，待完全溶解后定容至1000毫升，调节pH值至6.9，得到封闭剂。
2）不含马血清：取36.32g十二水合磷酸氢二钠，2.4g磷酸二氢钠和80g氯化钠，溶于800毫升纯水，并加入10mL ProClin300缓冲液（sigma），调节pH值至6.9，加入25g牛血清白蛋白（简称为BSA），待完全溶解后定容至1000毫升，调节pH值至6.9，得到封闭剂。
3）不含马血清，含山羊血清（Biosharp，BL210A）：取36.32g十二水合磷酸氢二钠，2.4g磷酸二氢钠和80g氯化钠，溶于800毫升纯水，并加入10mL ProClin300缓冲液（sigma），调节pH值至6.9，加入25g牛血清白蛋白（简称为BSA），2mL山羊血清，待完全溶解后定容至1000毫升，调节pH值至6.9，得到封闭剂。
CE210为购自北京博尔迈生物技术有限公司，型号CE210的封闭剂，CE510为购自北京博尔迈生物技术有限公司，型号CE510的封闭剂。
表12、不同封闭剂对CA153检测结果的影响
MFI：荧光值
根据表12可见，在微球溶液中添加封闭剂，有助于提高检测灵敏度和准确性，因为在偶联抗体微球溶液中添加封闭液，可以封闭微球上剩余的抗体结合位点，有效控制非特异性物质的结合，提高检测灵敏度和准确性，但是不同封闭剂所起到的效果存在区别，而且封闭剂中是否含有马血清，也对检测结果的灵敏度存在一定的影响。经计算，采用自制1）封闭剂时，该血液样品中的CA153含量为36.2U/mL，CEA含量为6.5ng/mL，CA125含量为40.7U/mL，与罗氏试剂盒检测结果几乎一致（通过质谱测试确认具体含量）当不加自制1）封闭剂时候，检测结果如下：CA153含量为10.2U/mL，CEA含量为1.5ng/mL，CA125含量为12.7U/mL（具体实验过程略）。相比其他封闭剂能显著提高检测灵敏度和准确性。因此最优选的封闭剂为自制1）封闭剂，含有马血清，能使检测结果更加精准，显著提高了CA153、CEA、CA125的检测灵敏度。
实施例7：1.5步法检测工艺的选择
本实施例按照实施例1提供的方法，在基于流式细胞仪同时检测三项肿瘤标志物的过程中，针对校准品系列浓度中的S8，分别采用如下的一步孵育法、两步孵育法和1.5步孵育法3种处理方法进行样本处理。
其中的一步孵育法：是指将第一溶液、第二溶液、第三溶液和样本全部放在一起孵育；
两步孵育法：是指将第一溶液、第二溶液和样本先孵育，清洗，然后加入第三溶液，孵育，清洗，共需两次清洗；
1.5步孵育法：将第一溶液、第二溶液和样本先孵育，加入第三溶液，孵育，清洗。
再进行流式细胞仪的检测，考察不同的前处理方法对CEA、CA125和CA153检测结果的影响。
三种处理方法的检测结果如表13所示。
表13、不同处理方法对检测结果的影响
根据表13，采用一步孵育法进行检测时，也就是把检测结果明显偏低，存在明显的干扰，难以实现CEA、CA125和CA153同时检测；采用两步孵育法和1.5步孵育法时，由于将CA153抗体先孵育，与CEA抗体、CA125抗体分开孵育，因此CA153抗体与CA153结合过程是先完成的，对CEA、CA125与抗体结合过程的影响更小，从而减少了交叉影响和干扰，检测结果更加准确。
两步孵育法和1.5步孵育法相比，两步孵育法进行了两次清洗，步骤更加繁琐，但检测结果反而降低，因此最优选采用1.5步孵育法进行处理。
虽然本发明披露如上，但本发明并非限定于此。任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种更动与修改，因此本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。

Claims (10)

1.一种基于流式细胞仪同时检测三项肿瘤标志物的试剂盒，其特征在于，包括：
第一溶液：偶联抗体的微球溶液，所述偶联抗体的微球溶液包括偶联CEA抗体的微球溶液，偶联CA125抗体的微球溶液和偶联CA153抗体的微球溶液；所述偶联CA153抗体的微球粒径大于偶联CEA抗体、CA125抗体的微球粒径；偶联CA153抗体的微球带有羧基修饰官能团；偶联CEA抗体、CA125抗体的微球带有氨基修饰官能团；
第二溶液：标记CA153抗体的溶液；
第三溶液：标记CEA抗体的溶液和标记CA125抗体的溶液；
第四溶液：包括反应缓冲液；
所述三项肿瘤标志物包括CEA、CA125和CA153；所述第四溶液中的反应缓冲液含有阻断剂，所述阻断剂包括小鼠IgG、山羊IgG、TRU-Block、TRU-Block3和MAK33。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第二溶液中的标记CA153抗体采用生物素标记；所述第三溶液中还包括标记的抗生物素抗体溶液。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述第一溶液中的偶联抗体的微球溶液还包括封闭液，所述封闭液包括十二水合磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、ProClin300缓冲液、BSA和马血清。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述第一溶液中还含有CA153抗体。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，第三溶液中的标记CEA抗体和标记CA125抗体采用藻红蛋白标记；抗生物素抗体采用藻红蛋白标记。
6.一种基于流式细胞仪同时检测三项肿瘤标志物样本的前处理方法，其特征在于，采用如权利要求5所述试剂盒进行样本的前处理，包括以下步骤：
步骤（1）：取待测样品，分别加入第一溶液、第二溶液和第四溶液，孵育；
步骤（2）：加入第三溶液，孵育；
步骤（3）：加入清洗液清洗，离心。
7.如权利要求6所述的前处理方法，其特征在于，步骤（1）所述待测样品需采用稀释液稀释10~30倍，所述稀释液包括三羟甲基氨基甲烷、氯化钠、ProClin300缓冲液和BSA；步骤（3）所述清洗液包括BSA、吐温-20。
8.一种封闭剂在制备提高基于流式细胞仪同时检测血液样品中CEA、CA125和CA153的检测灵敏度的制剂的用途，其特征在于，所述基于流式细胞仪同时检测血液样品中CEA、CA125和CA153采用如权利要求5所述试剂盒进行检测；所述封闭液包括十二水合磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、ProClin300缓冲液、BSA和马血清。
9.阻断剂在用于制备于流式细胞仪同时检测血液样品中三项肿瘤标志物并消除假阳性的制剂上的用途，其特征在于，所述流式细胞仪同时检测血液样品中三项肿瘤标志物采用如权利要求5所述试剂盒进行检测；所述阻断剂包括小鼠IgG、山羊IgG、TRU-Block、TRU-Block3和MAK33，其中，所述的三项肿瘤标志物为CEA、CA125和CA153。
10.阻断剂在用于制备于流式细胞仪同时检测三项肿瘤标志物并消除类风湿因子1500U/mL，HAMA 2000IU/mL干扰而造成假阳性的制剂上的用途，其特征在于，所述流式细胞仪同时检测血液样品中三项肿瘤标志物采用如权利要求5所述试剂盒进行检测；所述阻断剂包括小鼠IgG、山羊IgG、TRU-Block、TRU-Block3和MAK33，其中，所述的三项肿瘤标志物为CEA、CA125和CA153。
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