CN101201353A - 一种扩展免疫检测可测量范围的方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种在免疫分析中扩展被测物可检测范围的方法和相应的试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及体外免疫分析技术领域,具体地涉及一种检测方法,能扩展目标分析物的可测量范围。
背景技术
在免疫定量检测试验中,可测量范围受检测方法、抗体(或者抗原)性质和抗体(或者抗原)使用量的影响。如果检测方法确定,抗体(或者抗原)原料选定,则测定范围大至也确定,原料使用量只能在小幅度范围内改变测量范围;不同的免疫检测方法对试剂的可测量范围都有局限性,要么灵敏度低,要么检测范围窄,即使采用一些先进的技术平台(比如ECL,FTIR等)也只能小幅度地提高灵敏度和小幅度地增大检测范围。
临床样本(如血清样本)中目标检测物的浓度常常超出试剂盒的高值检测范围,比如甲胎蛋白(AFP)试剂盒的一般测量范围是0到2000ng/ml,但人群中AFP的血清样本值分布范围是0到2000,000ng/ml,而且很多病人血清样本远远高于2000ng/ml,分布在10,000-100,000ng/ml之间,在此种情况下,对于采用一步法(反应时同时加入固定有捕获抗体或抗原的固相载体、血清样本和二抗标记物及信号物质,无洗涤过程)的试剂盒常报告假阴性结果,对于采用多次洗涤的试剂盒,最终只能报告大于试剂盒检测范围的上限而不能给出具体的值。鉴于这种情况,现有试剂盒一般采用多次稀释反复测量的办法给出具体值,这样为工作人员带来大量烦琐工作,同时还增加了检测成本,是现有免疫检测试剂盒的一个瓶颈。
因此本领域需要一种既采用一步法反应(中间无洗涤过程)又能正确报告目标检测物具体浓度值的方法及试剂盒。
发明内容
本发明旨在提供一种方法,它只采用一步法反应,便能准确测定目标检测物的具体浓度值,无论该浓度是在线性范围内的,还是处于HD-Hook效应区的。
在本发明的第一方面,提供了一种扩展免疫检测可测量范围的方法,即在同一反应体系中的两种可相互区别的固相载体上,分别通过双抗夹心法和免疫竞争法测定样品浓度;双抗夹心法测定处于双抗夹心法线性范围内的样品浓度,免疫竞争法测定处于双抗夹心法的线性范围以外的样品浓度。
在另一优选例中,上述的方法包括步骤:
(1)将样品、检测载体和标记了可检测信号的第二抗体混合,形成一反应体系,其中所述的检测载体是带有第一抗体的固相载体,并且所述的第二抗体与第一抗体可同时结合于目标抗原的不同表位,从而形成“第二抗体-抗原-第一抗体-固相载体”四元复合物;
(2)将指示载体加入到步骤(1)的体系中,其中指示载体是带有目标抗原的固相载体,从而在带有可检测信号的第二抗体存在下,形成“第二抗体-抗原-固相载体”三元复合物;
(3)检测反应体系中所述三元复合物中微球上的可检测信号,得到指示载体的信号值,并与无HD-HOOK效应时的指示微球信号值(正常值)比较;
当指示载体测量值小于指示载体正常值时,则判定目标抗原的浓度处于HD-HOOK效应区,并通过三元复合物的标准值或标准曲线比较,确定反应体系中目标抗原的存在与否和/或数量;
当指示载体测量值大于或等于指示载体正常值时,则判定样品中目标抗原的浓度处于非HD-HOOK测量范围,此时通过检测反应体系中所述四元复合物中载体上的可检测信号,并与四元复合物的标准值或标准曲线比较,从而确定反应体系中目标抗原的存在与否和/或数量。
在另一优选例中,所述的抗原或抗体与固相载体之间的结合方式有共价键或配基反应或非特异性吸附。
在另一优选例中,所述的固相载体是带不同荧光或具有不同体积的物体。
在另一优选例中,上述的方法包括步骤:
(a)将样品、检测微球和标记了可检测信号的第二抗体混合,形成一反应体系,其中所述的检测微球是如I式所示的第一抗体-微球的二元复合物,
anti1X-bead (I)
式中,“X”表示目标抗原,“anti1X”表示针对所述目标抗原“X”的第一抗体,“bead”表示微球,“-”表示第一抗体与微球之间的结合方式,
并且所述的第二抗体与第一抗体可同时结合于目标抗原的不同表位,
从而形成“第二抗体-抗原-第一抗体-微球”四元复合物;
(b)将指示微球加入到步骤(a)的体系中,其中指示微球是式II所示的目标抗原-微球的二元复合物,
X-bead’(II)
式中,“bead’”表示可与“bead”互相区别的不同微球,“-”表示目标抗原X与微球之间的结合方式,
从而在带有可检测信号的第二抗体存在下,形成“第二抗体-抗原-微球”三元复合物;
(c)检测反应体系中所述三元复合物中微球上的可检测信号,得到指示微球的信号值,并与无HD-HOOK效应时的指示微球信号值(正常值)比较;
当指示微球测量值小于指示微球正常值时,则判定目标抗原的浓度处于HD-HOOK效应区,并与三元复合物的标准值或标准曲线比较,确定反应体系中目标抗原的存在与否和/或数量;
当指示微球测量值大于或等于指示微球正常值时,则判定样品中目标抗原的浓度处于非HD-HOOK测量范围,此时通过检测反应体系中所述四元复合物中微球上的可检测信号,并与四元复合物的标准值或标准曲线比较,从而确定反应体系中目标抗原的存在与否和/或数量。
在另一优选例中,在步骤(b)中,目标抗原与微球之间的结合方式有共价键或配基反应或非特异性吸附。
在另一优选例中,在步骤(c)中,当指示微球测量值≤0.9×指示微球正常值时,则判定样品存在HD-HOOK效应。
在另一优选例中,所述指示微球正常值是用以下方法确定的:
(a’)将浓度已知且处于测量范围的目标抗原标准品系列分别与所述检测微球、所述带有可检测信号的第二抗体混合,形成一反应体系,从而形成不同目标抗原标准品浓度的“第二抗体-抗原-第一抗体-微球”四元复合物;
(b’)将所述的指示微球加入到步骤(a’)的体系中,从而在带有可检测信号的第二抗体存在下,形成不同目标抗原标准品浓度的“第二抗体-抗原-微球”三元复合物;
(c’)检测所述三元复合物中微球上的可检测信号,以P+2SD为指示微球正常值,式中P表示不同目标抗原标准品浓度时,三元复合物中微球信号值的平均值,2SD为2倍的微球信号值的标准偏差。
在另一优选例中,所述的四元复合物中微球上的可检测信号的标准曲线由下述方法确定:
(i)将浓度已知且处于测量范围的目标抗原标准品系列分别与所述检测微球、所述带有可检测信号的第二抗体混合,形成一反应体系,从而形成不同目标抗原标准品浓度的“第二抗体-抗原-第一抗体-微球”四元复合物;
(ii)检测所述四元复合物中微球上的可检测信号,以其为Y轴,以目标抗原标准品浓度为X轴所得到的曲线为标准曲线。
在另一优选例中,所述的三元复合物中微球上的可检测信号的标准曲线由下述方法确定:
(i’)将浓度已知且超出测量范围的目标抗原标准品系列分别与所述检测微球、所述带有可检测信号的第二抗体混合,形成一反应体系,从而形成不同目标抗原标准品浓度的“第二抗体-抗原-第一抗体-微球”四元复合物;
(ii’)将所述的指示微球加入到步骤(a’)的体系中,从而在带有可检测信号的第二抗体存在下,形成“第二抗体-抗原-微球”三元复合物;
(iii’)检测所述三元复合物中微球上的可检测信号,以其Log值为Y轴,以目标抗原标准品浓度的Log值为X轴所得到的曲线为标准曲线。
在另一优选例中,第一抗体与相应的第二抗体的摩尔比为1∶0.1-2;式II所示的目标抗原-微球的二元复合物与第二抗体的摩尔比为1∶0.1-2。
在另一优选例中,第一抗体与相应的第二抗体的摩尔比为1∶0.8-1.5;式II所示的目标抗原-微球的二元复合物与第二抗体的摩尔比为1∶0.8-1.5。
在另一优选例中,所述的各种微球bead与bead’是带不同荧光的微球。
在另一优选例中,目标抗原数量为1-100种。
在另一优选例中,所述的抗原是蛋白质。
在本发明的第二方面,提供了一种用于检测目标抗原的试剂盒,它包括:容器,说明书,以及分别装于容器中的下列物质:
(1)两种可相互区别的固相载体;
(2)第一抗体和带有可检测信号的第二抗体,所述的第二抗体与第一抗体可同时结合于目标抗原的不同表位;
(3)目标抗原标准品。
在另一优选例中,所述的试剂盒包括:容器,说明书,以及分别装于容器中的下列物质:
(a)检测微球,其中所述的检测微球是如I式所示的第一抗体-微球的二元复合物,
anti1X-bead (I)
式中,“X”表示目标抗原,“anti1X”表示针对所述目标抗原“X”的第一抗体,“bead”表示微球,“-”表示第一抗体与微球之间的结合方式,
(b)带有可检测信号的第二抗体,其中,所述的第二抗体与第一抗体可同时结合于目标抗原的不同表位,
(c)指示微球,所述指示微球是式II所示的目标抗原-微球的二元复合物,
X-bead’(II)
式中,“bead’”表示可与“bead”互相区别的不同微球,“-”表示目标抗原X与微球之间的结合方式。
在另一优选例中,所述的试剂盒中含有针对1-100种目标抗原的相应的检测微球对和带有可检测信号的第二抗体,其中所述的检测微球由检测微球和指示微球组成,并且所述的各种微球bead与bead’是带不同荧光的微球。
据此,本发明提供了一种既采用一步法反应(中间无洗涤过程)又能正确报告目标检测物具体浓度值的方法及试剂盒。
附图说明
图1显示实施例1中的夹心法MMF(Meta-model Frameworks)曲线;曲线方程式为y=(a*b+c*x^d)/(b+x^d),其中a=-155.8,b=383.289,c=12602.2,d=1.06166;S=391.65218121,r=0.99925435。
图2显示实施例1中竞争法双对数曲线;曲线方程式为y=a+bx,其中a=6.1919435,b=-0.753973;S=0.04031135,r=0.99694446。
图3显示实施例2中的夹心法MMF(Meta-model Frameworks)曲线;曲线方程式为y=a(1-exp(-bx),其中a=4475.262,b=0.002951;S=99.08877036,r=0.99910704。
图4显示实施例2中竞争法双对数曲线;曲线方程式为y=a+bx,其中a=5.795542,b=-0.7543;S=0.04040649,r=0.99693273。
具体实施方式
发明人经过广泛而深入的研究,意外地发现在双位点夹心免疫测定的反应体系中加入另一指示微球,通过夹心法MMF曲线和竞争法双对数曲线,无论该检测物的浓度是在非HD-HOOK效应区内,还是处于HD-HOOK效应区,都能有效地定量检测目标检测物,从而大大扩展了一步法反应的有效检测范围。
如本文所用,术语“第一抗体”、“一抗”可互换使用,指可特异性结合于某一抗原(如肿瘤标志物)的一种抗体。
如本文所用,术语“第二抗体”、“二抗”可互换使用,指可特异性结合于某一抗原(如肿瘤标志物)的另一种抗体。例如,对于同一种抗原(如肿瘤标志物)而言,相应的第一抗体和第二抗体是不同的,并且可同时结合于所述的抗原的不同表位。
如本文所用,术语“抗原”指具有免疫原性的物质,例如蛋白质、多肽。代表性的抗原例子包括(但并不限于):细胞因子、肿瘤标志物、金属蛋白类、心血管糖尿病相关蛋白等。
如本文所用,术语“肿瘤标志物”是指在肿瘤的发生和增殖过程中,由肿瘤细胞本身所产生的或者是由机体对肿瘤细胞反应而产生的,反映肿瘤存在和生长的一类物质。代表性的肿瘤标志物包括(但并不限于):甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、癌抗原125(CA125)、糖抗原19-9(CA19-9)、总前列腺特异性抗原(PSA)、游离前列腺特异性抗原(f-PSA)、神经原特异性烯醇化酶(NSE)、糖链抗原(CA242)、癌抗原(CA15-3)、人绒毛膜促性腺激素(β-HCG)。
如本文所用,术语“一步法反应”是指中间没有洗涤过程的双抗体夹心反应。
基本原理
(a)双抗夹心法的原理
双抗夹心免疫检测法的基本原理是本领域技术人员所熟知的。常规的做法是将一抗固定于固相载体,然后一抗与抗原反应,洗涤后再与带有标记的二抗反应,洗涤,最后进行化学发光或酶联显色反应检测信号。
(b)免疫竞争法的原理
免疫竞争检测法的基本原理是本领域技术人员所熟知的。常规的做法是标本中的抗原和一定量的带有标记的抗原竞争性地与固相抗体结合,然后进行化学发光或酶联显色反应检测信号。标本中抗原量含量愈多,结合的标记抗原愈少,最后的检测信号也愈弱。
(c)流式微球免疫检测法的原理
流式微球免疫检测技术是一种非常灵活高效多功能的技术。目前流式微球技术平台主要有Luminex xMAP多功能技术平台,流式细胞仪多功能技术平台(BD公司和贝克曼库尔特(BeckmanCoulter)公司)。它们主要通过不同荧光编码微球或者通过改变微球直径大小来作为多种检测项目的载体,同时通过荧光标记检测物作为被检测物的丰度信号达到同时对多指标进行定量检测。
(I)流式细胞仪技术已经在医院广泛应用,其技术原理也为大家熟知。流式细胞仪应用于流式微球免疫检测技术的原理主要是采用多种不同直径大小的微球作为载体,每种直径大小的微球均可以作为一种检测项目,而且不同项目的微球可以在同一体系中同时进行免疫反应,最后通过仪器识别不同大小的微球和微球上的荧光信号达到同时检测多种项目的目的(即流式细胞仪蛋白芯片:微量样本多指标流式蛋白定量技术Cytometric Bead Array(CBA))。
(II)Luminex xMAP是一个非常灵活的多功能技术平台。其原理是把微小的乳胶颗粒(Beads,简称为“微球”)分别染成不同的荧光色,然后再把针对不同检测物的蛋白(如抗原抗体)以共价方式结合到特定颜色的微球上。应用时,先把针对不同检测物的、用不同颜色编码的微球混合,再加入被检测物(被测物可以是血清中的抗原、抗体、或酶等)。在悬液中的微球与被检测物特异性地结合,并加上荧光标记。然后,微球成单列通过两束激光,一束判定微球的颜色从而决定被测物的特异性(定性);另一束测定微球上的荧光标记强度从而决定被测物的量(定量),所得到的数据经电脑处理后可以直接用来判断结果。
在一个优选例中,充分利用了一抗固定在不同流动微球(Beads)的特点,同时优化藻红蛋白(PE)标记的二抗的浓度,将交联了一抗的微球溶液与血清样本或抗原标准质控品液、PE标记的二抗溶液依次或同时一并加入反应容器中,从而发生以下反应:
①微球上的一抗与血清或标准质控品液中相应的抗原(即肿瘤标志物抗原)结合,形成“肿瘤标志物-第一抗体-微球”三元复合物,
②二抗与血清或标准质控品液中相应的抗原(即肿瘤标志物抗原)结合,最终形成“第二抗体-肿瘤标志物-第一抗体-微球”四元复合物(包括微球交联的一抗-血清相应抗原-PE标记的复合物或微球交联的一抗-标准质控品液的抗原-PE标记的复合物),反应过程中不须离心洗涤,在液相中即可通过LuminexxMAP检测复合物的荧光,达到从反应到定性定量分析一步完成的效果,即:一步法。
在Luminex检测仪上,这些微球被微量液体传送系统排成单列,通过两束激光,一束判定微球的编码从而决定被测肿瘤标志物的种类;另一束测定微球上PE的荧光强度,经数据处理得出被测肿瘤标志物的含量。
关于Luminex xMAP的技术平台详细资料,请参见产品说明书或文献,(1)Cancer Chemotherapy and Pharmacology,51:321-327,(2)Journal ofImmunological Methods,227:41-52;(3)www.luminexcorp.com。
(d)扩展检测范围的原理
本发明基于免疫双抗体夹心方法和免疫竞争法的原理,在同一实验中同时采用双抗体夹心法和免疫竞争法,双抗体夹心法测量低范围的血清样本,这样可以保证检测的灵敏度和正确测量在临床参考值附近的样本。免疫竞争法测量超出双抗夹心测量范围的高值样本。
在一个优选例中,发明人在1种荧光编码的Beads(在此命名为1号Beads)上以共价键方式交联针对某种抗原的一抗;加入血清样本或标准质控品液、藻红蛋白(PE)标记的对应于该种抗原的二抗溶液(正常检测这种抗原浓度,与常规双抗夹心试剂方法相同),同时发生以下反应:①1号Beads上的一抗与血清或标准质控品液中相应的抗原结合,②二抗与血清或标准质控品液中相应的抗原结合,最终形成四元复合物:1号Beads-一抗-血清相应抗原-PE标记的二抗的或1号Beads-一抗-标准质控品液的抗原-PE标记的二抗。
在Luminex检测仪上,荧光编码的Beads被微量液体传送系统排成单列,通过两束激光,一束判定Beads的编码从而决定被测抗原的种类;另一束激发Beads上PE,荧光强度经数据处理得出被测抗原的含量。
在2号荧光编码的Beads(在此命名为2号Beads)上以共价键方式交联被检测抗原纯品;在1号beads和样本、二抗-PE反应结束后加入2号Beads于反应系统中,发生以下反应:2号Beads上的抗原与反应系统中剩余的抗原共同竞争系统中加入的二抗-PE,最终形成三元复合物:2号Beads-抗原-PE标记的二抗。
在Luminex检测仪上,荧光编码的2号与1号beads同时进行处理,Beads被微量液体传送系统排成单列,通过两束激光,一束判定Beads的编码从而决定为2号beads;另一束测定Beads上PE的荧光强度,根据荧光信号强度,经数据处理得出被测抗原的含量。
(e)指示HD-HOOK方法的原理
HD-HOOK效应是指在双位点夹心免疫实验中,其剂量反应曲线的高剂量(HIGH DOSE,HD)区段,线性走向不是呈平台状无限后延,而是向下弯曲状,似一只钩子或一把镰刀(HOOK),根据此现象写实性地称之为″HD-HOOK″效应(Miles LEM,Lipschitz DA,Bieber CP and Cook JD:Measurement of serumferritin by a 2-site immunoradiometric assay.Analyt Biochem 61:209-224,1974.)
产生HD-HOOK效应的分子机理有″分子变构说″和″浓度效应″等推论(《临床免疫学检验的进展》南京军区南京总医院全军医学检验中心,武建国;《ELISA的质量管理》江苏省临床检验中心,许斌;《肿瘤标志物检测的影响因素和应用原则》华中科技大学同济医学院附属协和医院,吴健民)。
在本发明提供的方法中,如果样品中待检测抗原的浓度处于非HD-HOOK区(即样品中含有待检测抗原的数量并不明显大于检测体系中二抗的数量,因此有一部分或较多的二抗呈未结合状态),那么会发生以下反应:2号beads上的抗原与反应系统中剩余的游离的二抗-PE结合,最终形成“2号beads-抗原-PE标记的二抗”的三元复合物。这导致后续检测中,可检测到一定数量的所述三元复合物。
与此相反,如果样品中待检测抗原的浓度超过检测的线性区域而处于HD-HOOK区(即样品中含有目标抗原的数量明显大于检测体系中二抗的数量,则几乎所有的二抗都结合于样品中的目标抗原,故体系中没有或基本上没有未结合状态的二抗),那么2号beads上的抗原将很难遇到与反应系统中剩余的游离的二抗-PE结合,因此难以形成“2号beads-抗原-PE标记的二抗”构成的三元复合物。这导致后续检测中,检测不到“2号beads-抗原-PE标记的二抗”构成的三元复合物或读数很低。
在Luminex检测仪上,荧光编码的2号与1号beads同时进行处理,微球被微量液体传送系统排成单列,通过两束激光,一束判定微球的编码从而决定为2号beads;另一束测定微球上PE的荧光强度,根据荧光信号强弱判断该血清样本是否为HD-HOOK血清样本。如果来自2号beads的荧光强度较低(如低于无HD-HOOK效应时的指示微球荧光信号值(正常值)的90%,较佳地低于50%,更佳地低于30%,最佳地低于10%),则可判定样品中待测抗原的浓度处于HD-HOOK区,即样品是HD-HOOK样品。
下面进一步说明本发明的相关操作细节。
第一抗体-微球的二元复合物(检测微球)
在本发明中,第一抗体-微球的二元复合物具有式(I)结构:
anti1X-bead (I)
式中,X表示肿瘤标志物,anti1X表示抗肿瘤标志物X的第一抗体,bead表示微球,-表示第一抗体与微球之间的共价键;
一抗与微球的交联
针对某种被检测抗原的一抗(anti1X,X代表肿瘤标志物抗原)与微球共价交联的详细操作程序可用常规方法,例如按照Luminex公司的产品说明书或网站:www.luminexcorp.com中所述的方法进行偶连,从而得到不同微球与相应一抗形成偶连物anti1X-Beads。
分别取针对某种抗原的anti1X-Beads,按一定比例混合就可得到第一抗体溶液(简称为A液)。
抗原-微球的二元复合物(指示微球)
按上述类似方法,将被检测抗原纯品与另一种号码的微球共价交联,形成抗原-微球的二元复合物,相应的溶液简称为H液。
二抗的标记
虽然二抗可用各种本领域已知的可检测信号进行标记。然而,优选的是用荧光信号进行标记,尤其是通过生物素-亲和素连接方式标记PE。
在一优选例中,二抗的生物素(Biotin)标记方法如下:分别取针对不同肿瘤标志物抗原的二抗(anti2X,X代表肿瘤标志物抗原)透析纯化后加入生物素二甲基亚砜(DMSO)溶液,避光反应,透析去除未反应的生物素,保存备用。
分别取针对不同肿瘤标志物抗原的生物素标记的anti2X,按比例混合,加入亲和素(Streptavidin)标记的PE,使生物素与Streptavidin结合,生成带荧光素标记的第二抗体(即PE-anti2X,其中PE表示藻红蛋白),得到第二抗体溶液(简称为C液)。
标准
用某种抗原的标准品配制一定浓度范围内的标准品溶液,为B液。
将上述的第一抗体溶液、标准品溶液和第二抗体溶液(即A、B和C液)依次或同时混匀,然后加入H液混匀,充分反应(如在37±50C反应10-100min),随后在luminex100上读数,得到针对某种抗原的不同浓度与对应的荧光信号的1号和2号标准曲线,1号标准曲线是MMF曲线,2号标准曲线是双对数曲线。
如果需要测定样品中的多种抗原,可以根据以上方法得到不同抗原的标准曲线对。
样品的检测
可用本发明方法检测的样品没有特别限制,可以是任何含有抗原的样品,代表性的例子包括血清样本、尿液样本、唾液样本等。优选的样品是血清样品。
将A、人血清样本和C液,H液,混匀370C反应30min,然后在luminex100上读数。如果是非hook样品,则根据1号beads上的荧光信号及MMF曲线换算出低浓度范围的抗原浓度。如果是hook样品,则根据2号beads上的荧光信号及双对数曲线计算出高浓度范围的抗原浓度。
如果同时检测样品中的多种抗原,可以相应地使用多对检测、指示微球,即对每一种抗原可以使用一对检测、指示微球,并且各对检测、指示微球具有不同的编码荧光,从而可以相互区分。
本发明的主要优点在于:
1、极大地扩展了双位点夹心免疫测定的测量范围;
2、一步法反应,无需洗涤,操作简单;
3、非常适用于同时定量检测样品中的多种抗原。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
人血清中甲胎蛋白(AFP)的定量检测
实验材料
针对AFP的一抗和二抗购自上海第二军医大学,
AFP抗原纯品购自Biodesign,
Beads购自Luminex公司,
常规试剂为市售品。
实验方法
1.准备
1.1一抗和AFP抗原预先去除含氨基小分子和杂蛋白(透析或过层析柱),测量其浓度。
1.2在1.5ml聚丙烯离心管中,精确称取5mg左右N-hydroxys μ Lfosuccini-mide(NHSS),备用(防潮)。
1.3在1.5ml聚丙烯离心管中,精确称取5mg左右N-ethyl-N’(3-dimethylainopropyl)-carbodiimide(EDC),备用(防潮)。
2.beads活化
2.1分别取33号和51号beads原液旋涡混旋仪混悬20秒,移取200L beads(相当于2.5×106beads)于两个1.5ml聚丙烯离心管中。
2.215000rpm离心2分钟(设置3分钟),移去上清液。
2.3加入100μL蒸馏水,旋涡混旋仪混悬20秒,15000rpm离心2分钟,移去上清液。
2.4重复2.3。
2.5在两管中分别加入80μL 0.1mol/L磷酸缓冲液(PBS),pH 6.2,旋涡混旋仪混悬20秒。
2.6用蒸馏水将(NHS)稀释至50mg/ml。(现配现用)
2.7分别取10μL 50mg/ml(NHSS)加到两种beads溶液中,旋涡混旋仪混悬20秒。
2.8用蒸馏水将EDC稀释至50mg/ml。(现配现用)
2.9分别取10μL 50mg/ml EDC加到两种beads溶液中,旋涡混旋仪混悬20秒。
2.10避光、37℃孵育20分钟。
2.1115000rpm离心2分钟,移去上清液。
2.12分别加入250μL 50mmol/L 2-(N-morpholino)ethanesμLfonicacid(MES)pH5.0。
2.1315000rpm离心2分钟,移去上清液。
2.14重复2.12,2.13,马上进行下步实验。
3.交联、封闭和储存
3.1取20μg已处理好的AFP一抗加入到已活化的33号beads中;取20μg已处理好的AFP抗原加入到已活化的51号beads中。旋涡混旋仪混悬20秒。
3.2避光、37℃反应2小时,每十五分钟混匀一次。
3.3分别加入1ml PBS-TBN,旋涡混旋仪混悬20秒,15000rpm离心2分钟。移去上清液(PBS-TBN的组成为10mmol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液、0.02%吐温20、1mg/ml的小牛血清白蛋白和0.05%叠氮钠)。
3.4分别加入500μL PBS-TBN,旋涡混旋仪混悬20秒,15000rpm离心2分钟。移去上清液。
3.5分别加入500μL PBS-TBN,旋涡混旋仪混悬20秒。
3.6用显微镜计数两种beads的浓度分别是:
33号:1×106个/ml,51号:1×106个/ml。
3.72-8℃避光保存。
4.二抗的Biotin标记
4.1二抗预处理
二抗中含有叠氮钠、甘氨酸等含氨基的小分子和其它小分子 | 用pH7.4的1×PBS充分透析。 |
二抗中含有牛血清白蛋白等大分子 | Protein A柱或其它柱子纯化。 |
二抗浓度标定 | 分光光度计测其OD280(1OD280相当于0.7mg/ml单克隆抗体)。最终用1×PBS,pH7.4将浓度定于2mg/ml(浓缩使用Pall公司脱盐离心柱)。 |
4.2生物素标记反应
取上述预处理的AFP二抗10μL,加入25μL的1mg/ml NHS-Biotin DMSO溶液,混匀,4℃冰箱避光反应2小时。透析过夜备用。
5.抗原标准品(B液)的配制
用pH7.4的磷酸盐缓冲液配制浓度为10ng/ml、50ng/ml、250ng/ml、1250ng/ml,2500ng/ml,12500ng/ml,50000ng/ml的AFP标准品液。
6.A液的配制
取适量标记了一抗的33号beads加入到1ml pH7.4的磷酸盐缓冲液中,使溶液中约含10000个beads。
7.二抗-PE(C液)的配制
取标记好biotin AFP二抗,加入pH7.4磷酸盐缓冲液中,二抗终浓度为20μg/ml,同时加入Streptavidin标记的PE总浓度为60μg/ml,二抗-PE总体积为5ml,4℃避光保存备用。
8.H液的配制
取适量标记了AFP抗原的51号beads加入到1ml pH7.4的磷酸盐缓冲液中,使溶液中约含10000个beads。
9.人AFP高值血清的检测
9.1收集AFP检测高值>2万ng/ml的人血清样本5份和AFP检测高值<1000ng/ml的人血清样本5份,2ml/份,5000rpm×5min,取上清,备用。
9.2在96孔反应板的8个反应孔内依次加入8个不同浓度的B液各5μL,每孔再分别加入25μL A液及25μL C液,混匀;另选10孔分别加入10种上述人血清样本5μL/孔和25μL/孔A液及25μL/孔C液,混匀;然后加入5μL/孔的H液,混匀;于37℃避光孵箱反应30mins。
9.3孵育完成后于旋涡混旋仪上充分混匀,在Luminex100上读数。
9.4检测结果:
9.4.1得到结合于19号beads和51号beads的标准品和样品的荧光值,见表1。
表1抗原标准品和样品的荧光值
9.4.2由表1中结合于19号beads和51号beads的标准品的荧光值与所对应的浓度得到MMF曲线和双对数曲线,见图1、2和表2、3、4。
表2结合于19号beads的标准品的荧光值
标准品 | 019号beads的荧光值 |
10ng/ml | 105 |
50ng/ml | 1828.5 |
250ng/ml | 5790 |
1250ng/ml | 10749 |
2500ng/ml | 11328 |
表3结合于51号beads的标准品的荧光值
标准品浓度 | 051号beads的荧光值 |
2500ng/ml | 4223 |
12500ng/ml | 1363 |
25000ng/ml | 679 |
50000ng/ml | 463.5 |
表451号beads的标准品的荧光值与所对应的浓度得到双对数值
标准品浓度 | 浓度Log10 | 荧光值Log10 |
2500ng/ml | 3.39794 | 3.625621 |
12500ng/ml | 4.09691 | 3.134496 |
25000ng/ml | 4.39794 | 2.83187 |
50000ng/ml | 4.69897 | 2.66605 |
9.4.3用curxpt曲线计算方法,得到各样品中AFP对应于MMF曲线和双对数曲线的浓度值,见表5。并将所得到的值与雅培公司(Abott)试剂盒所测得的结果进行比较,见表5。
Abott试剂盒购自雅培公司,该项产品使用传统的微粒子酶免法(Micropaticle Enzyme Immunoassay,MEIA)进行检测(产品名称:AFP ReagentPack;产品标准编号:YZB/ABBOTT-IA-014-2004)。
表5curxpt曲线计算结果及与传统产品的比较
曲线类型 | MMF曲线 | 双对数曲线 | abott对照数据 |
项目简称 | AFP | AFP-hook | |
单位 | ng/ml | ng/ml | ng/ml |
参考值 | 20 | 20 | 20 |
ys060524-11 | 6.9 | 2.2 | |
ys060524-12 | 106.6 | 140.39 | |
ys060524-15 | 10261.5 | 13966.8 | |
ys060524-16 | 2116.2 | 1696.78 | |
ys060524-17 | 44579.4 | 40980.8 | |
ys060524-18 | 7.8 | 2.15 | |
ys060524-19 | 6.9 | 2.4 | |
ys060524-22 | 8.0 | 5.15 | |
ys060524-28 | 7.4 | 3.08 | |
ys060524-30 | 6.3 | 1.2 | |
ys060524-31 | 6.8 | 3.17 | |
ys060524-32 | 105688.5 | 73441 | |
ys060524-33 | 56404.8 | 54436.1 |
ys060524-34 | 28.2 | 25.13 | |
ys060524-35 | 18223.9 | 15829.2 | |
ys060524-36 | 10.2 | 7.6 | |
ys060524-38 | 8.6 | 4.54 | |
ys060524-39 | 9.1 | 5.94 | |
ys060524-40 | 5.9 | 1.27 | |
ys060524-42 | 19289.2 | 10938.8 | |
ys060524-43 | 14.9 | 14.07 | |
ys060524-45 | 6.0 | 1.91 | |
ys060526-3 | 32.2 | 51.57 | |
ys060526-5 | 187553.4 | 230444 | |
ys060526-13 | 19.0 | 18 | |
ys060526-15 | 9.5 | 6.62 | |
ys060526-18 | 8.5 | 4.02 | |
ys060526-20 | 11811.1 | 18209.7 | |
ys060526-21 | 22.9 | 20.38 | |
ys060526-32 | 11664.7 | 34368.9 |
9.5结果判定
首先判断样本的HOOK情况,如果样本为HOOK则采用竞争法双对数曲线计算如样本ys060524-15,ys060524-16等;如果样本为非HOOK样本则采用MMF曲线计算如样本ys060524-11,ys060524-12等。实验结果通过统计学计算与对照比较CV<15%(P<0.5)。
结果表明,本发明提供的方法是一种很有效的扩展免疫检测可测量范围的方法。
实施例2
人血清中甲胎蛋白(AFP)的定量检测(微量样本多指标流式蛋白定量技术Cytometric Bead Array(CBA))
实验材料
针对AFP的一抗和二抗购自上海第二军医大学,
AFP抗原纯品购自Biodesign,
Beads购自BD公司
BD FACSCalibur,
常规试剂为市售品。
实验方法
1.准备
1.1一抗和AFP抗原预先去除含氨基小分子和杂蛋白(透析或过层析柱),测量其浓度。
1.2在1.5ml聚丙烯离心管中,精确称取5mg左右N-hydroxysμLfosuccini-mide(NHSS),备用(防潮)。
1.3在1.5ml聚丙烯离心管中,精确称取5mg左右N-ethyl-N’(3-dimethylainopropyl)-carbodiimide(EDC),备用(防潮)。
2.beads活化
2.1分别取5um和8um直径的beads原液旋涡混旋仪混悬20秒,移取200μL beads(相当于2.5×106beads)于两个1.5ml聚丙烯离心管中。
2.215000rpm离心2分钟(设置3分钟),移去上清液。
2.3加入100μL蒸馏水,旋涡混旋仪混悬20秒,15000rpm离心2分钟,移去上清液。
2.4重复2.3。
2.5在两管中分别加入80μL 0.1mol/L磷酸缓冲液(PBS),pH 6.2,旋涡混旋仪混悬20秒。
2.6用蒸馏水将(NHS)稀释至50mg/ml。(现配现用)
2.7分别取10μL 50mg/ml(NHSS)加到两种beads溶液中,旋涡混旋仪混悬20秒。
2.8用蒸馏水将EDC稀释至50mg/ml。(现配现用)
2.9分别取10μL 50mg/ml EDC加到两种beads溶液中,旋涡混旋仪混悬20秒。
2.10避光、37℃孵育20分钟。
2.1115000rpm离心2分钟,移去上清液。
2.12分别加入250μL 50mmol/L 2-(N-morpholino)ethanesμLfonicacid(MES)pH5.0。
2.1315000rpm离心2分钟,移去上清液。
2.14重复2.12,2.13,马上进行下步实验。
3.交联、封闭和储存
3.1取20μg已处理好的AFP一抗加入到已活化的5um beads中;取20μg已处理好的AFP抗原加入到已活化的8um beads中。旋涡混旋仪混悬20秒。
3.2避光、37℃反应2小时,每十五分钟混匀一次。
3.3分别加入1ml PBS-TBN,旋涡混旋仪混悬20秒,15000rpm离心2分钟。移去上清液(PBS-TBN的组成为10mmol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液、0.02%吐温20、1mg/ml的小牛血清白蛋白和0.05%叠氮钠)。
3.4分别加入500μL PBS-TBN,旋涡混旋仪混悬20秒,15000rpm离心2分钟。移去上清液。
3.5分别加入500μL PBS-TBN,旋涡混旋仪混悬20秒。
3.6用显微镜计数两种beads的浓度分别是:
5um Beads:1×106个/ml,8um Beads:1×106个/ml。
3.72-8℃避光保存。
4.二抗的Biotin标记
4.1二抗预处理
二抗中含有叠氮钠、甘氨酸等含氨基的小分子和其它小分子 | 用pH7.4的1×PBS充分透析。 |
二抗中含有牛血清白蛋白等大分子 | Protein A柱或其它柱子纯化。 |
二抗浓度标定 | 分光光度计测其OD280(1OD280相当于0.7mg/ml单克隆抗体)。最终用1×PBS,pH7.4将浓度定于2mg/ml(浓缩使用Pall公司脱盐离心柱)。 |
4.2生物素标记反应
取上述预处理的AFP二抗10μL,加入25μL的1mg/ml NHS-Biotin DMSO溶液,混匀,4℃冰箱避光反应2小时。透析过夜备用。
5.抗原标准品(B液)的配制
用pH7.4的磷酸盐缓冲液配制浓度为10ng/ml、50ng/ml、250ng/ml、1250ng/ml,2500ng/ml,12500ng/ml,50000ng/ml的AFP标准品液。
6.A液的配制
取适量标记了一抗的5um Beads加入到1ml pH7.4的磷酸盐缓冲液中,使溶液中约含10000个beads。
7.二抗-PE(C液)的配制
取标记好biotin AFP二抗,加入pH7.4磷酸盐缓冲液中,二抗终浓度为20μg/ml,同时加入Streptavidin标记的PE总浓度为60μg/ml,二抗-PE总体积为5ml,4℃避光保存备用。
8.H液的配制
取适量标记了AFP抗原的8um beads加入到1ml pH7.4的磷酸盐缓冲液中,使溶液中约含10000个beads。
9.人AFP高值血清的检测
9.1收集AFP检测高值>2万ng/ml的人血清样本5份和AFP检测高值<1000ng/ml的人血清样本5份,2ml/份,5000rpm×5min,取上清,备用。
9.2在96孔反应板的8个反应孔内依次加入8个不同浓度的B液各5μL,每孔再分别加入25μL A液及25μL C液,混匀;另选10孔分别加入10种上述人血清样本5μL/孔和25μL/孔A液及25μL/孔C液,混匀;然后加入5μL/孔的H液,混匀;于37℃避光孵箱反应30mins。
9.3孵育完成后于旋涡混旋仪上充分混匀,在流式细胞仪上读数。
9.4检测结果:
9.4.1得到结合于5μm beads和8μm beads的标准品和样品的荧光值,见表3。
表3抗原标准品和样品的荧光值
9.4.2由表3中结合于5μm beads和8μm beads的标准品的荧光值与所对应的浓度得到MMF曲线和双对数曲线,见图3、4和表4-6。
表4结合于5μm beads的标准品的荧光值
标准品 | 5μm beads的荧光值 |
10ng/ml | 42.00 |
50ng/ml | 731.40 |
250ng/ml | 2316.00 |
1250ng/ml | 4299.60 |
2500ng/ml | 4531.20 |
表5结合于8μm beads的标准品的荧光值
标准品浓度 | 8μm beads的荧光值 |
2500ng/ml | 1689.20 |
12500ng/ml | 545.20 |
25000ng/ml | 271.60 |
50000ng/ml | 185.40 |
表6 51号beads的标准品的荧光值与所对应的浓度得到双对数值
标准品浓度 | 浓度Log10 | 荧光值Log10 |
2500ng/ml | 3.39794 | 3.228 |
12500ng/ml | 4.09691 | 2.737 |
25000ng/ml | 4.39794 | 2.434 |
50000ng/ml | 4.69897 | 2.268 |
9.4.3用curxpt曲线计算方法,得到各样品中AFP对应于MMF曲线和双对数曲线的浓度值,见表7。并将所得到的值与雅培公司(Abott)试剂盒所测得的结果进行比较,见表7。
Abott试剂盒购自雅培公司,该项产品使用传统的微粒子酶免法(Micropaticle Enzyme Immunoassay,MEIA)方法进行检测(产品名称:AFPReagent Pack;产品标准编号:YZB/ABBOTT-IA-014-2004)。
表7curxpt曲线计算结果及与传统产品的比较
曲线类型 | 指数函数曲线 | 双对数曲线 | abott对照数据 |
项目简称 | AFP | AFP-hook |
单位 | ng/ml | ng/ml | ng/ml |
参考值 | 20 | 20 | 20 |
ys060524-11 | 2.92 | 2.2 | |
ys060524-12 | 118.30 | 140.39 | |
ys060524-15 | 10268.17 | 13966.8 | |
ys060524-16 | 2119.03 | 1696.78 | |
ys060524-17 | 44579.92 | 40980.8 | |
ys060524-18 | 4.05 | 2.15 | |
ys060524-19 | 2.97 | 2.4 | |
ys060524-22 | 4.24 | 5.15 | |
ys060524-28 | 3.56 | 3.08 | |
ys060524-30 | 2.23 | 1.2 | |
ys060524-31 | 2.86 | 3.17 | |
ys060524-32 | 105649.77 | 73441 | |
ys060524-33 | 56399.62 | 54436.1 | |
ys060524-34 | 28.47 | 25.13 | |
ys060524-35 | 18231.24 | 15829.2 | |
ys060524-36 | 6.84 | 7.6 | |
ys060524-38 | 5.00 | 4.54 | |
ys060524-39 | 5.57 | 5.94 | |
ys060524-40 | 1.82 | 1.27 | |
ys060524-42 | 19296.46 | 10938.8 | |
ys060524-43 | 12.46 | 14.07 | |
ys060524-45 | 1.88 | 1.91 | |
ys060526-3 | 33.24 | 51.57 | |
ys060526-5 | 187437.76 | 230444 | |
ys060526-13 | 17.37 | 18 | |
ys060526-15 | 5.99 | 6.62 | |
ys060526-18 | 4.88 | 4.02 | |
ys060526-20 | 11818.08 | 18209.7 | |
ys060526-21 | 22.09 | 20.38 | |
ys060526-32 | 11671.66 | 34368.9 |
9.5结果判定
首先判断样本的HOOK情况,如果样本为HOOK则采用竞争法双对数曲线计算如样本ys060524-15,ys060524-16等;如果样本为非HOOK样本则采用MMF曲线计算如样本ys060524-11,ys060524-12等。实验结果通过统计学计算与对照比较CV<15%(P<0.5)。
结果表明,本发明提供的方法是一种很有效的扩展免疫检测可测量范围的方法。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种扩展免疫检测可测量范围的方法,其特征在于,在同一反应体系中的两种可相互区别的固相载体上,分别通过双抗夹心法和免疫竞争法测定样品浓度;双抗夹心法测定处于双抗夹心法线性范围内的样品浓度,免疫竞争法测定处于双抗夹心法的线性范围以外的样品浓度。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,它包括步骤:
(1)将样品、检测载体和标记了可检测信号的第二抗体混合,形成一反应体系,其中所述的检测载体是带有第一抗体的固相载体,并且所述的第二抗体与第一抗体可同时结合于目标抗原的不同表位,从而形成“第二抗体-抗原-第一抗体-固相载体”四元复合物;
(2)将指示载体加入到步骤(1)的体系中,其中指示载体是带有目标抗原的固相载体,从而在带有可检测信号的第二抗体存在下,形成“第二抗体-抗原-固相载体”三元复合物;
(3)检测反应体系中所述三元复合物中微球上的可检测信号,得到指示载体的信号值,并与无HD-HOOK效应时的指示微球信号值(正常值)比较;
当指示载体测量值小于指示载体正常值时,则判定目标抗原的浓度处于HD-HOOK效应区,并通过三元复合物的标准值或标准曲线比较,确定反应体系中目标抗原的存在与否和/或数量;
当指示载体测量值大于或等于指示载体正常值时,则判定样品中目标抗原的浓度处于非HD-HOOK测量范围,此时通过检测反应体系中所述四元复合物中载体上的可检测信号,并与四元复合物的标准值或标准曲线比较,从而确定反应体系中目标抗原的存在与否和/或数量。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,它包括步骤:
(a)将样品、检测微球和标记了可检测信号的第二抗体混合,形成一反应体系,其中所述的检测微球是如I式所示的第一抗体-微球的二元复合物,
anti1X-bead (I)
式中,“X”表示目标抗原,“anti1X”表示针对所述目标抗原“X”的第一抗体,“bead”表示微球,“-”表示第一抗体与微球之间的结合方式,
并且所述的第二抗体与第一抗体可同时结合于目标抗原的不同表位,
从而形成“第二抗体-抗原-第一抗体-微球”四元复合物;
(b)将指示微球加入到步骤(a)的体系中,其中指示微球是式II所示的目标抗原-微球的二元复合物,
X-bead’(II)
式中,“bead’”表示可与“bead”互相区别的不同微球,“-”表示目标抗原X与微球之间的结合方式,
从而在带有可检测信号的第二抗体存在下,形成“第二抗体-抗原-微球”三元复合物;
(c)检测反应体系中所述三元复合物中微球上的可检测信号,得到指示微球的信号值,并与无HD-HOOK效应时的指示微球信号值(正常值)比较;
当指示微球测量值小于指示微球正常值时,则判定目标抗原的浓度处于HD-HOOK效应区,并与三元复合物的标准值或标准曲线比较,确定反应体系中目标抗原的存在与否和/或数量;
当指示微球测量值大于或等于指示微球正常值时,则判定样品中目标抗原的浓度处于非HD-HOOK测量范围,此时通过检测反应体系中所述四元复合物中微球上的可检测信号,并与四元复合物的标准值或标准曲线比较,从而确定反应体系中目标抗原的存在与否和/或数量。
4.如权利要求3所述的方法,其特征在于,在步骤(c)中,当指示微球测量值≤0.9×指示微球正常值时,则判定样品存在HD-HOOK效应。
5.如权利要求3所述的方法,其特征在于,所述指示微球正常值是用以下方法确定的:
(a’)将浓度已知且处于测量范围的目标抗原标准品系列分别与所述检测微球、所述带有可检测信号的第二抗体混合,形成一反应体系,从而形成不同目标抗原标准品浓度的“第二抗体-抗原-第一抗体-微球”四元复合物;
(b’)将所述的指示微球加入到步骤(a’)的体系中,从而在带有可检测信号的第二抗体存在下,形成不同目标抗原标准品浓度的“第二抗体-抗原-微球”三元复合物;
(c’)检测所述三元复合物中微球上的可检测信号,以P+2SD为指示微球正常值,式中P表示不同目标抗原标准品浓度时,三元复合物中微球信号值的平均值,2SD为2倍的微球信号值的标准偏差。
6.如权利要求3所述的方法,其特征在于,所述的四元复合物中微球上的可检测信号的标准曲线由下述方法确定:
(i)将浓度已知且处于测量范围的目标抗原标准品系列分别与所述检测微球、所述带有可检测信号的第二抗体混合,形成一反应体系,从而形成不同目标抗原标准品浓度的“第二抗体-抗原-第一抗体-微球”四元复合物;
(ii)检测所述四元复合物中微球上的可检测信号,以其为Y轴,以目标抗原标准品浓度为X轴所得到的曲线为标准曲线。
7.如权利要求3所述的方法,其特征在于,所述的三元复合物中微球上的可检测信号的标准曲线由下述方法确定:
(i’)将浓度已知且超出测量范围的目标抗原标准品系列分别与所述检测微球、所述带有可检测信号的第二抗体混合,形成一反应体系,从而形成不同目标抗原标准品浓度的“第二抗体-抗原-第一抗体-微球”四元复合物;
(ii’)将所述的指示微球加入到步骤(a’)的体系中,从而在带有可检测信号的第二抗体存在下,形成“第二抗体-抗原-微球”三元复合物;
(iii’)检测所述三元复合物中微球上的可检测信号,以其Log值为Y轴,以目标抗原标准品浓度的Log值为X轴所得到的曲线为标准曲线。
8.如权利要求3所述的方法,其特征在于,第一抗体与相应的第二抗体的摩尔比为1∶0.1-2;式II所示的目标抗原-微球的二元复合物与第二抗体的摩尔比为1∶0.1-2。
9.一种用于检测目标抗原的试剂盒,其特征在于,它包括:容器,说明书,以及分别装于容器中的下列物质:
(1)两种可相互区别的固相载体;
(2)第一抗体和带有可检测信号的第二抗体,所述的第二抗体与第一抗体可同时结合于目标抗原的不同表位;
(3)目标抗原标准品。
10.如权利要求9所述的试剂盒,其特征在于,它包括:容器,说明书,以及分别装于容器中的下列物质:
(a)检测微球,其中所述的检测微球是如I式所示的第一抗体-微球的二元复合物,
anti1X-bead (I)
式中,“X”表示目标抗原,“anti1X”表示针对所述目标抗原“X”的第一抗体,“bead”表示微球,“-”表示第一抗体与微球之间的结合方式,
(b)带有可检测信号的第二抗体,其中,所述的第二抗体与第一抗体可同时结合于目标抗原的不同表位,
(c)指示微球,所述指示微球是式II所示的目标抗原-微球的二元复合物,
X-bead’(II)
式中,“bead’”表示可与“bead”互相区别的不同微球,“-”表示目标抗原X与微球之间的结合方式。
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