CN101858912B - 联合分型检测猪传染性胸膜肺炎抗体的方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种联合分型检测猪传染性胸膜肺炎抗体的方法，包括如下步骤：首先制备胸膜肺炎放线杆菌多糖抗原，制备兔抗胸膜肺炎放线杆菌高免血清并纯化；然后用纯化的兔抗胸膜肺炎放线杆菌高免血清偶联液相芯片微球，根据双夹心ELISA原理，建立分型检测猪胸膜肺炎抗体的液相芯片方法，并确定最佳试验条件；最后通过统计学分析确定液相芯片阴阳判定的阈值。此外，本发明还公开了一种液相芯片联合分型检测猪传染性胸膜肺炎抗体的试剂盒。本发明可同时分型检测猪传染性胸膜肺炎S1-S7型血清抗体，整个反应可在3小时内完成，其快速、敏感、特异和同步检测多个血清型的特点可用于进出境种猪初筛、国内猪场猪传染性胸膜肺炎的诊断和监测。

Description

联合分型检测猪传染性胸膜肺炎抗体的方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及农业和动物检疫技术领域，具体涉及一种联合分型检测猪传染性胸膜肺炎抗体的方法；此外，本发明还涉及一种液相芯片联合分型检测猪传染性胸膜肺炎抗体的试剂盒。

背景技术

猪传染性胸膜肺炎(Porcine contagious pleuropneumoniae)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，简称App)引起的猪的一种呼吸道传染病，具有高度传染性，多呈最急性或急性病程而迅速致死，其发病率和死亡率都在50％以上，最急性型的死亡率可高达80-100％，慢性型可导致猪生长缓慢，成为僵猪，该病是集约化猪场常见猪病之一。该病是很多国家进口种猪必检的猪病之一，我国曾多次从美国、丹麦、英国等进口种猪中检出猪传染性胸膜肺炎。根据胸膜肺炎放线杆菌可溶性抗原荚膜多糖和脂多糖抗原性的差异，可将其分为15个血清型。血清学抗体检测是最重要的诊断方法之一。现有的血清学检测方法或多或少都存在一定缺陷。App抗体的检测方法有补体结合试验、血凝抑制试验、ELISA试验等。补体结合试验特异性强，但实验操作很繁琐，需要有经验的专业技术人员。ELISA方法快速、敏感，是最常用的方法。这些检测方法有的可以单独分型检测App抗体，有的可以检测包含所有型的App抗体，但都不能同时分型检测App抗体。由于App各型之间没有完全的交叉保护，准确诊断感染血清型是预防和控制该病的基础。如果对每个样本都进行15个血清型的检测，操作繁琐，工作量相当大，灵敏度较差，难以实施，不能真正满足临床诊断检测的需要。而固相生物芯片技术存在着可重复性差、灵敏度不够好以及操作繁琐的缺点。

液相芯片技术(xMAP)是一种可广泛应用于蛋白质、基因、受体/配体等多种生物反应的生物芯片技术平台，主要包括微球、探针分子、被检测物和报告分子四种成分。在微球的制造过程当中，掺入了两种不同的红色分类荧光，根据这两种荧光的比例不同，把球形基质分为100种，可以标记上100种不同的探针分子，能同时对一个样品中多达100种不同的目标分子进行检测。反应过程中，探针和报告分子都分别与目标分子特异性结合。反应结束后，使单个的微球通过检测通道，使用红、绿双色激光同时对微球上的红色分类荧光和报告分子上的绿色报告荧光进行检测，可确定所结合的检测物的种类和数量。

本发明基于液相芯片技术的高灵敏度、高通量、检测迅速等突出优点，对App抗体进行联合分型检测，能够在临床检测上得到更好的应用。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中的不足，提供一种可同时联合分型检测猪传染性胸膜肺炎抗体的方法，该方法解决了App分型检测耗时、成本高、使用血清量大等问题，该方法的建立可满足进出口种猪检疫、快速、准确的要求，同时，为我国养猪业在预防与控制猪传染性胸膜肺炎上提供一种新的适用方法。为此，本发明还提供一种联合分型检测猪传染性胸膜肺炎抗体的试剂盒。

本发明是通过以下技术方案实现的：

在本发明的一方面，提供一种联合分型检测猪传染性胸膜肺炎抗体的方法，具体步骤包括：

①制备胸膜肺炎放线杆菌(胸膜肺炎放线杆菌简称App)多糖抗原；

②制备兔抗胸膜肺炎放线杆菌(App)高免血清并纯化；

③制备阴性血清池；

④利用步骤①和②得到的多糖抗原和纯化的兔抗胸膜肺炎放线杆菌高免血清建立双夹心ELISA方法用以初步获得多糖抗原的工作浓度以及样本血清稀释度；

⑤使用步骤②纯化的兔抗App高免血清与液相芯片的微球偶联；

⑥采用液相芯片分型检测猪传染性胸膜肺炎抗体；

⑦确定猪传染性胸膜肺炎液相芯片检测阴性或阳性标准判定的阈值。

步骤①中，所述的胸膜肺炎放线杆菌多糖抗原的制备方法具体为：将App标准参考菌株涂布接种于有0.1％NAD的TSCA培养基上，37℃，放置5％CO₂培养箱中培养6h，用含0.5％福尔马林(甲醛)的生理盐水洗脱下来收集于瓶中，放置于4℃，过夜；次日，8000r/min，离心15min去上清，沉淀用生理盐水重悬并调整菌液浓度为10¹⁰CFU/mL。将重新混悬的菌液放置于100℃水浴中作用1h，冷却后，20000g，离心20min，保留上清。用0.22μm的滤膜过滤上清液，滤液即为多糖抗原。分装，放-20℃保存备用。

步骤②中，所述的兔抗胸膜肺炎放线杆菌高免血清的制备和纯化方法具体为：将胸膜肺炎放线杆菌6h的培养物加含0.8％福尔马林(甲醛)的生理盐水37℃灭活24h，离心去甲醛，0.01M PBS(pH7.4)重悬至2x10⁵CFU/mL，加入等体积弗氏不完全佐剂乳化后，分点皮下注射健康成年新西兰兔，每只体重约2kg，1mL/只，2周后静脉注射活菌0.5mL，每周2次，共注射3周。静脉注射第一次用1×10⁹CFU/mL的菌液，以后用2×10⁹CFU/mL的菌液。最后一次注射1周后心脏采血，分离血清小份量分装，-20℃保存备用。用改良的辛酸-硫酸铵提纯抗体的方法，纯化兔抗App高免血清，并用琼脂扩散试验测定免疫后的兔抗胸膜肺炎放线杆菌高免血清的抗体效价(该抗体效价大于或等于1∶32)。

步骤③中，所述的阴性血清池的制备具体方法为：将不同来源、不同大小的阴性猪血清混合在一起，混匀分装，作为阴性标准。

步骤④中，所述的双夹心ELISA方法滴定抗原浓度和待检样品的稀释度具体方法为：提纯的兔抗App高免血清经1∶100～1∶3200倍比稀释，相应血清型的App多糖抗原按1∶100～1∶3200倍比稀释，标准猪阳性血清按1∶100或1∶400稀释，进行方阵滴定，测定App多糖抗原的最佳稀释度以及样本血清稀释度。

步骤⑤中，所述的兔抗App高免血清与微球偶联，具体为：将4℃保存的微球放置于室温20～30min，涡旋微球(2～3min为宜)，按需要量(如包被的微球量可做200次检测，每次检测需要2000个微球，则需要4×10⁵个微球。微球的商品包装规格为1.25×10⁷/mL，则这次包被需要微球为32μL)吸取荧光微球加入到1.5毫升的离心管中，13000r/min离心4min去除保护液，用三蒸水洗涤后，用400μL 0.1M pH 6.2磷酸缓冲液重悬微球。加入10μL 50mg/mL Sulfo-NHS和10μL 50mg/ml EDC，混匀后37℃作用20min。离心去上清，将微球用900μL 0.05M MES重新悬浮，离心去上清，洗涤微球两次。用400μL 0.05M MES重悬微球，加入提纯的兔抗App高免血清，混匀后37℃作用2～3h(期间，每隔15min涡旋混匀一次)。离心去上清，加入900μL PBS-TBN(含有0.05％Tween-20、0.1％BSA、0.05％叠氮钠的0.01M PBS)重悬微球，混匀后离心去上清，洗涤微球两次。加入200μL PBS-TBN重悬微球。用血细胞计数器进行计数。

步骤⑥中，所述的采用液相芯片分型联合检测猪传染性胸膜肺炎抗体方法具体操作步骤为：

(a)包被好的微球(偶联有兔抗胸膜肺炎放线杆菌IgG的微球)放置室温20～30min，涡旋微球(2～3min为宜)，按每次试验需要2000个微球的量取微球1μL，加入App多糖抗原，总体积为50μL。37℃振荡作用45min；

(b)13000r/min离心3min去上清，用200μL PBS-TBN重悬微球，洗涤微球1次，离心去上清；

(c)加入稀释的待检猪血清，50μL，同时设猪阳、阴性血清对照。37℃振荡作用45min。离心去上清，用200μL PBS-TBN重悬微球，洗涤微球2次，离心去上清；

(d)加入生物素标记兔抗猪IgG(5μg/mL)与PE标记的链亲和素(7.5μg/mL)的混合物，25μL。37℃作用30min。

(e)加入100μL纯水，将悬液转移至96孔酶标反应板，通过Bio-plex^TM200system仪器检测荧光强度值(median fluorescenceintensity，MFI)，并用Bio-Plex Manager5.0软件分析数据。

步骤⑥中，所述的采用液相芯片分型联合检测猪传染性胸膜肺炎抗体参照在步骤④中确定的多糖抗原的工作浓度和样本血清稀释度，在此基础上倍比稀释上下两个梯度，测定胸膜肺炎放线杆菌血清多糖抗原的最佳稀释度以及样本血清的最佳稀释度；可以同时检测胸膜肺炎放线杆菌S1-S7型抗体，其反应条件为：液相芯片联合检测胸膜肺炎放线杆菌S1-S7型最佳抗原浓度为S1型为1∶100，S2型为1∶1600，S3型为1∶800，S4型为1∶200，S5型为1∶200，S6型为1∶400，S7型为1∶1600；待测猪血清的最佳稀释度为1∶400。

步骤⑦中，所述的液相芯片分型联合检测方法确定阳性阴性的判定标准具体为：对已知的阴性猪血清进行测定，对检测结果进行统计分析，计算标准差。根据统计学原理，约有99％的观测值在平均数左右三倍标准偏差范围内。3倍标准差加上阴性血清池的荧光值即为判定阈值，大于阈值的为阳性，小于阈值的为阴性。

在本发明的另一方面，还提供一种联合分型检测猪传染性胸膜肺炎抗体的试剂盒，包括以下主要组成成分：

(1)偶联抗体的微球：含有分别偶联了兔抗胸膜肺炎放线杆菌不同血清型抗体的各种微球，每种抗体分别抗一种胸膜肺炎放线杆菌血清型并且偶联于不同编号的微球，形成“抗体-微球”的二联复合体；

(2)与上述胸膜肺炎放线杆菌不同血清型对应的多糖抗原；

(3)生物素标记兔抗猪IgG与PE标记的链亲和素的混合物；

(4)阳性血清对照和阴性血清对照。

优选地，所述偶联抗体的微球分别是：偶联了兔抗胸膜肺炎放线杆菌S1型抗体的微球，偶联了兔抗胸膜肺炎放线杆菌S2型抗体的微球，偶联了兔抗胸膜肺炎放线杆菌S3型抗体的微球，偶联了兔抗胸膜肺炎放线杆菌S4型抗体的微球，偶联了兔抗胸膜肺炎放线杆菌S5型抗体的微球，偶联了兔抗胸膜肺炎放线杆菌S6型抗体的微球，偶联了兔抗胸膜肺炎放线杆菌S7型抗体的微球；所述多糖抗原是胸膜肺炎放线杆菌S1型-S7型多糖抗原。

上述联合分型检测猪传染性胸膜肺炎抗体的方法使用了液相蛋白芯片技术，该技术使用了特定的荧光微球，这些微球以聚苯乙烯为基质，根据荧光染料的比例不同，可将微球分为100种，从而可标记上100种探针分子，不同微球上的探针分子与样品中需要检测的各种目标分子进行特异性结合，报告分子与目标分子特异性结合，即构成了液相芯片系统，能同时对一个样品中多达100种不同目标分子进行检测。与传统的检测诊断方法相比，液相蛋白芯片技术具有如下优点：1.灵敏度高、特异性强、稳定性好、重复性好：液相蛋白芯片的灵敏度是常规的ELISA方法的灵敏度10～100倍；液相蛋白芯片杂交发生在准均相的液体环境中，在反应中液相环境更有利于保持蛋白质的天然构象，不仅有利于探针和被检测物的反应，也更能保证反应的特异性和稳定性；检测系统中的两束激光同时分别检测微球分类荧光(特异性)和报告荧光(敏感性)，只有与分类荧光同时出现的报告荧光信号才被检测记录，更加提高了结果的特异性。液相蛋白芯片技术在对每个指标的检测中，在同一个反应体系中有其相对应的1000～5000颗相同的微球。检测时，抽取其中的100～500颗微球读数，最终的数据是取其所有值的中位数，这样可以把误差减到最小，从而使检测结果重复性好。2.样本需要量小，成本相对较低：液相蛋白芯片技术的血清用量较ELISA法、化学发光法、电化学发光法要少得多。液相蛋白芯片中微球表面积大，单个微球可结合多达约(1～2)×10⁶个目标分子，因此只需极少量样品即可同时进行多种成分检测，便于临床采样分析；同时试剂用量少，所需成本较低，可节约成本，减少人力消耗。3.反应快速，耗时短：液相蛋白芯片技术的反应环境为液相，微球上固定的探针(或抗体)与待检样品均在溶液中反应，其彼此间碰撞几率与速度相对于固相芯片或ELISA等反应模式可增加10倍以上，反应时间甚至可缩短到十几分钟，因此可提高反应速度。而且微球直径很小(约5～6μm)，容易混悬在液体中，为生物分子反应提供近似生理的液相环境，反应快速、充分、需时短。抗原-抗体等蛋白质分子相互作用的结果可在瞬间经流式细胞检测系统判定后由电脑以数据信息的形式记录下来，更节省了反应过程的时间。4.高通量：可进行多元化分析，适用范围广，目前商业化微球采用双色荧光编码技术，可同时对100种目标分子进行检测。一次可以同时检测多种指标，这与传统方法的逐个检测相比是一个质的飞跃；通过对微球表面的修饰，微球表面可以包被抗体、抗原、细胞因子、蛋白质或核酸、配体、受体等各种抗体或受体分子，从而满足不同检测和功能的研究需要，可适用于各种分析研究；强大的软件分析系统和高通量检测系统，更方便快捷直观地获得更多信息。

与现有技术相比，本发明使用高通量的液相蛋白芯片技术，可以同时检测S1-S7型App血清抗体，解决了App分型检测耗时、成本高、使用血清量大、以及检测单一血清型容易出现漏检其它血清型等问题，也为进一步同时检测所有15个血清型App奠定了基础，为App的检测提供了理想的方法。且本发明可以根据需要进行灵活组合，联合检测，且操作简单，用时短，传统的血清学诊断方法无法做到这点。利用该发明可以快速、廉价、准确地检测猪传染性胸膜肺炎抗体，整个反应可以在3小时内完成，其快速、敏感、特异和同步检测多个血清型的特点可以应用于进出境种猪初筛、国内猪场猪传染性胸膜肺炎的诊断和监测。该方法的建立可满足进出口种猪检疫、快速、准确的要求，同时，为我国养猪业在预防与控制猪传染性胸膜肺炎上提供一种新的适用方法。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明：本实施例在本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如杜平等在《医用实验病毒学》(北京人民军医出版社，1985)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

1.制备胸膜肺炎放线杆菌S1-S7型多糖抗原

将冻干保存的App血清S1-S7型标准参考菌株(丹麦国家兽医研究所赠送)划线接种于涂布有0.1％烟碱腺嘌呤二核苷酸(NAD，购自国药集团化学试剂有限公司)的TSCA培养基(该TSCA培养基由本实验室配制：取40gTSA(Tryptic Soy Agar，DIFCO^TM)琼脂粉，溶于1000mL去离子水中，搅拌加热溶解，煮沸1min至完全溶解后121℃高压灭菌15min，冷却到40℃～50℃，加8％(V/V)的脱纤绵羊血(购自上海闽行区诸翟无菌动物血试剂供应站)和0.15％的葡萄糖(W/V)，于80℃～82℃水浴10min～12min，培养基颜色由血红色变为巧克力色，出现细小颗粒。冷却到60℃左右，加入10％的(V/V)酵母浸液，混匀倒平皿，4℃保存备用)上，放置37℃，5％CO₂培养箱中培养。次日，挑取单个菌落，划线接种于新的TSCA(含0.1％NAD)培养基上，放置37℃，5％CO₂培养箱中培养；次日，用灭菌的生理盐水将App洗脱下来，涂布接种于新的TSCA(含0.1％NAD)上，放置37℃，5％CO₂培养箱中培养6h，App菌落用含0.5％福尔马林(甲醛)的生理盐水洗脱下来收集于瓶中，放置于4℃，过夜；次日，8000r/min，离心15min去上清，沉淀用生理盐水重悬并调整菌液浓度为10¹⁰CFU/mL。将重新混悬的菌液放置于100℃水浴中作用1h，冷却后，20000g，离心20min，保留上清。用0.22μm的滤膜过滤上清液，滤液即为多糖抗原。

2.兔抗胸膜肺炎放线杆菌S1-S7型高免血清的制备与提纯

将胸膜肺炎放线杆菌6h的培养物(按照上述1.制备胸膜肺炎放线杆菌S1-S7型多糖抗原所述的方法培养)加含0.8％福尔马林(甲醛)的生理盐水37℃灭活24h，离心去甲醛，0.01M PBS(pH7.4)重悬至2x10⁵CFU/mL，加入等体积弗氏不完全佐剂乳化后，分点皮下注射健康成年新西兰兔(购自上海生旺实验动物养殖有限公司)，每只体重约2kg，1mL/只，2周后静脉注射活菌0.5mL，每周2次，共注射3周。静脉注射第一次用1×10⁹CFU/mL的菌液，以后用2×10⁹CFU/mL的菌液。最后一次注射1周后心脏采血，分离血清小份量分装，-20℃保存备用。测量血清总体积(原始体积)，加入2倍原始体积的60mmol/L醋酸缓冲液(pH 4.0)稀释，加入正辛酸(75μL/mL血清)，室温下边加边搅拌30min后，4℃静置2h；4℃，12000r/min离心30min，弃沉淀。上清溶液过滤后转移至透析袋中，PBS透析过夜。在透析后的溶液中加入等体积饱和硫酸铵溶液。4℃静置1h；4℃，10000r/min离心30min。弃上清液，收集沉淀并溶于原血清体积30％～50％的PBS中，透析过夜。透析过后的液体即为纯化后的抗体。

3.阴性血清池的制备

阴性猪血清63份，包括上海小猪、中猪、母猪(上海供港猪场提供)；上海巴马小型猪(上海交大农业与生物学院提供)；美国进口种猪，每份取100ul，混匀为阴性血清池(pool)，然后分装，备用。

4.双夹心ELISA初步测定抗原效价及血清稀释度

提纯的兔抗App高免血清与App多糖抗原均用1∶100～1∶3200倍比稀释，App猪阳性血清按1∶100或1∶400稀释，进行方阵滴定，初步测定提纯的兔抗App血清、多糖抗原以及样本血清稀释度。具体操作步骤如下：①包被：提纯的兔抗App高免血清用0.01M PBS稀释后加入到96孔平底酶标板，每孔100μL，37℃孵育1.5～2h；用PBST(含0.05％吐温-20的0.01M PBS)每孔350μL洗涤3次；②封闭：每孔加入250μL含10％马血清的PBST封闭酶标板，37℃孵育1.5～2h，洗涤3次；③将App多糖抗原加入到酶标板，每孔100μL，37℃孵育1h，洗涤3次；④将待检猪血清加入到酶标板，每孔100μL，同时设标准猪阴、阳性血清对照，37℃孵育1h，洗涤3次；⑤将HRP-兔抗猪IgG加入到酶标板，每孔100μL，37℃孵育1h，洗涤3次；⑥加入邻苯二胺(OPD，sigma产品)每孔100μL，作用15min；⑦加终止液：2M H₂SO₄终止反应，每孔50μL；于490nm处读取吸光值(OD)，记录结果，并分析。

5.纯化的兔抗App高免血清与微球偶联

委托上海透景生命科技有限公司偶联，主要步骤如下：

将4℃保存的微球(Luminex产品，购自上海透景生命科技有限公司)放置于室温20～30min，涡旋微球(2～3min为宜)，按需要量(如包被的微球量可做200次检测，每次检测需要2000个微球，则需要4×10⁵个微球。微球的商品包装规格为1.25×10⁷/mL，则这次包被需要微球为32μL)吸取荧光微球加入到1.5毫升的离心管中，13000r/min离心4min去除保护液，用三蒸水洗涤后，用400μL 0.1M pH 6.2磷酸缓冲液重悬微球。加入10μL 50mg/mL Sulfo-NHS和10μL 50mg/ml EDC，混匀后37℃作用20min。离心去上清，将微球用900μL 0.05M MES重新悬浮，离心去上清，洗涤微球两次。用400μL 0.05M MES重悬微球，加入提纯的兔抗App高免血清，混匀后37℃作用2～3h(期间，每隔15min涡旋混匀一次)。离心去上清，加入900μL PBS-TBN(含有0.05％Tween-20、0.1％BSA、0.05％叠氮钠的0.01M PBS)重悬微球，混匀后离心去上清，洗涤微球两次。加入200μL PBS-TBN重悬微球。用血细胞计数器进行计数。

6.液相芯片分型检测猪传染性胸膜肺炎抗体

取包被好的微球放置室温20～30min，涡旋微球(2～3min为宜)。按每次试验需要每种微球2000个的量分别取七种微球各1μL，按App各血清型的多糖抗原的初步稀释浓度混合抗原并加入微球中，充分涡旋混匀，总体积为50μL。37℃振荡作用45min；13000r/min离心3min去上清，用200μL PBS-TBN重悬微球，洗涤微球1次，离心去上清；加入稀释的待检猪血清(来源见表5)，50μL，同时设猪阳、阴性血清对照(阴性血清的制备见3.阴性血清池的制备，阳性血清由上海出入境检验检疫局使用App标准菌株(丹麦国家兽医实验室馈赠)免疫猪制备，具体为：将App血清S1-S7型标准参考菌株分别接种于TSCA(含0.1％NAD)培养基上，放置37℃，5％CO₂培养箱中培养18h，用生理盐水洗下，每只猪鼻腔接种4.5x10⁸个菌；第6天取App 6小时培养菌8.5x10⁸加等量弗氏不完全佐剂乳化，分三个部分肌肉注射；第7天取App 6小时培养菌7.5x10⁹静脉注射，第24天取App 6小时培养菌2.5x10⁹静脉注射，第28天取App 6小时培养菌2.5x10⁹静脉注射，第32天取App 6小时培养菌2.5x10⁹静脉注射，最后一次静脉注射后20天扑杀采血，分离血清-20℃保存备用)。37℃振荡作用45min。离心去上清，用200μL PBS-TBN重悬微球，洗涤微球2次，离心去上清；加入5μg/mL生物素标记兔抗猪IgG(上海出入境检验检疫局制备，具体步骤为：将纯化的兔抗猪血清(sigma产品)用0.1M pH 9.0～9.2NaHCO₃，4℃，透析过夜后，用0.1M NaHCO₃调整蛋白的浓度至1mg/ml。同时，用二甲基甲酰胺溶解N-羟基琥珀酰亚胺-生物素(BNHS，sigma产品)至1mg/ml。按BNHS∶IgG的质量比为1∶8混合，室温涡旋搅拌反应4小时，或者4℃过夜。生物素化的IgG装入透析袋中，用0.01M PBS pH 7.2～7.4 4℃透析过夜。透析过后的生物素化的IgG测定蛋白浓度，然后加入0.02％的叠氮钠，4℃保存。)与7.5μg/mL PE标记的链亲和素(购自invitrogen)混合物25μL。37℃作用30min。加入100μL纯水，将悬液转移至96孔可拆卸酶标反应板，通过Bio-plex^TM200system仪器检测荧光强度值(median fluorescenceintensity，MFI)，并用Bio-Plex Manager5.0软件分析数据。确定最佳工作浓度：参照在双夹心ELISA中确定的多糖抗原的工作浓度、样本(待测猪血清)的稀释度，在此基础上倍比稀释上下两个梯度，进行滴定，确定App血清多糖抗原的最佳稀释度以及样本血清稀释度。液芯联合检测App S1-S7型最佳抗原浓度为：S1为1∶100，S2为1∶1600，S3为1∶800，S4为1∶200，S5为1∶200，S6为1∶400，S7为1∶1600；待测猪血清的最佳稀释度为1∶400。

7.液相芯片检测方法阴阳性临界值---阈值的计算方法

对399份阴性猪血清用液相蛋白芯片方法检测，阈值＝阴性血清池MFI值+3×标准偏差(SD)。App血清S1型-S7型3*SD见表1。如果大于阈值则为阳性，小于阈值为阴性。

表1 App血清S1-S7型3*SD

	S1	S2	S3	S4	S6	S7	S5
								3*SD	1452	3291	2038	1829	1174	667	1656

实施例2液相蛋白芯片特异性检测

使用液相芯片分型检测猪传染性胸膜肺炎抗体试验方法检测App血清1-7型猪阳性血清，猪蓝耳病阳性血清(欧洲株和美洲株均来自美国国家兽医实验室)；猪圆环病毒阳性血清、猪副猪嗜血杆菌阳性血清、猪弓形体阳性血清、猪支原体肺炎阳性血清(上海动物疫病预防控制中心馈赠)；猪O型口蹄疫阳性血清(购自中国农业科学院兰州兽医研究所)；猪传染性胃肠炎阳性血清(svanova biotech ELISA试剂盒)；猪布氏杆菌病阳性血清(购自中国兽药监察所)；猪链球菌阳性血清(上海交大农学院馈赠)；猪伪狂犬病阳性血清(IDEXX ELISA试剂盒)、猪乙脑阳性血清(上海出入境检验检疫局保存)。检测App各自血清型抗体结果均为阳性，而其它对照血清均为阴性，检测结果见表2。说明该方法能特异地检测出App血清抗体。

表2液相蛋白芯片特异性检测结果(MFI值)

实施例3液相芯片检测方法与ELISA检测敏感性比较

将App S1-S7型阳性猪血清1∶200-1∶25600倍比稀释，用液相芯片检测猪传染性胸膜肺炎抗体试验方法与商品化ELISA试剂盒(加拿大BIOVET产品)同时进行检测，液芯的检测的滴度普遍高于ELISA 2-4个稀释度，具体见表3。

表3液相芯片(简称液芯)与ELISA检测试剂盒的比较

注：+：为阳性；-：为阴性；±：为可疑

实施例4液相蛋白芯片检测的重复性

从2009年10月26日至2010年3月30日之间，使用3批试剂，用液相芯片分型检测猪传染性胸膜肺炎抗体试验方法对S1型阳性血清进行23次检测(见表4)，检测结果经SPSS检验，S1型与其它型之间有显著差异，S1型不同批次试剂之间无显著差异、S1型不同时间检测无显著差异。说明试剂稳定性较好，检测的重复性较好。

表4不同时间不同批次试剂检测S1型阳性血清结果

***表示未做

实施例5液相芯片技术的初步应用及与ELISA比较

使用液相芯片分型检测猪传染性胸膜肺炎抗体试验方法检测不同来源的573份临床样品，其中部分使用加拿大ELISA试剂盒(加拿大BIOVET产品)检测，检测结果见表5。由于S3与S6以及S4与S7有部分相似的抗原结构，ELISA将S3/S6、S4/S7同时检测。液芯检测部分样品也有交叉，因此，比较两种检测方法时将S3/S6、S4/S7同时进行比较。两种方法的相符率为：S1为94.9％(186/196，可疑作为阴性)或96.4％(189/196，可疑作为阳性)；S2为99.5％(570/573)；S3/6为99.2％(504/508，可疑作为阴性)或99.8％(507/508，可疑作为阳性)；S4/7为95.4％(187/196，可疑作为阴性)或96.9％(190/196，可疑作为阳性)；S5为90.3％(177/196，可疑作为阴性)或91.3％(179/196，可疑作为阳性)。这两种方法检测App血清1-7型相符率均在90％以上，说明具有较好的相符性。由于本发明可同时检测多个血清型，效率高于ELISA检测方法。

Claims (9)

1.一种联合分型检测猪传染性胸膜肺炎抗体的方法，其特征在于，包括如下步骤：

①制备胸膜肺炎放线杆菌多糖抗原；

②制备兔抗胸膜肺炎放线杆菌高免血清并纯化；

③制备阴性血清池；

④利用步骤①和②得到的多糖抗原和纯化的兔抗胸膜肺炎放线杆菌高免血清建立双夹心ELISA方法，以初步获得多糖抗原的工作浓度以及样本血清稀释度；

⑤使用步骤②纯化的兔抗胸膜肺炎放线杆菌高免血清与液相芯片的微球偶联；

⑥采用液相芯片分型联合检测猪传染性胸膜肺炎抗体，具体步骤为：

(a)取偶联有兔抗胸膜肺炎放线杆菌IgG的微球放置室温20～30min，涡旋微球，按胸膜肺炎放线杆菌每个型每次试验需要2000个微球的量，每个型取微球1μL，加入相应的胸膜肺炎放线杆菌多糖抗原，总体积为50μL，37℃振荡作用45min；

(b)13000r/min离心3min去上清，用200μL PBS-TBN重悬微球，洗涤微球1次，离心去上清；

(c)加入1∶400稀释的待检猪血清，50μL，同时设猪阳性、阴性血清对照，37℃振荡作用45min，离心去上清，用200μL PBS-TBN重悬微球，洗涤微球2次，离心去上清；

(d)加入生物素标记兔抗猪IgG与PE标记的链亲和素的混合物，37℃作用30min；

(e)加入100μL纯水，将悬液转移至96孔酶标反应板，通过Bio-plex^TM200system仪器检测荧光强度值，并用Bio-Plex Manager5.0软件分析数据；

⑦确定猪传染性胸膜肺炎液相芯片检测阴性或阳性标准判定的阈值。

2.根据权利要求1所述的联合分型检测猪传染性胸膜肺炎抗体的方法，其特征在于，步骤①中，所述胸膜肺炎放线杆菌多糖抗原的制备方法具体为：将胸膜肺炎放线杆菌标准参考菌株涂布接种于有0.1％NAD的TSCA培养基上，37℃，放置5％CO₂培养箱中培养6h，用含0.5％甲醛的生理盐水洗脱下来收集于瓶中，放置于4℃，过夜；次日，8000r/min，离心15min去上清，沉淀用生理盐水重悬并调整菌液浓度为10¹⁰CFU/mL；将重新混悬的菌液放置于100℃水浴中作用1h，冷却后，20000g，离心20min，保留上清；用0.22μm的滤膜过滤上清液，滤液即为多糖抗原，分装，放-20℃保存备用。

3.根据权利要求1所述的联合分型检测猪传染性胸膜肺炎抗体的方法，其特征在于，步骤②中，所述的兔抗胸膜肺炎放线杆菌高免血清的制备和纯化方法具体为：将胸膜肺炎放线杆菌6h的培养物加含0.8％甲醛的生理盐水37℃灭活24h，离心去甲醛，0.01M PBS重悬至2x10⁵CFU/mL，加入等体积弗氏不完全佐剂乳化后，分点皮下注射健康成年新西兰兔，每只体重约2kg，1mL/只，2周后静脉注射活菌0.5mL，每周2次，共注射3周；静脉注射第一次用1×10⁹CFU/mL的菌液，以后用2×10⁹CFU/mL的菌液；最后一次注射1周后心脏采血，分离血清小份量分装，-20℃保存备用；采用正辛酸和硫酸铵提纯抗体，纯化兔抗胸膜肺炎放线杆菌高免血清，并用琼脂扩散试验测定免疫后的兔抗胸膜肺炎放线杆菌高免血清的抗体效价。

4.根据权利要求3所述的联合分型检测猪传染性胸膜肺炎抗体的方法，其特征在于，步骤②中，所述用琼脂扩散试验测定免疫后的兔抗胸膜肺炎放线杆菌高免血清的抗体效价大于或等于1∶32。

5.根据权利要求1所述的联合分型检测猪传染性胸膜肺炎抗体的方法，其特征在于，步骤③中，所述制备阴性血清池具体为：将不同来源、不同大小的阴性猪血清混合在一起，分装，作为阴性标准。

6.根据权利要求1所述的联合分型检测猪传染性胸膜肺炎抗体的方法，其特征在于，步骤④中，所述的双夹心ELISA方法具体为：步骤②纯化的兔抗胸膜肺炎放线杆菌高免血清经1∶100～1∶3200倍比稀释，相应血清型的胸膜肺炎放线杆菌多糖抗原按1∶100～1∶3200倍比稀释，标准猪阳性血清按1∶100或1∶400稀释，进行方阵滴定，测定胸膜肺炎放线杆菌多糖抗原的最佳稀释度以及样本血清稀释度。

7.根据权利要求1所述的联合分型检测猪传染性胸膜肺炎抗体的方法，其特征在于，步骤⑤中，所述的兔抗胸膜肺炎放线杆菌高免血清与微球偶联，具体为：将4℃保存的微球放置于室温20～30min，涡旋微球，按需要量吸取荧光微球加入到1.5毫升的离心管中，13000r/min离心4min去除保护液，用三蒸水洗涤后，用400μL0.1M pH6.2磷酸缓冲液重悬微球；加入10μL50mg/mL Sulfo-NHS和10μL50mg/ml EDC，混匀后37℃作用20min；离心去上清，将微球用900μL0.05M MES重新悬浮，离心去上清，洗涤微球两次；用400μL0.05M MES重悬微球，加入提纯的兔抗胸膜肺炎放线杆菌高免血清，混匀后37℃作用2～3h；离心去上清，加入900μL PBS-TBN重悬微球，混匀后离心去上清，洗涤微球两次；加入200μL PBS-TBN重悬微球，用血细胞计数器进行计数。

8.根据权利要求1所述的联合分型检测猪传染性胸膜肺炎抗体的方法，其特征在于，步骤⑥中，所述的采用液相芯片分型联合检测猪传染性胸膜肺炎抗体参照在步骤④中确定的多糖抗原的工作浓度和样本血清稀释度，在此基础上倍比稀释上下两个梯度，测定胸膜肺炎放线杆菌血清多糖抗原的最佳稀释度以及样本血清的最佳稀释度；同时检测胸膜肺炎放线杆菌S1-S7型抗体，其反应条件为：液相芯片联合检测胸膜肺炎放线杆菌S1-S7型最佳抗原浓度为S1型为1∶100，S2型为1∶1600，S3型为1∶800，S4型为1∶200，S5型为1∶200，S6型为1∶400，S7型为1∶1600；待测猪血清的最佳稀释度为1∶400。

9.根据权利要求1所述的联合分型检测猪传染性胸膜肺炎抗体的方法，其特征在于，步骤⑦中，所述的液相芯片分型联合检测方法确定阳性阴性的判定标准具体为：对已知的阴性猪血清进行测定，对检测结果进行统计分析，计算标准差；根据统计学原理，约有99％的观测值在平均数左右三倍标准偏差

范围内；3倍标准差加上阴性血清池的荧光值即为判定阈值，大于阈值的为阳性，小于阈值的为阴性。