CN101113980A - 一种检测猪胸膜肺炎抗体的胶体金化学发光免疫分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测猪胸膜肺炎抗体的胶体金化学发光免疫分析方法，属于动物病毒学免疫检测和化学发光免疫检测技术领域。发明的要点如下：将猪胸膜肺炎Apx IVA抗原固定在96孔酶标板上，封闭96孔酶标板上多余的活性位点，加入待检样品，使之与本发明制备的猪胸膜肺炎Apx IVA抗原相结合；再加入金标兔抗猪IgG，使其与待检样品特异性反应；利用混酸溶解标记在兔抗猪IgG上的胶体金，将溶解液加入化学发光试剂中，检测化学发光强度。本发明中化学发光强度和待测抗体浓度成正比，可以得出化学发光强度和待测猪胸膜肺炎Apx IVA抗体浓度之间的线性关系。与现有技术相比本发明的方法更好的灵敏度，且特异性强，能更好地满足胸膜肺炎临床检测的需要。

Description

一种检测猪胸膜肺炎抗体的胶体金化学发光免疫分析方法

技术领域

本发明属于免疫检测技术领域和化学发光免疫分析技术领域，具体涉及一种用于检测猪胸膜肺炎抗体的胶体金化学发光定性免疫定量分析方法。

背景技术

猪胸膜肺炎(Porcine Pleuropneumonia)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus Pleuropneumoniae，简称APP)引起的以胸膜肺炎和出血性坏死性肺炎为特征的一种高度传染性和致死性的呼吸系统疾病，是国际上公认的猪的五大疾病之一。该病自1957年报道以来，在英国、美国、德国、加拿大等国均有发生，是一种世界性疾病，广泛存在于全世界所有养猪国家，给养猪业造成了巨大的经济损失。从临床调查和检测结果来看，该病在我国的一些集约化的大型养猪场呈现出愈演愈烈的趋势，已经成为严重影响我国养猪业健康发展的重要呼吸道传染病之一。耐过种猪因带菌往往成为传染性胸膜肺炎再次爆发和流行的潜在传染源，给本病的控制和根除带来了极大的困难。

APP对猪致病有几个毒力因素，包括荚膜多糖(CPS)、脂多糖(LPS)、外膜蛋白(OMP)、细胞毒素(APX)、转铁结合蛋白(TBP)、蛋白酶、渗透因子、粘附素等，其中APX是本菌最重要的毒力因子和保护性抗原(FreyJ等，immunological properties of Actionbacillus pleuroneumoniae hemolysin I.Vet Microbiol，1991，28：61-73)。APP可产生4种Apx毒素，即ApxI、ApxII、ApxIII和ApxIV。不同血清型的APP产生的Apx种类尽管不尽相同，但它们都能在宿主体内分泌ApxIV。

目前诊断该病主要采用微生物学诊断法、血清学诊断法(如补体结合试验、补反试验、协同凝集试验、乳胶凝集试验、间接血凝试验、琼脂扩散试验、酶联免疫吸附试验)和分子生物学诊断法。这些方法主要是基于对ApxI、ApxII、ApxIII的检测方法，但针对ApxI、ApxII、ApxIII的检测方法特异性差，并且这些抗体也能在胸膜肺炎阴性的猪体内检测到，这是因为罗斯放线杆菌、猪放线杆菌以及非致病性的猪扁桃体放线杆菌等也能分泌这三种外毒素。而且这些分析方法周期长，对分析人员要求高，不适于高通量样品的分析。所以急需寻找一种能检测胸膜肺炎抗体的快速、简单、灵敏、特异、高通量的方法。

化学发光(Chemiluminescence，简称CL)，即化学发光物质经催化剂的催化或氧化剂的氧化后，形成一个激发态的中间体，当这种激发态中间体回到稳定的基态时，同时发射出光子，可以利用发光测量仪测量光量子产额。这一特征早在19世纪80年代就得到证实，但未受到人们的关注。20世纪60年代初，Yallow和Berson创建了具有划时代意义的放射免疫分析技术(Radioimmunoassay，简称RIA)，因其高灵敏度和高特异性，开创了生物医学的微量物质分析的新领域。RIA具有较广泛的使用价值和市场价值，但该方法也存在一些固有的弱点，如污物处理难，污染环境，影响工作人员健康等，使其发展受到一定限制。化学发光免疫分析(Chemiluminescence immunoassay，简称CLIA)是在RIA基本理论的基础上，以标记发光试剂为示踪物信号建立起来的一种非放射标记免疫分析法。早期的CLIA具有与RIA相似的特异性，但灵敏度低于RIA。经过许多学者的实验研究，积极开发利用许多新材料、新技术、新工艺以及新仪器的研制取得成功，加速了CLIA的完善，使其成为取代RIA的首选技术。但由于CLIA成本居高，成为推广的障碍。所以必须找出一种灵敏度更高、更稳定、线性范围更宽、成本更低的分析方法。很快，人们把目光投向了纳米粒子。纳米粒子是指颗粒尺寸为纳米量级的超细微粒，具有表面效应、小尺寸效应、量子效应、宏观量子隧道效应等几种特性，也由此导致了纳米粒子的光、磁、电、热、声、力以及化学活性等性质与本体物质有显著差异，使其具有广泛的用途。如纳米粒子特有的量子尺寸效应使纳米粒子的光学性质具有随粒子大小变化而变化的特性，具有该性质的材料作为生物分析的标记物质，可大大改善标记物的性能，显著提高了现有分析方法的灵敏度。另外又有研究结果表明，纳米粒子具有独特的生物兼容性，蛋白质吸附在纳米粒子上不会失去活性。胶体金纳米粒子的特性使其作为免疫探针比其它纳米粒子具有更大的优势，因此申请人选择胶体金作为研究中的免疫探针。目前胶体金作为免疫探针的检测主要方法有：分光光度法、质谱法、电子显微镜法等，但是分光光度法灵敏度低，质谱法和电子显微镜法仪器昂贵，而基于胶体金的化学发光免疫分析法灵敏度高、操作简单、仪器便宜，正好可以弥补这些缺点，在生化分析中独树一帜。

申请号为200510038211.5的发明专利公开说明书公开了一种基于ELISA方法的用于猪胸膜肺炎放线杆菌野毒感染的检测试剂盒，该试剂盒的组成除常用试剂外，其核心试剂还包括制备山包被抗原。方法是：利用PCR方法从猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型的ApxIV基因中扩增出目的基因，构建了含有目的基因的表达质粒，以该质粒转化宿主菌经体外表达得到该试剂盒的包被原。但该专利申请存在以下缺陷：一是该申请的说明书公开不充分，没有清楚地公布用于PCR扩增用的菌株。二是该申请的血清稀释倍数比较底(最佳为100倍)，其敏感性不高。三是其用于对比试验的临床血清样品是取自于存在严重的呼吸道症状且解剖病变集中于肺部的病死猪，对猪胸膜肺炎的提前诊断效果不明显。四是该发明建立的对比试验方法所采用的APP夹膜多糖具有血清型特异性，可能存在相当多的假阳性和假阴性，导致检测的可靠性缩水，按照本领域报道的资料，两种或两种以上的对比检测方法很少有100％的符合率的报道，该申请宣称的100％的符合率的报道的效果难以认同。

迄今为止未见有利用胶体金化学发光免疫方法检测猪胸膜肺炎抗体的方法和试剂盒的报道。

发明内容

本发明的任务在于克服现有技术的缺陷，提供一种特异性强的和检测方法更加可靠的适用于检测猪胸膜肺炎抗体(即猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型，APP)的胶体金化学发光定性免疫定量分析方法，本发明的方法灵敏度高，特异性强，操作简便，适合对APP样品进行高通量检测的方法，能够更好地满足临床的需要。

本发明通过以下技术方案实现

根据GenBank报道的胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus Pleuropneumoniae)APP血清1型apx IVA基因序列(登陆号AF021919)设计一对引物。以本申请人在先的专利申请(一种不含抗性标记的猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型双基因缺失突变株的疫苗及应用，申请号：200710051389.2)猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型菌株号为APP-1-mut01的保藏菌株为膜板(该菌株已于2007年1月19日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号：CCTCCNO：M207005)，从中扩增了apx IVA基因5′端2445bp的片段。将该DNA片段克隆到原核表达载体pET-28b(参见实施例的该载体来源描述)的T7启动子下游，与6×His Tag融合，再转化大肠杆菌BL21(或称DE3)，体外表达蛋白纯化后作为抗原，建立化学发光免疫分析检测方法，并优化了该方法的反应条件，具体是：以96孔酶标板为固相载体，将猪胸膜肺炎Apx IVA抗原固定在96孔酶标板上，封闭96孔酶标板上多余的活性位点，加入待检样品使之与猪胸膜肺炎Apx IVA抗原相结合，再加入金标兔抗猪IgG，使其与待检样品特异性反应。利用混酸溶解标记在兔抗猪IgG上的胶体金，然后将溶解液(作催化剂用)加入到化学发光试剂中，利用仪器测定化学发光强度。本发明中化学发光强度和待测抗体浓度成正比，可以得出化学发光强度和待测猪胸膜肺炎抗体浓度之间的线性关系，从而完成了本发明。

更详细的检测分析方法如下所述：

一种检测猪胸膜肺炎抗体的胶体金化学发光免疫分析方法，其步骤包括：

a)在96孔酶标板孔内加入猪胸膜肺炎Apx IVA重组蛋白，以该重组蛋白为包被原，再加入待测样品，使之与所述的包被原结合；

b)用胶体金标记兔抗猪IgG，使其与待测样品反应，得到胶体金标记物；

c)用混酸溶解步骤b)的兔抗猪IgG上的胶体金，得到溶解液，以该溶解液作催化剂；

d)将步骤c)制备的催化剂加入到化学发光试剂中建立鲁米诺化学发光体系，判定化学发光强度与待测样品抗体浓度之间的线性关系。

在上述实施步骤中，所述的混酸是由0.05mol/l盐酸，0.015mol/l氯化钠和0.25mmol/l溴水配制而成。所述的化学发光试剂是由0.1mol/l氢氧化钠与10^-6mol/l鲁米诺配制而成。

其中所述的催化剂含有AuCl₄ ^-。

所述的鲁米诺化学发光体系为AuCl₄ ^-与鲁米诺的复合物构成。

本发明的积极效果如下：

(1)本发明的方法具有灵敏度高，适合高通量样本检测；

(2)本发明的方法特异性强，采用本方法对一份标准阳性血清定量测定，在1∶20480～1∶160倍稀释的范围内线性关系良好，r＝0.996，最低检出限为1∶22000倍稀释(3σ)。与酶联免疫吸附试验(ELISA)比较，阳性符合率为93.33％，阴性符合率为90.90％，总符合率为92％。与间接血凝试验(IHA)比较，阳性符合率为81.63％，阴性符合率为86.27％，总符合率为88％，说明本发明在实际应用中具有良好的特异性。

附图说明

图1为本发明的技术流程示意图；

图2是本发明实施例中抗原制备中质粒pET-28b的图谱；

图3是本发明实施例中抗原制备中apx IVA5的PCR结果；

图4是本发明制备的重组质粒pTapx IVA5的酶切鉴定；

图5式本发明制备的表达质粒pETapx IVA5的酶切鉴定；

图6是本发明重组菌的SDS-PAGE检测结果；

图7是本发明实施例胶体金的高分辨透射电子显微镜图；

图8是本发明实施例胶体金标记兔抗猪IgG前后的紫外可见吸收光谱；

图9是实施例信噪比对HCl浓度作图；

图10是实施例信噪比对NaCl浓度作图；

图11是实施例信噪比对Br₂浓度作图；

图12是实施例信噪比对NaOH浓度作图；

图13是实施例信噪比对Luminol浓度作图；

图14是实施例胶体金的标准曲线；

图15是实施例猪胸膜肺炎ApxIV抗体的标准曲线。

具体实施方式

实施例1

在下面的实施例中如果没有特别说明，试验所用的材料均来自下面注明的信息和厂商：

氯化钠：分析纯，上海化学试剂有限公司生产；

盐酸：分析纯，武汉市亚泰化工有限公司生产；

溴水：分析纯，成都科农化工试剂厂生产；

氯金酸、柠檬酸三钠：分析纯，上海试剂一厂生产；

碳酸钾、磷酸一氢钠、磷酸二氢钠、吐温20：分析纯，国药集团化学试剂有限公司生产；

96孔酶标板：武汉科前动物生物制品有限责任公司惠赠；

牛血清白蛋白：罗氏公司(Roche)生产；

兔抗猪IgG：上海伯奥生科技有限公司生产；

大肠杆菌DH5α、pET-28b和BL21(或称DE3)：为通用菌株，华中农业大学农业微生物国家重点实验室惠赠；

载体pMD-18T、限制酶、EX TaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶：大连宝生物(TaKaRa)公司生产；

DNA凝胶回收试剂盒：上海生工生物工程有限公司生产；

BPCL微弱化学发光测定仪：中国科学院物理研究所生产；

H-7650型电子透射显微镜：日本Hatachi公司生产；

Evolution300型紫外-可见分光光度计：美国Thermo Nicolet公司生产。

1、猪胸膜肺炎Apx IVA抗原的制备

(1)引物设计

根据GenBank报道的APP血清1型apx IVA基因序列(登陆号AF021919)设计一对引物，扩增该基因5′端编码区2445bp的片段。为便于PCR产物的克隆，上、下游引物分别添加一个NdeI和Hind III酶切位点。该引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列如下：

上游引物P1：5′-cgccatatgagcgacaatgccttttttg-3′

下游引物P2：5′-cgcaagcttacgaatgtctttatccgtcg-3′

(2)apx IVA基因的克隆与表达载体的构建：参照文献(Christopher T等，Protection of mice againstchallenge with homologous and heterologous serovars of Actionbacillus pleuropneumoniae after live vaccination.Current Microbiol，1998，37：324-332)介绍的方法进行APP的培养及基因组DNA的提取。以本申请人在先的专利申请(一种不含抗性标记的猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型双基因缺失突变株的疫苗及应用，申请号：200710051389.2)猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型菌株号为APP-1-mut01的保藏菌株(该菌株已于2007年1月19日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号：CCTCCNO：M207005)的基因组为膜板PCR扩增apx IV基因5′端编码区apx IVA5。50μl的PCR反应体系中含：模板DNA2μl，10×PCRbuffer 5μl，25mmol/l MgCl₂ 4μl，2μmol/l dNTPs 2μl，DMSO5μl，10μmol/l P1和P2各2μl，5u/μl Ex Taq DNA Polymerase 0.25μl以及灭菌去离子水27.75μl。PCR反应条件为：95℃预变性5分钟后，进行35个循环(94℃变性40秒，49.5℃复性90秒，72℃延伸3分钟)最后72℃延伸10分钟。PCR扩增片段大小约为2500bp，与预计大小(2445bp)一致(见附图3)。用DNA凝胶回收试剂盒(上海生工生物工程有限公司生产)回收PCR产物，与载体pMD-18T(购自大连TaKaRa公司)连接后，转化大肠杆菌DH5α，获得重组质粒pTapx IVA5。经KpnI酶切鉴定后，得到DNA片段大小分别为1639bp和3498bp(见附图4)，说明PCR扩增获得DNA片段为本发明需要的目的片段。用Nde I和Hind III分别酶切重组质粒pTapx IVA5和表达载体pET-28b(其物理构建图谱见附图2)，回收2445bp的apx IVA5片段和线性化的pET-28b，经T4DNA连接酶连接后，转化大肠杆菌DH5α。用碱裂解法(黄培堂，译.[美]J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，分子克隆试验指南[M]，第3版，北京，科学出版社，2002年版)提取重组质粒pETapx IVA5，用Nde I和Hind III酶切鉴定。酶切片段大小分别为2436bp和5315bp(见附图5)，表明apx IVA5成功地插入到了pET-28b中。

(3)apx IVA5的诱导表达和表达产物的提取：将重组表达质粒pETapx IVA5转化大肠杆菌BL21，挑取单菌落，于37℃培养至对数生长期(OD600＝0.6～1.0)，加入异丙基-B-D硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度1.0mmol/l，继续诱导培养3h，收集菌体。同时设空白载体pET-28b转化子作对照。参照文献(MarshakDR等，Strategies for Protein purification and Characterization：A Laboratory Course Manual.New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1996)提取包涵体。具体步骤如下：用40000赫兹超声波裂解上述的大肠杆菌菌体，离心取沉淀后再用0.2％十二烷基肌氨酸钠裂解，然后用氧化型与还原型谷胱甘肽进行变性和复性(具体操作步骤参见：邓小红等，葡萄球菌肠毒素B突变体(K172E)的制备和抗肿瘤活性分析，细胞与分子免疫学杂志，2004，20(3)，360-362)。菌体裂解液和包涵体提取物用10％的聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE电泳(参照芮琪等，用凝胶电泳法研究小麦叶片衰老期间的内肽酶同工酶，南京农业大学学报2002，25(3)：85～88)。结果发现，在pETapx IVA5转化子的裂解物中出现一条大小约90kD的蛋白带，与预期的apx IVA的分子量相符，该表达产物以包涵体形式存在(见附图6)，该包涵体即是本发明需要的Apx IVA重组蛋白，用该重组蛋白做包被原用。

3、标准血清的制备

(1)标准阳性血清的制备

制备用动物：选用来自无猪传染性肺炎的地区、APP为阴性、年龄为5-6周龄的健康易染仔猪。试验前隔离观察7日。

免疫原制备：以含0.01％氧化型辅酶I(NAD)大豆分解蛋白质干酪素培养基(中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1419-2004TSA培养基，公开文献)复苏已经用于专利程序保藏的猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型APP-1-mut01菌株(保藏号：CCTCCNO：M207005)，灼取单个菌落于含0.01％NAD酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤(参见公开文献：中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1419-2004TSA培养基)中37℃培养至对数生长期，用稀释平板计数法进行活菌计数后，将培养物用TSB(参见公开文献：中华人民共和国卫生行业标准ws/T232-2002)稀释至1×10⁷个/ml。

人工感染方法：取5-6周龄的健康易染仔猪3头，经气管内接种上述制备的菌液2ml(含2×10⁷个活菌)。感染后14-28天内每隔5天采血一次，用apx IVA-ELISA检测Apx IVA抗体效价，当效价到≥1：640时，颈动脉无菌采血，分离血清。

血清的收集与分装：采血前12小时不喂饲料，但不限制饮水。采取颈动脉无菌采血，采得的血液用高速离心机(4000转/分、10分钟)分离血液，56℃灭活30分钟，按血清量(重量体积比)的0.04％加入叠氮钠，分装于血清管中，0.5ml/管。

(2)标准阴性血清的制备

制备用动物：选用来自无猪传染性肺炎的地区、APP为阴性、年龄为5-6周龄的健康易染仔猪。试验前隔离观察7日。

血清的收集与分装：试验猪采血前12小时不喂饲料，但不限制饮水。采取颈动脉无菌采血，采得的血液用高速离心机(4000转/分、10分钟)分离血液，56℃灭活30分钟，按血清量的0.04％加入叠氮钠，分装于血清管中，0.5ml/管。

4、胶体金的制备

制备胶体金的所有玻璃器皿先用自来水把玻璃器皿上的灰尘冲洗干净，加入清洁液(重铬酸钾1000g，加入浓硫酸2500ml，加蒸馏水至10000ml备用)浸泡24小时，再用自来水洗净器皿上的清洁液，然后每个玻璃器皿用商业洗洁净洗3～4次，自来水冲洗掉洗洁净，用蒸馏水洗3～4次，再用双蒸水把每个器皿洗3～4次，烤箱干燥后备用。

取100ml0.01％HAuCl₄溶液置于300ml圆底烧瓶中，加热沸腾，加入1％柠檬酸三钠溶液2.5ml，边加边搅拌，观察溶液颜色由浅蓝-紫-酒红，持续加热15分钟，室温冷却，加纯水恢复至原体积，避光保存。采用透射扫描电镜(H-7650型日本Hatachi公司生产)对制备的胶体金进行表征，其结果见附图7。本实施例获得的胶体金的尺寸大约是15nm。

5、金标兔抗猪IgG的制备

(1)兔抗猪IgG溶液的制备

将待标记兔抗猪IgG预先在0.005mol/l pH7.0氯化钠溶液中4℃透析过夜，以除去多余的盐离子，然后用100000转/分钟，4℃离心1小时，去除聚合物。

(2)胶体金与兔抗猪IgG结合的最佳pH测定

采用目测法，即：取8个1.5ml的Ependorf管，分别加入1ml15nm的胶体金，用0.2mol/l碳酸钾将pH值分别调为7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5。取一96孔酶标板，按pH从高到低分别将上述胶体金各取100μl加入孔中，每个pH值点重复三次，每孔加10μl浓度为0.1mg/ml的兔抗猪IgG，混合，室温下放置15分钟，每孔加20μl10％的NaCl溶液，混合，室温下放置2小时，观察胶体金颜色的变化。发现当pH为9.0时颜色最深，体系最稳定，故选择pH9.0为最佳标记pH值。由于胶体金溶液可能损坏pH计的电板，因此，在调节pH时，采用精密pH试纸测定为宜。

(3)最小兔抗猪IgG浓度的确定

采用比色法，即：将兔抗猪IgG溶液稀释成一系列浓度梯度，各取10μl加到100μlpH9.0的胶体金溶液中去，使得最终的兔抗猪IgG浓度分别为5，10，15，20，25，30，35，40，45，50μg/ml，另设一不加蛋白的对照管，5分钟后，加入10μl10％NaCl溶液，混匀，室温静置2小时，观察颜色的变化。能使胶体金稳定的最适兔抗猪IgG量的110％既为最佳标记兔抗猪IgG量。

(4)胶体金探针制备与纯化

取15nm胶体金50ml于三角瓶内，用0.2mol/l碳酸钾标定pH到9.0，放在磁力搅拌器上搅拌(100转/分钟)，另取1mg/ml兔抗猪IgG100μl。在搅拌过程中缓缓加入兔抗猪IgG，常温下搅拌10分钟。加入5％牛血清白蛋白至终浓度为1％，搅拌30分钟后取出。1200转/分钟4℃离心30分钟，取上清弃沉淀。15000转/分钟4℃离心1小时，尽量吸走上清，用0.1mol/lpH7.4磷酸缓冲液(取磷酸氢二钠1.9734克与磷酸二氢钾0.2245克，加水使溶解成1000ml，调节pH值至7.4)稀释至原体积，重复上述步骤一次，雾状沉淀用磷酸缓冲液稀释到原体积1/10，4℃避光保存，使用时将其稀释500倍。

采用紫外可见光谱对标记前后的胶体金进行了表征(见附图8)，如附图8所示，标记后紫外光谱发生了红移，说明本发明的金标兔抗猪IgG制备成功。

6、胶体金的溶解和化学发光条件的选择

本发明采用混酸来溶解胶体金，混酸溶解液是由一定浓度的盐酸，氯化钠和溴水而组成的混合液。具体方法是：考察了0.0015～0.1mol/l范围内的盐酸、0.0037～0.25mol/l范围内的氯化钠以及0.0625～2mmol/l范围内的溴水对胶体金溶解的影响。确定本发明选择0.05mol/l的盐酸(见附图9)，0.015mol/l的氯化钠(见附图10)和0.25mmol/l的溴水(见附图11)来溶解胶体金，其信噪比最高。此外，溴水和混酸溶解胶体金后生成的次溴酸都有着强的氧化性，都能促进胶体金的溶解，但剩余的次溴酸也能氧化鲁米诺产生化学发光，导致空白增高，故将混酸溶解胶体金之后的溶液置于60℃加热30分钟除去剩余的次溴酸。

考察了0.008～2mol/l范围内的氢氧化钠和0.5×10^-8～2×10^-6mol/l范围内的鲁米诺对化学发光的影响，本发明确定选择0.1mol/l的氢氧化钠(见附图12)和10^-6mol/l的鲁米诺(见附图13)信噪比最高。7、化学发光分析方法的建立

用100μl上述步骤制备的混酸(终浓度为0.05mol/l的盐酸，0.015mol/l的氯化钠和0.25mmol/l的溴水)溶解标记在兔抗猪IgG上的胶体金，得到AuCl₄ ^-。吸取90μl混酸溶解胶体金后的溶液加入化学发光试剂(终浓度为0.1mol/l的氢氧化钠和10^-6mol/l的鲁米诺)中，用超微弱化学发光仪测定化学发光强度。8、胶体金化学发光免疫分析法检测步骤

胶体金化学发光免疫分析法检测步骤如附图1所示，其过程如下：

(1)将提纯的猪胸膜肺炎Apx IV抗原蛋白用包被缓冲液稀释650倍包被96孔酶标板(100μl/孔)，4℃下过夜。

(1)然后用洗涤缓冲液清洗5次，每次5分钟。

(2)向孔内加入封闭液400μl/孔，置37℃1小时后取出，清洗同上。

(3)将被检血清用稀释液稀释650倍，加100μl/孔于上述已经封闭的孔中，每个样品加六孔，对照孔分别加特异对照血清和正常组织血清，置37℃30分钟，清洗同上。

(4)加用稀释液稀释20倍的金标兔抗猪IgG100μl/孔，37℃1小时后取出，清洗同上。

(5)最后用混酸(终浓度为0.05mol/l的盐酸，0.015mol/l的氯化钠和0.25mmol/l的溴水)将标记在兔抗猪IgG上的胶体金溶解。

(6)吸取90μl混酸溶解胶体金后的溶液加入化学发光试剂(终浓度为0.1mol/l的氢氧化钠和10^-6mol/l的鲁米诺)中，用超微弱化学发光仪检测化学发光，根据化学发光强弱显示检测结果。溶液的配制

包被缓冲液(pH9.6 0.05mol碳酸盐缓冲液)：

Na₂CO₃                        1.59克

NaHCO₃                        2.93克

加蒸馏水至                    1000ml

洗涤缓冲液(PH7.4 PBS)：       0.15mol

KH₂PO₄                        0.2克

Na₂HPO₄·12H₂O                2.9克

NaCl                          8.0克

KCl                           0.2克

Tween-20 0.05％               0.5ml

加蒸馏水至                    1000ml

封闭液：牛血清白蛋白(BSA)     1克

加洗涤缓冲液至                100ml

稀释液：

牛血清白蛋白(BSA)0.1克

加洗涤缓冲液至                100ml

9、猪胸膜肺炎Apx IVA抗原和血清最佳稀释倍数的确定

按照上述检测步骤，将猪胸膜肺炎Apx IVA抗原进行1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1280倍稀释，标准猪阳性血清和标准猪阴性血清进行1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320倍稀释。本发明选择ApxIVA抗原的最佳稀释倍数为640倍，血清的最佳棉释倍数为160倍。

10、临界值的确定

用该方法检测来自猪胸膜肺炎阴性猪场(无胸膜肺炎病史、未免疫过胸膜肺炎疫苗，且IHA检测为阴性)的40份猪血清，测量其化学发光。其化学发光强度的平均值(mean)为2.7×10⁵，标准差(SD)为6.9×10⁴，因此确定阴阳性临界值为mean+2SD＝4.08×10⁵，即当检测血清的化学发光强度＞4.08×10⁵时判为阳性，当检测血清的化学发光强度≤4.08×10⁵时判为阴性。

11、标准曲线

将15nm胶体金直接溶解，测定AuCl₄ ^-的化学发光，线性范围为4.86×10^-12～6.08×10^-10mol/l，回归方程为Δ₁＝3.0×10⁵+3.5×10¹⁴C，r＝0.997(见附图14)。对一份猪胸膜肺炎标准阳性血清进行测量，在1∶20480～1∶160倍稀释的范围内线性关系良好，同归方程为Δ₁＝2.8×10⁵-3.4C，r＝0.996，最低检出限为1∶2.2×10⁴倍稀释(3σ)(见附图15)。

12、对比实验

用本发明的方法、ELISA和IHA(间接血凝反应)方法平行检测来自3个未免疫过胸膜肺炎疫苗猪场的100份血清结果，如表1和表2所示。

表1    本发明与间接酶联免疫(ELISA)分析法的比较

Apx IVA的化学发光免疫分析法(Apx IVA-CLIA)
							阳性数	阴性数	总数
Apx IVA间接酶联免疫分析法(Apx IVA-ELISA)	阳性数阴性数总数	42547	35053	4555100

表2    本发明与间接血凝(IHA)方法的比较

Apx IVA的化学发光免疫分析法(Apx IVA-CLIA)
							阳性数	阴性数	总数
Apx IVA的间接血凝实验(Apx IVA-IHA)	阳性数阴性数总数	40747	94453	4951100

本发明与ELISA方法相比，其阳性符合率为93.33％，阴性符合率为90.90％，总符合率为92％，检测结果如表1所示，与IHA方法的阳性符合率为81.63％，阴性符合率为86.27％，总符合率为88％，检测结果如表2所示。

Claims (6)

1.一种检测猪胸膜肺炎抗体的胶体金化学发光免疫分析方法，其步骤包括：

1)在酶标板孔内包被有猪胸膜肺炎Apx IVA重组蛋白，以该重组蛋白为包被原，加入待测样品，使之与所述的包被原结合；

2)用胶体金标记兔抗猪IgG，使其与待测样品反应，得到胶体金标记物；

3)用混酸溶解步骤2)的兔抗猪IgG上的胶体金，得到溶解液，以该溶解液作催化剂；

4)将步骤3)制备的催化剂加入到化学发光试剂中建立鲁米诺化学发光体系，判定化学发光强度与待测样品抗体浓度之间的线性关系。

2.根据权利要求1所述的分析方法，其中所述的猪胸膜肺炎Apx IVA重组蛋白是由保藏号为CCTCC NO：M207005的猪胸膜肺炎放线杆菌APP-1-mut01的基因组所扩增的。

3.据权利要求1所述的分析方法，其中所述的混酸是由0.05mol/l盐酸，0.015mol/l氯化钠和0.25mmol/l溴水配制而成。

4.据权利要求1所述的分析方法，其中所述的化学发光试剂是由0.1mol/l氢氧化钠与10^-6mol/l鲁米诺配制而成。

5.根据权利要求1所述的分析方法，其中所述的催化剂含有AuCl₄ ^-。

6.根据权利要求1所述的分析方法，其中所述的鲁米诺化学发光体系为AuCl₄ ^-与鲁米诺的复合物。

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