CN102912021B - 一种用于分子马达生物传感器技术的沙门氏菌分子分型试剂盒 - Google Patents

一种用于分子马达生物传感器技术的沙门氏菌分子分型试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明属于一种对沙门氏菌进行快速分子分型判断的试剂盒，具体地说是用试剂盒中的F0F1-ATPase分子马达生物传感器Chro-invA、Chro-hut、Chro-spvR、Chro-sdf对沙门氏菌的属特异性基因invA、hut，毒性质粒基因spvR和肠炎沙门氏菌种特异性基因sdf进行检测，从而对沙门氏菌是否携带毒性质粒以及是否为肠炎沙门氏菌进行分型判断。第一，对属特异性基因invA、hut的检测可以对目标菌进行鉴定；第二，对spvR的检测可以对目标菌是否携带毒性质粒做出判断；第三，对sdf的检测可以对目标菌是否为肠炎沙门氏菌做出判断。方法包括试剂盒中F0F1-ATPase分子马达生物传感器的构建、用F0F1-ATPase分子马达生物传感器进行分子分型，最后根据分型结果对沙门氏菌是否携带毒性质粒以及是否为肠炎沙门氏菌进行分型判断。其优点在于灵敏度高、快速、操作简单、成本低廉。

Description

一种用于分子马达生物传感器技术的沙门氏菌分子分型试剂盒
技术领域
本发明属于一种对沙门氏菌进行快速分子分型判断的试剂盒，具体地说是用试剂盒中的F0F1-ATPase分子马达生物传感器Chro-invA、Chro-hut、Chro-spvR、Chro-sdf对沙门氏菌（Salmonella）的属特异性基因invA、hut，毒性质粒基因spvR和肠炎沙门氏菌种特异性基因sdf进行检测，从而对Salmonella是否携带毒性质粒以及是否为肠炎沙门氏菌进行分型判断。
背景技术
Salmonella是自然界普遍存在的一种致病菌，在世界各地的食物中毒中，沙门氏菌引起的中毒病例占第一位或第二位。它引起的疾病主要分为两大类：一类是伤寒等烈性传染病，另一类是急性肠胃炎。常见的肉类食品和奶蛋类食品都可以被沙门氏菌污染，其中鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、肠炎沙门氏菌等是常见的污染菌，它们是引起人类沙门氏菌食物中毒的主要致病菌，已对食品安全构成了严重威胁。
Salmonella致病性的分子机制，目前的研究主要涉及Salmonella的毒力相关基因，包括inv、hut、stn、spv、fim、hilA等。沙门氏菌的侵袭蛋白（invasion protein,inv）是研究的热点，该蛋白决定细菌进入宿主上皮细胞的能力，与沙门菌的致病性密切相关，侵袭蛋白是由inv基因簇（invA、invB、invC、invD和invE等一组基因）编码，其中invA为沙门氏菌的主要毒力因子。研究表明invA基因是沙门氏菌A～E群高度保守基因，对人类致病的沙门氏菌99%属A至E群。且invA基因编码吸附和侵袭上皮细胞表面的蛋白，该蛋白决定沙门氏菌对肠粘膜细胞的侵袭力，invA基因适合致病性沙门氏菌的检测，但作为沙门氏菌属特异性基因有一定的确定，有漏检的可能。hut为编码组氨酸操纵子基因，高度保守。stn为编码肠毒素的基因。在不同血清型沙门氏菌的毒性质粒中存在一个10kb左右高度保守区域，毒性区域位于一个8.2kb片段中，具有一个操纵子和5个编码基因(spvR，spvA，spvB，spvC，spvD)。spy基因编码与沙门氏菌毒性质粒相关的毒力因子，与沙门氏菌的致病性有关。Fim是编码菌毛的基因，是沙门氏菌中高度保守的属特异基因。Hil是侵袭基因正调节蛋白的编码基因。上述基因常用于Salmonella的PCR检测鉴定。另外sdf基因作为肠炎沙门氏菌的种特异性基因常用于肠炎沙门氏菌的PCR检测鉴定。
为了便于进行临床诊断、流行病学调查、食品中微生物检测及医院感染监控，微生物的分型与检测研究是必不可少的内容。目前，随着分子生物学的发展以及与流行病学的密切结合，分子分型技术以其敏感性高、特异性强、分型率和分辨率高等优点，在流行病学调查、食物中毒的预警和溯源、食源性疾病的诊断以及微生物的检测等方面发挥了重要的作用，并逐步替代了传统的生化分型和血清学分型技术，如重复序列PCR（rep-PCR）、随机扩增多态性DNA分析技术（RAPD）、限制性片段长度多态性分析（RFLP）、多位点序列分析（MLST）、脉冲场凝胶电泳（PFGE）等。然而，上述方法操作起来都比较繁琐，程序比较复杂。因此，在上述分子分型方法的优点基础上，开发一种操作简便、价格低廉的分子分型方法将具有重要意义。
发明内容
本发明以Salmonella属特异性基因invA、hut，毒性质粒基因spvR和肠炎沙门氏菌种特异性基因sdf为靶基因设计4个探针，通过“ε亚基抗体-链霉素-生物素-探针”系统将探针与F0F1-ATPase分子马达连接构建F0F1-ATPase分子马达生物传感器，进而与相应辅助试剂配套构建分子马达生物传感器分子分型试剂盒，从而对Salmonella是否携带毒性质粒以及是否为肠炎沙门氏菌进行分型判断，从而建立Salmonella的分子马达分子分型方法，为Salmonella的快速分型和溯源提供技术基础。
本发明所采用的技术方案为：以Salmonella属特异性基因invA、hut，毒性质粒基因spvR和肠炎沙门氏菌种特异性基因sdf靶基因设计4个探针，首先将生物素标记的ε亚基抗体结合在F0F1-ATPase的ε亚基上，然后用链霉亲和素（Streptavidin）与ε亚基抗体上的生物素结合，最后将生物素标记的探针与链霉亲和素结合，构建F0F1-ATPase分子马达生物传感器，对目标Salmonella的DNA进行检测，从而对Salmonella是否携带毒性质粒以及是否为肠炎沙门氏菌进行分型判断。一方面，对属特异性基因invA、hut的检测可以对目标菌进行鉴定；另一方面，对spvR和sdf的检测可以对目标菌是否携带毒性质粒以及是否为肠炎沙门氏菌做出判断。利用F0F1-ATPase作为载体对目标物进行检测具有快速、灵敏度高、特异性强的特点。在F0F1-ATPase分子马达上连接特异的核酸探针，可以实现对目标基因快速、高特异性、高通量的检测。
本发明涉及的Salmonella的分子马达生物传感器分子分型试剂盒，包括以下试剂：
沙门氏菌分子分型试剂盒组成
Figure GDA0000375167060000021
Figure GDA0000375167060000031
上述试剂盒中Chro-invA、Chro-hut、Chro-spvR、Chro-sdf等4个分子马生物传感器的构建，依次包括下列步骤：
（1）载色体（Chromatophore）的制备
将Thermomicrobium roseum菌种按比例1:100接种到液体培养基，60℃，150rpm振荡培养24h。然后4℃，4000g离心30min收集菌体。用提取Buffer（20mM Tris-Cl，100mM NaCl，2mM MgCl2，1mM DTT，pH8.0）重悬菌体。4℃，6000g离心10min去上清。加入提取Buffer重悬菌体（10mL Buffer/g），再加入PMSF至终浓度1mM，置于冰上超声破碎30min（超声5s，停8s）。将破碎菌体于4℃，25000g离心30min，取上清于一新的离心管中，4℃145000g超速离心1h，取沉淀即为Chromatophores。最后用提取Buffer重悬沉淀并加入终浓度50%的甘油，﹣80℃保存备用。
（2）F-DHPE标记Chromatophores
取200μL Chromatophores于一离心管中，加入10μL F-DHPE（200mg/mL,溶于乙醇），混匀，室温避光轻微振荡孵育15min。加入PBS（10mM，pH7.4）至总体积1.3mL后，于4℃，30000g离心15min，去上清，沉淀用PBS在4℃，10000g离心15min条件下清洗3次，以除去游离的F-DHPE。最后沉淀用200μL PBS悬浮，备用。
（3）生物素标记ε亚基抗体
将2μL2μM的生物素（biotin-AC5-Sulfo-Os）加入到20μLε亚基抗体中，室温孵育30min，抗体N端即被标记。
（4）探针合成及标记
以Salmonella属特异性基因invA、hut，毒性质粒基因spvR和肠炎沙门氏菌种特异性基因sdf为模板设计探针，并用生物素（biotin-AC5-Sulfo-Os）标记探针5’端。探针序列如下表：
4种Salmonella核酸探针序列
Figure GDA0000375167060000032
Figure GDA0000375167060000041
（5）F0F1-ATPase分子马达生物传感器的构建
分别吸取200μL F-DHPE标记的Chromatophores于4个离心管中，各加入40μg生物素标记的ε亚基抗体，用PBS补加至1mL，37℃孵育1h；用PBS补加至1.4mL，4℃，30000g超速离心10min；弃上清，沉淀用500μL PBS重悬；加入链霉亲和素（Streptavidin）（2mg/mL）2μL，用PBS补加至1mL，室温，50～100rpm振荡反应10min；用PBS补加至1.4mL，4℃，30000g超速离心10min，弃上清，沉淀用500μL PBS重悬；最后，每管各加入生物素标记的invA、hut、spvR、sdf核酸探针（10μM）50μL，用PBS补加至1mL，室温，50～100rpm振荡反应10min；每管用PBS补加至1.4mL，4℃，30000g超速离心10min，弃上清，用150μL含30%甘油的PBS重悬Chromatophores，放入﹣20℃冰箱备用。各分子马达生物传感器分别命名为Chro-invA、Chro-hut、Chro-spvR、Chro-sdf。分子马达生物传感器模式图见图1。
使用上述试剂盒对Salmonella的致病性进行分子分型，依次包括下列步骤（1）—（3）：
（1）细菌的培养及DNA的提取
将Salmonella接种到含缓冲蛋白胨水（BPW）中增菌，36℃±1℃培养8-18h后，吸取增菌液1mL分别接种于10mL四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液和亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液中，分别于42℃±1℃和36℃±1℃培养18-24h，然后划线接种亚硫酸铋（BS）和木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂。最后挑取可疑菌落转接到营养琼脂上，36℃±1℃培养24h，用于DNA的提取。
将培养获得的Salmonella用DNA提取试剂盒（商业）进行提取，详细操作步骤见试剂盒说明书。最后获得的离心管中的液体就是菌体的DNA提取液，用作分子马达传感器的目标检测物。
（2）用F0F1-ATPase分子马达生物传感器进行分子分型
①取4个1.5mL EP管，各加入待测样本10μL。将EP管放入沸水浴中加热3min，然后立即转移到冰上至完全冷却；
②分别取2μL Chro-invA、Chro-hut、Chro-spvR、Chro-sdf，用合成buffer稀释到一定的倍数。取稀释后的分型装置分别加入上述EP管；
③阴性对照用10μL无菌水代替DNA提取液进行。另取1个EP管加入10μL无菌水，沸水浴中加热3min，然后立即转移到冰上至完全冷却，再加入10μL合成buffer作为本底对照，短暂振荡使反应体系混匀；
④向上述EP管中分别加入30μL启动buffer（由ADP和上述合成buffer配置，体积比1：3），振荡使反应体系混匀，然后立即短暂离心以除去管盖内壁上的水珠；
⑤将上述反应体系放入37℃恒温摇床中温育30min，然后将EP管从摇床中取出，分别加入450μL PBS缓冲液，振荡使体系混匀；
⑥取一块干净的96孔板，将各管中的最终反应体系加入其中，每个体系加3孔，每孔加样50μL，然后对每个加样孔分别加入30μL已配置好的荧光素酶溶液（将荧光素酶/荧光素重组缓冲液加入装有荧光素酶/荧光素的棕色玻璃瓶中，盖上瓶塞，反复颠倒几次混匀，不可振荡。使用前应将混合液在室温放置1h），用枪反复吹打几次使体系混匀；
⑦将96孔板上机检测，读取各孔荧光值，对各组数据取平均值，然后用样本数值减去本底数值即为样本的实际荧光值；
⑧将样本荧光值绝对值与H2O的阴性对照荧光值绝对值进行单因素方差分析，若差异显著（p＜0.05）表示检出该基因；
（3）分型判断
检出属特异性基因invA和hut，可判断该菌为沙门氏菌；检出spvR，可判断该沙门氏菌携带毒性质粒，检出sdf，可判断该菌为肠炎沙门氏菌。
附图说明
图1：F0F1-ATPase分子马达生物传感器模式图（其中a、b、c、α、β、δ、γ、ε均为ATP合酶亚基），1为ε亚基抗体，2为链霉亲和素（Strptavidin），3为N-biotin，4为分子探针（此处为invA、hut、spvR、sdf探针），5为Salmonella单链DNA；
图2：实施例中应用分子马达生物传感器检测12株Salmonella分离株所得荧光值柱状图。A，Chro-invA对12株Salmonella的分型结果；B，Chro-hut对12株Salmonella的分型结果；C，Chro-spvR对12株Salmonella的分型结果；D，Chro-sdf对12株Salmonella的分型结果。1-12：12株Salmonella。*表示样本荧光值与阴性对照相比差异显著（p＜0.05）。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明。
实施例
（1）细菌的培养及DNA的提取
12株Salmonella为从食品中分离得到。将12株Salmonella接种到含缓冲蛋白胨水（BPW）中增菌，36℃±1℃培养8-18h后，吸取增菌液1mL分别接种于10mL四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液和亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液中，分别于42℃±1℃和36℃±1℃培养18-24h，然后划线接种亚硫酸铋（BS）和木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂。最后挑取可疑菌落转接到营养琼脂上，36℃±1℃培养24h，用于DNA的提取。
将培养获得Salmonella用DNA提取试剂盒（离心柱型）DP320进行提取，详细操作步骤见试剂盒说明书。最后获得的离心管中的液体就是菌体的DNA提取液，用作PCR扩增时的模板以及分子马达传感器的目标检测物。该DNA提取液置于冰箱中﹣20℃保存，使用时置于室温自然解冻，然后用振荡器振荡混匀。
（2）用F0F1-ATPase分子马达生物传感器对12株Salmonella进行分子分型
①取10个1.5mL EP管，各加入12株Salmonella浓度为70ng/mL的DNA提取液10μL。将EP管放入沸水浴中加热3min，然后立即转移到冰上至完全冷却；
②取2μL Chro-invA，用合成buffer（0.1mM Tricine，10%甘油，5mM NaH2PO4，5mM MgCl2，pH9.0）稀释60倍。取稀释后的生物传感器分别加入上述EP管；
③阴性对照用10μL无菌水代替DNA提取液进行。另取1个EP管加入10μL无菌水，沸水浴中加热3min，然后立即转移到冰上至完全冷却，再加入10μL合成buffer作为本底对照，短暂振荡使反应体系混匀；
④向上述EP管中分别加入30μL启动buffer，振荡使反应体系混匀，然后立即短暂离心以除去管盖内壁上的水珠；
⑤将上述反应体系放入37℃恒温摇床中温育30min，然后将EP管从摇床中取出，分别加入450μL PBS缓冲液，振荡使体系混匀；
⑥取一块干净的96孔板，将各管中的最终反应体系加入其中，每个体系加3孔，每孔加样50μL，然后对每个加样孔分别加入30μL已配置好的荧光素酶溶液（将荧光素酶/荧光素重组缓冲液加入装有荧光素酶/荧光素的棕色玻璃瓶中，盖上瓶塞，反复颠倒几次混匀，不可振荡。使用前应将混合液在室温放置1h），用枪反复吹打几次使体系混匀；
⑦将96孔板上机检测，读取各孔荧光值，对各组数据取平均值，然后用样本数值减去本底数值即为样本的实际荧光值；
⑧将样本荧光值绝对值与H2O的阴性对照荧光值绝对值进行单因素方差分析，若差异显著（p＜0.05）表示检出该基因；
Chro-hut、Chro-spvR、Chro-sdf对12株Salmonella的检测同上述步骤。Chro-hut的最适稀释倍数为70倍，对应最适DNA浓度为30ng/mL；Chro-spvR的最适稀释倍数为50倍，对应最适DNA浓度为80ng/mL；Chro-sdf的最适稀释倍数为70倍，对应最适DNA浓度为60ng/mL。
（3）分型判断
检出属特异性基因invA和hut，可判断该菌为沙门氏菌；检出spvR，可判断该沙门氏菌携带毒性质粒，检出sdf，可判断该菌为肠炎沙门氏菌。分型结果见图2。由图可知，Chro-invA、Chro-hut对12株Salmonella的检测结果均为阳性，说明12株菌均携带属特异性基因invA和hut，可判断12株菌为沙门氏菌；Chro-spvR对12株Salmonella的检测结果显示有6株为阳性，说明该6株菌携带毒性质粒；Chro-sdf对12株Salmonella的检测结果显示仅有1株为阳性，说明该株菌为肠炎沙门氏菌。结果与PCR验证结果一致。

Claims (1)

1.一种基于分子马达生物传感器技术的沙门氏菌（Salmonella）分子分型试剂盒，其特征在于包括以下组分：
沙门氏菌分子分型试剂盒组成
Figure FDA0000375167050000011
其中分子马达生物传感器的构建，包括：
（1）载色体（Chromatophore）的制备：
从玫瑰红嗜热菌（Thermomicrobium roseum）中提取载色体，F0F1-ATPase存在于载色体上，是一种可旋转分子马达，由多个亚基组成，分别为α3β3γδεab2cn。F1一般由3α，3β，1γ，1δ和1ε等9个亚基组成，F0一般由a，b，c等3个亚基组成；
（2）F-DHPE标记载色体：
F-DHPE是一种脂染料探针，可以嵌入到磷脂分子层中。同时F-DHPE也是一种pH指示剂，将其嵌入磷脂双分子层可以用来测量磷脂层外面的pH变化。在pH7.0-9.0范围内，F-DHPE的荧光强度与pH值呈正相关。本发明将F-DHPE标记到分子马达载色体磷脂分子层中用以指示F0F1-ATPase合成ATP的效率；
（3）生物素标记ε亚基抗体：
用生物素（biotin-AC5-Sulfo-Os）标记ε亚基抗体N端；
（4）探针合成及标记：
以Salmonella属特异性基因invA、hut，毒性质粒基因spvR和肠炎沙门氏菌种特异性基因sdf为模板设计探针，并用生物素（biotin-AC5-Sulfo-Os）标记探针5’端。一方面，对属特异性基因invA和hut的检测可以对目标菌进行鉴定；另一方面，对spvR和sdf的检测可以对目标菌是否携带毒性质粒以及是否为肠炎沙门氏菌做出判断。探针序列如下表：
4种Salmonella核酸探针序列
（5）F0F1-ATPase分子马达生物传感器的构建：
首先将生物素标记的ε亚基抗体结合在F0F1-ATPase的ε亚基上，然后用链霉亲和素（Streptavidin）与ε亚基抗体上的生物素结合，最后将生物素标记的探针与链霉亲和素结合，高速离心去除未结合分子，即得到F0F1-ATPase分子马达生物传感器，4个分子马达生物传感器分别命名为Chro-invA、Chro-hut、Chro-spvR、Chro-sdf；
应用其进行分型，包括以下步骤：
（1）细菌的培养及DNA的提取
（2）用分子马达生物传感器进行分子分型
①取4个1.5mL EP管，各加入待测样本10μL。将EP管放入沸水浴中加热3min，然后立即转移到冰上至完全冷却；
②分别取2μL Chro-invA、Chro-hut、Chro-spvR、Chro-sdf，用合成buffer稀释到一定的倍数。取稀释后的生物传感器分别加入上述EP管；
③阴性对照用10μL无菌水代替DNA提取液进行。另取1个EP管加入10μL无菌水，沸水浴中加热3min，然后立即转移到冰上至完全冷却，再加入10μL合成buffer作为本底对照，短暂振荡使反应体系混匀；
④向上述EP管中分别加入30μL启动buffer（由ADP和上述合成buffer配置，体积比1：3），振荡使反应体系混匀，然后立即短暂离心以除去管盖内壁上的水珠；
⑤将上述反应体系放入37℃恒温摇床中温育30min，然后将EP管从摇床中取出，分别加入450μL PBS缓冲液，振荡使体系混匀；
⑥取一块干净的96孔板，将各管中的最终反应体系加入其中，每个体系加3孔，每孔加样50μL，然后对每个加样孔分别加入30μL已配置好的荧光素酶溶液（将荧光素酶/荧光素重组缓冲液加入装有荧光素酶/荧光素的棕色玻璃瓶中，盖上瓶塞，反复颠倒几次混匀，不可振荡。使用前应将混合液在室温放置1h），用枪反复吹打几次使体系混匀；
⑦将96孔板上机检测，读取各孔荧光值，对各组数据取平均值，然后用样本数值减去本底数值即为样本的实际荧光值；
⑧将样本荧光值绝对值与H2O的阴性对照荧光值绝对值进行单因素方差分析，若差异显著（p＜0.05）表示检出该基因；
（3）分型判断
检出属特异性基因invA和hut，可判断该菌为沙门氏菌；检出spvR，可判断具有毒性质粒；检出sdf，可判断该菌为肠炎沙门氏菌。
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CN102135543A (zh) * 2010-01-27 2011-07-27 中国科学院生物物理研究所 实时灵敏生物大分子检测新方法及试剂盒制备

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分子马达传感器对沙门氏菌快速检测方法的初步研究;张婕等;《食品工业科技》;20111130;第33卷(第12期);摘要和第1.1节材料与仪器、第1.2节实验方法、第1.2.4节分子马达检测体系的构建 *
刘喆等.沙门氏菌的检测技术进展.《中国动物传染病学报》.2012,第20卷(第2期),第2.1.1节multiplex PCR.
张婕等.分子马达传感器对沙门氏菌快速检测方法的初步研究.《食品工业科技》.2011,第33卷(第12期),摘要和第1.1节材料与仪器、第1.2节实验方法、第1.2.4节分子马达检测体系的构建.
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沙门菌PCR检测技术应用进展;黄丽华等;《中国热带医学》;20120118;第12卷(第1期);第1.1节属特异性引物基因 *
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