CN103604802B - 一种快速化学发光免疫分析检测人IgG的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速化学发光免疫分析检测人IgG的方法，该方法包括以下步骤：（1）将抗体修饰的纳米金和抗原进行完全的免疫反应；（2）而后将化学发光试剂注入免疫反应后的纳米金溶液中；（3）检测发光信号。该发明建立了一种全新的一步快速非溶出化学发光金属免疫分析方法，实现了对人IgG快速灵敏且环境友好的检测。

Description

一种快速化学发光免疫分析检测人IgG的方法

技术领域

本发明涉及化学检测技术领域，尤其涉及一种快速化学发光免疫分析检测人IgG的方法。

背景技术

免疫分析作为一种分析技术，已经广泛应用于药学分析、环境毒理学分析、分子生物学、生物技术、生物化学、和临床诊断等各领域中,一直以来成为研究的热点。自从1959年引入放射性免疫分析后，放射性免疫分析法广泛应用于免疫分析中。但是，放射性同位素作为标记具有一些不可避免的缺点如健康危害、废物处理问题和短的半衰期等。随着免疫分析技术的发展，将酶、金属离子的螯合物以及荧光染料作为标记物引入免疫分析中。这些免疫分析方法克服了上述放射性免疫分析所带来的缺陷，因而具有很好的发展前景，但仍存在一些如灵敏度低、稳定性不好及线性范围窄的弊端，需要寻求一种操作简单，灵敏度高而且价格便宜，适用性强的分析方法。

化学发光分析因具有灵敏度高、线性范围宽、试剂便宜及仪器操作简单等优点已广泛应用于免疫分析中。近年来，化学发光免疫分析具有灵敏度高、特异性强等优点，备受人们的青睐。纳米粒子尤其金属纳米粒子具有许多优点，首先，在纳米尺寸范围内，各种各样具有独特性能的纳米粒子很容易合成；其次，纳米粒子具有较好的生物相容性，不会影响生物活性。因此，金属纳米粒子尤其贵金属纳米粒子作为生物标记引起了研究者很大的关注。近几年来，已有很多文献报道将贵金属纳米粒子作为标记物用于化学发光免疫分析中。Han研究组报道了基于纳米金溶解并结合AuCl₄ ^--HCl-NaCl-Br₂-luminol体系的化学发光金属免疫分析法，用于抗坏血酸过氧化物酶抗体(ApxIVAb)的测定。Li研究组和Lu研究组相继报道了基于纳米金标记的化学发光免疫分析方法用于羊抗人IgG的测定，该方法是利用将标记在抗体上的纳米金溶解得到AuCl₄ ^-，结合AuCl₄ ^--luminol-H₂O₂化学发光体系测定化学发光信号。作为一种新的测定方法，开创了纳米粒子标记化学发光分析的新途径。但是在此方法中，纳米金的溶解需要在高浓度的HNO₃-HCl或HBr-Br₂中溶解12小时以上，才能保证其溶解完全。在此基础上，Li研究组又发展了一种新的化学发光金属免疫分析方法测定人IgG，该方法将标记的纳米金用Ag⁺还原溶液处理后，Ag⁺沉淀在纳米金表面，经硝酸溶出后，结合Ag⁺-Mn²⁺-K₂S₂O₈-H₃PO₄-luminol化学发光体系测定化学发光信号。该方法相比于利用纳米金溶解的化学发光金属免疫分析方法，大大提高了灵敏度，而且银的溶解剥离要比金的溶解相对要容易些，只需要在稀硝酸中可以达到完全溶解，但是仍需要繁琐的贵金属粒子的溶解过程。上述这些传统的基于纳米金或纳米银的化学发光金属免疫分析方法存在一定缺陷：一、需要纳米金(银)的溶解剥离，而且能够使金、银粒子的完全溶解的条件一般都比较苛刻，使用的溶剂大多有毒且具有强腐蚀性。纳米金(银)的溶解不仅繁琐耗时，而且会增加背景信号，从而降低方法的灵敏度；二、这些分析方法大多是异相的，需要多步的标记和洗脱，从而难以克服重现性和精密度的问题。Li等人提出采用不规则纳米金的增强催化作用，第一次发展了“非溶出”的化学发光免疫分析方法，然而该方法中不规则纳米金的合成条件难以控制，从而限制了它的实际应用。Cui等人通过标记的纳米金对luminol–AgNO₃体系的催化作用，建立了一个“非溶出”的化学发光免疫分析方法。然而，该方法需要特殊的微孔发光仪和多步的标记和洗脱过程，因而使得方法繁杂，耗时很长。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是如何通过一步标记，采用实用、简单、灵敏的非溶出方法实现化学发光免疫分析。

为了解决以上技术问题，本发明公开了一种快速化学发光免疫分析检测人IgG的方法，包括以下步骤：

（1）纳米金的制备和表征；

（2）羊抗人IgG标记的纳米金的制备；

（3）免疫反应；

（4）将化学发光试剂注入免疫反应后的纳米金溶液中，检测发光信号。

本发明利用抗体修饰的纳米金和抗原发生免疫反应后，引起纳米金的团聚从而导致其对鲁米诺化学发光催化活性增强，建立了一种全新的一步快速非溶出化学发光金属免疫分析方法，实现了对人IgG快速灵敏且环境友好的检测。具有以下优点：(1)它是非溶出的，避免繁琐和艰难的纳米金(或银)的溶解剥离，具有高的灵敏度和好的重现性；(2)相比于别的非溶出方法所用的不规则纳米金的合成，该方法中所用的13nm纳米金的合成简单容易的多；(3)该方法只需要非竞争的一步操作，避免了多步免疫反应及洗脱步骤，大大节省了分析时间，将测试时间缩短为40分钟以内。

附图说明

当结合附图考虑时，通过参照下面的详细描述，能够更完整更好地理解本发明以及容易得知其中许多伴随的优点，但此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定，其中：

图1一步非溶出的化学发光免疫分析测定的原理图。

图2抗体用量的优化（纳米金浓度固定为1.7nM；所测吸光度为波长520nm处）。

图3免疫反应时间的影响（条件:鲁米诺,5×10^-4M;H₂O₂,5.0×10^-2M）。

图4盐浓度的影响（条件:鲁米诺,5×10^-4M;H₂O₂,5.0×10^-2M）。

图5不同浓度人IgG对化学发光信号的响应。注人IgG的浓度:(a)0gmL^-1,(b)2.6×10^-10gmL^-1,(c)1.3×10^-9gmL^-1,(d)2.6×10^-9gmL^-1,(e)3.9×10^-9gmL^-1,(f)5.3×10^-9gmL^-1,(g)2.6×10^-8gmL^-1,(h)1.3×10^-7gmL^-1,(i)2.6×10^-7gmL^-1,(j)3.9×10^-7gmL^-1,(k)5.3×10^-7gmL^-1。条件:鲁米诺,5×10^-4M;H₂O₂,5.0×10^-2M。

图6(a)测定人IgG的灵敏度分析。

图6(b)测定人IgG的灵敏度分析。

图7测定人IgG的特异性评价。注(a)人IgG,(b)牛血清白蛋白,(c)羊IgG,(d)兔IgG。

图8方法可靠性的评价。

图9纳米金及羊抗人IgG修饰的纳米金免疫反应前后的紫外可见光谱。

图10羊抗人IgG修饰的纳米金免疫反应前后的透射电镜图片。注a为免疫反应前的；b为免疫反应后的。

具体实施方式

参照图1-10对本发明的实施例进行说明。

为使上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

本发明利用抗体修饰的纳米金和抗原发生免疫反应后，引起纳米金的团聚从而导致其对鲁米诺化学发光催化活性增强，建立了一种非溶出均相化学发光金属免疫分析方法，实现了对人IgG快速灵敏且环境友好的检测。测定原理如图1所示，当分析物人IgG不存在时，抗体修饰的纳米金催化鲁米诺-过氧化氢体系，产生一个较弱的化学发光信号；而当分析物人IgG存在时，羊抗人IgG标记的纳米金和抗原发生免疫反应从而导致纳米金的团聚，抗体修饰纳米金的团聚大大地增强鲁米诺-过氧化氢体系的化学发光信号，从而实现对人IgG的测定。

所用到的主要仪器设备和试剂：

IFFL-D流动注射化学发光分析仪及其配套设备(西安瑞迈分析仪器有限公司)，TU-1901型紫外-可见分光光度仪(北京普析通用仪器有限公司)，透射电子显微镜(日立公司，规格型号：H-600)，恒温磁力搅拌器(85-2型，上海司乐仪器有限公司)，恒温水浴锅(HH-1型，北京科伟永兴仪器有限公司)，KYC1OOC生化培养箱(上海福玛实验设备有限公司),可调微量加液器(上海求精玻璃仪器厂),聚苯乙烯96微孔板(FOLCON)。

氯金酸(HAuCl₄·4H₂O，AR，Au含量>47.8%，国药集团化学试剂有限公司)；将氯金酸固体溶于二次去离子水中制备氯金酸储备溶液，放于4℃冰箱中保存。将4.43g鲁米诺固体粉末溶解在20mL0.10MNaOH溶液中并稀释至1L，制备得到2.5×10^–2M鲁米诺储备溶液。使用之前避光保存一星期以确保试剂性质的稳定。鲁米诺的工作溶液通过储备溶液的稀释而得到。H₂O₂的工作溶液在每次使用时从30%(w/w)H₂O₂(上海化学试剂公司)稀释得到。将13.8gNa₂HPO₄·12H₂O、1.6gNaH₂PO₄·H₂O和9.0gNaCl溶解在1L的二次去离子超纯水中，配制得到磷酸缓冲溶液(pH7.4)。邻苯二胺(OPD)底物溶液临用前配制。将10mg邻苯二胺溶解于6.1mL0.1mol/L柠檬酸(2.1g/100mL)、6.4mL0.2mol/LNa₂HPO₄(7.163g/100mL)和12.5mL二次去离子水的混合液中，临用前加40μL30%(w/w)H₂O₂。羊抗人IgG、人IgG、兔IgG、羊IgG、牛血清白蛋白和辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗人IgG均购自于北京鼎国生物技术有限公司。实验用水为二次去离子水。

实验条件的优化：

固定金纳米粒子的浓度为1.7nM，对标记所用抗体的用量进行优化，如图2所示，选择羊抗人IgG的浓度为0.5mg/mL。

考察了免疫反应的时间及盐浓度的影响。结果如图3和图4所示，由图3可以看出，免疫反应一开始化学发光信号较弱，随着时间增加，化学发光信号逐渐增强，反应时间到达20分钟时，发光信号迅速增强，30分钟以后达到稳定。所以，选择免疫反应的时间为30分钟。另外，高浓度的盐能够引起纳米金的团聚，而盐浓度太低将会影响免疫反应的有效进行。本发明考察了盐浓度的影响，从图4可以看出，随着盐浓度的增加，化学发光信号增强，而当盐浓度大于1.0×10^-3mol/L时，随着盐浓度的增加，化学发光信号开始降低，可能是由于过高的离子强度使蛋白质(抗原或抗体)变质，不利于免疫反应的进行，从而影响免疫反应诱导的纳米金的团聚。所以，选择NaCl浓度为1.0×10^-3mol/L。

另外，考虑到化学发光强度和试剂的消耗，选择鲁米诺的浓度为5×10^-4mol/L，过氧化氢浓度为5×10^-2mol/L。实验结果表明该体系的pH值优化为12.0。

13nm纳米金的制备：

采用柠檬酸盐还原法制备。50mL的HAuCl₄(0.01%w/w)溶液加热至沸，然后在强力搅拌下，迅速向漩涡中加入2.8mL1%的柠檬酸钠溶液。此混合溶液保持沸腾10分钟后关掉加热电源，然后在不断的搅拌下冷却至室温。得到的溶液在4℃冰箱中保存备用。

羊抗人IgG修饰金纳米颗粒的制备：

制备羊抗人IgG修饰的金纳米微粒。取5mL纳米金溶液用0.1mol/LK₂CO₃溶液调节pH为9，加入1mL一定浓度的羊抗人IgG，室温搅拌反应1小时使抗体和金纳米粒子充分结合，于4℃离心30分钟(12000转/分)以除去未标记的抗体，吸出上清液，沉淀用0.01mol/L含有1%BSA的磷酸缓冲溶液(pH7.4)悬浮至原体积，于冰箱中(4℃)保存待用。

化学发光免疫分析测定：

移取免疫反应后羊抗人IgG修饰的纳米金/抗原混合液100μL于化学发光池中，并注入200μL鲁米诺–过氧化氢化学发光试剂(5×10^-4M鲁米诺和5.0×10^-2M过氧化氢的体积比为2:1)，通过IFFL-D流动注射化学发光分析仪测定并记录其化学发光强度。通过测定化学发光强度检测抗原人IgG的含量，由此可以得出化学发光强度和待测人IgG之间的相关关系。

人IgG化学发光的分析性能：

在上述优化的实验条件下，实现了对人IgG化学发光免疫分析的测定。图5为免疫反应后不同浓度人IgG响应的化学发光信号，可以明显看出，随着人IgG浓度的增加，化学发光信号逐渐增强。且在2.6×10^-10～5.3×10^-7g/mL的浓度范围内，人IgG的浓度与化学发光信号的强度成良好的线性关系，线性曲线如图6（a）和图6（b）所示，其检出限为3.2×10^–11g/mL(S/N=3)。并对6.2×10^–9g/mL的人IgG进行五次重复测定，相对标准偏差(R.S.D.)为4.6%。实验结果表明该方法检出限低，精密度好。和已有的基于纳米金的“非溶出”化学发光免疫分析相比较，我们建立的方法检出限要低两个数量级。

该化学发光免疫分析方法的特异性评价结果如图7所示，所用待测物的浓度均为1.0×10^-7g/mL时，只有当待测物为人IgG时才有明显的化学发光信号，而其它抗原所诱导的化学发光信号相对来说都非常弱，表明该化学发光免疫分析方法对于人IgG的测定具有良好的特异性。

酶联免疫吸附分析：

酶联免疫吸附分析被认为是免疫分析的经典方法。实验中在测定血清样品中人IgG含量时，通过与酶联免疫吸附分析标准方法相比较，来评价本发明所提出的化学发光免疫分析方法的可靠性。酶联免疫吸附分析的测定过程如下：(1)于聚苯乙烯96孔板中加入100μL1.0×10^-5g/mL羊抗人IgG，4℃放置过夜以完成羊抗人IgG在聚苯乙烯96孔板上的包被。未标记的羊抗人IgG用0.01mol/L含0.05%tween20的磷酸缓冲溶液(PBS-T，pH=7.4)洗三次洗掉。(2)于上述微孔内加入100μL0.01mol/L含1%BSA的磷酸缓冲溶液(PBS-BSApH=7.4)，在37℃下保温一小时之后，用PBS-T洗三次。该过程用于填补微孔内未被羊抗人IgG包被的空缺，避免后面过程所造成的非特异性的吸附。(3)于上述微孔中加入100μL不同浓度的人IgG(或血清样品)，在37℃下保温两小时之后，倒出，每个微孔分别用PBS-T洗六次。(4)于上述微孔中加入100μL1.0×10^-5g/mLHRP标记的羊抗人IgG，在37℃下保温两小时之后用PBS-T洗涤。(5)加入邻苯二胺OPD底物溶液200μL，室温下暗处反应15分钟后，加入100μL2mol/L硫酸终止液。在波长为492nm处，测定有色溶液的吸光度值。用同样的步骤得出人IgG的酶联免疫吸附标准曲线，计算出血清样品中人IgG浓度。

血样的测定：

人血清样品经稀释后同时用本发明所提出的化学发光免疫分析方法及酶联免疫吸附分析方法进行测定，来评价本发明的化学发光免疫分析方法的可靠性。

将一系列稀释的人血清样品作为待测样品，用化学发光免疫分析方法进行测定，同时测定并绘制人IgG的标准曲线。根据人IgG的标准曲线，得出血清样品中IgG的浓度，与用酶联免疫吸附方法得出的结果进行比较，结果如图8所示，两种分析方法测定的结果基本相同，说明本发明所建立的化学发光免疫分析方法比较可靠，可以用于实际血清样品的测定。

利用紫外-可见吸收光谱和透射电镜两种手段对羊抗人IgG修饰的纳米金在与人IgG发生免疫反应前后的变化进行了研究，结果如图9和图10。如图9所示，紫外可见吸收光谱发生了明显的改变。另外，从透射电镜的结果(图10)可以看出，免疫反应之前纳米金是单分散的(图10中的a)，免疫反应完之后纳米金发生了明显的团聚(图10中的b)。

虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是本领域的技术人员应当理解，这些具体实施方式仅是举例说明，本领域的技术人员在不脱离本发明的原理和实质的情况下，可以对上述方法和系统的细节进行各种省略、替换和改变。例如，合并上述方法步骤，从而按照实质相同的方法执行实质相同的功能以实现实质相同的结果则属于本发明的范围。因此，本发明的范围仅由所附权利要求书限定。

Claims (4)

1.一种快速化学发光免疫分析检测人IgG的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

(1)将抗体修饰的纳米金和抗原进行完全的免疫反应；所述免疫反应的时间为30分钟，免疫反应NaCl浓度为1.0×10^-3mol/L；抗体修饰的纳米金制作方法为：取5mL纳米金溶液用0.1mol/LK₂CO₃溶液调节pH为9，加入羊抗人IgG，室温搅拌反应1小时使抗体和金纳米粒子充分结合，于4℃离心30分钟12000转/分以除去未标记的抗体，吸出上清液，沉淀用0.01mol/L含有1％BSA的磷酸缓冲溶液pH7.4悬浮至原体积；

(2)而后将化学发光试剂注入免疫反应后的纳米金溶液中；化学发光试剂中鲁米诺的浓度为5×10^-4mol/L，过氧化氢浓度为5×10^-2mol/L；

(3)检测发光信号：通过IFFL-D流动注射化学发光分析仪测定并记录其化学发光强度。

2.根据权利要求书1所述的快速化学发光免疫分析检测人IgG的方法，其特征在于：所用纳米金的粒径为13nm,且浓度为1.7nM。

3.根据权利要求书1所述的快速化学发光免疫分析检测人IgG的方法，其特征在于：标记抗体所用浓度为0.5mg/mL。

4.根据权利要求书1所述的快速化学发光免疫分析检测人IgG的方法，其特征在于：化学发光体系的pH值优化为12.0。