CN104062287B - 一种基于纳米金催化的化学发光分析检测铁蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于纳米金催化的化学发光分析检测铁蛋白的方法，包括以下步骤：1)纳米金溶液制备，0.01％w/w的HAuCl₄溶液加热至沸，强力搅拌下加入1％的柠檬酸钠溶液，混合溶液保持沸腾15分钟后撤掉加热源，而后不断搅拌冷却至室温，得到的溶液于4℃冰箱中保存备用；2)铁蛋白抗体对纳米金的标记，利用铁蛋白抗体修饰金纳米颗粒；3)免疫反应；4)化学发光分析检测铁蛋白，移取免疫反应完的铁蛋白抗体修饰的纳米金/铁蛋白混合液于化学发光池中，注入鲁米诺‑高碘酸钾化学发光试剂，通过IFFL‑D化学发光分析仪测定并记录其化学发光强度，得出化学发光强度和待测铁蛋白之间的相关关系。

Description

一种基于纳米金催化的化学发光分析检测铁蛋白的方法

技术领域

本发明涉及药物检测技术领域，具体的说，本发明涉及一种基于纳米金催化的化学发光分析检测铁蛋白的方法。

背景技术

铁蛋白是一类广泛存在于动植物及微生物细胞中含高铁量的蛋白质，能够参与和维持铁代谢的平衡。人体内铁蛋白可以通过储存机体中的过剩铁,避免产生铁中毒，也可以释放铁给需铁细胞,用于合成含铁的蛋白质或酶。人们的许多疾病如缺铁性贫血、急性肝炎及蛋白质缺乏症等都与血清中铁蛋白的含量有关，甚至某些癌症患者体内的铁蛋白也会出现异常，可作为一些癌症的辅助诊断，因此对铁蛋白进行准确快速的测定具有重要的意义。目前,铁蛋白的测定主要采用酶联免疫分析(ELISA)法,放射性免疫法、电化学分析方法、表面等粒子共振技术、荧光分析以及很少的化学发光分析等。但是，放射性免疫法因使用放射性同位素作为标记，必然会带来健康危害、废物处理等问题。寥寥可数的化学发光分析和酶联免疫法存在步骤繁多的缺点,而不适用于各种生物标记的检测。别的分析方法大多需要复杂、费时的样品处理和贵重的分析仪器以及具有一定技术要求的操作人员，使得这些方法的应用受到一定限制。

化学发光分析以其灵敏度高、线性范围宽以及操作简单等优点常被用作各种免疫分析的最终检测手段,然而有些化学发光体系〔例如鲁米诺一H₂O₂一HRP(辣根过氧化物酶)〕直接用于免疫分析时大分子的空间位阻作用使方法的灵敏度不够理想。在纳米科学迅猛发展的过程中，纳米粒子尤其金属纳米粒子因其具有容易合成和生物相容性好等优点已被引入化学发光分析，开创纳米粒子化学发光生物分析的新领域，一度成为研究的热点。但是大多基于纳米粒子标记的化学发光免疫分析，均是通过将所标记金属纳米粒子溶出为金属离子，从而催化化学发光反应实现对目标物的检测。Han研究组报道了基于纳米金溶解并结合AuCl₄ ^--HCl-NaCl-Br₂-luminol体系的化学发光金属免疫分析法，用于抗坏血酸过氧化物酶抗体(ApxIV Ab)的测定。Li研究组和Lu研究组相继利用将标记所用纳米金溶解得到AuCl₄ ^-，结合AuCl₄ ^--luminol-H₂O₂化学发光体系测定羊抗人IgG。此外，Li研究组利用将标记的纳米金用Ag⁺还原溶液处理后，经硝酸溶出后，结合Ag⁺-Mn²⁺-K₂S₂O₈-H₃PO₄-luminol化学发光体系测定人IgG。上述这些纳米粒子化学发光金属免疫分析方法存在一定缺陷：一、需要将纳米金属离子的溶出，要使纳米粒子尤其贵金属纳米粒子完全溶出的的条件均比较苛刻且所用溶剂大多有毒。溶出步骤繁琐耗时，且会带来高的背景信号，从而降低方法的灵敏度；二、这些分析方法大多是异相的，需要多步的标记和洗脱，从而难以克服重现性和精密度的问题。

发明内容

本发明针对目前铁蛋白检测技术存在的不足，以免疫特异性反应为分子识别基础，纳米金为信号探针，利用纳米金形态影响其对鲁米诺-高碘酸钾化学发光反应的催化性能，建立了一种简便、快速灵敏的化学发光分析检测铁蛋白的方法。

本发明提供的技术方案是：一种基于纳米金催化的化学发光分析检测铁蛋白的方法，包括以下步骤：

1)纳米金溶液制备，0.01％w/w的HAuCl₄溶液加热至沸，强力搅拌下加入1％的柠檬酸钠溶液，混合溶液保持沸腾15分钟后撤掉加热源，而后不断搅拌冷却至室温，得到的溶液于4℃冰箱中保存备用；

2)铁蛋白抗体对纳米金的标记，利用铁蛋白抗体修饰金纳米颗粒，具体为：将铁蛋白抗体修饰在纳米金粒子的表面，取纳米金溶液用0.1mol/L K₂CO₃溶液调节pH为9，加入铁蛋白抗体，室温搅拌作用1小时使铁蛋白抗体和金纳米粒子充分结合，于4℃温度环境下以12000转/分的速度离心30分钟，以除去未标记的抗体，吸出上清液，剩余的沉淀用0.01mol/L含有1％BSA的磷酸缓冲溶液pH7.4悬浮至原体积，于4℃冰箱中保存待用；

3)免疫反应，免疫反应选用NaCl浓度为1.5×10^-3mol/L，免疫反应时间为15-25分钟；

4)化学发光分析检测铁蛋白，移取免疫反应完的铁蛋白抗体修饰的纳米金/铁蛋白混合液于化学发光池中，注入鲁米诺-高碘酸钾化学发光试剂，通过IFFL-D化学发光分析仪测定并记录其化学发光强度；通过测定化学发光强度检测铁蛋白的含量，由此可以得出化学发光强度和待测铁蛋白之间的相关关系。

所述的步骤1)中，选用的纳米金的粒径为25nm，浓度为6.0×10^-10mol/L～6.0×10^-8mol/L之间。

所述的步骤2)中，标记铁蛋白抗体所用浓度为0.5mg/mL。

所述的步骤4)中，选择鲁米诺-高碘酸钾化学发光试剂为5×10^-4M鲁米诺和5.0×10^-2M高碘酸钾的体积比为2:1混合而成。

鲁米诺-高碘酸钾化学发光试剂的pH值优化为12.0。

本发明的有益效果是：

将纳米粒子对于化学发光反应的催化性能和高特异性的免疫分析相结合，实现铁蛋白的分析检测至今仍未见报道。因此，本发明基于纳米金形态影响其对化学发光反应的催化性能，而建立的实用性、简单、灵敏且快速化学发光分析测定铁蛋白的方法很有意义，能够解决上述检测方法遇到的问题。具有以下优点：(1)所用化学发光仪价格低廉且操作简单；(2)避免繁琐和艰难的纳米金(或银)的溶解剥离，具有高的灵敏度和好的重现性；(3)所用的25nm纳米金的合成简便且易于标记；(4)该方法只需要非竞争的一步操作，避免了多步反应及洗脱步骤，大大节省了分析时间，将测试时间缩短为30分钟以内。

附图说明

当结合附图考虑时，通过参照下面的详细描述，能够更完整更好地理解本发明以及容易得知其中许多伴随的优点，但此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定，其中：

图1抗体用量的优化，纳米金浓度固定为0.6nM，所测吸光度为波长520nm处；

图2免疫反应时间的影响，条件:鲁米诺,5×10^-4M；高碘酸钾,5.0×10^-2M；

图3盐浓度的影响，条件:鲁米诺,5×10^-4M；高碘酸钾,5.0×10^-2M；

图4化学发光反应动力学曲线；图中自下至上分别为没有纳米金,纳米金,纳米金+铁蛋白抗体,纳米金+铁蛋白抗体+铁蛋白；条件:鲁米诺,5×10^-4M；高碘酸钾,5.0×10^-2M；

图5测定铁蛋白的灵敏度分析；

图6测定铁蛋白的特异性评价；注(a)铁蛋白,(b)牛血清白蛋白(BSA),(c)人免疫球蛋白G(IgG),(d)羊免疫球蛋白G IgG,(e)兔免疫球蛋白G IgG，(f)α-胎儿蛋白抗原(AFT)；

图7方法可靠性的评价；

图8纳米金透射电镜图；图8a为纳米金+铁蛋白抗体,图8b为纳米金+铁蛋白抗体+铁蛋白。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

所用到的主要仪器设备和试剂：

IFFL-D流动注射化学发光分析仪及其配套设备(西安瑞迈分析仪器有限公司)，透射电子显微镜(日立公司，规格型号：H-600)，恒温磁力搅拌器(85-2型，上海司乐仪器有限公司)，恒温水浴锅(HH-1型，北京科伟永兴仪器有限公司)，KYC1OOC生化培养箱(上海福玛实验设备有限公司),可调微量加液器(上海求精玻璃仪器厂),聚苯乙烯96微孔板(FOLCON)。

氯金酸(HAuCl₄·4H₂O，AR，Au含量>47.8％，国药集团化学试剂有限公司)；将氯金酸固体溶于二次去离子水中制备氯金酸储备溶液，放于4℃冰箱中保存。将4.43g鲁米诺固体粉末溶解在20mL0.10M NaOH溶液中并稀释至1L，制备得到2.5×10^–2M鲁米诺储备溶液。使用之前避光保存一星期以确保试剂性质的稳定。工作溶液通过稀释鲁米诺储备溶液而得到。将13.8g Na₂HPO₄·12H₂O、1.6g NaH₂PO₄·H₂O和9.0g NaCl溶解在1L的二次去离子超纯水中，配制得到磷酸缓冲溶液(pH7.4)。邻苯二胺(OPD)底物溶液临用前配制。铁蛋白抗体、铁蛋白、人IgG、兔IgG、羊IgG、牛血清白蛋白和α-胎儿蛋白抗原(AFT)均购自于北京鼎国生物技术有限公司。实验用水为二次去离子水。

实验条件的优化：

选用粒径为25nm的纳米金粒子，固定其浓度为0.6nM，对标记所用铁蛋白抗体的用量进行优化，如图1所示，选择铁蛋白抗体的浓度为0.5mg/mL。

免疫反应的有效程度对分析检测铁蛋白的灵敏性至关重要。实验中考察了免疫反应的时间和盐浓度的影响。结果如图2和图3所示，由图2可以看出，免疫反应一开始化学发光信号较弱，随着时间增加，化学发光信号逐渐增强，反应时间到达15分钟时，发光信号迅速增强，约25分钟以后达到稳定。所以，免疫反应的时间选择为25分钟。另外，高浓度的盐能够引起纳米金的团聚，而盐浓度太低将会影响免疫反应的有效进行。本发明考察了盐浓度的影响，从图3可以看出，随着盐浓度的增加，化学发光信号增强，而当盐浓度大于1.5×10^{- 3}mol/L时，随着盐浓度的增加，化学发光信号开始降低，可能是由于过高的离子强度使蛋白质(抗原或抗体)变质，不利于免疫反应的进行而导致纳米金催化性能减弱，从而化学强度降低。所以，NaCl浓度选择为1.5×10^-3mol/L。

另外，考虑到化学发光强度和试剂的消耗，选择鲁米诺的浓度为5×10^-4mol/L，高碘酸钾浓度为5×10^-2mol/L。实验结果表明该体系的pH值为12.0时较适宜。

25nm纳米金的制备：

采用柠檬酸盐还原法制备。50mL的HAuCl₄(0.01％w/w)溶液加热至沸，然后在强力搅拌下，迅速加入0.8mL1％的柠檬酸钠溶液。此混合溶液保持沸腾15分钟后撤掉加热源，而后在不断的搅拌下冷却至室温。得到的溶液于4℃冰箱中保存备用。

铁蛋白抗体修饰金纳米颗粒的制备：

将铁蛋白抗体修饰在25nm金纳米粒子的表面。取5mL纳米金溶液用0.1mol/L K₂CO₃溶液调节pH为9，加入1mL铁蛋白抗体，室温搅拌作用1小时使铁蛋白抗体和金纳米粒子充分结合，于4℃离心30分钟(12000转/分)以除去未标记的抗体，吸出上清液，剩余的沉淀用0.01mol/L含有1％BSA的磷酸缓冲溶液(pH7.4)悬浮至原体积，于冰箱中(4℃)保存待用。

化学发光分析检测铁蛋白：

考虑蛋白质生物试剂的消耗，实验中采取静态注射的方式。移取免疫反应完的铁蛋白抗体修饰的纳米金/铁蛋白混合液200μL于化学发光池中，注入300μL鲁米诺–高碘酸钾化学发光试剂(5×10^-4M鲁米诺和5.0×10^-2M高碘酸钾的体积比为2:1)，通过IFFL-D化学发光分析仪测定并记录其化学发光强度。通过测定化学发光强度检测铁蛋白的含量，由此可以得出化学发光强度和待测铁蛋白之间的相关关系。

铁蛋白化学发光的分析性能：

实验中首先考察了25nm纳米金对鲁米诺-高碘酸钾化学发光反应的催化性能。如图4所示，在没有催化剂的存在下，鲁米诺-高碘酸钾进行的是一个弱的化学发光反应。25nm纳米金能够催化该体系的化学发光反应，铁蛋白抗体对纳米金进行标记几乎没有对其催化性能产生影响，而免疫反应能够导致纳米金的团聚，这一形态的改变使得其催化性能大大提高。基于此现象，实现了铁蛋白的化学发光分析检测。

在前述优化的实验条件下，考察了铁蛋白分析测定的灵敏性。实验中发现随着铁蛋白浓度的增加，化学发光信号逐渐增强。且在6.0×10^-10～6.0×10^-7g/mL的浓度范围内，化学发光的强度与铁蛋白的浓度的对数值成良好的线性关系，线性曲线如图5所示，其检出限为2.8×10^–11g/mL(S/N＝3)。并对5.6×10^–9g/mL的铁蛋白进行六次重复测定，相对标准偏差(R.S.D.)为3.6％。实验结果表明该方法检出限低，精密度好。和已有的灵敏性较好的电化学检测方法相比较，检出限相当，但本方法简便快速得多。

该化学发光分析检测铁蛋白的特异性评价结果如图6所示，所用待测物的浓度均为5.0×10^-7g/mL时，只有当待测物为铁蛋白时才有明显的化学发光信号，而其它组分所诱导的化学发光信号相对来说都非常弱，表明本发明所建立的方法对于铁蛋白的测定具有良好的特异性。

血样的测定：

人血清样品经稀释后同时用本发明所提出的化学发光分析方法及酶联免疫吸附分析方法进行测定，用以评价本发明所建立的分析方法检测铁蛋白的可靠性。

实验中将一系列稀释的人血清样品作为待测样品，用本方法进行测定，同时测定并绘制铁蛋白的标准曲线。根据铁蛋白的标准曲线，得出血清样品中铁蛋白的浓度，与用酶联免疫吸附方法得出的结果进行比较，结果如图7所示，两种分析方法测定的结果基本相同，说明本发明所建立的化学发光分析方法检测铁蛋白比较可靠，可以用于实际血清样品的测定。

利用透射电镜对铁蛋白抗体修饰的纳米金在与铁蛋白发生免疫反应前后的变化进行了研究，结果如图8。可以看出，铁蛋白抗体标记的纳米金是单分散的(图8a)，免疫反应完之后纳米金发生了明显的团聚(图8b)。

以上实例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (4)

1.一种基于纳米金催化的化学发光分析检测铁蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)纳米金溶液制备，0.01％w/w的HAuCl₄溶液加热至沸，强力搅拌下加入1％的柠檬酸钠溶液，混合溶液保持沸腾15分钟后撤掉加热源，而后不断搅拌冷却至室温，得到的溶液于4℃冰箱中保存备用；纳米金的粒径为25nm，浓度为6.0×10^-10mol/L～6.0×10^-8mol/L之间；

2)铁蛋白抗体对纳米金的标记，利用铁蛋白抗体修饰金纳米颗粒，具体为：将铁蛋白抗体修饰在纳米金粒子的表面，取纳米金溶液用0.1mol/L K₂CO₃溶液调节pH为9，加入铁蛋白抗体，室温搅拌作用1小时使铁蛋白抗体和金纳米粒子充分结合，于4℃温度环境下以12000转/分的速度离心30分钟，以除去未标记的抗体，吸出上清液，剩余的沉淀用0.01mol/L含有1％BSA的磷酸缓冲溶液pH7.4悬浮至原体积，于4℃冰箱中保存待用；

3)免疫反应，免疫反应选用NaCl浓度为1.5×10^-3mol/L，免疫反应时间为15-25分钟；

4)化学发光分析检测铁蛋白，移取免疫反应完的铁蛋白抗体修饰的纳米金/铁蛋白混合液于化学发光池中，注入鲁米诺-高碘酸钾化学发光试剂，通过IFFL-D化学发光分析仪测定并记录其化学发光强度；通过测定化学发光强度检测铁蛋白的含量，由此可以得出化学发光强度和待测铁蛋白之间的相关关系。

2.根据权利要求1所述的一种基于纳米金催化的化学发光分析检测铁蛋白的方法，其特征在于，所述的步骤2)中，标记铁蛋白抗体所用浓度为0.5mg/mL。

3.根据权利要求1所述的一种基于纳米金催化的化学发光分析检测铁蛋白的方法，其特征在于，所述的步骤4)中，选择鲁米诺-高碘酸钾化学发光试剂为5×10^-4M鲁米诺和5.0×10^-2M高碘酸钾的体积比为2:1混合而成。

4.根据权利要求3所述的一种基于纳米金催化的化学发光分析检测铁蛋白的方法，其特征在于，其特征在于，鲁米诺-高碘酸钾化学发光试剂的pH值优化为12.0。