CN103954611A

CN103954611A - 基于适体技术金纳米化学发光放大检测腺苷的方法

Info

Publication number: CN103954611A
Application number: CN201410138208.XA
Authority: CN
Inventors: 严喜鸾; 凌云; 邹宏
Original assignee: Nanchang University
Current assignee: Nanchang University
Priority date: 2014-04-09
Filing date: 2014-04-09
Publication date: 2014-07-30

Abstract

本发明公开了一种基于核酸适体技术的金纳米标记化学发光检测腺苷并在此基础上发展羟胺放大检测的方法，它是利用羧基修饰的磁性微球作为分离载体,通过氨羧反应将腺苷适体连接于磁性微球，通过腺苷和生物素修饰的适体报告序列与腺苷适体竞争结合，导致连接于磁性微球的链霉亲和素金纳米量的差异，实现腺苷的化学发光间接检测。并利用羟胺放大金纳米的特性极大提高了化学发光检测灵敏度。本方法优点在于灵敏度高，特异性强，测定范围宽，设备简单，操作简便，适合测定腺苷的血、尿试样，为临床诊断疾病提供有利分析数据。

Description

基于适体技术金纳米化学发光放大检测腺苷的方法

技术领域

本发明属于分析技术领域，特别涉及小分子腺苷的化学发光检测方法。

背景技术

腺苷是一种遍布人体细胞的内源性核苷，自Drury和Szen-Gyorgyi于1929年证实心肌细胞中存在腺苷之后，许多医学研究证实腺苷不但是用于合成三磷酸腺苷、腺嘌呤、腺苷酸、阿糖腺苷的重要中间体，而且可直接进入心肌经磷酸化生成腺苷酸，参与心肌能量代谢，同时还参与扩张冠脉血管，增加血流量。另外，大量研究表明在尿中腺苷含量可作为肿瘤的潜在生物标志物，在癌症诊断、手术疗效评价中具有临床实用价值，因此对腺苷的高灵敏分析检测在许多领域具有重要的意义。

金纳米((Au nanoparticles, AuNPs) 毒性小、粒径小，易于被细胞摄取，经功能化修饰后，可以用于生物成像、药物与基因传递等治疗与诊断领域。另外，AuNPs具有卓越的电传导性、等离子体共振特性、高催化性和高稳定性，且其表面易于修饰，已在光学、电化学等生物传感器构建方面大受欢迎。故AuNPs以其优良的电学、光学、热力学等性能，已广泛地应用于物理学、化学、生物学、医学和材料科学及其交叉学科。化学发光(chemiluminescence，CL)分析法是根据化学反应产生的可见光的强度来确定物质含量的分析方法。CL分析技术具有分析速度快、灵敏度高、仪器设备简单、线性范围广且适用于微量分析等特性，已广泛应用于分析化学的各个领域。功能化AuNPs一方面可用作CL底物的载体；另一方面，由于AuNPs尺寸小、可控组装、表面效应明显，在NH₂OH/Au³⁺溶液中可在较小粒径的AuNPs表面沉积形成更大颗粒的胶体金，达到放大CL信号的目的。

以AuNPs为核，氯金酸和弱还原剂盐酸羟胺反应生成的金原子沉积在金纳米粒表面，获得更大的分散性较好的金纳米颗粒，从而实现羟胺放大化学发光检测腺苷。

研究者们在单链DNA或RNA自身形成的空间结构与目标分子高效特异结合的基础上，建立随机寡核苷酸文库，将该库中的核苷酸序列与目标分子混合，用洗脱、过滤、亲和色谱、磁性微球等方法筛选出与其特异性结合的核苷酸片段，再通过PCR进行扩增，经多个循环分离得到亲和力和特异性都最高的寡核苷酸结合序列，此技术称为指数富集配体系统进化 (Systematic evolution of ligand by exponential enrichment， SELEX)技术筛选出的寡核苷酸片段被称为核酸适配体，也称为适体。目前己经通过SELEX技术，筛选到对腺苷具有专一性识别能力的适体，为腺苷的检测提供了一种新的分析平台。本发明将适体技术应用到AuNPs的光学传感器的构建上来，可以兼具二者的优势，显著提高检测的灵敏度与特异性。

发明内容

本发明的目的针对现有检测方法大多数存在仪器设备昂贵、操作费时且需要复杂的样本前处理等的不足，提供一种操作简单基于适体技术的以金纳米为标记物的化学发光检测腺苷的方法。

本发明的操作方案是通过以下步骤实现的：

一种基于适体技术的金纳米及羟胺放大化学发光检测腺苷的方法，其特征在于包含以下步骤：

（1）链霉亲和素金纳米制备：取100mL 0.01%HAuCl₄120℃加热至沸腾，迅速加入4mL2%Na₃C₆H₅O₇再沸10min后自然冷却，（为达到更好的效果，用0.1mol/LK₂CO₃调pH至6.8～7.0），再加入10 mL0.022mol/L链霉亲和素，反应10min，加入500μL1%BSA稳定剂，6000r/min离心1h，弃去上清液，沉淀再用1%BSA洗涤三次，最后用pH7.0的0.1mol/L PBS缓冲液定容为100mL，置4℃下保存备用；

（2）传感器检测腺苷：取40μg羧基修饰的磁性微球，置于1.5mL离心管中，通过磁性分离器分离，弃去上清液，用100μL咪唑缓冲液洗涤磁性微球三次，加入100μL含1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺即EDC的0.1M pH6.0咪唑缓冲液悬浮磁性微球， 37℃ 的恒温振荡器中活化20min（振荡速度170r/min）；然后加入30pmol氨基修饰的腺苷适体， 37℃ 的恒温振荡器中，反应lh; 磁性分离器分离，弃去上清液，用100μL WB (即7mM pH8.0 Tris–HCl、 0.17 M NaCl、0.05% Tween 20溶液) 溶液洗涤，进行三次；加入10%BSA溶液，37℃下封闭反应lh，WB溶液洗涤三次；加入10pmol生物素修饰的腺苷适体互补序列的BA（20 mM pH 8.0Tris–HCl、0.5 M NaCl溶液）溶液100μL， 37℃的恒温振荡器中反应lh；平行处理多份；分别加入一系列不同浓度的目标物腺苷及待测样品溶液，每管总体积为100μL，37℃的恒温振荡器中反应lh，磁性分离器分离，WB溶液洗涤三次；再分别加入50μL链霉亲和素金金纳米SA-Au的PBS缓冲液， 37℃下恒温振荡器中反应1h；最后用含有2%BSA的WB洗涤液通过磁性分离器洗涤磁性微球复合物3次；

（3）检测方法：将磁性微球复合物用0.1M PBS定容50μL；加入4℃溴饱和水溶液50μL，常温下反应10min，60℃反应20min，从中取该溶液90μL与100μL10^-5 mol/L鲁米诺溶液迅速混合后立即置化学发光仪中测定；以加入腺苷的浓度为横坐标，以发光强度为纵坐标，绘制标准曲线；根据标准曲线计算待测样品中腺苷浓度。

具体技术原理为：

（1）活化的羧基磁性微球通过氨羧反应联接腺苷适体；（2）适体先与生物素修饰的报告序列进行杂交反应，随后加入一系列不同量的腺苷，由于适体与腺苷的结合常数比DNA杂交互补序列的结合常数高几个数量级，腺苷与腺苷适体的竞争结合导致部分已与腺苷适体杂交的报告序列脱离，从而离开磁性微球；（3）随后加入SA-Au，通过生物素与链霉亲和素的特异性反应将Au连接在磁性微球上；随着腺苷量的增加，脱离磁性微球表面的生物素修饰的报告序列越多，故磁性微球上连接的SA-Au也越少，信号减弱，这是一个信号递减（signal-off ）的反应。（4）磁性分离后，利用氧化剂溴水溶解AuNPs，在NaCl-HCl作用下形成AuCl^-4 ,催化鲁米诺体系产生化学发光信号,对腺苷实现高灵敏度间接定量。详见附图1。

（2）羟胺放大是利用NH₂0H/Au³⁺在溶液中可在较小粒径的AuNPs表面聚集形成更大颗粒的金纳米（金纳米化学发光信号与其粒径正相关）而达到放大信号的效果。

本发明方法与其它方法比较，本方法有以下优点：

操作简单、快速、仪器易于普及、灵敏度高、测量范围广。

附图说明

图1 基于适体技术腺苷化学发光检测原理图；

图2 基于金纳米与羟胺放大腺苷发光检测标准曲线图；

图3 基于金纳米腺苷发光检测标准曲线图。

具体实施方式

羧基修饰的磁珠(直径1.5μm，20mg/mL)购自于Polyscience Inc.公司 (Warrington PA，USA)；

氨基修饰的腺苷适体、生物素修饰的腺苷适体互补序列均由上海生工生物有限公司根据公开的腺苷适体序列合成；

WB溶液为7mM Tris–HCl， pH8.0， 0.17 M NaCl、0.05% Tween 20；

BA溶液为20 mM Tris–HCl， pH 8.0 和 0.5 M NaCl。

实施例1 基于适体的金纳米化学发光体系腺苷的方法

链霉亲和素金纳米（SA-Au）制备：取100mL 0.01%HAuCl₄120℃加热至沸腾，迅速加入4mL 2%Na₃C₆H₅O₇，再沸10min后自然冷却，用0.1mol/LK₂CO₃调pH至6.8～7.0，再加入10 mL0.022mol/L链霉亲和素，反应10min，加入500μL1%BSA稳定剂，6000r/min离心1h，沉淀再用1%BSA洗涤3次，最后用pH7.0的0.1mol/LPBS定容至100mL。

将280μg羧基修饰的磁性微球，置1.5mL离心管中，通过磁性分离器分离，弃去上清液，接着每次用100μL咪唑缓冲液洗涤磁性微球三次，加入含EDC的100μL的咪唑缓冲液( pH6.0 )重新悬浮磁性微球， 37℃ 的恒温振荡器中活化20min（振荡速度170r/min）；加入210pmol氨基修饰的腺苷适体， 37℃ 的恒温振荡器中-反应lh，磁性分离器分离，弃去上清液，每次用100μL WB洗涤三次；加入10%BSA溶液37℃下封闭反应lh， WB洗涤三次；将70pmol生物素修饰的腺苷适体互补序列加入封闭后的磁性微球BA液中， 37℃的恒温振荡器中反应lh，弃去上清液， WB洗涤两次；加入800μLWB溶液悬浮磁性微球，平均分成八份，分别置于1.5mL离心管中，弃去上清液，各离心管分别加入100μL不同浓度(1×10^-11， 2×10^-11， 5×10^-11， 1×10^-10， 2×10^-10， 5×10^-10mol/L)的目标物腺苷AA溶液(20 mM Tris-HCl， pH 8.0 and 0.5 M NaCl )、100μL待测样品（尿样）溶液，同时以加100μL AA溶液作为空白实验，37℃的恒温振荡器中反应lh，反应后在磁场下分离，WB洗涤三次。

各管分别加入50μL包含有1%BSA的链霉亲和素金纳米（SA-Au）的PBS缓冲液， 37℃下轻摇孵育1h后，磁性微球复合物用包含有2%BSA的WB洗涤液洗涤3次；将复合物用0.1M PBS定容至50μL，加入4℃溴饱和水溶液50μL，60 ℃反应20min；取该液90μL，加100μL 10^-5 mol/L鲁米诺溶液迅速混合后立即放入化学发光仪中测定。记录实验结果，本实验空白实验的数值最大。将空白值减去所有浓度对应的数值，由实验结果可得实验数据与腺苷浓度的线性关系良好(y=5858x-4187， R=0.9949)，如图3所示。待测样品溶液中的腺苷浓度根据标准曲线得出。

实施例2 基于羟胺放大金纳米化学发光检测腺苷的方法

链霉亲和素金纳米制备：同上。

取640μg羧基修饰的磁性微球，置1.5mL离心管中，通过磁性分离器分离，弃去上清液，用100μL咪唑缓冲液，洗涤磁性微球三次，加入含EDC的100μL的咪唑缓冲液( pH6.0 )重新悬浮磁性微球，37℃ 的恒温振荡器中活化20min；加入160pmol氨基修饰的腺苷适体，37℃ 的恒温振荡器中，反应lh；磁性分离器分离，吸去上清液，每次用100μL WB洗涤三次；加入10%BSA溶液37℃下封闭反应lh，WB洗涤三次；将120pmol生物素修饰的适体互补序列加入封闭后的磁性微球的BA液中， 37℃的恒温振荡器中反应lh，弃去上清液， WB洗涤两次；加入900μLWB溶液悬浮磁性微球，平均分成九份，分别置于1.5mL离心管中，弃去上清液，分别加入100μL不同浓度(5×10^-11， 1×10^-11， 5×10^-12， 2×10^-12， 1×10^-12， 5×10^-13， 2×10^-13mol/L )的目标物腺苷（做标准曲线用）AA溶液及待测样品（尿样）溶液，同时以加100μL AA溶液为空白实验， 37℃的恒温振荡器中反应lh，反应后在磁场下分离，WB洗涤三次；

各管分别加入50μL包含有1%BSA链霉亲和素金纳米（SA-Au）的PBS缓冲液， 37℃下轻摇孵育1h后，磁性微球复合物用包含有2%BSA的WB洗涤液洗涤3次；加入100μL 50 μmol/L HAuCl₄和100μL 0.05mmol/L NH₂OH到复合物中置于37℃的恒温振荡器振荡10 min，再加入4℃溴饱和水溶液50μL，常温下反应10min，60 ℃反应20min；取该液50μL，加100μL 10^-6 mol/L鲁米诺溶液迅速混合后立即放入化学发光仪中测定。记录实验结果，绘制标准曲线，本实验空白实验的数值最大。将空白值减去所有浓度对应的数值，由实验结果可得实验数据与腺苷浓度的线性关系良好(y=130975x-242095， R=0.9979)，如图2所示。待测样品溶液中的腺苷浓度根据标准曲线得出。

Claims

1.一种基于适体技术金纳米化学发光放大检测腺苷的方法，其特征在于包含以下步骤：（1）链霉亲和素金纳米制备：取100mL 0.01%HAuCl₄120℃加热至沸腾，迅速加入4mL 2%Na₃C₆H₅O₇再沸10min后自然冷却，再加入10 mL0.022mol/L链霉亲和素，反应10min，加入500μL 1%BSA稳定剂，6000r/min离心1h，弃去上清液，沉淀再用1%BSA洗涤3次，最后用pH7.0的0.1mol/L PBS缓冲液定容至100mL，置4℃下保存备用；（2）传感器检测腺苷：取40 μg羧基修饰的磁性微球，置于1.5mL离心管中，通过磁性分离器分离，弃去上清液，用100μL咪唑缓冲液洗涤磁性微球三次，加入100μL含1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺即EDC的0.1M pH6.0咪唑缓冲液悬浮磁性微球，置37℃ 的恒温振荡器中活化20min（振荡速度170r/min）；然后加入30pmol氨基修饰的腺苷适体，37℃ 的恒温振荡器中，反应lh; 磁性分离器分离，弃去上清液，用100μL WB (即7mM pH8.0 Tris–HCl、 0.17 M NaCl、0.05% Tween 20溶液) 溶液洗涤，进行三次；加入10%BSA溶液，37℃下封闭反应lh,WB溶液洗涤三次；加入10pmol生物素修饰的腺苷适体互补序列的BA（20 mM pH 8.0Tris–HCl、0.5 M NaCl溶液）溶液100μL， 37℃的恒温振荡器中反应lh，平行处理多份；分别加入一系列不同浓度的目标物腺苷及待测样品溶液，每管总体积为100μL，37℃的恒温振荡器中反应lh，磁性分离器分离，WB溶液洗涤三次；再分别加入50μL链霉亲和素金纳米SA-Au的PBS缓冲液， 37℃下恒温振荡器中反应1h；随后，最后用含有2%BSA的WB洗涤液通过磁性分离器洗涤磁性微球复合物3次；（3）检测方法：将磁性微球复合物用0.1M PBS定容50μL；加入4℃溴饱和水溶液50μL，常温下反应10min，60℃反应20min，从中取该溶液90μL与100μL10^-5mol/L鲁米诺溶液迅速混合后立即置化学发光仪中测定；以加入腺苷的浓度为横坐标，以发光强度为纵坐标，绘制标准曲线；根据标准曲线计算待测样品中腺苷浓度。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（1）中溶液加入链霉亲和素之前，用0.1mol/LK₂CO₃调pH至6.8～7.0。