CN103267847A - 一种猪血清中猪胸膜肺炎放线杆菌的检测方法 - Google Patents

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曹杰
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Abstract

本发明涉及一种猪血清中猪胸膜肺炎放线杆菌的检测方法，步骤如下：对随机抽取规模场的仔猪及育肥猪血清样品，首先对采集的血清样品进行IHA（间接血凝试验）方法检测，然后对采集的血清样品进行APPELISA检测，即可检测猪血清中猪胸膜肺炎放线杆菌。本发明检测方法采用APP间接血凝试验与APPELISA试验的联合使用，使得猪胸膜肺炎放线杆菌的检测结果更为准确、可靠、快速、灵敏，检测结果稳定，不会出现误差，而且检测方法成本低廉，方法简单，适于基层应用，给猪的养殖及防病、抗病带来了极大的便利。

Description

一种猪血清中猪胸膜肺炎放线杆菌的检测方法
技术领域
本发明属于猪血清检测技术领域，尤其是一种猪血清中猪胸膜肺炎放线杆菌的检测方法。
背景技术
猪传染性胸膜肺炎是由猪胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）引起的一种呼吸道传染病，以急性出血性纤维素性胸膜炎和慢性纤维素性坏死性肺炎为特征。该病自1957年在英国发现以来，已在世界范围内广泛流行，成为国际上公认的危害现代猪业的五大疫病之一。该病虽在我国发现较晚，但对养殖业危害较为严重，已成为我国病猪业中呼吸道病的三大常发病之一。
猪胸膜肺炎放线杆菌的现有检测方法很多，大致可以分为三大类，即病原学诊断方法、血清学诊断方法和分子生物学诊断法。病原学诊断方法需要细菌分离、培养和鉴定，周期较长；血清学诊断方法包括补体结合反应、荧光抗体、间接血液凝集试验和酶联免疫吸附试验(ELISA)等，血清学诊断方法的缺点是只能检测动物体内胸膜肺炎放线杆菌的抗体而无法检测病原；分子生物学诊断方法主要包括反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)与荧光核酸探针，分子生物学方法比前两种方法快速、灵敏，但需要使用特殊的仪器，如PCR仪，而荧光探针的制备比较昂贵，不适于基层应用。
但是，有时通过上述检测方法单一使用进行检测时，经常检测结果不稳定，有时会出现误差，这也给猪的养殖及防病、抗病带来了极大的不便。
通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种方法简便、检测结果准备、灵敏度高的猪血清中胸膜肺炎放线杆菌的检测方法。
本发明实现目的的技术方案是：
一种猪血清中猪胸膜肺炎放线杆菌的检测方法，步骤如下：
⑴随机抽取规模场的仔猪及育肥猪血清样品；
⑵间接血凝试验检测待检猪血清中的猪胸膜肺炎放线杆菌抗体
①将猪胸膜肺炎放线杆菌间接血凝试剂盒中的阴阳性对照、抗原恢复室温；
②在V型110度板上进行微量间接血凝试验，200倍倍比稀释血清，做阴阳性对照，加样处理好后放入37℃恒温箱中静置1.5h后观察判断结果，猪血清中检测到猪胸膜肺炎放线杆菌，检测结果即为阳性；
⑶猪胸膜肺炎ELISA试剂盒检测待检猪胸膜肺炎放线杆菌抗体；
①将试剂盒取出，盒内试剂恢复室温并充分摇匀；
②将200倍稀释后的样本和对照加入板孔中，每孔50uL，阴阳性对照均为双份；
③盖上膜，37℃维持60min；
④去膜，用300uL的洗液清洗3次，最后一次在吸水纸上将平板拍干；
⑤每孔加50uL酶标抗体；
⑥重复步骤③；
⑦重复步骤④；
⑧加入50uL底物溶液，轻摇2秒；
⑨将平板放入黑暗中在20-25℃作用15min；
⑩加入50uL终止液，轻摇2s，10min内在405nm下读数并记录结果，判定标准根据试剂盒使用说明书判定，猪血清中检测到猪胸膜肺炎放线杆菌，检测结果即为阳性；
⑷步骤⑴及步骤⑵的检测结果均为阳性，则猪血清中检测到猪胸膜肺炎放线杆菌。
而且，所述步骤⑴中猪胸膜肺炎放线杆菌间接血凝试剂盒购自兰州兽医研究所。
而且，所述步骤⑵中猪胸膜肺炎ELISA试剂盒购自法国LSI公司。
本发明的优点和积极效果是：
本发明检测方法采用APP间接血凝试验与APPELISA试验的联合使用，使得猪胸膜肺炎放线杆菌的检测结果更为准确、可靠、快速、灵敏，检测结果稳定，不会出现误差，而且检测方法成本低廉，方法简单，适于基层应用，给猪的养殖及防病、抗病带来了极大的便利。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为常规方法；所使用的试剂及试剂盒，如无特殊说明，均为市售产品。
本发明检测方法的总体思路是：对随机抽取规模场的仔猪及育肥猪血清样品，首先对采集的血清样品进行IHA（间接血凝试验）方法检测，然后对采集的血清样品进行APPELISA试验复检，统计实验室检测结果，分析确定猪传染性胸膜肺炎的情况。
一、检测前的准备
1、猪血清材料采集地点：石家庄地区。
2、猪血清材料采集对象：我市54家未接种过传染性胸膜肺炎疫苗的规模性猪场，随机抽仔猪和育肥猪血清样品，详见表1：
表1猪传染性胸膜肺炎血液样本采集分布
东部地区 西部地区 北部地区 南部地区 合计
规模场数量 19 15 11 9 54
仔猪检测数量 74 57 44 36 211
育肥猪检测数量 124 94 68 61 347
合计 198 151 112 97 558
3、APP间接血凝试剂盒购自兰州兽医研究所。
4、APPELISA试验试剂盒购自法国LSI公司。
二、对上述猪血清中猪胸膜肺炎放线杆菌的检测方法，步骤如下：
⑴间接血凝试验（IHA）检测待检猪血清中的APP抗体
①将APP间接血凝试剂盒中的阴阳性对照、抗原恢复室温；
②在V型110度板上进行微量间接血凝试验，200倍倍比稀释血清，做阴阳性对照，加样处理好后放入37℃恒温箱中静置1.5h后观察判断结果；
③判定标准根据兰州兽医研究所《猪传染性胸膜肺炎间接血凝试验诊断抗原说明书》。
⑵猪胸膜肺炎ELISA试剂盒（APP-Ab）检测待检APP抗体；
①将试剂盒取出，盒内试剂恢复室温并充分摇匀；
②将200倍稀释后的样本和对照加入板孔中，每孔50uL,阴阳性对照均为双份；
③盖上膜，37℃维持60min；
④去膜，用300uL的洗液清洗3次，最后一次在吸水纸上将平板拍干；
⑤每孔加50uL酶标抗体；
⑥重复步骤③；
⑦重复步骤④；
⑧加入50uL底物溶液，轻摇2秒；
⑨将平板放入黑暗中在20-25℃作用15min；
⑩加入50uL终止液，轻摇2s，10min内在405nm下读数并记录结果，判定标准根据试剂盒使用说明书判定。
三、检测结果
1、IHA方法检测结果：42家规模猪场129份血清阳性
阳性猪场和阳性血清的比例分别为77.78%和23.12%，详见表2。
表2猪传染性胸膜肺炎间接血凝试验结果
东部平原 西部山区 北部 南部 合计
规模猪场数 19 15 11 9 54
阳性数 16 10 8 8 42
阳性率 84.21% 66.67% 72.73% 88.89% 77.78%
仔猪检测份数 74 57 44 36 211
阳性数 10 4 5 7 26
阳性率 13.51% 7.02% 11.36% 19.44% 12.32%
育肥猪检测份数 124 94 68 61 347
阳性数 43 23 18 19 103
阳性率 34.68% 24.47% 26.47% 31.15% 29.68%
血清样本数 198 151 112 97 558
阳性数 53 27 23 26 129
阳性率 26.77% 17.88% 20.54% 26.80% 23.12%
数据显示：规模猪场育胎儿阳性率大概在30%，远大于仔猪的阳性率。西部山区的规模猪场感染率较低，东部和南部最高。
2、APPELISA试验结果：
41家规模猪场119份血清阳性，阳性猪场和阳性血清的比例分别为75.93%和21.33%，详见表3。
表3猪传染性胸膜肺炎ELISA试验结果
东部平原 西部山区 北部 南部 合计
规模猪场数 19 15 11 9 54
阳性数 16 9 8 8 41
阳性率 84.21% 60.00% 72.73% 88.89% 75.93%
仔猪检测份数 74 57 44 36 211
阳性数 10 3 5 6 24
阳性率 13.51% 5.26% 11.36% 16.67% 11.37%
育肥猪检测份数 124 94 68 61 347
阳性数 39 20 18 18 95
阳性率 31.45% 21.28% 26.47% 29.51% 27.38%
血清样本数 198 151 112 97 558
阳性数 49 23 23 24 119
阳性率 24.75% 15.23% 20.54% 24.74% 21.33%
数据显示：规模猪场育肥猪阳性率为27%，可仍远大于仔猪的阳性率11%，558份血清119份为阳性。
根据以上两种结果分析得出以下结论：
⑴国产和进口两种试剂盒的重复检出率为100%，APPELISA试验试验119份样本APP间接血凝试验全部检出过，国产试剂价格低廉，所以国产试剂可以广泛应用于猪群传染性胸膜肺炎的检测工作。同时，APP间接血凝试验与APPELISA试验的联合使用，使得胸膜肺炎放线杆菌的检测结果更为准确、可靠。
⑵本次被检测的血清样品全部在未免疫猪传染性胸膜肺炎疫苗的猪场采集，因此可以判定该猪场已经出现APP携带的猪只。
⑶育肥猪因为饲养的时间长，感染几率大，所以感染率远大于仔猪。
⑷东部、南部的规模猪场因交通便利，流通频繁和引入带菌猪只也是猪传染性胸膜肺炎检出率高的原因。
⑸西部山区一家规模场APP间接血凝试验检出1例仔猪和2例育肥猪胸膜肺炎弱阳性，APPELISA试验试验显示阴性，说明该猪群于不稳定时期，应该加强卫生消毒、饲养管理和监测其它猪群是否为隐性携带者。
⑹北部地区APP间接血凝试验和APPELISA试验检测出阳性猪只完全一样，通过流行病学调查，该猪群为隐性携带者。
四、讨论
1、利用兽医体系建设的平台，定期开展猪场兽医人员技术培训，传播新技术、新方法，提高技术业务水平，以便及时掌握胸膜肺炎的流行与发展的最初动态。
2、坚持自繁自养的原则，做到“全进全出”的科学管理。健全畜禽引进检测制度，保证引进的畜禽不带毒；养殖场、舍的设计、建设设施要符合国家动物卫生防疫要求；强化动物防疫条件的审核，落实生物安全措施；保持干燥，优化环境，防止病原的滋生，切断传播途径，减少感染。
3、对危害畜禽的主要疫病进行定期监测，尤其是受猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒影响的猪场更容易被APP感染。同时要采取经常性的控制措施，并将监控程序形成规范化制度。
总之，猪传染性胸膜肺炎的问题在世界范围内仍然没有彻底解决，由于种猪的交流，有传入新血清型的可能，做好引种检疫是必要的。所以一方面要搞好环境卫生，切断疾病传播途径，另一方面还要尽可能避免猪传染性胸膜肺炎与其它呼吸道混合感染造成的较大经济损失。

Claims (3)

1.一种猪血清中猪胸膜肺炎放线杆菌的检测方法，其特征在于：步骤如下：
⑴随机抽取规模场的仔猪及育肥猪血清样品；
⑵间接血凝试验检测待检猪血清中的猪胸膜肺炎放线杆菌抗体
①将猪胸膜肺炎放线杆菌间接血凝试剂盒中的阴阳性对照、抗原恢复室温；
②在V型110度板上进行微量间接血凝试验，200倍倍比稀释血清，做阴阳性对照，加样处理好后放入37℃恒温箱中静置1.5h后观察判断结果，猪血清中检测到猪胸膜肺炎放线杆菌，检测结果即为阳性；
⑶猪胸膜肺炎ELISA试剂盒检测待检猪胸膜肺炎放线杆菌抗体；
①将试剂盒取出，盒内试剂恢复室温并充分摇匀；
②将200倍稀释后的样本和对照加入板孔中，每孔50uL，阴阳性对照均为双份；
③盖上膜，37℃维持60min；
④去膜，用300uL的洗液清洗3次，最后一次在吸水纸上将平板拍干；
⑤每孔加50uL酶标抗体；
⑥重复步骤③；
⑦重复步骤④；
⑧加入50uL底物溶液，轻摇2秒；
⑨将平板放入黑暗中在20-25℃作用15min；
⑩加入50uL终止液，轻摇2s，10min内在405nm下读数并记录结果，判定标准根据试剂盒使用说明书判定，猪血清中检测到猪胸膜肺炎放线杆菌，检测结果即为阳性；
⑷步骤⑴及步骤⑵的检测结果均为阳性，则猪血清中检测到猪胸膜肺炎放线杆菌。
2.根据权利要求1所述的猪血清中猪胸膜肺炎放线杆菌的检测方法，其特征在于：所述步骤⑴中猪胸膜肺炎放线杆菌间接血凝试剂盒购自兰州兽医研究所。
3.根据权利要求1所述的猪血清中猪胸膜肺炎放线杆菌的检测方法，其特征在于：所述步骤⑵中猪胸膜肺炎ELISA试剂盒购自法国LSI公司。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101113980A (zh) * 2007-06-28 2008-01-30 华中农业大学 一种检测猪胸膜肺炎抗体的胶体金化学发光免疫分析方法

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