CN112557652A - 一种双抗体夹心法检测新型冠状病毒的胶体金试剂盒及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种双抗体夹心法检测新型冠状病毒的胶体金试剂盒及制备方法。所述试剂盒包括盒体、位于所述盒体内的底板，所述底板上延长度方向依次粘贴有样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫，所述硝酸纤维素膜上靠近所述胶体金结合垫侧设有检测T线，所述硝酸纤维素膜上靠近所述吸水垫侧设有质控C线，所述胶体金结合垫含有S‑RBD蛋白抗原，所述检测T线上包被有兔抗人IgG抗体，所述质控C线上包被羊抗兔IgG。该系列产品为更快捷、更准确、更早期、更便利检测新冠病毒提供更多工具，为全球抗击疫情的战役提供交叉科学的武器。

Description

一种双抗体夹心法检测新型冠状病毒的胶体金试剂盒及制备 方法

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种双抗体夹心法检测新型冠状病毒的胶体金试剂盒及制备方法。

背景技术

新型冠状病毒(2019-nCoV)感染后常见体征有发热、干咳、乏力、逐渐出现呼吸困难，而部分患者未表现出临床症状。潜伏期及无症状感染者均具有传染性，且具备人传人的特点，而无症状感染者也可成为传染源，其主要通过呼吸道飞沫和密切接触传染传播，人群普遍易感。

新型冠状病毒(2019-nCoV)感染暴发以来，目前临床诊断是通过实时定量荧光PCR核酸检测试剂(核酸检测)检测患者和疑似患者血液中的2019-nCoV特定核酸序列，虽然该方法在排查中发挥了重要作用，但是该方法受操作繁琐、耗时长、需要集中送检、对检测人员要求高等的限制，同时检测结果受RNA提取效果影响较大，假阴性较高。该方法检测结果还会受到PCR试剂的质量和气溶胶污染的影响。市场上检测试剂盒目前为抗体检测试剂盒，其仅在发病产生抗体 (感染8-15天)后才能检出，不能在感染早期检测出来，因此还不能满足大规模疑似患者和无症状感染者的快速筛查。

疫情发展至今，国内疫情已较为稳定，国外疫情较为严重，目前境外输入控制极为重要，如何在机场这种人流量很大的场所快速筛查疑似病例，供临床医生快速判断是否为新型冠状病毒肺炎，以便于快速隔离免于传染给更多的人，是亟需解决的问题。

发明内容

本发明的目的是解决上述现有技术的不足，提供一种双抗体夹心法检测新型冠状病毒的胶体金试剂盒及制备方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种双抗体夹心法检测新型冠状病毒的胶体金试剂盒，包括盒体、位于所述盒体内的底板，所述底板上延长度方向依次粘贴有样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫，所述硝酸纤维素膜上靠近所述胶体金结合垫侧设有检测T 线，所述硝酸纤维素膜上靠近所述吸水垫侧设有质控C线，所述胶体金结合垫含有S-RBD蛋白抗原，所述检测T线上包被有兔抗人IgG抗体，所述质控C线上包被羊抗兔IgG。

上述双抗体夹心法检测新型冠状病毒的胶体金试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

S1、胶体金结合垫的制备：将结合垫使用预处理液处理干燥后均匀滴加胶体金免疫复合物，37℃烘箱放置，彻底干燥后备用；

S2、硝酸纤维素膜的制备：将兔抗人IgG抗体包被在硝酸纤维素膜上形成检测T线，将羊抗兔IgG包被在硝酸纤维素膜上形成质控C线；

S3、切割装配：将硝酸纤维素膜固定在底板中部，处理过的胶体金结合垫的一端压在硝酸纤维素膜的检测T线端，处理过的样品垫一端压于胶体金结合垫的另一端，将吸水垫粘在底板上，其中一端压于硝酸纤维素膜的质控C线端，将装配好的试纸条检测片用切条机切成4mm±0.5mm宽，放入卡扣底座的凹槽里，盖上盖压紧，成品置于铝箔袋中，加入干燥剂，抽真空，干燥环境保存备用。

优选地，步骤S1所述预处理液为含有0.5％PVA、50mmol/L PBS、0.5％BSA、 0.88％NaCl，pH7.4的多聚酯纤维素膜预处理液。

进一步地，步骤S1所述胶体金免疫复合物的制备方法包括以下步骤：

S11、取200μL胶体金纳米颗粒水溶液分装于清洁的玻璃瓶中，用0.1M的碳酸钾溶液调节pH为8.0，缓慢均匀的加入1.8μg S-RBD蛋白抗原，混匀后室温放置30分钟；

S12、迅速加入100μL 20％牛血清白蛋白溶液，加入稳定剂以防止抗体蛋白与胶体金聚合发生沉淀，混匀后室温放置30分钟，12000rpm离心20分钟；

S13、离心后弃去上清液，将沉淀溶于200μL胶体金缓冲液中，4℃避光保存备用；

S14、将S-RBD蛋白抗原替换成兔IgG抗体重复步骤S11～S13标记兔IgG 抗体；

S15、将上述标记后的S-RBD蛋白抗原和兔IgG抗体以1：1比例混合得到胶体金免疫复合物。

更进一步地，步骤S11所述胶体金纳米颗粒水溶液的制备方法包括以下步骤：

S111、将待用玻璃器皿进行清洁；

S112、在圆底烧瓶中加入100mL超纯水，再加入1％氯化金溶液1mL，搅拌下加热至刚沸腾，一次性迅速加入1％柠檬酸三钠1.5mL，在溶液完全变成深红色后停止加热，10分钟后，用水冷却至室温，再用容量瓶定容至100mL；

S113、用0.22μm过滤器过滤除菌，4℃避光保存。

优选地，步骤S13所述胶体金缓冲液含有10mmol/L、pH9.0Tris-HCL，0.2％ BSA，5％海藻糖，2％蔗糖和0.286％柠檬酸钠。

优选地，步骤S111所述清洁包括以下步骤：

S1111、用自来水把玻璃器皿上的灰尘流水冲洗干净；

S1112、加入清洁液浸泡24h，用自来水洗净清洁液；

S1113、用洗洁剂洗3～4次，自来水冲洗掉洗洁剂；

S1114、用蒸馏水洗3～4次，再用双蒸水或三蒸水洗3～4次；

S1115、烤箱干燥后备用；

步骤S1112所述清洁液为重铬酸钾1000g，加入浓硫酸2500mL，加蒸馏水至10000mL。

本发明的有益效果在于：

该系列产品可有效辅助核酸检测，克服周期长、操作复杂、对检验场地、检验人员要求高的痛点；也可有效解决血清学抗体检测发现时间晚(发病后8-14 天才能有效检出)，部分免疫缺陷人员无法检出等痛点。为更快捷、更准确、更早期、更便利检测新冠病毒提供更多工具，为全球抗击疫情的战役提供交叉科学的武器。

附图说明

图1为本发明一种双抗体夹心法检测新型冠状病毒的胶体金试剂盒的结构示意图；

图2为使用本发明一种双抗体夹心法检测新型冠状病毒的胶体金试剂盒的检测结果示意图；

图3为本发明一种双抗体夹心法检测新型冠状病毒的胶体金试剂盒的实物图；

附图标记：1-底板，2-样品垫，3-胶体金结合垫，4-硝酸纤维素膜，41-检测 T线，42-质控C线，5-吸水垫。

具体实施方式

为更好理解本发明，下面结合实施例及附图对本发明作进一步描述，以下实施例仅是对本发明进行说明而非对其加以限定。

实施例1：胶体金纳米颗粒水溶液的制备

1.玻璃器皿的清洁

制备胶体金的成功与失败除试剂因素以外玻璃器皿清洁是非常关键的一步。如果玻璃器皿内不干净或者有灰尘落入就会干扰胶体金颗粒的生成，形成的颗粒大小不一，颜色微红、无色或混浊不透明。我们的经验是制备胶体金的所有玻璃器皿先用自来水把玻璃器皿上的灰尘流水冲洗干净，加入清洁液(重铬酸钾 1000g，加入浓硫酸2500mL，加蒸馏水至10000mL)浸泡24h，自来水洗净清洁液，然后每个玻璃器皿用洗洁剂洗3～4次，自来水冲洗掉洗洁剂，用蒸馏水洗 3～4次，再用双蒸水把每个器皿洗3～4次，烤箱干燥后备用。

2.胶体金纳米颗粒水溶液的制备

所有配制试剂的容器均按以上要求酸处理洗净，配制试剂用双蒸馏水或三蒸馏水。

使用柠檬酸三钠还原法制备金纳米颗粒。在圆底烧瓶中加入100mL超纯水，在加入1％氯化金溶液1mL，搅拌下加热至刚沸腾，一次性迅速加入1％柠檬酸三钠1.5mL，在溶液完全变成深红色后停止加热。10分钟后，用水冷却至室温，再用容量瓶定容至100mL。用0.22μm过滤器过滤除菌，4℃避光保存。

3.胶体金纳米颗粒水溶液的质量鉴定

将胶体金纳米颗粒水溶液适当倍数稀释，轻轻沾取溶液置于滤纸上自然干燥，在透射电镜下观察胶体金颗粒大小，形态均一、形状为圆形、无杂质或金颗粒聚集现象，则判定达到标准，可以用于标记抗体。

实施例2：胶体金试剂盒的材料准备及组装

1.胶体金免疫复合物的制备

取200μL上述胶体金纳米颗粒水溶液分装于清洁的玻璃瓶中，用0.1M的碳酸钾溶液调节pH为8.0，缓慢均匀的加入1.8μg S-RBD蛋白抗原，混匀后室温放置30分钟。迅速加入100μL 20％牛血清白蛋白溶液，加入稳定剂以防止抗体蛋白与胶体金聚合发生沉淀，混匀后室温放置30分钟，12000rpm离心20分钟。弃去上清液，将沉淀溶于200μL胶体金缓冲液(10mmol/L、pH9.0Tris-HCL，0.2％ BSA，5％海藻糖，2％蔗糖，0.286％柠檬酸钠)中，4℃避光保存备用。

以同样方法将S-RBD蛋白抗原替换成兔IgG抗体标记兔IgG抗体。

将上述标记后的S-RBD蛋白抗原和兔IgG抗体以1：1比例混合得到胶体金免疫复合物。

2.胶体金结合垫的制备

配制含有0.5％PVA、50mmol/L PBS、0.5％BSA、0.88％NaCl，pH7.4的多聚酯纤维素膜预处理液，将结合垫均匀平整地浸泡在预处理液中，室温静置 30min后，37℃烘箱放置12h。彻底干燥后均匀滴加制备得到的胶体金免疫复合物，继续37℃烘箱放置1.5h，彻底干燥后备用。

3.检测T线和质控C线的包被

胶体金免疫层析试纸条质控C线42包被的是羊抗兔IgG，用磷酸盐缓冲液稀释至1.2mg/mL，同样方法获得包被兔抗人IgG抗体的检测T线溶液。分别装载不同的抗体溶液，启动印膜仪，设定喷笔移动速度30mm/秒，液体推进速度 0.5μL/cm，在贴有硝酸纤维素膜4的PVC片上分别进行印膜，包被检测T线41 和质控C线42。将印制好的膜在37℃干燥箱内干燥6小时，置于含干燥剂的密封袋保存。

4.胶体金免疫层析试纸条的组装

启动除湿机，使操作室内湿度降至25％以下，同时开启空调，保持温度低于 28℃。将按照上述步骤处理过的各类固相材料按照如下方式粘成一体。

首先将硝酸纤维素膜4(分析膜)固定在底板1中部，处理过的胶体金结合垫3的一端压在硝酸纤维素膜4的检测T线41端，重叠1mm。处理过的样品垫 2一端压于胶体金结合垫3的另一端，重叠2mm。将吸水垫5粘在底板1上，其中一端压于硝酸纤维素膜4的质控C线42端，重叠2mm。将装配好的试纸条检测片用切条机切成4mm宽，放入塑料卡扣底座的凹槽里，塑料盖盖上压紧。成品置于铝箔袋中，加入1g/袋干燥剂，抽真空，干燥环境保存备用。底板1上依次为样品垫2、胶体金结合垫3、硝酸纤维素膜4(检测T线41、质控C线42)、吸水垫5，效果如图1所示。

实施例3：新型冠状病毒试剂盒性能测试

1)取新冠检测试纸条，向加样孔内加入血浆或者血清10μL，再立即加入样品稀释液80-100μL。

2)10分钟后在结果观察区读取结果，并做出判断。质控C线显示红色，检测T线显示红色，即为阳性；质控C线显示红色，检测T线无颜色，即为阴性；质控C线无颜色，提示检测无效。如图2和3所示。

以上所述实施方式仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

Claims (7)

1.一种双抗体夹心法检测新型冠状病毒的胶体金试剂盒，包括盒体、位于所述盒体内的底板(1)，所述底板(1)上延长度方向依次粘贴有样品垫(2)、胶体金结合垫(3)、硝酸纤维素膜(4)、吸水垫(5)，所述硝酸纤维素膜(4)上靠近所述胶体金结合垫(3)侧设有检测T线(41)，所述硝酸纤维素膜(4)上靠近所述吸水垫(5)侧设有质控C线(42)，其特征在于：所述胶体金结合垫(3)含有S-RBD蛋白抗原，所述检测T线(41)上包被有兔抗人IgG抗体，所述质控C线(42)上包被羊抗兔IgG。

2.一种权利要求1所述双抗体夹心法检测新型冠状病毒的胶体金试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、胶体金结合垫(3)的制备：将结合垫使用预处理液处理干燥后均匀滴加胶体金免疫复合物，37℃烘箱放置，彻底干燥后备用；

S2、硝酸纤维素膜(4)的制备：将兔抗人IgG抗体包被在硝酸纤维素膜(4)上形成检测T线(41)，将羊抗兔IgG包被在硝酸纤维素膜上形成质控C线(42)；

S3、切割装配：将硝酸纤维素膜(4)固定在底板(1)中部，处理过的胶体金结合垫(3)的一端压在硝酸纤维素膜(4)的检测T线(41)端，处理过的样品垫(2)一端压于胶体金结合垫(3)的另一端，将吸水垫(5)粘在底板(1)上，其中一端压于硝酸纤维素膜(4)的质控C线(42)端，将装配好的试纸条检测片用切条机切成4mm±0.5mm宽，放入卡扣底座的凹槽里，盖上盖压紧，成品置于铝箔袋中，加入干燥剂，抽真空，干燥环境保存备用。

3.根据权利要求2所述的双抗体夹心法检测新型冠状病毒的胶体金试剂盒的制备方法，其特征在于：步骤S1所述预处理液为含有0.5％PVA、50mmol/L PBS、0.5％BSA、0.88％NaCl，pH7.4的多聚酯纤维素膜预处理液。

4.根据权利要求2所述的双抗体夹心法检测新型冠状病毒的胶体金试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤S1所述胶体金免疫复合物的制备方法包括以下步骤：

S11、取200μL胶体金纳米颗粒水溶液分装于清洁的玻璃瓶中，用0.1M的碳酸钾溶液调节pH为8.0，缓慢均匀的加入1.8μg S-RBD蛋白抗原，混匀后室温放置30分钟；

S12、迅速加入100μL 20％牛血清白蛋白溶液，加入稳定剂以防止抗体蛋白与胶体金聚合发生沉淀，混匀后室温放置30分钟，12000rpm离心20分钟；

S13、离心后弃去上清液，将沉淀溶于200μL胶体金缓冲液中，4℃避光保存备用；

S14、将S-RBD蛋白抗原替换成兔IgG抗体重复步骤S11～S13标记兔IgG抗体；

S15、将上述标记后的S-RBD蛋白抗原和兔IgG抗体以1：1比例混合得到胶体金免疫复合物。

5.根据权利要求4所述的双抗体夹心法检测新型冠状病毒的胶体金试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤S11所述胶体金纳米颗粒水溶液的制备方法包括以下步骤：

S111、将待用玻璃器皿进行清洁；

S112、在圆底烧瓶中加入100mL超纯水，再加入1％氯化金溶液1mL，搅拌下加热至刚沸腾，一次性迅速加入1％柠檬酸三钠1.5mL，在溶液完全变成深红色后停止加热，10分钟后，用水冷却至室温，再用容量瓶定容至100mL；

S113、用0.22μm过滤器过滤除菌，4℃避光保存。

6.根据权利要求4所述的双抗体夹心法检测新型冠状病毒的胶体金试剂盒的制备方法，其特征在于：步骤S13所述胶体金缓冲液含有10mmol/L、pH9.0Tris-HCL，0.2％BSA，5％海藻糖，2％蔗糖和0.286％柠檬酸钠。

7.根据权利要求5所述的双抗体夹心法检测新型冠状病毒的胶体金试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤S111所述清洁包括以下步骤：

S1111、用自来水把玻璃器皿上的灰尘流水冲洗干净；

S1112、加入清洁液浸泡24h，用自来水洗净清洁液；

S1113、用洗洁剂洗3～4次，自来水冲洗掉洗洁剂；

S1114、用蒸馏水洗3～4次，再用双蒸水或三蒸水洗3～4次；

S1115、烤箱干燥后备用；

步骤S1112所述清洁液为重铬酸钾1000g，加入浓硫酸2500mL，加蒸馏水至10000mL。

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