CN117665293A - 同型半胱氨酸的检测试剂和检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种同型半胱氨酸的检测试剂和检测试剂盒，检测试剂盒包括：试剂R1、试剂R2和免疫层析试纸卡，其中：试剂R1包括10至50mmol/L的缓冲液、20至150mmol/L的氯化钠和1至10g/L的甘氨酸；试剂R2包括5至50mmol/L的缓冲液、0.05至1mg/mL的S‑腺苷同型半胱氨酸水解酶、50至150mmol/L的氯化钠、0.5至6g/L的甜菜碱、0.5至10g/L的聚乙二醇、2至10mmol/L的乙二胺四乙酸、5至20g/L的甘油和0.2至1g/L的防腐剂；免疫层析试纸卡通过竞争法检测由同型半胱氨酸转化形成的S‑腺苷‑L‑同型半胱氨酸。根据本申请，能够提供一种简便、快速、准确性较高的检测同型半光氨酸的试剂和试剂盒。
Description
技术领域
本申请涉及生化检测技术领域，特别是涉及一种同型半胱氨酸的检测试剂和检测试剂盒。
背景技术
同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）是一种人体内的含硫氨基酸，为蛋氨酸和半胱氨酸代谢过程中的重要中间产物，在人体血液中，同型半胱氨酸以游离或蛋白质结合的形式存在。它可以被氧化或还原。同型半胱氨酸是一种含硫非必需氨基酸，它由甲硫氨酸去甲基化转变而来，是甲硫氨酸循环中的代谢产物。甲硫氨酸在腺苷转移酶作用下形成s-腺苷甲硫氨酸，后者是一个活泼的甲基供体，进一步转化成S-腺苷同型半胱氨酸，再脱去腺苷生成同型半胱氨酸。需要蛋氨酸合成酶及维生素B12、叶酸、维生素B6参与，酶功能障碍或维生素的缺乏等均可导致同型半胱氨酸升高。人体中同型半胱氨酸的水平与心血管疾病、神经系统疾病、糖尿病、慢性肾功能衰竭、肺血栓栓塞症等息息相关；临床上发现高胱氨酸尿症病人早年多因全身动脉粥样硬化和血栓形成死于脑梗塞和心肌梗塞，这与血中HCY升高有关；通过血管内超声观察AS（动脉粥样硬化）斑块情况，观察到血浆HCY浓度<8μmol/L时，斑块较小（0.17-0.76mmol/L），>8μmol/L时，斑块明显增大（0.27-1.04，p<0.001），表明与冠状动脉病变程度呈正相关。轻度、中度HCY水平升高可使心血管疾病死亡危险性增加4~6倍，血浆总HCY水平每升高5μmol/L则CHD（冠心病）危险性男性增加60%，女性增加80%；脑血管病是目前严重危害人类健康的主要疾病，近年来随着分子生物学的深入发展，HCY在脑卒中的作用日益受到重视，普遍认为血浆HCY>15μmol/L为高HCY血症，普通人群血浆Hcy水平升高者只有不到5％，而在脑卒中患者中可达30~40％HCY的升高，是与中风有重要关联的危险因子；国内外大量研究结果显示，血浆HCY水平可作为2-型糖尿病患者患大血管疾病的独立危险因素，监测糖尿病患者HCY水平有利于对其预后的评估；HCY升高在糖尿病伴肾脏、视网膜及血管并发症的患者更为严重，高HCY血症也能促进糖尿病微血管并发症的发生与发展；慢性肾功能衰竭（CRF）患者普遍有高HCY血症，其发生率是正常人33倍；尿毒症时一方面肝脏蛋氨酸腺苷转移酶活性升高，导致S-腺苷蛋氨酸水平升高；另一方面肾功能下降使HCY代谢的必需产物丝氨酸合成减少，导致HCY代谢受抑制引起HCY的堆积；研究表明，高HCY血症（>20μmol/L）使得深静脉血栓的危险性明显增大，高HCY血症可使深静脉血栓发生率增加4倍；高HCY是我国汉族人群肺血栓栓塞症（PTE）发病的一个独立的危险因子，降低HCY可降低国人静脉血栓栓塞症（VTE）的危险；《中国高血压防治指南》提出了同型半胱氨酸（Hcy）的升高加速了血管动脉粥样硬化进程，被认为是冠心病、卒中等心脑血管疾病的重要危险因素。因此，检测同型半胱氨酸水平在临床中具有重要意义。
HCY检测目前主要采用的技术方法有高效液相（HPLC）方法、荧光偏振免疫检测（FPLA）方法、酶联免疫技术（ELISA）和化学发光法等。高效液相（HPLC）方法操作比较复杂，试验耗时比较长，且试验数据变异比较大。荧光偏振免疫检测（FPLA）方法检测费时，须配备专用全自动荧光分析仪器，设备昂贵，不宜普及。酶联免疫技术（ELISA）大部分操作为手工操作，比较耗时，定量检测需配备仪器，必须有专门的实验室。化学发光法成本高，需专用仪器。
综上所述，亟需一种简便、快速、低成本并且准确可靠的检测同型半光氨酸的方法或产品。
发明内容
本申请的目的是提供一种同型半胱氨酸的检测试剂和检测试剂盒。
本申请采用了以下技术方案：
本申请的一方面公开了一种同型半胱氨酸的检测试剂盒，包括：试剂R1、试剂R2和免疫层析试纸卡，其中：所述试剂R1包括10mmol/L至50mmol/L的缓冲液、20mmol/L至150mmol/L的氯化钠和1g/L至10g/L的甘氨酸；所述试剂R2包括5mmol/L至50mmol/L的缓冲液、0.05mg/mL至1mg/mL的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶、50mmol/L至150mmol/L的氯化钠、0.5g/L至6g/L的甜菜碱、0.5g/L至10g/L的聚乙二醇、2mmol/L至10mmol/L的乙二胺四乙酸、5g/L至20g/L的甘油和0.2g/L至1g/L的防腐剂；所述免疫层析试纸卡通过竞争法检测由同型半胱氨酸转化形成的S-腺苷-L-同型半胱氨酸。
本申请的一种实现方式中，所述试剂R1包括10mmol/L的缓冲液、50mmol/L的氯化钠和4g/L的甘氨酸。
本申请的一种实现方式中，所述试剂R2包括10mmol/L的缓冲液、0.6mg/mL的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶、50mmol/L的氯化钠、2.5g/L的甜菜碱、2g/L的聚乙二醇、5mmol/L的乙二胺四乙酸、15g/L的甘油和0.4g/L的防腐剂。
本申请的一种实现方式中，所述试剂R1中的缓冲液为磷酸盐缓冲液，所述试剂R2中的缓冲液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液，所述防腐剂为山梨酸钾。
本申请的一种实现方式中，所述免疫层析试纸卡包括衬底和设置于衬底的样品垫、结合垫、检测垫和吸水垫，且样品垫部分覆盖所述结合垫，所述结合垫部分覆盖所述检测垫，所述检测垫被所述吸水垫部分覆盖，其中，所述结合垫包被有经标记物标记的抗S-腺苷-L-同型半胱氨酸单克隆抗体和经所述标记物标记的质控抗体，所述检测垫的检测线包被有S-腺苷-L-同型半胱氨酸，所述检测垫的质控线包被有抗质控抗体。
本申请的一种实现方式中，所述样品垫含有植物凝集素。
本申请的一种实现方式中，所述样品垫通过浸泡于含有1.0mg/mL的植物凝集素的磷酸盐缓冲液中而获得。
本申请的一种实现方式中，所述标记物为胶体金、荧光微球、量子点或彩色微球。
本申请的一种实现方式中，所述标记物为表面带有环氧基、磺酰基、醛基、酰胺基、氨基、羧基、巯基或羟基修饰的彩色微球。
本申请的另一方面公开了一种用于检测同型半胱氨酸的检测试剂，包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1包括10mmol/L至50mmol/L的缓冲液、20mmol/L至150mmol/L的氯化钠和1g/L至10g/L的甘氨酸；所述试剂R2包括5mmol/L至50mmol/L的缓冲液、0.05mg/mL至1mg/mL的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶、50mmol/L至150mmol/L的氯化钠、0.5g/L至6g/L的甜菜碱、0.5g/L至10g/L的聚乙二醇、2mmol/L至10mmol/L的乙二胺四乙酸、5g/L至20g/L的甘油和0.2g/L至1g/L的防腐剂。
本申请的有益效果在于：
能够提供一种简便、快速、准确性较高的检测同型半光氨酸的试剂和试剂盒。
附图说明
图1是本申请涉及的免疫层析试纸卡的结构示意图。
图2是本申请所涉及的经试剂R1和试剂R2处理后的全血样本的图片。
图3是本申请所涉及的单孔卡的结构示意图。
图4是本申请所涉及的双孔卡的结构示意图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他材料、方法所替代。在某些情况下，本申请相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本申请的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。
另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。
HCY检测目前主要采用较为复杂的检测方法，本申请中，创造性地通过使样本经本申请的试剂R1和试剂R2处理后再用本申请的免疫层析试纸条来进行HCY检测，具有以下优点：
本申请的预处理液（即试剂R1和试剂R2）能够和待测物进行反应，且能够有效地对全血样本的红细胞进行保护，减少红细胞破裂对检测的干扰和影响；
本申请采用基于彩色乳胶微球的免疫层析试纸来检测同型半胱氨酸，利用免疫层析法检测同型半胱氨酸，可以检测人手指末梢血，实现家用场景检测；
本申请解决了现有技术中的检测试剂盒检测操作复杂或检测仪器昂贵的不足，与同类产品相比，具有高特异性、操作简便、检测时间短、更契合人群同型半胱氨酸筛查的需求的优点，适用于家用、药店、基层医院或资源一般地区和机构的推广应用。
本申请涉及一种同型半胱氨酸的检测试剂盒（以下有时简称为“检测试剂盒”或“试剂盒”）。
在一具体实施例中，检测试剂盒可以包括试剂R1、试剂R2和免疫层析试纸卡。
在一具体实施例中，试剂R1可以包括缓冲液、还原剂和稳定剂。
在一具体实施例中，试剂R1的缓冲液可以为柠檬酸缓冲液、碳酸缓冲液、磷酸盐缓冲液或Good’s缓冲液。优选地，试剂R1的缓冲液为磷酸盐缓冲液。
在一具体实施例中，试剂R1中，磷酸盐缓冲液的浓度可以为10mM至50mM。优选地，试剂R1中，磷酸盐缓冲液的浓度为10mM。
在一具体实施例中，试剂R1的还原剂可以为硫苏糖醇、三（2-羰基乙基）磷盐酸盐和β-巯基乙醇。优选地，还原剂为三（2-羰基乙基）磷盐酸盐。
在一具体实施例中，试剂R1中，还原剂浓度可以为5mM至30mM。优选地，还原剂浓度为20mM。
在一具体实施例中，试剂R1的稳定剂可以包括氯化钠和甘氨酸。
在一具体实施例中，试剂R1中，氯化钠的浓度可以为20mM至150mM。优选地，试剂R1中，氯化钠的浓度为50mM。
在一具体实施例中，试剂R1中，甘氨酸的浓度可以为1-10g/L。优选地，试剂R1中，甘氨酸的浓度为4g/L。
在一具体实施例中，试剂R2可以包括缓冲液。试剂R2的缓冲液可以为柠檬酸缓冲液、碳酸缓冲液、磷酸盐缓冲液或三羟甲基氨基甲烷缓冲液。优选地，试剂R2的缓冲液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液。
在一具体实施例中，试剂R2中，三羟甲基氨基甲烷缓冲液的浓度可以为5mM至50mM。优选地，试剂R2中，三羟甲基氨基甲烷缓冲液的浓度为10mM。
在一具体实施例中，试剂R2可以包括S-腺苷同型半胱氨酸水解酶。
在一具体实施例中，试剂R2中，S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的浓度可以为0.05mg/mL至1mg/mL。优选地，试剂R2中，S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的浓度为0.6mg/mL。
在一具体实施例中，试剂R2可以包括氯化钠。
在一具体实施例中，试剂R2中，氯化钠的浓度可以为50mM至150mM。优选地，试剂R2中，氯化钠的浓度为50mM。
在一具体实施例中，试剂R2可以包括甜菜碱。
在一具体实施例中，试剂R2中，甜菜碱的浓度可以为0.5g/L至6g/L。优选地，试剂R2中，甜菜碱的浓度为2.5g/L。
在一具体实施例中，试剂R2可以包括聚乙二醇。
在一具体实施例中，试剂R2中，聚乙二醇的浓度可以为0.5g/L至10g/L。优选地，试剂R2中，聚乙二醇的浓度为2g/L。
在一具体实施例中，试剂R2可以包括乙二胺四乙酸。
在一具体实施例中，试剂R2中，乙二胺四乙酸的浓度可以为2mM至10mM。优选地，试剂R2中，乙二胺四乙酸的浓度为5mM。
在一具体实施例中，试剂R2可以包括甘油。
在一具体实施例中，试剂R2中，甘油的浓度可以为5g/L至20g/L。优选地，试剂R2中，甘油的浓度为15g/L。
在一具体实施例中，试剂R2可以防腐剂。优选地，防腐剂为山梨酸钾。
在一具体实施例中，试剂R2中，防腐剂的浓度可以为0.2g/L至1g/L。优选地，试剂R2中，防腐剂的浓度为0.4g/L。
在一具体实施例中，试剂R1和试剂R2可以分别装在滴瓶中。需要说明的是，将试剂R1和试剂R2装在滴瓶中，在使用时，只需挤压滴瓶使试剂滴出，由此，能够便于操作。在一具体实施例中，滴瓶每次滴出的体积可以为30μL至60μL。
图1是本申请涉及的免疫层析试纸卡的结构示意图。如图1所示，在一具体实施例中，免疫层析试纸卡10可以包括衬底11和设置于衬底的样品垫12、结合垫13、检测垫14和吸水垫15。其中，沿着层析方向（样品垫12至吸水垫15的方向），样品垫12部分覆盖结合垫13，结合垫13部分覆盖检测垫14，检测垫14被吸水垫15部分覆盖。
在一具体实施例中，衬底11可以由支撑性良好的材料制成。例如，衬底11可以为PVC（聚氯乙烯）板。衬底11的长度可以为60mm至75mm，宽度可以为3mm至5mm。
在一具体实施例中，样品垫12可以为玻璃纤维膜、聚酯膜、不对称聚砜膜或复合纤维素膜。
在一具体实施例中，样品垫12可以含有植物凝集素。
在一具体实施例中，样品垫12可以浸泡在含有1.0mg/mL植物凝集素、0.5％酪蛋白、0.1％T-20（吐温-20）、1％BSA（牛血清蛋白）的10 mM磷酸盐缓冲液中，然后烘干。
在一具体实施例中，结合垫13可以为聚酯纤维或玻璃纤维。
在一具体实施例中，结合垫13包被有有经标记物标记的抗S-腺苷-L-同型半胱氨酸单克隆抗体和经所述标记物标记的质控抗体。其中，质控抗体可以为羊抗鸡IgY。
在一具体实施例中，标记物可以为胶体金、荧光微球、量子点或彩色微球。优选地，标记物为彩色微球。
在一具体实施例中，彩色微球包括但不限于：表面带有环氧基、磺酰基、醛基、酰胺基、氨基、羧基、巯基、羟基修饰的彩色微球。
在一具体实施例中，彩色微球粒径可以为200nm至400nm。优选地，彩色微球粒径为300nm。
在一具体实施例中，可以将经彩色微球标记的小鼠抗S-腺苷-L-同型半胱氨酸单克隆抗体和羊抗鸡IgY重悬于PBS缓冲液，并喷点至结合垫13上。
在一具体实施例中，检测垫14可以硝酸纤维素膜（NC膜）。硝酸纤维素膜的长度可以为25mm。
在一具体实施例中，可以以划膜速度1μL/cm，分别将质控线工作液和检测线工作液均匀地划在检测垫14上，形成C线（质控线）和T线（检测线）。
在一具体实施例中，检测线工作液含有1.0mg/mL的S-腺苷-L-同型半胱氨酸，质控线工作液含有1.0mg/mL的鸡IgY。
在一具体实施例中，吸水垫15可以由吸水性良好的材料制成。例如，吸水垫15可以为吸水纸。
在一具体实施例中，免疫层析试纸卡10还可以包括壳体，壳体将组装好的衬底11、样品垫12、结合垫13、检测垫14和吸水垫15包裹，并至少暴露出部分样品垫12（样品添加孔）和部分检测垫14（质控线和检测线观察窗口）。
在一具体实施例中，检测试剂盒还可以包括铝箔袋、干燥剂、0.6mL离心管、采血针、定量微量采血吸管。在一具体实施例中，检测试剂盒由免疫层析试纸条、装在滴瓶的试剂R1、装在滴瓶的试剂R2、铝箔袋、干燥剂、0.6mL离心管、采血针、定量微量采血吸管和使用说明书组成。
在一具体实施例中，检测试剂盒的检测对象可以为全血样本。
在一具体实施例中，检测试剂盒为定量检测，阳性判断阈值为10μmol/L。需要说明的是，阳性判断阈值为10μmol/L是指本检测试剂盒能够检出同型半胱氨酸含量≥10μmol/L的待测样本。
需要说明的是，由于小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上位点，因此不能采用双抗体夹心法，可以采用竞争法模式。样本中的一定量的小分子抗原和固相抗原竞争结合垫上包被的带有标记物的抗体，样本中抗原量越多，结合在检测垫（NC膜）检测区上的标记抗体就会越少，最后T线（检测线）显色的也会越浅，若C线（质控线）不显色，则试纸条报废，不能使用。
本申请还涉及一种用于检测同型半胱氨酸的检测试剂，检测试剂包括试剂R1和试剂R2。需要说明的是，检测试剂的试剂R1和试剂R2为上述检测试剂盒中的试剂R1和试剂R2，关于试剂R1和试剂R2的方案可以参考本申请中检测试剂盒部分的描述。
本申请还涉及一种检测同型半胱氨酸的免疫层析试纸卡（下面有时简称为“免疫层析试纸卡”）。需要说明的是，免疫层析试纸卡为上述检测试剂盒中的免疫层析试纸卡，关于免疫层析试纸卡的方案可以参考本申请中检测试剂盒部分的描述。
本申请还涉及一种同型半胱氨酸的检测方法（以下有时简称为“检测方法”）。
在一具体实施例中，检测方法可以包括将样本与试剂R1混合，再与试剂R2混合，得到经试剂R1和试剂R2处理的样本混合液，将样本混合液滴加至免疫层析试纸卡的样品垫以对样本中的同型半胱氨酸进行检测。
在一具体实施例中，检测方法可以包括将样本滴加至免疫层析试纸卡的样品垫，再将依次将试剂R1和试剂R2滴加至免疫层析试纸卡的样品垫，以对样本中的同型半胱氨酸进行检测。需要说明的是，该检测方法所使用的免疫层析试纸条可以为双孔卡结构，即在样品垫处具有两个加样孔，其中较靠近检测垫的孔为接收试剂R1和试剂R2的处理液孔，较远离检测垫的孔为接收样本的样品孔。
在一具体实施例中，样本可以为全血样本。
在一具体实施例中，检测方法为定量检测，阳性判断阈值为10μmol/L。需要说明的是，阳性判断阈值为10μmol/L是指本检测方法能够检出同型半胱氨酸含量≥10μmol/L的待测样本。
在一具体实施例中，可以在离心管中滴加30至100μL的试剂R1，然后，可以取30至100μL的全血样本加入到装了试剂R1的离心管中，再滴加30至100μL的试剂R2，混匀，得到经试剂R1和试剂R2处理后的混合液。随后，将反应混合液样本滴加40至100μL至免疫层析试纸条的样品垫，在室温（15℃~30℃）下静置12分钟后进行结果判定，15分钟后显示的结果无临床意义。
下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。
实施例1：免疫层析试纸条的制备
① 样品垫前处理
将裁切好尺寸的样品垫，浸泡在含有1.0mg/mL植物凝集素、0.5％酪蛋白、0.1％T-20、1％BSA的10 mM磷酸盐缓冲液中，浸泡时间为10秒，然后拎起放置于37度烘箱烘干过夜。
② 抗体标记乳胶微球
1）取100μL彩色微球，加入0.4mL MES偶联缓冲液，4℃离心16000r，10分钟，超声清洗机超声；吸去上清。
2）加入0.5mL MES偶联缓冲液复融，超声，4℃离心16000r，10分钟，超声清洗机超声；吸去上清，备用。
3）配制10mg/mL EDC和10mg/mL NHS，用偶联缓冲液溶解，现配现用。将20μL10mg/mL EDC溶液 ，40μL 10mg/mL NHS溶液依次加入到微球溶液里面，快速充分混匀。
4）用铝箔纸包裹，室温避光震荡反应30分钟；4℃离心16000r，10分钟，吸去上清。
5）加入0.5mL MES偶联缓冲液，超声清洗机超声。4℃离心16000r，10分钟；吸去上清，加入0.5mL MES偶联缓冲液，超声清洗机超声。
6）然后加入100ug抗体。
7）铝箔纸包裹，室温避光滚轴反应90分钟。
8）加入0.5mL含1%BSA的封闭液，充分混匀，继续室温反应120分钟。
9）封闭结束后4℃离心16000r，10分钟，去上清后加入1.0 ml微球洗涤液，超声。
10）4℃离心16000r，10分钟，去上清后加入含1%BSA+2%海藻糖的微球保存液，超声后得到微球-抗体母液。
③ 结合垫包被
1）按喷金耗液量为4μL/cm计算；
2）打开连接喷金划膜机的空气压缩机；用纯化水冲洗喷金头并排空管道；将排空的吸液管道放入结合物工作溶液中；将结合物工作溶液填满注射器，排空空气；将结合物工作溶液充满管道；并且喷出10-20μL的前端结合物工作溶液。将结合垫正确排放在喷结合物槽上，按计算好的体积在每条玻纤上喷结合物，检查喷结合物的液量是否均匀无误。
3）干燥：30%湿度以下，50℃干燥过夜。
④ NC膜包被
1）以划膜速度1μL/cm，将质控线工作液（1.0mg/mL 鸡IgY）和检测线工作液（1.0mg/mL S-腺苷-L-同型半胱氨酸）均匀地划在膜上。
2）干燥：30%湿度以下，50℃干燥过夜。
⑤ 试纸条的组装
在试纸条的支撑板上依次贴有样品垫、结合垫、NC膜检测区和吸水垫。用裁切机将试纸条本体进行裁剪，并装入试剂卡壳体中，即得成品。
实施例2：试剂R1和试剂R2的制备
按下表配制得到试剂R1和试剂R2，配制好后分别装在滴瓶中：
实施例3：检测同型半胱氨酸标准物质
提供国家总同型半胱氨酸标准物，采用实施例1的免疫层析试纸条和实施例2中实验组1的试剂R1和试剂R2进行检测。
每个标准物取60μL，滴加一滴试剂R1，再滴加一滴试剂R2。取60μL处理后的标准物，加样至实施例1的免疫层析试纸条的样品垫，计时12分钟后读取检测结果，结果如下表：
实施例4：血液样本测定（单孔卡）
（1）采集全血样本
指尖消毒处理：使用一次性消毒酒精片，由内向外消毒原则指尖；拧（旋转）下一次性末梢釆血针的保护帽，把末梢采血针端面放在选定的采血部位，然后按击发射；待指尖上的酒精挥发干燥后，采血者用食指和拇指轻轻挤压，血液会从针口处外溢，使血液尽可能呈球状；采用带抗凝剂的定量微量采血吸管收集样品。
（2）全血样本预处理
采用实施例2中实验组1的试剂R1和试剂R2，将试剂R1滴一滴到离心管中，然后用定量微量采血吸管吸取60μL末梢血到离心管，接着往里滴一滴试剂R2，顺时针旋转离心管20秒。图2是本申请所涉及的经试剂R1和试剂R2处理后的全血样本的图片，由图2可知，全血样本和试剂R1、试剂R2混合液后，然后进行离心，会看到上清比较透明，证明红细胞没有破裂。
（3）同型半胱氨酸含量测定
图3是本申请所涉及的单孔卡的结构示意图。取出免疫层析试纸卡（单孔卡），用定量吸管吸吐多次上述混合液，然后取40μL加到试剂卡加样孔S。加样后的试剂卡在室温下静置12分钟后进行结果判定，15分钟后显示的结果无临床意义。
实施例5：血液样本测定（双孔卡）
（1）采集全血样本
指尖消毒处理：使用一次性消毒酒精片，由内向外消毒原则指尖；拧下一次性末梢釆血针的保护帽，把末梢采血针端面放在选定的采血部位，然后按击发射；待指尖上的酒精挥发干燥后，采血者用食指和拇指轻轻挤压，血液会从针口处外溢，使血液尽可能呈球状；采用带抗凝剂的定量微量采血吸管收集样品。
（2）同型半胱氨酸含量测定
图4是本申请所涉及的双孔卡的结构示意图，取出免疫层析试纸卡（双孔卡）。采用实施例2中实验组1的试剂R1和试剂R2，加50μL待测末梢血至免疫层析试纸卡的样品孔A中，然后滴加50μL试剂R1于免疫层析试纸卡的处理液孔B中，等30秒后再滴加50μL试剂R2于免疫层析试纸卡的处理液孔B中。加样后的试剂卡在室温下静置12分钟后进行结果判定，15分钟后显示的结果无临床意义。
实施例6：与市售检测试剂盒的比较
检测全血样本40例，先采用已上市的同型半胱氨酸检测试剂盒（干化学法）（购自：江西美康盛德生物科技有限公司，货号：DC2022JX）测试后，再采用本申请实施例1的免疫层析试纸条和实施例2中实验组1的试剂R1和试剂R2进行检测，检测结果如下表：
| 序号 | 上市试剂结果 | 本实施例检测结果 | 序号 | 上市试剂结果 | 本实施例检测结果 |
| 1 | + | + | 21 | - | - |
| 2 | + | + | 22 | - | - |
| 3 | + | + | 23 | - | - |
| 4 | + | + | 24 | - | - |
| 5 | + | + | 25 | - | - |
| 6 | + | + | 26 | - | - |
| 7 | + | + | 27 | - | - |
| 8 | + | + | 28 | - | - |
| 9 | + | + | 29 | - | - |
| 10 | + | + | 30 | - | - |
| 11 | + | + | 31 | - | - |
| 12 | + | + | 32 | - | - |
| 13 | + | + | 33 | - | - |
| 14 | + | + | 34 | - | - |
| 15 | + | + | 35 | - | - |
| 16 | + | + | 36 | - | - |
| 17 | + | + | 37 | - | - |
| 18 | + | + | 38 | - | - |
| 19 | + | + | 39 | - | - |
| 20 | + | + | 40 | - | - |
由上表可知，本申请的同型半胱氨酸的检测试剂盒和上市试剂盒相比，检测结果较一致，阴、阳性符合率高。
实施例7：
采集新鲜全血样本20例，先采用市售的同型半胱氨酸检测试剂盒（干化学法）（购自：江西美康盛德生物科技有限公司，货号：DC2022JX）测试后，得到每个样本的样本结果信息。再将该20例样本分别采用实施例2中的实验组1、实验组2、实验组3和对照组1的试剂R1和试剂R2对样本进行处理，然后使用实施例1的免疫层析试纸条进行检测，结果如下表：
| 样本结果信息 | 对照组1 | 实验组1 | 实验组2 | 实验组3 |
| 阴性 | - | - | - | - |
| 阴性 | - | - | - | - |
| 阴性 | - | - | - | - |
| 阴性 | - | - | - | - |
| 阴性 | - | - | - | - |
| 阴性 | - | - | - | - |
| 阴性 | - | - | - | - |
| 阴性 | - | - | - | - |
| 阴性 | - | - | - | - |
| 阴性 | - | - | - | - |
| 阳性 | + | + | + | + |
| 阳性 | + | + | + | + |
| 阳性 | - | + | + | + |
| 阳性 | + | + | + | + |
| 阳性 | - | + | + | + |
| 阳性 | + | + | + | + |
| 阳性 | + | + | + | + |
| 阳性 | + | + | + | + |
| 阳性 | + | + | + | + |
| 阳性 | + | + | + | + |
由上表可知，实验组的检测结果准确性比对照组更佳，说明采用本申请的试剂R1和试剂R2，检测准确性更高。
以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。
Claims (10)
1.一种同型半胱氨酸的检测试剂盒，其特征在于，包括：试剂R1、试剂R2和免疫层析试纸卡，其中：所述试剂R1包括10mmol/L至50mmol/L的缓冲液、20mmol/L至150mmol/L的氯化钠和1g/L至10g/L的甘氨酸；所述试剂R2包括5mmol/L至50mmol/L的缓冲液、0.05mg/mL至1mg/mL的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶、50mmol/L至150mmol/L的氯化钠、0.5g/L至6g/L的甜菜碱、0.5g/L至10g/L的聚乙二醇、2mmol/L至10mmol/L的乙二胺四乙酸、5g/L至20g/L的甘油和0.2g/L至1g/L的防腐剂；所述免疫层析试纸卡通过竞争法检测由同型半胱氨酸转化形成的S-腺苷-L-同型半胱氨酸。
2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R1包括10mmol/L的缓冲液、50mmol/L的氯化钠和4g/L的甘氨酸。
3.根据权利要求1或2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R2包括10mmol/L的缓冲液、0.6mg/mL的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶、50mmol/L的氯化钠、2.5g/L的甜菜碱、2g/L的聚乙二醇、5mmol/L的乙二胺四乙酸、15g/L的甘油和0.4g/L的防腐剂。
4.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R1中的缓冲液为磷酸盐缓冲液，所述试剂R2中的缓冲液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液，所述防腐剂为山梨酸钾。
5.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述免疫层析试纸卡包括衬底和设置于衬底的样品垫、结合垫、检测垫和吸水垫，且样品垫部分覆盖所述结合垫，所述结合垫部分覆盖所述检测垫，所述检测垫被所述吸水垫部分覆盖，其中，所述结合垫包被有经标记物标记的抗S-腺苷-L-同型半胱氨酸单克隆抗体和经所述标记物标记的质控抗体，所述检测垫的检测线包被有S-腺苷-L-同型半胱氨酸，所述检测垫的质控线包被有抗质控抗体。
6.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，所述样品垫含有植物凝集素。
7.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，所述样品垫通过浸泡于含有1.0mg/mL的植物凝集素的磷酸盐缓冲液中而获得。
8.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，所述标记物为胶体金、荧光微球、量子点或彩色微球。
9.根据权利要求8所述的检测试剂盒，其特征在于，所述标记物为表面带有环氧基、磺酰基、醛基、酰胺基、氨基、羧基、巯基或羟基修饰的彩色微球。
10.一种用于检测同型半胱氨酸的检测试剂，其特征在于，包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1包括10mmol/L至50mmol/L的缓冲液、20mmol/L至150mmol/L的氯化钠和1g/L至10g/L的甘氨酸；所述试剂R2包括5mmol/L至50mmol/L的缓冲液、0.05mg/mL至1mg/mL的S 腺苷同型半胱氨酸水解酶、50mmol/L至150mmol/L的氯化钠、0.5g/L至6g/L的甜菜碱、0.5g/L至10g/L的聚乙二醇、2mmol/L至10mmol/L的乙二胺四乙酸、5g/L至20g/L的甘油和0.2g/L至1g/L的防腐剂。
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|---|---|---|---|
| CN202410112116.8A CN117665293A (zh) | 2024-01-26 | 2024-01-26 | 同型半胱氨酸的检测试剂和检测试剂盒 |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN118130782A (zh) * | 2024-05-07 | 2024-06-04 | 山东康华生物医疗科技股份有限公司 | 一种同型半胱氨酸的干式免疫荧光定量检测试剂盒 |
-
2024
- 2024-01-26 CN CN202410112116.8A patent/CN117665293A/zh active Pending
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN118130782A (zh) * | 2024-05-07 | 2024-06-04 | 山东康华生物医疗科技股份有限公司 | 一种同型半胱氨酸的干式免疫荧光定量检测试剂盒 |
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