KR102138861B1 - ApxIVA의 재조합 항원 단백질을 포함하는 돼지 흉막폐렴균의 감염 진단용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 돼지 흉막폐렴균(Actinobacillus pleuropneumoniae, App)의 외독소 ApxIVA의 재조합 항원 단백질을 포함하는, 돼지 흉막폐렴균의 감염 진단용 조성물; 상기 조성물을 포함하는 돼지 흉막폐렴균의 감염 진단용 키트; 및 상기 키트를 이용하여 인간을 제외한 개체의 돼지 흉막폐렴균 감염 여부를 진단하는 방법 등에 관한 것이다.
본 발명은 ApxIVA 외독소를 이용하여 돼지 흉막폐렴균의 자연감염 개체를 진단 가능한 항원 후보 구간을 발굴하였으며, 특히 ApxIVA 외독소 단백질의 구조 예측으로부터 선별된 본 발명의 ApxIVA 재조합 항원 단백질은 Apx 외독소 간 교차반응을 일으키지 않으면서, 높은 특이도와 민감도로 돼지 흉막폐렴균의 감염을 진단할 수 있다.

Description

ApxIVA의 재조합 항원 단백질을 포함하는 돼지 흉막폐렴균의 감염 진단용 조성물 {Composition for diagnosing infection of Actinobacillus pleuropneumoniae containing recombinant antigen protein of ApxIVA}

본 발명은 돼지 흉막폐렴균(Actinobacillus pleuropneumoniae, App)의 외독소 ApxIVA의 재조합 항원 단백질을 포함하는, 돼지 흉막폐렴균의 감염 진단용 조성물; 상기 조성물을 포함하는 돼지 흉막폐렴균의 감염 진단용 키트; 및 상기 키트를 이용하여 인간을 제외한 개체의 돼지 흉막폐렴균 감염 여부를 진단하는 방법 등에 관한 것이다.

돼지 흉막폐렴(Porcine pleuropneumoniae)은 전염성이 매우 높은 급성, 열성 전염병으로, 전 세계 양돈 산업에 막대한 경제적인 피해를 주고 있는 질병이다. 이 질병의 원인체인 Actinobacillus pleuropneumoniae(A. pleuropneumoniae, App)는 주로 공기를 통하거나(aerosol), 직접적인 접촉에 의해 전파되며, 감염된 돼지는 고열, 침울, 식욕부진, 호흡곤란으로 인한 개구복식호흡 및 기침증세를 보인다. 또한, 부검시 폐엽의 종창과 섬유소의 석출, 폐흉막의 비후 및 폐의 간변화를 관찰할 수 있고 현미경적 소견으로는 폐포의 비대 및 호중구의 침윤, 폐포 내 화농성 삼출물과 섬유소가 특징적이다. 돼지 흉막폐렴은 모든 연령의 돼지에서 감수성을 보이고 감염되나, 대개 12주령 이상의 돼지에서 심각한 임상증상을 나타내는 것으로 알려져 있다. 그러나, 국내에서의 발생은 포유기의 모돈과 자돈을 제외한 모든 연령대에서 발생하고 있어 국내 양돈 산업에 막대한 경제적인 피해를 주고 있다.

국내ㆍ외 양돈 산업에서 문제시 되는 돼지 흉막폐렴의 원인균인 App는 현재까지 15가지의 혈청형이 알려져 있으며, 혈청형에 따라 다양한 병원성 (virulence and pathogenicity)을 나타낸다. App 혈청형의 다양한 병원성은 capsular polysaccharides, mural lipopolysaccharides, proteinaceous cytotoxins(ApxI, ApxII, ApxIII, ApxIV)에 의해 주로 결정되며, 이러한 App의 다양한 병원성 인자 중 RTX endotoxin인 Apx 독소의 생성이 병원성을 결정하는데 가장 큰 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 나아가, App의 외독소는 App 혈청형의 병원성을 결정하는 것뿐만 아니라, 숙주에 감염시 뛰어난 면역원성으로 항체 형성을 강하게 유도하여 진단 항원으로서도 가치를 지닌다. 특히, 각기 다른 혈청형의 App를 외독소 발현에 따라 진단하는 경우 App 외독소 간의 교차 반응성이 큰 점을 고려하여 특이적인 에피토프(epitope)의 발굴과 항원성의 평가는 새로운 진단법을 개발함에 앞서서 선행되어야할 필수적인 연구이다.

현재 대표적인 혈청학적 진단방법은 보체결합반응(complement fixation test, CFT), Apx 외독소를 이용한 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), capsular polysaccharide 또는 lipopolysaccharide(LPS) 등을 이용한 ELISA 등이 있다. 특히, ELISA 방법은 이용이 비교적 간편하여 가장 많이 이용되고 있는 방법으로 상용화되어 있다. 그러나, 기존의 혈청학적 진단방법은 결과의 불명확성과 함께 교차반응, 특이도 편차 등으로 인해 야외 혈청의 진단용으로 이용시 많은 문제점이 제기되어왔고, 기존에 개발된 ELISA 키트 역시 각각의 외독소에 대한 면역형성 수준을 파악하는 것이 불가능하며, 다른 균의 LPS와의 교차반응 및 자연감염과 백신접종돈 간의 구분이 불가능하다는 단점을 가지고 있다. 또한, Apx 외독소를 항원으로 하는 ELISA의 경우 ApxIA, ApxIIA, ApxIIIA, 및 ApxIVA의 교차반응성이 높아 감별진단의 낮은 정확도가 문제점으로 제기되어 왔다. 또한, 아직 국내에서는 Apx의 전체 서열에 대한 항원 위주의 연구가 진행되고 있으며, 외독소들 간 구분이 가능한 에피토프에 대한 연구가 미진한 상황이며, 각 외독소의 에피토프에 대한 면역원성 분석 또한 전무한 상태이다. 더욱이 자연감염과 백신접종 개체를 구분할 수 있는 항원으로 널리 알려진 ApxIVA 항원의 경우, 감염 후 숙주 내에서만 발현되어 생성되는 것이 알려 졌을 뿐, 아직 명확한 면역학적병리학적 메커니즘은 밝혀지지 않은 실정이다.

이러한 배경 하에 본 발명의 발명자들은 Apx 외독소를 이용하여 돼지 흉막폐렴균의 자연감염 개체를 효과적으로 진단 가능한 항원 후보 구간을 발굴하고자 예의 노력한 결과, ApxIVA 외독소 단백질의 구조 예측으로부터 선별된 서열번호 9의 아미노산 서열로 구성되는 ApxIVA 재조합 항원 단백질이 Apx 외독소 간 교차반응을 일으키지 않으면서, 높은 특이도와 민감도로 돼지 흉막폐렴균의 감염을 진단할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 돼지 흉막폐렴균(Actinobacillus pleuropneumoniae, App)의 외독소 ApxIVA의 재조합 항원 단백질을 포함하는, 돼지 흉막폐렴균의 감염 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 조성물을 포함하는 돼지 흉막폐렴균의 감염 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 키트를 이용하여 인간을 제외한 개체의 돼지 흉막폐렴균 감염 여부를 진단하는 방법을 제공하는 것이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 돼지 흉막폐렴균의 외독소 ApxIVA의 재조합 항원 단백질을 포함하는, 돼지 흉막폐렴균의 감염 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 돼지 흉막폐렴균의 감염 진단은 Apx 외독소 단백질의 특이적인 항원 구간 설정에 크게 영향을 받는다는 사실에 기초하여, 돼지 흉막폐렴균의 자연감염시에만 발현되는 ApxIVA 외독소 단백질의 구조를 예측함으로써 감염 여부를 특이적으로 진단 가능한 항원 구간을 설정한 것에 의의가 있다. 즉, 본 발명의 돼지 흉막폐렴균의 감염 진단용 조성물을 이용할 경우, 외독소 ApxIVA에 대한 항체만을 특이적으로 검출할 수 있으며, 높은 특이성으로 인해 다른 Apx 외독소에 대한 교차반응이 없고, 돼지 흉막폐렴균의 백신접종 개체와 자연감염 개체를 구분하여 진단 가능하다. 특히, 본 발명의 조성물은 서열번호 9의 아미노산 서열로 구성된 재조합 항원 단백질 ApxIVA C2를 포함하는 것으로, 다른 항원 구간에 비해 현저히 높은 특이도와 민감도로 돼지 흉막폐렴균의 감염 여부를 진단할 수 있음을 본 발명을 통해 최초로 확인하였다.

본 발명에서 용어 "돼지 흉막폐렴균(Actinobacillus pleuropneumoniae, App)"은 돼지의 흉막폐렴(Porcine pleuropneumoniae)을 일으키는 주된 원인이 되는 세균으로, 악티노바실루스 속(Actinobacillus sp.)의 그람-음성균에 속하며, 1957년에 처음 보고되었다. "돼지 흉막폐렴"은 전염성이 매우 높은 급성, 열성 전염병으로, 주로 공기를 통하거나(aerosol), 직접적인 접촉에 의해 전파되며, 감염된 돼지는 고열, 침울, 식욕부진, 호흡곤란으로 인한 개구복식호흡 및 기침증세를 보인다. 경과에 따라 심급성형, 급성형, 아급성형 및 만성형의 4가지로 임상형을 구분할 수 있으며, 모든 연령의 돼지에서 감수성을 보이고 감염되나, 대개 12주령 이상의 돼지에서 심각한 임상증상을 나타내는 것으로 알려져 있다.

본 발명에서 용어 "외독소"는 세균이 증식하는 과정에서 균체 밖으로 분비하는 독소로, 감염된 숙주의 체내에서 여러가지 증사을 일으킨다. 구체적으로, "외독소 Apx"는 돼지 흉막폐렴균(Actinobacillus pleuropneumoniae, App)이 감염된 돼지 내에서 강한 면역원성을 나타내어 항체 형성을 강하게 유도하고, 돼지 흉막폐렴의 병원성을 결정하는 가장 중요한 인자이다. 현재까지 ApxI, ApxII, ApxIII 및 ApxIV의 네 종류가 밝혀져 있으며, ApxI와 ApxII는 세포 용혈작용을 나타내는 반면, ApxIII는 용혈작용을 보이지는 않으나 폐포 대식세포에 세포독성을 가지고 있다. 하지만 ApxIV의 병원성과 관련된 역할은 아직까지 명확하게 밝혀져 있지 않다(Schaller, A. et al., 1999. Microbiology 145:2105-2116.). 본 발명에서 "외독소 ApxIVA"는 서열번호 7의 아미노산 서열로 구성된 것일 수 있다.

본 발명에서 용어 "재조합 항원 단백질"은 돼지 흉막폐렴의 자연감염 개체를 특이적으로 진단하기 위한 항원으로서, 구체적으로, 외독소 ApxIVA 단백질로부터 선별되어 특정 구간의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 의미한다.

본 발명의 일 실시예에서는, or-ApxIVA (HM021153) 균주를 대상으로 bioinformatics 및 in-silico 방법을 통해 ApxIVA 외독소 단백질의 구조를 예측함으로써 외독소 ApxIVA의 재조합 항원 단백질 구간을 설정하였다. 상기 재조합 항원 단백질은 ApxIVA C1, ApxIVA C2 또는 ApxIVA C3로 표현될 수 있으며, 구체적으로 ApxIVA C2일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 외독소 ApxIVA의 재조합 항원 단백질은 서열번호 7의 568번 내지 636번째 아미노산 서열을 포함하는 것이거나, 서열번호 7의 501번 내지 900번째 아미노산 서열을 포함하는 것이거나, 서열번호 9의 아미노산 서열로 구성된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어 "진단"은 개체를 대상으로 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미하는 것일 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 목적상 돼지 흉막폐렴균에 감염되었거나 감염된 것으로 의심되는 개체(돼지)로부터 분리된 시료와 상기 재조합 항원 단백질의 특이적인 반응 여부를 확인하여 돼지 흉막폐렴균의 자연감염 여부를 판단하는 것일 수 있으며, 상기 반응은 항원-항체반응일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 재조합 항원 단백질 ApxIVA C1, ApxIVA C2, ApxIVA C3 및 ApxIVA C1과 C2가 적정 비율로 혼합된 cocktail 항원을 대상으로, 최적화된 ELISA 조건으로부터 돼지 흉막폐렴 진단의 특이도 및 민감도를 평가한 결과, ApxIVA C1 항원의 Area Under Curve(AUC)는 0.6596, ApxIVA C2 항원의 AUC는 0.8397, ApxIVA C1과 C2 의 0.25:9.75 비율의 cocktail 항원은 0.7639, ApxIVA C1과 C2 의 0.5:9.5 비율의 cocktail 항원은 0.7625로 나타났으며, ApxIVA C3의 경우 App 양성 혈청에 대해 반응성이 없음을 확인하였다. 이로부터 본 발명의 ApxIVA C2 재조합 항원 단백질을 이용할 경우, 다른 Apx 외독소 간 교차반응을 일으키지 않으면서도 높은 특이도와 민감도로 돼지 흉막폐렴균의 감염을 진단할 수 있음을 알 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 조성물을 포함하는 돼지 흉막폐렴균의 감염 진단용 키트를 제공하는 것이다. 상기 돼지 흉막폐렴균, 외독소 ApxIVA, 재조합 항원 단백질 및 진단은 전술한 바와 같다.

본 발명에서 용어 "키트"는 본 발명의 목적상 돼지 흉막폐렴균의 자연감염 여부를 진단하기 위해 사용될 수 있는, 당업계에 공지된 도구 또는 장비를 제한없이 포함한다. 구체적으로, 상기 키트는 돼지 흉막폐렴균의 자연감염으로 발현된 ApxIVA 외독소에 의해 개체(돼지)의 체내에 생성된 항체를 검출 가능한 것으로, 당업계에 공지된 형태의 키트를 제한없이 사용할 수 있으며, 보다 구체적으로 ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) 키트, 보다 구체적으로 indirect ELISA 키트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 돼지 흉막폐렴균의 감염 진단용 키트는 돼지 흉막폐렴균의 외독소 ApxIVA에 대한 항체만을 특이적으로 검출하는 것일 수 있으며, 높은 특이성으로 인해 다른 Apx 외독소에 대한 교차반응이 없고, 돼지 흉막폐렴균의 백신접종 개체와 자연감염 개체를 구분하여 진단 가능하다. 또한, 본 발명의 키트는 상기 재조합 항원 단백질 ApxIVA C2를 포함하는 조성물을 포함하는 것으로, 높은 특이도와 민감도로 돼지 흉막폐렴균의 감염 여부를 진단할 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 키트를 이용하여 인간을 제외한 개체의 돼지 흉막폐렴균 감염 여부를 진단하는 방법을 제공하는 것이다. 상기 돼지 흉막폐렴균, 외독소 ApxIVA, 재조합 항원 단백질 및 진단은 전술한 바와 같다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 하나의 양태는 서열번호 9의 아미노산 서열로 구성되는, 돼지 흉막폐렴균의 감염 진단용 재조합 항원 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명은 ApxIVA 외독소를 이용하여 돼지 흉막폐렴균의 자연감염 개체를 진단 가능한 항원 후보 구간을 발굴하였으며, 특히 ApxIVA 외독소 단백질의 구조 예측으로부터 선별된 본 발명의 ApxIVA 재조합 항원 단백질은 Apx 외독소 간 교차반응을 일으키지 않으면서, 높은 특이도와 민감도로 돼지 흉막폐렴균의 감염을 진단할 수 있다.

도 1은 ApxIVA C1, C2 및 C3의 3차원 구조 및 각각의 C-socre값을 나타낸 것이다.
도 2는 ApxIVA C1, C2 및 C3에 대해 SDS-PAGE 및 anti-histidine antibody를 이용한 Western-blot을 수행하여 App 양성 혈청에 대한 특이적 반응 여부를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 확립된 in-house ELISA 조건을 바탕으로, ApxIVA C1 항원을 이용한 174개 야외 혈청에 대한 결과와 IDEXX APP-ApxIV Ab Test 키트를 이용한 결과를 비교한 것을 나타낸다.
도 4는 확립된 in-house ELISA 조건을 바탕으로, ApxIVA C2 항원을 이용한 174개 야외 혈청에 대한 결과와 IDEXX APP-ApxIV Ab Test 키트를 이용한 결과를 비교한 것을 나타낸다.
도 5은 확립된 in-house ELISA 조건을 바탕으로, ApxIVA C1, C2 cocktail 항원을 이용한 174개 야외 혈청에 대한 결과와 IDEXX APP-ApxIV Ab Test 키트를 이용한 결과를 비교한 것을 나타낸다.
도 6는 ApxIVA C1, C2의 cocktail 항원을 이용한 in-house ELISA 수치와 IDEXX APP-ApxIV Ab Test 키트의 수치를 비교하여 특이도 및 민감도 측정한 결과를 나타낸다.
도 7은 ApxIVA C1, ApxIVA C2 및 ApxIVA C1, C2의 cocktail 항원(0.5:9.5 및 0.25:9.25) 각각의 in-house ELISA 코팅 조건에 따른, 야외 혈청에 대한 ROC-curve 결과를 나타낸다.

이하, 본 발명을 하기 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: ApxIVA 외독소 단백질의 항원 후보 구간(ApxIVA C1, C2 및 C3)의 설정 및 유전자 클로닝

Bioinformatics 및 in-silico 방법을 통해 ApxIVA 외독소 단백질의 구조를 예측함으로서 ApxIVA 외독소 단백질의 항원 후보구간을 선정하였다. ApxIVA 외독소 단백질은 Kor-ApxIVA (HM021153) 균주를 이용하였다. 구체적으로, 항원 후보구간의 설정을 위해 Chou-Fasman Beta-Turn Prediction, Emini Surface Accessibility Prediction, Karplus and Schulz Flexibility Prediction, Kolaskar and Tongaonkar Antigenicity, Parker Hydrophilicity Prediction, Linear Epitope Prediction, Protein domain boundary 분석을 수행하였으며, 그 결과 ApxIVA 외독소 단백질의 아미노산 서열(서열번호 7)의 568-636 영역(서열번호 8)에서 beta-turn, flexibility prediction analysis, surface accessibility, and hydrophilicity 에 대한 높은 수치를 확인하였다.

이러한 분자 화학적 분석과 함께, 다른 ApxA 외독소에 비해 특이적으로 큰 크기와 복잡한 구조를 가지고 있는 ApxIVA 외독소 단백질의 3차원 구조 또한 I-TASSER, Phyre2 및 ProFunc를 통해 예측 및 분석하였다. 아직까지 X-ray crystallography 및 NMR(Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy)에 의해 ApxIVA 외독소 단백질의 3차원적 구조가 밝혀지지 않아, 상기 언급된 in-silico 프로그램으로 산출된 ApxIVA 외독소 단백질의 3차원 구조 및 분자 화학적 성질을 기초로 실험을 진행하였다.

이를 통해, 높은 항원성을 가질것으로 예측된 3가지 구간으로 protein domain을 선정하였고, ApxIVA 외독소의 항원 구간으로 N-말단 부분에 해당하는 C1은 1-1500bp, 중간 부분에 해당하는 C2 는 1441-2700bp, C-말단 부분에 해당하는 C3 는 5011-5760bp로 선정되었다. ApxIVA C1, C2, C3의 3차원적 구조는 각각 -0.34, -2.22, -1.64 의 C-score(Confidence score)로 예측되었으며, -5 에서 2 사이로 나타나는 이 수치는 예측된 구조의 질을 나타낸다. 이는 Threading template alignments와 structure assembly simulation의 convergence parameters로 인해 정해지며, C-score가 2에 가까울수록 높은 질의 구조를 나타낸다(도 1). 한편, ApxIVA C2 항원에 해당하는 아미노산 서열 596-1084 구간은 PDB hit 5a9q4 의 구조와 0.943 의 TM-score를 나타내어 예측된 구조와 높은 유사성을 보였으며, 상당 부분의 alpha-helices를 포함한 구조를 나타내었다.

이를 토대로 선정된 후보 구간(ApxIVA C1, C2 및 C3)을 PCR로 증폭하였으며, PCR 증폭에 사용된 프라이머의 서열 정보는 아래 표 1에 나타내었다.

[표 1]

PCR 증폭은 Actinobacillus pleuropneumoniae(App) 표준주 및 야외주에서 상용 bacterial genomic DNA kit(Promega, USA)를 이용하여 추출한 DNA를 template로 하여 NCBI gene bank에서 프라이머를 제작하여 실시하였다. 이후 증폭된 항원 에피토프의 유전자를 클로닝하고, 클로닝된 벡터를 E. coli Top10 에 형질전환한 후 colony PCR을 통하여 벡터의 삽입 유무를 확인하였다. 클로닝된 벡터는 miniprep하여 T7 프로모터에 대한 universial primers를 사용하여 앞/뒤 방향으로 염기서열을 분석하였으며, 이를 통해 항원 에피토프의 각 유전자들이 제대로 클로닝된 것을 확인하였다.

실시예 2: 외독소 재조합 단백질 발현

상기 실시예 1에서 확인한 항원 구간으로부터, pET300 발현 벡터 및 E. coli BL21(DE3)을 이용하여 외독소 재조합 단백질을 발현시켰다. 위의 E. coli Top10에서 miniprep한 플라스미드를 heat-shock 방법으로 E. coli BL21(DE3)에 다시 형질전환을 수행하였다. Colony PCR을 통하여 형질전환 유무를 확인하고, 여러 클론들을 LB broth에서 배양한 후, IPTG (isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside) 1mM을 첨가하여 재조합 단백질 발현을 유도하였다. 여러 클론들에서 추출한 crude한 단백질을 이용하여 SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)를 수행하였고, 그 중 재조합 단백질 발현량이 가장 많은 클론을 선정하였다. 선정된 클론들은 Nickel-nitrilotriacetic acid(Ni-NTA) chelate affinity chromatography을 이용하여 순수 정제하였다. 순수 정제된 재조합 단백질은 heating을 통해 변성(denaturation)시키고, SDS-PAGE 와 anti-histidine antibody 이용한 Western blot을 실시하여 그 순수도와 특이도를 확인하였다. 한편, ApxIVA C3의 경우, 단백질 발현은 확인되었으나, Western-blot 결과에서 App 양성 혈청 및 anti-histidine antibody와 반응성을 보이지 않아 ApxIVA의 항원 후보로써 제외하였다(도 2). 이후 확립된 재조합 단백질 정제 조건을 바탕으로 대량생산 체제에 적용하였다.

실시예 3: 외독소 재조합 단백질을 이용한 ELISA 조건의 확립과 진단의 특이도 및 민감도 분석

ELISA 조건의 확립을 위해, 순수 정제된 재조합 단백질(항원 에피토프)의 농도, conjugate 농도 및 혈청 희석배수 등을 결정하였다. ELISA 조건의 확립은 checker-board titration을 이용하였다. 우선 정제된 재조합 단백질을 96-well 플레이트의 한 well 당 400-3.125ng으로 2진 단계 희석하여 항원 코팅을 실시하였다. 이후 양성ㆍ음성 돼지 혈청, 양성ㆍ 음성 토끼 다클론항체 혈청을 1/10 내지 1/2560 배로 2진 단계 희석하여 코팅된 항원에 반응시켜 ELSIA 조건을 최적화하였다. Conjugate 농도는 1:1000, 1:2000, 1:5000, 1:10000 의 희석배수로 반응 시켜 가장 적절한 conjugate 농도를 설정하여 indirect ELISA 조건을 확립하였다. 확립된 ELISA 조건은 다음과 같다. 1) 재조합 단백질의 농도: 한 well 당 400ng 2)Washing buffer: 1XPBS-T (Tween20 0.05%) 3)Blocking buffer: 1% Casein in PBS-T 4)Antibody diluent: 0.1% Casein in PBS-T 5) Sample dilution factor: 1/20 6)Conjugate dilution: 1:10000 in antibody diluent 6)ELISA plate: Polysorp, low-binding ELISA plate.

확립된 ELISA 조건의 평가 시, 본원발명의 항원 또는 cocktail 항원을 이용한 ELISA 키트와 기존의 상용 키트인 IDEXX사의 APP-ApxIV Ab Test 키트 와의 correlation과 함께 민감도(sensitivity), 특이도(specificity), Efficiency, ROC curve를 종합적으로 분석하였다. 구체적으로, ApxIVA C1 과 C2 재조합 단백질 각각의 민감도와 특이도를 고려하여, 두가지 항원이 적정 비율로 혼합된 cocktail 항원의 ApxIVA C1 : ApxIVA C2의 비율은 0.25:9.75 와 0.5:9.5로 설정하였다. 이러한 코팅 항원을 사용한 in-house ELISA로 산출된 각 야외 혈청에 대한 O.D. 값을 IDEXX 키트를 이용한 결과와 대조하여 통계적 분석을 실시하였다. IDEXX 키트에서 판단된 양성 및 음성혈청 샘플을 그룹화하여 각 코팅 항원을 이용한 in-house ELISA의 O.D.값 수치를 대입하였고, 각 ELISA 조건으로 인한 양성 및 음성 혈청의 분포도를 관찰하였다(도 6).

IDEXX kit 와 ApxIVA C1, C2 항원을 이용한 ELISA 실험 결과를 비교해본 결과, 전체 야외혈청의 O.D.값 패턴이 유사하였다. 하지만, ApxIVA C1 항원의 경우 IDEXX kit를 사용했을 때 높은 O.D.값을 보인 샘플들에 한해서 비슷한 수치의 양성 패턴을 보였으나 반대로 음성 혈청에서 전체적으로 높은 O.D.값을 보여 ApxIVA C1 항원을 이용한 ELISA에서는 낮은 특이도를 나타내었다(도 3). 반면, ApxIVA C2 항원의 경우 ApxIVA C1과 달리 야외혈청을 대상으로 IDEXX kit에서 음성 수치를 보이는 혈청에 대해 뛰어난 유사성을 보여 높은 특이도를 보였다(도 4).

또한, 이러한 특징은 통계적 분석을 통해서도 확인할 수 있다. ApxIVA 외독소를 이용한 4가지 항원 후보물질에 대한 ROC-curve의 AUC 값을 산출하였을 때, ApxIVA C2 항원은 0.8397인 가장 높은 수치를 보여 IDEXX kit로 인해 분리된 App 양성 및 음성 혈청군에 대한 가장 높은 특이도를 보여 그 유의성이 검증되었다(도 7). 즉, 야외혈청 샘플에 대해 높은 민감도를 보인 ApxIVA C1 항원을 비롯하여 본 발명에서 제시된 다른 항원 후보에 비해 보완된 민감도와 상대적으로 높은 특이도를 보인 ApxIVA C2 항원은 돼지 흉막폐렴이 의심되는 개체 중에서 App 양성군을 감별진단 하는데에 중요한 바이오마커로 활용될 수 있을 것이다.

한편, ApxIVA C1, C2 항원의 민감도 및 특이도를 최적화하기 위해 C1 과 C2 항원을 여러 비율로 혼합하여 cocktail 항원을 제조하였고, 구체적으로 ApxIVA C1과 C2 항원의 비율이 0.25:9.75 와 0.5:9.5 로 혼합하여 cocktail 항원을 사용하여 검출 특이도 및 민감도의 유의적인 변화를 관찰하였다.

그 결과, 본 발명에서 제시한 C1, C2 coaktail 항원을 이용한 실험 결과가 기존의 돼지 흉막폐렴 키트(IDEXX)와 유사한 패턴의 결과를 보이는 것을 알 수 있었다(도 5). 다만, 본 발명에서 제시한 항원들을 이용한 ELISA 결과는 기존 IDEXX 사의 APP-ApxIV Ab Test 키트와 유사한 패턴을 보이기는 하나, 도 6에 나타낸 App 양성군 및 음성군 혈청의 cut-off O.D 값을 기준으로 나타낸 통계 결과에서는 차이를 보였다.

나아가, 각각의 항원 또는 cocktail 항원을 이용하여 돼지 흉막폐렴균 진단의 민감도 및 특이도를 평가하였다. 구체적으로, ApxIVA C1, C2 및 C1과 C2 항원의 0.25:9.75 비율의 cocktail 항원, C1과 C2 항원의 0.5:9.5 비율의 cocktail 항원의 4가지의 항원을 이용한 각각의 ELISA 조건으로부터 산출된 O.D.값을 이용하여 Reciever Operating Characteristic(ROC-curve)를 제시하였다.

그 결과, ApxIVA C1 항원의 Area Under Curve(AUC)는 0.6596, ApxIVA C2 항원의 AUC는 0.8397, ApxIVA C1과 C2 의 0.25:9.75 비율의 cocktail 항원은 0.7639, ApxIVA C1과 C2 의 0.5:9.5 비율의 cocktail 항원은 0.7625로 나타났다(도 7). 즉, 전술한 바와 같이 ApxIVA C2 항원을 이용한 ELISA 키트의 경우 AUC 값이 0.8397로 ApxIVA C1 항원 또는 이와 혼합된 cocktail 항원을 이용한 경우에 비해 진단의 특이도 및 민감도 면에서 현저히 우수함을 확인하였다. 이로부터 ApxIVA C2 재조합 단백질을 이용할 경우 다른 Apx 외독소 간 교차반응을 일으키지 않으면서도 높은 특이도와 민감도로 돼지 흉막폐렴균의 감염을 진단할 수 있음을 알 수 있다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> Seoul National University R&DB Foundation REPUBLIC OF KOREA (Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs, Animal and Plant Quarantine Agency) <120> Composition for diagnosing infection of Actinobacillus pleuropneumoniae containing recombinant antigen protein of ApxIVA <130> KPA180342-KR <160> 9 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ApxIVA Forward Primer <400> 1 caccatgaca aaattaacta tgcaagatgt g 31 <210> 2 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ApxIVA C1 Reverse Primer <400> 2 actttttaac tttttaacgg cgggcaattt tag 33 <210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ApxIVA C2 Forward Primer <400> 3 caccactaat tatcgttatg aagttaaagg ac 32 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ApxIVA C2 Reverse Primer <400> 4 gctatcggtg ctttctagcg 20 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ApxIVA C3 Forward Primer <400> 5 caccgatatt ctaagaggtg gctacggt 28 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ApxIVA C3 Reverse Primer <400> 6 cgactcaacc atcttctcca c 21 <210> 7 <211> 1951 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RTX toxin ApxIVA <400> 7 Met Thr Lys Leu Thr Met Gln Asp Val Thr Asn Leu Tyr Leu Tyr Lys 1 5 10 15 Thr Lys Thr Leu Pro Lys Asp Arg Leu Asp Asp Ser Leu Ile Ser Glu 20 25 30 Ile Gly Lys Gly Asp Asp Asp Ile Asp Arg Lys Glu Phe Met Val Gly 35 40 45 Pro Gly Arg Phe Val Thr Ala Asp Asn Phe Ser Val Val Arg Asp Phe 50 55 60 Phe Asn Ala Gly Lys Ser Arg Ile Ile Ala Pro Gln Val Pro Pro Ile 65 70 75 80 Arg Ser Gln Gln Glu Lys Ile Leu Val Gly Leu Lys Pro Gly Lys Tyr 85 90 95 Ser Lys Ala Gln Ile Leu Glu Met Leu Gly Tyr Thr Lys Gly Gly Glu 100 105 110 Val Val Asn Gly Met Phe Ala Gly Glu Val Gln Thr Leu Gly Phe Tyr 115 120 125 Asp Asp Gly Lys Gly Asp Leu Leu Glu Arg Ala Tyr Ile Trp Asn Thr 130 135 140 Thr Gly Phe Lys Met Ser Asp Asn Ala Phe Phe Val Ile Glu Glu Ser 145 150 155 160 Gly Lys Arg Tyr Ile Glu Asn Phe Gly Ile Glu Pro Leu Gly Lys Gln 165 170 175 Glu Asp Phe Asp Phe Val Gly Gly Phe Trp Ser Asn Leu Val Asn Arg 180 185 190 Gly Leu Glu Ser Ile Ile Asp Pro Ser Gly Ile Gly Gly Thr Val Asn 195 200 205 Leu Asn Phe Thr Gly Glu Val Glu Thr Tyr Thr Leu Asp Glu Thr Arg 210 215 220 Phe Lys Ala Glu Ala Ala Lys Lys Ser His Trp Ser Leu Val Asn Ala 225 230 235 240 Ala Lys Val Tyr Gly Gly Leu Asp Gln Ile Ile Lys Lys Leu Trp Asp 245 250 255 Ser Gly Ser Ile Lys His Leu Tyr Gln Asp Lys Asp Thr Gly Lys Leu 260 265 270 Lys Pro Ile Ile Tyr Gly Thr Ala Gly Asn Asp Ser Lys Ile Glu Gly 275 280 285 Thr Lys Ile Thr Arg Arg Ile Ala Gly Lys Glu Val Thr Leu Asp Ile 290 295 300 Ala Asn Gln Lys Ile Glu Lys Gly Val Leu Glu Lys Leu Gly Leu Ser 305 310 315 320 Val Ser Gly Ser Asp Ile Ile Lys Leu Leu Phe Gly Ala Leu Thr Pro 325 330 335 Thr Leu Asn Arg Met Leu Leu Ser Gln Leu Ile Gln Ser Phe Ser Asp 340 345 350 Ser Leu Ala Lys Leu Asp Asn Pro Leu Ala Pro Tyr Thr Lys Asn Gly 355 360 365 Val Val Tyr Val Thr Gly Lys Gly Asn Asp Val Leu Lys Gly Thr Glu 370 375 380 His Glu Asp Leu Phe Leu Gly Gly Glu Gly Asn Asp Thr Tyr Tyr Ala 385 390 395 400 Arg Val Gly Asp Thr Ile Glu Asp Ala Asp Gly Lys Gly Lys Val Tyr 405 410 415 Phe Val Arg Glu Lys Gly Val Pro Lys Ala Asp Pro Lys Arg Val Glu 420 425 430 Phe Ser Glu Tyr Ile Thr Lys Glu Glu Ile Lys Glu Val Glu Lys Gly 435 440 445 Leu Leu Thr Tyr Ala Val Leu Glu Asn Tyr Asn Trp Glu Glu Lys Thr 450 455 460 Ala Thr Phe Ala His Ala Thr Met Leu Asn Glu Leu Phe Thr Asp Tyr 465 470 475 480 Thr Asn Tyr Arg Tyr Glu Val Lys Gly Leu Lys Leu Pro Ala Val Lys 485 490 495 Lys Leu Lys Ser Pro Leu Val Glu Phe Thr Ala Asp Leu Leu Thr Val 500 505 510 Thr Pro Ile Asp Glu Asn Gly Lys Ala Leu Ser Glu Lys Ser Ile Thr 515 520 525 Val Lys Asn Phe Lys Asn Gly Asp Leu Gly Ile Arg Leu Leu Asp Pro 530 535 540 Asn Ser Tyr Tyr Tyr Phe Leu Glu Gly Lys Asp Thr Gly Phe Tyr Gly 545 550 555 560 His Ala Phe Tyr Ile Glu Arg Lys Asn Gly Gly Gly Ser Lys Asn Asn 565 570 575 Ser Ser Gly Ala Gly Asn Ser Lys Asp Trp Gly Gly Asn Gly His Gly 580 585 590 Asn His Arg Asn Asn Ala Ser Asp Leu Asn Lys Pro Asp Gly Asn Asn 595 600 605 Gly Asn Asn Gln Asn Asn Gly Ser Asn Gln Asp Asn Asn Ser Asp Val 610 615 620 Asn Ala Pro Asn Asn Pro Gly Arg Asn Tyr Asp Ile Tyr Asp Pro Leu 625 630 635 640 Ala Leu Asp Leu Asp Gly Asp Gly Leu Glu Thr Val Ser Met Asn Gly 645 650 655 Arg Gln Gly Ala Leu Phe Asp His Glu Gly Lys Gly Ile Arg Thr Ala 660 665 670 Thr Gly Trp Leu Ala Ala Asp Asp Gly Phe Leu Val Leu Asp Arg Asn 675 680 685 Gln Asp Gly Ile Ile Asn Asp Ile Ser Glu Leu Phe Ser Asn Lys Asn 690 695 700 Gln Leu Ser Asp Gly Ser Ile Ser Ala His Gly Phe Ala Ala Leu Ala 705 710 715 720 Asp Leu Asp Thr Asn Gln Asp Gln Arg Ile Asp Gln Asn Asp Lys Leu 725 730 735 Phe Ser Lys Leu Gln Ile Trp Arg Asp Leu Asn Gln Asn Gly Phe Ser 740 745 750 Glu Ala Asn Glu Leu Phe Ser Leu Glu Ser Leu Asn Ile Lys Ser Leu 755 760 765 His Thr Ala Tyr Glu Glu Arg Asn Asp Phe Leu Ala Gly Asn Asn Ile 770 775 780 Leu Ala Gln Leu Gly Lys Tyr Glu Lys Thr Asp Gly Thr Phe Ala Gln 785 790 795 800 Met Gly Asp Leu Asn Phe Ser Phe Asn Pro Phe Tyr Ser Arg Phe Thr 805 810 815 Glu Ala Leu Asn Leu Thr Glu Gln Gln Arg Arg Thr Ile Asn Leu Thr 820 825 830 Gly Thr Gly Arg Val Arg Asp Leu Arg Glu Ala Ala Ala Leu Ser Glu 835 840 845 Glu Leu Ala Ala Leu Leu Gln Gln Tyr Thr Lys Ala Ser Asp Phe Gln 850 855 860 Ala Gln Arg Glu Leu Leu Pro Ala Ile Leu Asp Lys Trp Ala Ala Thr 865 870 875 880 Asp Leu Gln Tyr Gln His Tyr Asp Lys Thr Leu Leu Lys Thr Leu Glu 885 890 895 Ser Thr Asp Ser Ser Ala Ser Val Val Arg Val Thr Pro Ser Gln Leu 900 905 910 Ser Ser Ile Arg Asn Val Lys His Asp Pro Thr Val Met Gln Asn Phe 915 920 925 Glu Gln Ser Lys Ala Lys Ile Ala Thr Leu Asn Ser Leu Tyr Gly Leu 930 935 940 Asn Ile Asp Gln Leu Tyr Tyr Thr Thr Asp Lys Asp Ile Arg Tyr Ile 945 950 955 960 Thr Asp Lys Val Asn Asn Met Tyr Gln Thr Thr Val Glu Leu Ala Tyr 965 970 975 Arg Ser Leu Leu Leu Gln Thr Arg Leu Lys Lys Tyr Val Tyr Ser Val 980 985 990 Asn Ala Lys Gln Phe Glu Gly Lys Trp Val Ala Asp 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Glu Lys Leu Glu Phe Ala Asp Arg Ser Ile Thr Arg Asp Glu 1205 1210 1215 Leu Gly Lys Gln Gly Met Ala Leu Phe Gly Thr Asp Gly Asp Asp Asp 1220 1225 1230 Ile Asn Asp Trp Gly Arg Asn Ser Val Ile Asp Ala Gly Ala Gly Asn 1235 1240 1245 Asp Thr Ile Asn Gly Ser Tyr Gly Asp Asp Thr Leu Ile Gly Gly Thr 1250 1255 1260 Gly Asn Asp Ile Leu Lys Gly Ser Tyr Gly Ala Asp Thr Tyr Leu Phe 1265 1270 1275 1280 Ser Lys Gly His Gly Gln Asp Val Ile Tyr Glu Tyr Ser Asp Ser Ala 1285 1290 1295 Asn Ser Lys Arg Asp Ile Asp Thr Leu Lys Phe Thr Asp Val Asn Tyr 1300 1305 1310 Ala Glu Val Lys Phe Arg Arg Val Gly Asp Asp Leu Met Leu Phe Gly 1315 1320 1325 Tyr His Asp Thr Asp Ser Val Thr Val Lys Ser Phe Tyr Asp His Glu 1330 1335 1340 Tyr Tyr Gln Phe Glu Lys Leu Glu Phe Ala Asp Arg Ser Ile Ser Arg 1345 1350 1355 1360 Asp Glu Leu Ile Lys Ala Gly Leu His Leu Tyr Gly Thr Asp Gly Asn 1365 1370 1375 Asp Glu Ile Asn Asp His Ala Asp Trp Asp Ser Ile Leu Glu Gly Gly 1380 1385 1390 Lys Gly Asn Asp Ile Leu Arg Gly Ser Tyr Gly Ala 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Gly Asn Gly Asp Asp 1795 1800 1805 Thr Leu Ile Gly Gly Lys Gly Asn Asp Ile Leu Arg Gly Gly Tyr Gly 1810 1815 1820 Ala Asp Thr Tyr Ile Phe Ser Lys Gly His Gly Gln Asp Ile Val Tyr 1825 1830 1835 1840 Glu Asp Thr Asn Asn Asp Asn Arg Ala Arg Asp Ile Asp Thr Leu Lys 1845 1850 1855 Phe Thr Asp Ile Asn Leu Ser Glu Leu Trp Phe Ser Arg Glu Asn Asn 1860 1865 1870 Asp Leu Ile Ile Lys Ser Leu Leu Ser Glu Asp Lys Val Thr Val Gln 1875 1880 1885 Asn Trp Tyr Ser His Gln Asp His Lys Ile Glu Asn Ile Arg Leu Ser 1890 1895 1900 Asn Glu Gln Thr Leu Val Ser Thr Gln Val Glu Lys Met Val Glu Ser 1905 1910 1915 1920 Met Ala Gly Phe Ala Gln Lys His Gly Gly Glu Ile Ser Leu Ala Ser 1925 1930 1935 Pro Glu Glu Val Lys Gln Tyr Ile Asn Ser Leu Thr Ala Ala Leu 1940 1945 1950 <210> 8 <211> 69 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RTX toxin ApxIVA (568-636) <400> 8 Lys Asn Gly Gly Gly Ser Lys Asn Asn Ser Ser Gly Ala Gly Asn Ser 1 5 10 15 Lys Asp Trp Gly Gly Asn Gly His Gly Asn His Arg Asn Asn Ala Ser 20 25 30 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Ala 145 150 155 160 Leu Phe Asp His Glu Gly Lys Gly Ile Arg Thr Ala Thr Gly Trp Leu 165 170 175 Ala Ala Asp Asp Gly Phe Leu Val Leu Asp Arg Asn Gln Asp Gly Ile 180 185 190 Ile Asn Asp Ile Ser Glu Leu Phe Ser Asn Lys Asn Gln Leu Ser Asp 195 200 205 Gly Ser Ile Ser Ala His Gly Phe Ala Ala Leu Ala Asp Leu Asp Thr 210 215 220 Asn Gln Asp Gln Arg Ile Asp Gln Asn Asp Lys Leu Phe Ser Lys Leu 225 230 235 240 Gln Ile Trp Arg Asp Leu Asn Gln Asn Gly Phe Ser Glu Ala Asn Glu 245 250 255 Leu Phe Ser Leu Glu Ser Leu Asn Ile Lys Ser Leu His Thr Ala Tyr 260 265 270 Glu Glu Arg Asn Asp Phe Leu Ala Gly Asn Asn Ile Leu Ala Gln Leu 275 280 285 Gly Lys Tyr Glu Lys Thr Asp Gly Thr Phe Ala Gln Met Gly Asp Leu 290 295 300 Asn Phe Ser Phe Asn Pro Phe Tyr Ser Arg Phe Thr Glu Ala Leu Asn 305 310 315 320 Leu Thr Glu Gln Gln Arg Arg Thr Ile Asn Leu Thr Gly Thr Gly Arg 325 330 335 Val Arg Asp Leu Arg Glu Ala Ala Ala Leu Ser Glu Glu Leu Ala Ala 340 345 350 Leu Leu Gln Gln Tyr Thr Lys Ala Ser Asp Phe Gln Ala Gln Arg Glu 355 360 365 Leu Leu Pro Ala Ile Leu Asp Lys Trp Ala Ala Thr Asp Leu Gln Tyr 370 375 380 Gln His Tyr Asp Lys Thr Leu Leu Lys Thr Leu Glu Ser Thr Asp Ser 385 390 395 400

Claims (10)

1. 돼지 흉막폐렴균(Actinobacillus pleuropneumoniae, App)의 외독소 ApxIVA의 재조합 항원 단백질을 포함하는, 돼지 흉막폐렴균의 감염 진단용 조성물로,
   상기 재조합 항원 단백질은 서열번호 9의 아미노산 서열로 구성된 것인, 조성물.
   
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 제1항에 있어서, 상기 재조합 항원 단백질은 돼지 흉막폐렴균의 외독소 ApxIVA에 대한 항체만을 특이적으로 검출하는 것인, 조성물.
   
6. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 돼지 흉막폐렴균의 자연 감염 여부를 진단할 수 있는 것을 특징으로 하는, 조성물.
   
7. 제1항 및 제5항 내지 제6항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 돼지 흉막폐렴균의 감염 진단용 키트.
   
8. 제7항에 있어서, 상기 키트는 ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) 키트 형태인, 키트.
   
9. 제7항의 키트를 이용하여 인간을 제외한 개체의 돼지 흉막폐렴균 감염 여부를 진단하는 방법.
   
10. 서열번호 9의 아미노산 서열로 구성되는, 돼지 흉막폐렴균의 감염 진단용 재조합 항원 단백질.

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