JP2024501941A - アフリカブタ熱ｄｉｖａイムノアッセイ - Google Patents

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Abstract

本発明は、試験サンプルにおけるＡＳＦＶ抗体の存在を検出するための、アフリカブタ熱ウイルスＣＤ２ｖタンパク質の診断的使用、方法、装置およびキット、特に、ＤＩＶＡイムノアッセイにおけるその使用に関する。【選択図】図１

Description

本発明は、試験サンプルにおけるアフリカブタ熱ウイルス（ＡＳＦＶ）抗体の存在を検出するための、アフリカブタ熱ウイルス（ＡＳＦＶ）ＣＤ２ｖ抗原の診断的使用、方法、装置およびキットに関する。
アフリカブタ熱（アフリカ豚コレラ）（ＡＳＦ）なる疾患の背景、その原因因子であるＡＳＦウイルスおよび該ウイルスを制御する試みは最近の多数のレビューの対象となっている（Ａｒｉａｓら，Ｖａｃｃｉｎｅｓ ５，３５，２０１７；Ｇａｌｉｎｄｏら，Ｖｉｒｕｓｅｓ ９，１０３，２０１７；Ｒｅｖｉｌｌａら，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｖｉｒ．Ｒｅｓ．１００，２０１８；Ｓａｎｃｈｅｚら，Ｖｉｒ．Ｒｅｓ．２６５，１５０－１５５，２０１９；Ｂｌｏｍｅら，Ｖｉｒ．Ｒｅｓ．２８７，９８０９９，２０２０；Ｂｏｓｃｈ－Ｃａｍｏｓら，Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｈｅａｌｔｈ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ，２０２０ ６：１７；Ｄｉｘｏｎら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ａｎｉｍ．Ｂｉｏｓｃｉ．，２０２０，８：２２１－２４６）。１９００年代初頭、ＡＳＦは、ほぼ全ての感染家畜ブタの死亡をもたらす急性出血熱として東アフリカにおいて報告された。感染源は、古代の森林サイクルから広がったウイルスであると特定された。それ以来、ＡＳＦＶはサハラ以南のほとんどのアフリカ諸国および欧州に広がっている。この疾患の根絶は欧州においては１９９０年代半ばまでに達成された。２００７年にカフカス地方のジョージアに伝播したことは新たな感染時代の予兆となった。なぜなら、ＡＳＦＶはその後、主に東欧の多数の国に広がったからである。２０１８年に、世界のブタ頭数の半分を含むと考えられる中国でＡＳＦＶが検出され、状況は大幅に悪化した。ＡＳＦの大きな社会経済的影響は、動物が受ける苦痛、ブタ生産連鎖における事業の損失、疾病管理のコストおよび商業的損失から生じる。伝染病の大流行は国内のブタ集団の劇的なサイズ減少、ならびにブタおよびブタ肉製品の価格の高騰をもたらしうる。ＡＳＦは国際獣疫事務局（Ｗｏｒｌｄ Ｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ）（ＯＩＥ）によって届出疾患として列挙されている。
ＡＳＦＶの宿主域はイノシシ科動物（ｓｕｉｄ）とヒメダニ（Ｏｒｎｉｔｈｏｄｏｒｏｓ）属のヒメダニとに限定されている。アフリカにおけるその野生イノシシ科動物宿主においては、ＡＳＦＶ感染は軽度の臨床症状を引き起こし、長期にわたる持続感染をもたらしうる。対照的に、ほとんどのＡＳＦＶ分離体は、家畜ブタおよび野生イノシシにおいて、致死率が１００％に近い急性出血熱を引き起こす。家畜ブタおよび野生イノシシで観察される疾患には急性型および超急性型が含まれ、これらは高毒性分離体によって引き起こされ、感染後４～１５日以内に死をもたらす。中等度の毒性の分離体はより低い致死率をもたらす（３０～７０％）。低毒性分離体は低い死亡率をもたらし、または死亡を全くもたらさず、血管病変を引き起こさない。しかし、関節炎のような慢性疾患の徴候が観察されうる。急性ＡＳＦの臨床徴候には、高熱、食欲不振ならびに嗜眠および罹患の増加が含まれる。血性下痢、嘔吐および流産も観察されうる。
ＡＳＦＶは、最大の且つ最も複雑な細胞質二本鎖ＤＮＡウイルスの１つである。このウイルスは、単核食細胞系の細胞、主に単球およびマクロファージにおいて複製されるが、他の細胞型にも感染しうる。ＡＳＦＶビリオンは約２００ｎｍの正二十面体構造であり、これは、内部コア、コアシェル（中心殻）、内膜、カプシドを含む、そして細胞外ビリオンにおいては外部エンベロープを含む同心円層によって形成される。このウイルスはアスファウイルス（Ａｓｆａｖｉｒｉｄａｅ）科の唯一のメンバーであり、アスフィウイルス（Ａｓｆｉｖｉｒｕｓ）属内に分類される。
ＡＳＦＶゲノムは、ＡＳＦＶ株によって異なる１７０～１９０ｋｂｐの様々な長さを有する。これは、特にゲノムの多重遺伝子ファミリー（ＭＧＦ）領域における幾つかのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のサイズのばらつきと、遺伝子および遺伝子間領域内の短いタンデムリピートのばらつきとによるものである。株に応じて、ゲノムは１５０～１６７個のＯＲＦを含有し、これらはウイルス複製および形態形成ならびに宿主細胞機能の調節および免疫回避に関与している。分子遺伝子型解析に基づいて、ＡＳＦＶの２３個の異なる遺伝子型が現在までに記載されている。
ウイルス感染、免疫原性および病原性におけるＡＳＦＶの種々の構造タンパク質および非構造タンパク質の役割が過去に研究されており、とりわけ、Ｊｉａら，Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．６１，１３５－１４３，２０１７；Ｂｌｏｍｅら，Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２８７，９８０９９，２０２０；およびＢｏｓｃｈ－Ｃａｍｏｓら，Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｈｅａｌｔｈ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ，２０２０ ６：１７においてレビューされている。５０個を超えるタンパク質がウイルス粒子内にパッケージングされ、１００個を超えるタンパク質が感染に関与する。現在研究中のＡＳＦＶタンパク質としては、とりわけ、ｐｐ２２０、ｐｐ６２、ｐ５４、ｐ３０、ｐ７２、ｐ１４．５、ｐ１７、ＣＤ２ｖ、Ａ２３８Ｌｐ、Ａ１７９Ｌｐ、Ａ２３８Ｌｐ、Ａ２２４Ｌｐ、ＤＰ７１Ｌｐ、およびＭＧＦによってコードされるタンパク質が挙げられる。
過去数年間に幾つかの研究グループが、不活化ワクチン、組換えタンパク質／ペプチドワクチン、ＤＮＡワクチンおよび弱毒化生ウイルス（ＬＡＶ）ワクチン候補にわたる新規ワクチン技術を開発してきたにもかかわらず、現在のところ、商業的で効果的で安全なＡＳＦＶワクチンは存在しない。したがって、現在、ＡＳＦ疾患と闘うためには、予防、制御および根絶の手段のみが講じられうる。これらは、主に、検査室での診断による早期検出、ならびに厳格な衛生的措置、移動および貿易の制限の実施、ならびに感染集団の殺処分に基づいている。これらの問題は、理論的には、いわゆるマーカーワクチンの使用によって解決されうる。そのようなワクチンは免疫原性ウイルスタンパク質の１以上を欠いており、その結果、マーカーワクチンで免疫化された動物は全ての免疫原性ウイルスタンパク質に対する抗体を産生するわけではない。ワクチン接種動物と感染動物との間のＡＳＦＶ抗体パレット（ｐａｌｅｔｔｅ）の違いの検出は、この目的のために設計された診断試験において行われうる。したがって、そのような試験は「感染動物をワクチン接種動物から識別すること」（ＤＩＶＡ）を可能にする。
有効かつ安全なＡＳＦ（マーカー）ワクチンが利用可能になれば、ＡＳＦ疾患の制御および根絶プログラムが改善されて、動物福祉が改善され、経済的損失が低減するであろう。しかし、ＡＳＦウイルス自体の複雑さ、およびＡＳＦＶに対する防御免疫の複雑さに対する理解の欠如が、これまでのところ、安全かつ有効なワクチンの商業的利用可能性を妨げている。
不活化ＡＳＦＶワクチンは安全であるが、強力なアジュバントの存在下でさえも、防御をもたらさない。
ＡＳＦＶサブユニットワクチンを開発する幾つかの試みが報告されている（Ｂｏｓｃｈ－Ｃａｍｏｓら，２０２０，前掲）。現在、４０個を超えるＡＳＦＶタンパク質が研究されている。これらには、ｐ３０、ｐ１２、ｐ７２、ｐ５４、ｐ２２、ＣＤ２ｖおよびＤ１１７Ｌのようなタンパク質が含まれる。しかし、免疫原性サブユニットタンパク質に基づくワクチンは、病原性ＡＳＦＶチャレンジに対して、同種（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）防御を全くもたらさなかった、または低い同種防御をもたらしたに過ぎない。
弱毒化生ウイルス（ＬＡＶ）ワクチンは、ＡＳＦと闘うための最も有望なタイプのワクチンであると考えられている。最近、宿主免疫応答の遮断および／または病原性に関連する遺伝子が不活性化された生きた複製性ＡＳＦＶ株に基づく組換えＬＡＶを開発する試みが行われている。ＡＳＦＶ株の安全性を改善するための欠失の対象となるＡＳＦＶ遺伝子の例には、とりわけ、ＤＰ７１Ｌ、幾つかのＭＧＦ３６０およびＭＧＦ５０５遺伝子、９ＧＬ、ＤＰ９６Ｒ、ＣＤ２ｖ、Ａ２８３Ｌ、Ａ２２４Ｌ、ＥＰ１５３Ｒ、Ａ２７６Ｒ、ＤＰ１４８Ｒ、Ｂ１１９ＬおよびＤＰ９６Ｒが含まれる。
ＷＯ ２０１８／００５３５８（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ）は、親ジョージア２００７株の９ＧＬ（Ｂ１１９Ｌ）遺伝子とＵＫ（ＤＰ９６Ｒ）遺伝子との両方の大部分の欠失から生じる新規突然変異体ＡＳＦＶ－Ｇ Δ９ＧＬ／ΔＵＫウイルスを開示している。
ＷＯ ２０２０／０４９１９４（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍａｄｒｉｄ）は、Ｌｖ１７／ＷＢ／Ｒｉｅ１と命名されたＡＳＦＶの野外分離体を開示し、特徴付けしている。このＡＳＦＶ株はラトビアにおいて感染野生イノシシから分離された。該新規ＡＳＦＶ株は経口投与による野生イノシシにおける弱毒化生ワクチンとして使用され、安全かつ有効であることが証明された。
ＵＳ ２０２０／０１２９６０９（Ｐｉｒｂｒｉｇｈｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）は、５つのＭＧＦ３６０遺伝子、すなわち、１０Ｌ、１１Ｌ、１２Ｌ、１３Ｌ、１４Ｌ、および３つのＭＧＦ５０５遺伝子、すなわち、１Ｒ、２Ｒ、３Ｒの欠失、ならびに追加的な遺伝子（ＭＧＦ３６０ ９Ｌ、ＭＧＦ５０５ ４ＲおよびＤＰ１４８Ｒ）の中断（ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｉｏｎ）を開示している。これらの突然変異は病原性ウイルスの弱毒化をもたらし、該新規突然変異株でのワクチン接種は親ＡＳＦＶ株によるチャレンジに対する１００％の防御を誘導した。
現在の世界的なＡＳＦＶ流行と成功裏に闘うためには、安全かつ有効なワクチンが利用可能となることに加えて、真に有効なワクチン接種戦略のための追加的な要件、すなわち、信頼しうるＤＩＶＡアプローチを可能にする診断アッセイが利用可能となることが満たされなければならないことが、一般に受け入れられている。一般に、ＤＩＶＡ診断アッセイは、安全かつ有効なＤＩＶＡワクチンと共に使用されうるように設計され適合化された診断アッセイである。そのようなアッセイおよび付随的（ａｃｃｏｍｐａｎｙｉｎｇ）ワクチンは、一緒になって、免疫学的予防および感染監視に基づいて疾患を根絶することを可能にする。基本的には、ＤＩＶＡワクチンにおける有効成分は、野外で蔓延している病原体（陰性マーカー）とは異なる表現型／遺伝子型特性を示す。
欧州連合ＡＳＦ参照試験所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｕｎｉｏｎ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ ＡＳＦ）（ｅｕｒｌ－ａｓｆ）によると、現在、ＰＣＲが、その優れた感度、特異性、堅牢性およびハイスループット適用ゆえに、家畜ブタ、ブタ、イノシシおよびダニからの任意の種類の臨床サンプルにおけるＡＳＦＶゲノムを検出するための、疾患の早期検出のための「ゴールドスタンダード」（「至適基準」）検査とみなされている。過去２０年にわたり、種々の公知ウイルス遺伝子型に属する広範なＡＳＦ分離体を検出するために、伝統的なＰＣＲアッセイおよびリアルタイムＰＣＲアッセイの両方を含む種々のＰＣＲ試験が開発され、検証されている。これらのＰＣＲアッセイの全ては、任意のＡＳＦＶ分離体の（潜在的）検出が保証されるように、主要ウイルスタンパク質をコードする高度に保存された遺伝子であるＶＰ７２コード領域を使用して設計されている。
ＥＬＩＳＡによるＡＳＦＶに対する特異的抗体の検出は、これまでのところ、国際貿易のためにＯＩＥによって規定された試験である。現在、抗原として生ウイルスを使用することに基づく試験の幾つかのＯＩＥ「組織内（ｉｎ ｈｏｕｓｅ）」形態だけでなく、多数のＡＳＦ ＥＬＩＳＡ変法が利用可能である。３つの市販ＥＬＩＳＡキット（ＩＮＧＥＮＡＳＡ、ＩＤＶＥＴおよびＳＶＡＮＯＶＩＲ）が検証されており、抗ＡＳＦＶ抗体の検出に利用可能である。これらのＥＬＩＳＡアッセイは、ｐ７２、ｐ３２、ｐｐ６２およびｐ５４のようなこれまでに記載されている最も抗原性のタンパク質に基づいている（ｈｔｔｐｓ：／／ａｓｆ－ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｌａｂ．ｉｎｆｏ／ａｓｆ／ｅｎ／ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ－ｄｉａｇｎｏｓｉｓ／ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ－ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓを参照されたい）。
Ｋｏｌｌｎｂｅｒｇｅｒら（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８３，１３３１－１３４２，２００２）は、発現されたＡＳＦＶタンパク質を回復期抗血清でＥＬＩＳＡスクリーニングすることによってＡＳＦＶの主要な血清学的免疫決定基を特定し、ＥＬＩＳＡにおいて認識される抗体応答を刺激する１４種類のウイルスタンパク質を特定した。これらには、これまでに未帰属であったＯＲＦ（Ｂ６０２Ｌ、Ｃ４４Ｌ、ＣＰ３１２Ｒ、Ｅ１８４Ｌ、Ｋ１４５ＲおよびＫ２０５Ｒ）によってコードされる６つのタンパク質、ならびにより詳細に研究されている構造タンパク質（Ａ１０４Ｒ、ｐ１０、ｐ３２、ｐ５４およびｐ７３）および非構造タンパク質［ＲＮＡレダクターゼＦ３３４Ｌｐ、Ｆ７７８Ｒｐ、ＤＮＡリガーゼ（ＮＰ４１９Ｌｐ）およびチミジンキナーゼ（Ｋ１６９Ｒｐ）］が含まれる。
ＷＯ ２０２０／１０２３７０においては、ＡＳＦＶ回復期血清を使用して、ＡＳＦＶ診断用抗原が検証された。ＫＰＩ７１２と称されるキメラ抗原は、診断抗原としてこれまでに評価されているｐ３２、ｐ５４、ｐ７２およびｐｐ６２よりも強力に認識された。
しかし、前記文献はいずれも、一方では診断アッセイにおいて抗原として使用可能であり他方ではＤＩＶＡを可能にするマーカーワクチンにおける付随的マーカー免疫原として使用可能であるＡＳＦＶタンパク質を特定していない。
したがって、ＡＳＦＶマーカーワクチンでワクチン接種された動物からのサンプルと、野外で蔓延しているＡＳＦＶに感染した動物からのサンプルとを血清学的に識別しうるインビトロ診断アッセイを提供することが、本発明の目的である。
実施例で使用される完全長ＡＳＦＶ ＣＤ２ｖタンパク質、そのドメインおよび断片の概要図。番号付けはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＤ２０６８４２０に基づいている。 種々のＡＳＦＶ株のＡＳＦＶ ＣＤ２ｖタンパク質のアミノ酸配列アラインメント。ＭＶｉｅｗ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｍｖｉｅｗ／）でのアライメントの視覚化。番号１～８は遺伝子型ＩＩ株、血清群８ ＣＤ２ｖである。番号９～１５は遺伝子型Ｉ株、血清群４ ＣＤ２ｖである。配列番号との対応を以下に示す。
Figure 2024501941000002
 種々の血清サンプルに関してＥＬＩＳＡ［ＣＤ２「１６－２０４」抗原（すなわち、ＣＤ２「１６～２０４」抗原；以下同様）］において４５０ｎｍで測定された相対光学濃度。 種々の血清サンプルに関してＥＬＩＳＡ（ＣＤ２「１３２－２０４」抗原）において４５０ｎｍで測定された相対光学濃度。 種々の血清サンプルに関してＥＬＩＳＡ（ＣＤ２「１３２－２０４」抗原）において４５０ｎｍで測定された相対光学濃度。 種々のサンプル希釈剤における幾つかの血清サンプル希釈度で４５０ｎｍ（ＣＤ２「１３２－２０４」抗原）で測定されたＥＬＩＳＡ光学濃度。 ＥＬＩＳＡの性能に対するＣＤ２ｖ断片のサイズの影響。種々の長さのＣＤ２ｖ断片と、１：３００に希釈された種々の血清サンプルとを使用して、ＥＬＩＳＡ光学濃度を４５０ｎｍで測定した。注意：ＣＤ２ｖ断片１３２－２０４は、血清Ｓ１３、Ｓ１５、Ｓ１９またはＳ２１では、ペプチド物質の欠如ゆえに、試験されなかった。 ＥＬＩＳＡのＰ／Ｎ比に対するサンプル希釈剤における界面活性剤濃度の影響。使用したＣＤ２ｖペプチド断片はＣＤ２「１３２－２０４」であり、一連の希釈度の種々の血清サンプルを使用した。 ＥＬＩＳＡのＰ／Ｎ比に対するサンプル希釈剤における塩濃度の影響。ＣＤ２「１３２－２０４」ペプチドを使用し、幾つかの希釈度の血清サンプルを使用した。注意：Ｃ－６７血清に関するデータ点はＳ３血清のものと完全に重なっている。 ＥＬＩＳＡのＰ／Ｎ比に対するサンプル希釈剤におけるＰＢＳバッファーの影響。ＣＤ２「１３２－２０４」ペプチドを使用し、幾つかの希釈度の血清サンプルを使用した。
発明の説明
驚くべきことに、この目的は、抗ＡＳＦＶ抗体の検出のためのインビトロ診断イムノアッセイであって、単離されたＡＳＦＶ ＣＤ２ｖ抗原に基づくものによって達成されうることが見出された。
ＡＳＦＶ感染動物と、ＡＳＦＶ（ＣＤ２－）マーカーワクチンでワクチン接種された動物とを有効に識別するために、単離されたＡＳＦＶ ＣＤ２ｖ抗原が使用可能であるという観察は、その流行と闘うためのＤＩＶＡ戦略の実施を初めて可能にするものである。
この有利な観察に至った重要な段階は、ＡＳＦＶ ＣＤ２ｖタンパク質が弱い免疫原であるという先行技術における報告（Ｒｕｉｚ－Ｇｏｎｚａｌｖｏら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９６，７６９－７７７，１９９３；Ａｒｇｉｌａｇｕｅｔら，ＰＬｏＳ ＯＮＥ ７（９）：ｅ４０９４２．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００４０９４２；Ｇｏｍｅｚ－Ｐｕｅｒｔａｓら，Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌ．Ａｕｇ．１９９６，ｐ．５６８９－５６９４；Ｌｏｋｈａｎｄｗａｌａら，Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒ．２３５，１０－２０，２０１９およびＰＬｏＳ ＯＮＥ １２（５）：ｅ０１７７００７．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１７７００７，２０１７）にもかかわらず、単離されたＡＳＦＶ ＣＤ２ｖ抗原が本発明の目的のためにイムノアッセイにおいて有利に使用されうるという発明者らによる認識であった。
付随的ＬＡＶ ＣＤ２ｖ－マーカーワクチンでワクチン接種された動物から得られた試験サンプルは、野生型ＡＳＦＶ株に感染した動物から得られた試験サンプルから、必要な特異性および感度で血清学的に識別されうる（実施例１～３）。この観察は、獣医学界が長年待ち望んでいたＤＩＶＡ戦略でＡＳＦの流行と闘うことを初めて可能にするものである。
実施例はまた、ＣＤ２ｖ抗原に基づく抗体ＥＬＩＳＡにおいては、抗ＡＳＦＶ抗血清における成分とイムノアッセイにおけるＡＳＦＶ ＣＤ２ｖ抗原との非特異的結合が生じた結果として、回復期ＡＳＦＶブタ抗血清がＡＳＦＶ陰性対照ブタ血清サンプルから確実には識別され得なかったことを示している。サンプル希釈剤での回復期ブタ血清サンプルの処理は以下のことを示した：（ｉ）ＡＳＦＶのＣＤ２ｖタンパク質が、十分な特異性および感度でブタ試験サンプルにおける抗ＣＤ２ｖ抗体の存在または非存在を検出するための抗原としてイムノアッセイにおいて使用されうること、（ｉｉ）ＣＤ２ｖタンパク質（ＥＰ４０２Ｒ）をコードするＡＳＦＶ遺伝子が、ＤＩＶＡワクチンとして使用されうるＬＡＶ ＡＳＦＶ株を与える遺伝的修飾の適切な標的であること、（ｉｉｉ）野生型ＡＳＦＶにおけるＣＤ２ｖタンパク質が、ブタにおける検出可能な抗ＣＤ２ｖ抗体応答を誘導するのに十分な免疫原性を有すること、ならびに（ｉｖ）修飾ＬＡＶ ＡＳＦＶが、ＤＩＶＡを可能にする有利な診断プロトコールにおけるイムノアッセイにおいて併用されうること。
したがって、第１の態様においては、本発明は、固体支持体に結合した単離されたアフリカブタ熱ウイルス（ＡＳＦＶ）ＣＤ２ｖタンパク質またはその抗原性断片の、イムノアッセイにおける抗原としての使用であって、ＣＤ２ｖタンパク質またはその抗原性断片が、付随的ＡＳＦＶ弱毒化生ウイルスＣＤ２ｖ－マーカーワクチン（ＬＡＶ ＣＤ２ｖ－マーカーワクチン）でワクチン接種されたブタから得られた試験サンプルにおけるＡＳＦＶ抗体の存在（非存在を含む）を検出するために使用されることを特徴とする、前記使用を提供する。
ＡＳＦＶ ＣＤ２ｖタンパク質は、公知であり十分に確立されたＡＳＦＶタンパク質である（Ｂｏｒｃａら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９，４６３－４６８，１９９４；Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６７，５３１２－５３２０，１９９３）。それは、インビトロでＡＳＦＶ感染細胞の赤血球吸着表現型をもたらす、約１０５ｋＤａの相対分子量を有する糖タンパク質であり、ＡＳＦＶゲノム上のＥＰ４０２Ｒ遺伝子によってコードされている。このＡＳＦＶタンパク質は細胞Ｔリンパ球表面接着受容体ＣＤ２タンパク質のウイルスホモログ（ＣＤ２ｖ）である。配列データおよびハイドロパシー（疎水性親水性指標）プロファイルに基づけば、ＡＳＦＶ ＣＤ２ｖタンパク質は典型的な（ＣＤ２）クラスＩＩＩ膜貫通タンパク質に類似している。一般に、完全長ＡＳＦＶ ＣＤ２ｖタンパク質は以下の４つの異なる部分を含有する：（ｉ）タンパク質のＮ末端側の疎水性リーダー、（ｉｉ）多数の潜在的なＮ結合グリコシル化部位を含む親水性細胞外ドメイン、（ｉｉｉ）膜貫通ドメインとして機能するアミノ酸の疎水性伸長、および（ｉｖ）ヘキサペプチド（ＰＰＰＫＰＣ）の多数の典型的な不完全反復を含有するＣ末端親水性細胞質ドメイン（図１）。多数のＡＳＦＶ株のＥＰ４０２遺伝子およびＡＳＦＶ ＣＤ２ｖタンパク質に関する詳細な情報［ＡＳＦＶ遺伝子のゲノム位置、ヌクレオチド／アミノ酸配列情報（のアラインメント）、４つのＣＤ２ｖドメインの特定、および他のアノテーションを含む］が、図２、ならびに欧州連合アフリカブタ熱参照試験所（ＥＵＲＬ－ＡＳＦ）のような種々の公的な核酸配列およびタンパク質配列のデータベース［例えば、ＮＣＢＩゲノムデータベース、ＵｎｉＰｒｏｔ、ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ、およびＣｅｎｔｒｏ ｄｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｃｉｏｎ ｅｎ ｓａｎｉｄａｄ ａｎｉｍａｌ（ＣＩＳＡ－ＩＮＩＡ）における欧州連合アフリカブタ熱参照試験所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｕｎｉｏｎ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ａｆｒｉｃａｎ Ｓｗｉｎｅ Ｆｅｖｅｒ）（ＥＵＲＬ－ＡＳＦ）（ｈｔｔｐｓ：／／ａｓｆ－ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｌａｂ．ｉｎｆｏ／ａｓｆ／ｅｎ／ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｄａｔａ－ｂａｓｅ）］において見出されうる。ＺｈｕおよびＭｅｎｇ（Ｄａｔａｂａｓｅ，１－９，２０２０）において、該著者はＡＳＦＶデータベースの確立を報告しており、該データベースにおいては、集合的な公的なゲノムおよびプロテオームＡＳＦＶ情報が収集されており、利用可能となる。ＡＳＦＶｄｂは、ｈｔｔｐ：／／ａｓｆｖｄｂ．ｐｏｐｇｅｎｅｔｉｃｓ．ｎｅｔおよびｖｉｒｕＳＩＴＥゲノムブラウザ；ｈｔｔｐ：／／ｖｉｒｕｓｉｔｅ．ｏｒｇ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ，Ｓｔａｎｏ，Ｍ．，Ｂｅｋｅ，Ｇ．，Ｋｌｕｃａｒ，Ｌ．（２０１６）：ｖｉｒｕＳＩＴＥ － ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｄａｔａｂａｓｅ ｆｏｒ ｖｉｒａｌ ｇｅｎｏｍｉｃｓ．Ｄａｔａｂａｓｅ（Ｏｘｆｏｒｄ）．ｂａｗ１６２．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｄａｔａｂａｓｅ／ｂａｗ１６２において自由にアクセス可能である。
本発明で用いるＣＤ２ｖ ＡＳＦＶタンパク質およびそのポリペプチド断片の配列は、本明細書に開示されている特定の配列とは異なりうる。これは、前記の公的配列データベースおよび図２から入手可能な配列から明らかなとおり、ＡＳＦＶ株間の、存在する自然配列変異によるものである。本明細書に記載されている特定のＣＤ２ｖアミノ酸配列および特定の配列番号付けはＡＳＦＶ参照株ジョージア（Ｇｅｏｒｇｉａ）２００７／１に関するものであり、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＤ２０６８４２０（配列番号１）においても開示されている。その完全なゲノムヌクレオチド配列、およびジョージア２００７／１のゲノムによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＦＲ６８２４６８においても示されている。
特に、本明細書中で用いるＡＳＦＶ ＣＤ２ｖタンパク質は、重複（ＭＵＳＣＬＥアルゴリズム ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｍｕｓｃｌｅ／でのアライメント）の領域において、配列番号２（ＣＤ２「１６－２０４」）に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性、好ましくは、配列番号２に対して少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む細胞外ドメインを含むタンパク質として定義される。
本発明の文脈においては、前記のＡＳＦＶ ＣＤ２ｖタンパク質の抗原性断片も抗原として使用されうる。そのような抗原性断片はＣＤ２ｖタンパク質のトランケート化（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）形態を表し、野生型ＡＳＦＶに感染したブタから得られた試験サンプルにおける抗ＡＳＦＶ ＣＤ２ｖ抗体によって認識されうる１以上のエピトープを含むポリペプチドである。
好ましくは、抗原性断片は、ＣＤ２ｖタンパク質の細胞外ドメインまたは細胞外ドメインの抗原性断片を含むポリペプチドである。
ＡＳＦＶ ＣＤ２ｖタンパク質の細胞外ドメインは膜貫通ドメインのＮ末端側に位置する。
ＡＳＦＶ ＣＤ２ｖタンパク質の細胞外ドメインまたは膜貫通ドメインは、例えばＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７，１０５－１３２）ならびにＲｏｄｒｉｇｕｅｚら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７，５３１２－５３２０，１９９３）によって記載されているような当技術分野で公知の方法によって、その典型的なアミノ酸配列に基づいて特定されうる。あるいは、そのようなドメインは公知ＡＳＦＶ株の公的配列データベースに開示されており、または公的配列データベースから入手可能なＡＳＦＶ細胞外ドメインのアミノ酸配列の１以上とのアミノ酸配列アライメントによって特定されうる。例えば、Ｇｅｏｒｇｉａ ２００７／１ ＣＤ２ｖタンパク質の４つのドメインはおよそ以下のアミノ酸領域に伸長している：リーダー：ａａ（アミノ酸）１～１５；細胞外ドメイン：ａａ １６～２０４；膜貫通領域：ａａ ２０５～２２９；および細胞外ドメイン：ａａ ２３０～３６０（ここで、アミノ酸番号は参照アミノ酸配列配列番号１の番号付けに関して示されている）。
特に好ましい実施形態においては、ＡＳＦＶ ＣＤ２ｖタンパク質の細胞外ドメインは、重複の領域において、配列番号２に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性、好ましくは、配列番号２に対して少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
もう１つの好ましい実施形態においては、本発明における使用のための細胞外ドメインの抗原性断片は、重複の領域において、配列番号３（ＣＤ２「１３２－２０４」）に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性、好ましくは、配列番号３に対して少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
より好ましい実施形態においては、本発明における使用のための細胞外ドメインの抗原性断片は、重複の領域において、配列番号２３および２４から選択される配列に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性、より一層好ましくは、配列番号２３および２４から選択される配列に対して少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性、更により好ましくは、配列番号２３および２４から選択される配列に対して１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
最も好ましい実施形態においては、本発明における使用のための細胞外ドメインの抗原性断片は、重複の領域において、配列番号２５に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性、より一層好ましくは、配列番号２５に対して少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性、更により好ましくは、配列番号２５に対して１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
本発明の場合、配列番号３はＣＤ２「１３２－２０４」であり、配列番号２３はＣＤ２「１３２－１９４」であり、配列番号２４はＣＤ２「１４２－２０４」であり、配列番号２５はＣＤ２「１４２－１９４」である。
実施例において、（遺伝子型ＩＩ株の）細胞外ドメインのＣＤ２「１３２－２０４」断片がＥＬＩＳＡにおける抗原として使用された場合、遺伝子型Ｉ陽性試験サンプルもこの抗原と反応することが示されており、一方、完全な細胞外ポリペプチドＣＤ２「１６－２０４」は遺伝子型Ｉ陽性サンプルにおける抗体によっては認識されないことも示されている。したがって、ＣＤ２「１３２－２０４」断片は、ＬＡＶ株に付随する遺伝子型Ｉまたは遺伝子型ＩＩのいずれかによってワクチン接種されたブタからのサンプルと、無傷ＣＤ２ｖ遺伝子を含有する野生型ＡＳＦＶに感染したブタからのサンプルとを血清学的に識別するためのＤＩＶＡイムノアッセイにおいて、本発明に従い有利に使用されうる。
したがって、より一層好ましい実施形態においては、本明細書中で用いる細胞外ドメインの抗原性断片は、重複の領域において、配列番号３（ＣＤ２「１３２－２０４」）に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性、好ましくは、配列番号３に対して少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＡＳＦＶアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
更により一層好ましい実施形態においては、本明細書中で用いる細胞外ドメインの抗原性断片は、重複の領域において、配列番号２３および２４から選択される配列に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは、配列番号２３および２４から選択される配列に対して少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性、更により好ましくは、配列番号２３および２４から選択される配列に対して１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＡＳＦＶアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
最も好ましい実施形態においては、本明細書中で用いる細胞外ドメインの抗原性断片は、重複の領域において、配列番号２５に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性、より一層好ましくは、配列番号２５に対して少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性、更により好ましくは、配列番号２５に対して１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＡＳＦＶアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
あるいは、本明細書中で用いる細胞外ドメインの抗原性断片は、配列番号１に示されている断片１３２～１９４、１３２～２１４、１２２～１９４、１２２～２０４または１４２～２１４のいずれか、ならびに配列番号１に示されている断片１３２～１９４、１４２～２０４または１４２～１９４のいずれかに対して、重複の領域において、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＡＳＦＶアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
前記のＡＳＦＶ ＣＤ２ｖ抗原は、ＡＳＦウイルスに関して公知の任意の血清群、特に血清群４または８、好ましくは血清群８のものでありうる。
ＡＳＦＶ血清群のクラスター化は、同じグループに属する血清によるＡＳＦＶ赤血球吸着表現型の抑制の検査に基づく。現在、血清群１～８の存在が確定されている（Ｍａｌｏｇｏｌｏｖｋｉｎら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．９６，８６６－８７３，２０１５）。
更に、前記のＡＳＦＶ ＣＤ２ｖ抗原は、タンパク質発現の検出または抗原の精製を可能にするタグを含みうる。適切なタグには、Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ（Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ １７，３５３－３５８，２００６）に開示されているとおり、６×Ｈｉｓタグ、ｃ－Ｍｙｃドメイン：ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号４）、血球凝集素タグ：ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ（配列番号５）、マルトース結合タンパク質、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質、ＦＬＡＧタグペプチド、ビオチンアクセプターペプチド、ストレプトアビジン結合ペプチドまたはカルモジュリン結合ペプチドが含まれる。ＦＬＡＧタグまたはＨｉｓタグが好ましいタグである。
本明細書中で用いるＣＤ２ｖ抗原の製造には、細菌、酵母、真菌、昆虫および脊椎動物の細胞発現系を含む、一般的な及び商業的に利用可能な通常のペプチド合成法ならびに組換えＤＮＡ発現系および方法が使用されうる。原核生物および真核生物の発現系に関する詳細な指針は、とりわけ、例えば以下のような組換えＤＮＡ発現法に関する総説および教科書に記載されている：Ｔｒｅｐｅ，Ｋ．，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，７２，Ｎｕｍｂｅｒ ２（２００６），２１１－２２２；Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｎｏｖｅｌ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｎｄ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｇｅｌｌｉｓｓｅｎ，Ｇ編．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＲ，ＩＳＢＮ：３５２７３１０３６３ ｅｄｉｔｉｏｎ ２００５，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｃｈａｅｌ ＤｙｓｏｎおよびＹｖｅｓ Ｄｕｒｏｃｈｅｒ編，Ｓｃｉｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｌｔｄ，ＩＳＢＮ ９７８１９０４８４２４３９ ｅｄｉｔｉｏｎ ２００７。
有利には、ＣＤ２ｖ抗原は、バキュロウイルス昆虫細胞発現系を使用することによって製造されうる。この系を例示する科学論文、教科書および総説の例としては、Ｌｕｃｋｏｗら，１９８８，Ｂｉｏ－ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．６，ｐ．４７；Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ｂｙ Ｄａｖｉｄ Ｒ．Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｐｒｅｓｓ，１９９３，ＩＳＢＮ：０７１６７７０１７２；Ｔｈｅ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｇｕｉｄｅ，Ｋｉｎｇ ＆ Ｐｏｓｓｅｅ編，１９９２，ＩＳＢＮ：９４０１０５０４７３が挙げられ、総説としては、ｖａｎ Ｏｅｒｓら，２０１５，Ｊ．ｏｆ Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，９６，６－２３が挙げられる。大腸菌および昆虫細胞系におけるＡＳＦＶポリペプチドの発現および精製は、例えば、Ｌｏｋｈａｎｄｗａｌａら，ＰＬＯＳ ＯＮＥ，Ｍａｙ ２０１７、およびＫｏｌｌｎｂｅｒｇｅｒら（前掲）に記載されている。
本発明における使用のためのバキュロウイルスの効率的作製のための手段およびキットが商業的に入手可能であり、それらとしては、例えば、Ｂａｃ－ｔｏ－Ｂａｃ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ．，ＵＳＡ）；ＰｒｏＥａｓｙ（商標）（ＡＢ Ｖｅｃｔｏｒ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．，ＵＳＡ）；およびｆｌａｓｈＢＡＣ（商標）（Ｏｘｆｏｒｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）が挙げられる。
「マーカーワクチン」は獣医ワクチン学の分野におけるよく知られた概念である。マーカーワクチンは、野生型形態と比較して少なくとも１つのエピトープを欠く又は異なる形態のエピトープを有する点で対応野生型ポリペプチド免疫原とは免疫原性において異なる改変されたポリペプチド免疫原を含む、および／または発現する。典型的には、マーカーワクチンにおける、またはマーカーワクチンによって発現されるポリペプチド免疫原（をコードする遺伝子）は生化学的技術または組換えＤＮＡ技術によって改変されており、その結果、マーカーワクチンにおける改変免疫原における野生型部分に対する抗体応答の欠如を利用して、ワクチン接種に無関係な感染動物を血清学的に検出することが可能である。これは血清学的ＤＩＶＡを可能にするであろう。典型的には、改変免疫原は、存在しない免疫原であり、または野生型ポリペプチド免疫原の断片である。
本明細書中で用いる免疫原なる語は、生物の免疫系による特異的抗体応答を誘発する分子（例えば、タンパク質またはポリペプチド）の能力を指し、一方、抗原なる語は、生物の免疫系によって産生される抗体に特異的に結合する分子の能力を指す。
本明細書中で用いるエピトープは、この部分に特異的な抗体応答を誘発しうる、および／またはそのような応答によって産生される特異的抗体に結合しうる、タンパク質またはポリペプチド内の、典型的には５～１５アミノ酸の伸長である。
本明細書中で用いるＬＡＶ ＣＤ２ｖ－マーカーワクチンは、野生型ＡＳＦＶ株のＣＤ２ｖポリペプチド免疫原から血清学的に識別可能な改変ＣＤ２ｖポリペプチド免疫原を発現しうる弱毒化生複製性ＡＳＦＶマーカーワクチン株を含むワクチンである。
「付随的（ａｃｃｏｍｐａｎｙｉｎｇ）」ＬＡＶ ＣＤ２ｖ－マーカーワクチンは、前記のＣＤ２ｖ－マーカーワクチン株を含むワクチンを意味し、ここで、改変ＣＤ２ｖポリペプチド免疫原はイムノアッセイにおけるＣＤ２ｖポリペプチド抗原とアライメントされ、イムノアッセイにおけるＣＤ２ｖポリペプチド抗原とは異なるように設計され、その結果、該ＣＤ２ｖポリペプチド抗原は、ＣＤ２ｖポリペプチド免疫原の野生型部分に特異的な試験サンプル中の抗体を血清学的に検出しうるが、ＣＤ２ｖポリペプチド免疫原の改変部分に特異的な抗体を認識し得ない。
したがって、付随的ＬＡＶ ＣＤ２ｖ－マーカーワクチンは前記のＣＤ２ｖ－マーカーワクチン株を含み、該ワクチン株はブタにおいて有効な免疫応答を誘発して、野生型ＡＳＦＶに感染したブタの血清サンプルにおける抗体レパートリーに存在する抗体を欠くワクチン接種ブタの血清サンプルにおける抗体レパートリーを生成する。したがって、感染動物とワクチン接種動物または陰性動物との識別は、マーカーワクチンに欠けている１以上のＡＳＦＶ ＣＤ２ｖエピトープに特異的な抗体を検出するイムノアッセイに基づく。
特に、付随的ＬＡＶ ＣＤ２ｖ－マーカーワクチンは、トランケート化ＣＤ２ｖタンパク質を含む及び／若しくは発現しうる、またはＣＤ２ｖタンパク質を含まない及び／若しくは発現し得ないＡＳＦＶ ＣＤ２ｖ－マーカーワクチン株を含む。好ましくは、トランケート化ＣＤ２ｖタンパク質は、細胞外ドメインまたはその断片を欠くＣＤ２ｖタンパク質のポリペプチド断片である。
より好ましくは、トランケート化ＣＤ２ｖタンパク質は、細胞外ドメインの断片を欠くＣＤ２ｖタンパク質のポリペプチド断片である。
より一層好ましい実施形態においては、トランケート化ＣＤ２ｖタンパク質は、重複の領域において、配列番号３（ＣＤ２「１３２－２０４」）に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性、好ましくは、配列番号３に対して少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＣＤ２ｖタンパク質の細胞外ドメインの断片を欠くＣＤ２ｖタンパク質のポリペプチド断片である。
更により一層好ましい実施形態においては、トランケート化ＣＤ２ｖタンパク質は、重複の領域において、配列番号２３および２４から選択される配列に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性、より一層好ましくは、配列番号２３および２４から選択される配列に対して少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性、更により好ましくは、配列番号２３および２４から選択される配列に対して１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＣＤ２ｖタンパク質の細胞外ドメインの断片を欠くＣＤ２ｖタンパク質のポリペプチド断片である。
最も好ましい実施形態においては、トランケート化ＣＤ２ｖタンパク質は、重複の領域において、配列番号２５に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性、より一層好ましくは、配列番号２５に対して少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性、更により好ましくは、配列番号２５に対して１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＣＤ２ｖタンパク質の細胞外ドメインの断片を欠くＣＤ２ｖタンパク質のポリペプチド断片である。
更により好ましい実施形態においては、トランケート化ＣＤ２ｖタンパク質は、重複の領域において、配列番号３（ＣＤ２「１３２－２０４」）に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性、好ましくは、配列番号３に対して少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＡＳＦＶアミノ酸配列を含む、ＣＤ２ｖタンパク質の細胞外ドメインの断片を欠くＣＤ２ｖタンパク質のポリペプチド断片である。
更により一層好ましい実施形態においては、トランケート化ＣＤ２ｖタンパク質は、重複の領域において、配列番号２３および２４から選択される配列に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは、配列番号２３および２４から選択される配列に対して少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性、更により好ましくは、配列番号２３および２４から選択される配列に対して１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＡＳＦＶアミノ酸配列を含む、ＣＤ２ｖタンパク質の細胞外ドメインの断片を欠くＣＤ２ｖタンパク質のポリペプチド断片である。
最も好ましい実施形態においては、トランケート化ＣＤ２ｖタンパク質は、重複の領域において、配列番号２５に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは、配列番号２５に対して少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性、更により好ましくは、配列番号２５に対して１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＡＳＦＶアミノ酸配列を含む、ＣＤ２ｖタンパク質の細胞外ドメインの断片を欠くＣＤ２ｖタンパク質のポリペプチド断片である。
付随的ＬＡＶ ＣＤ２ｖ－マーカーワクチンでワクチン接種されたブタから得られた試験サンプルにおけるＡＳＦＶ抗体の存在（非存在を含む）を検出する前記のイムノアッセイにおけるＡＳＦＶ ＣＤ２ｖ抗原の使用の特定の実施形態においては、ＡＳＦＶ ＣＤ２ｖ抗原は、ＣＤ２ｖ－マーカーワクチン株の、またはＣＤ２ｖ－マーカーワクチン株によって発現される改変ＣＤ２ｖポリペプチド免疫原と共通のエピトープ、特に重複するアミノ酸配列を有さない。重複するアミノ酸配列を有さないは、イムノアッセイにおけるＡＳＦＶ ＣＤ２ｖ抗原と、ＬＡＶ ＣＤ２ｖ－マーカーワクチン株の又はＬＡＶ ＣＤ２ｖ－マーカーワクチン株によって発現される改変ＣＤ２ｖポリペプチド免疫原とが、ＣＤ２ｖタンパク質の、異なる領域に由来し、それらの末端において重複を示さないことを意味する。
より好ましくは、前記のとおり、イムノアッセイにおけるＡＳＦＶ ＣＤ２ｖ抗原と、付随的マーカーワクチンにおける改変ＣＤ２ｖポリペプチド免疫原とは、ＡＳＦＶ ＣＤ２ｖタンパク質の細胞外ドメインの、２つの異なる重複しない断片を表す。
適切な弱毒化生ＡＳＦＶ ＣＤ２ｖ－マーカーワクチン株は当技術分野で公知であり、または例えばＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓもしくは相同組換えのような標準的な方法を用いる組換えＤＮＡ技術によって製造可能であり、または野外から分離されうる。
最近、ＡＳＦＶ株を遺伝的に修飾することによるＡＳＦＶ ＬＡＶ株の（合理的）設計を開示する種々の研究活動の結果が公開された（前掲のＡＳＦＶの総説およびそこに引用されている参考文献を参照されたい）。これらの先行技術文献は、弱毒化された有効なＡＳＦＶワクチン株を得るために突然変異されうる種々のＡＳＦＶ遺伝子を開示している。
先行技術はまた、改変ＣＤ２ｖタンパク質を含む又は発現する種々のＡＳＦＶ突然変異株の作製を開示している：Ｇａｌｌａｒｄｏら（Ｔｒａｎｓｂｏｕｎｄ．Ｅｍｅｒｇ．Ｄｉｓ．６６，１３９９－１４０４，２０１９）およびＢａｒａｓｏｎａら（Ｆｒｏｎｔ．Ｖｅｔ．Ｓｃｉ．６；１３７，２０１９）。ＡＳＦＶ株Ｌｖ１７／ＷＢ／Ｒｉｅ１（ＷＯ ２０２０／０４９１９４）が家畜ブタおよび野生イノシシの免疫化の後のその安全性および有効性プロファイルに関して試験されている。Ｌｖ１７／ＷＢ／Ｒｉｅ１は、トランケート化ＣＤ２ｖタンパク質（突然変異ＥＰ４０２Ｒ遺伝子によってコードされる）を有する、およびインビトロで非赤血液吸着表現型を有する自然弱毒化株である。もう１つの天然に存在する非病原性ＡＳＦＶ分離体ＯＵＲＴ８８／３は、ＣＤ２ｖの細胞質ドメインをコードする配列にフレームシフト突然変異を含み、その結果、最後の２１５個のアミノ酸が翻訳されない。Ｂｏｒｃａら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２，２８８１－２８８９，１９９８およびＳｃｉ Ｒｅｐ．２０２０，１０：４９４）およびＭｏｎｔｅａｇｕｄｏら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．９１，２０１７，９１（２１）：ｅ０１０５８－１７）は、それぞれ、ＡＳＦＶ株Ｍａｌａｗｉ（マラウイ）、Ｇｅｏｒｇｉａ（ジョージア）２００７／１およびＢＡ７１に基づく、組換えＤＮＡ技術によるＣＤ２ｖ欠失突然変異体の作製を開示している。Ｃｈｅｎら（Ｓｃｉ Ｃｈｉｎａ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ，６３，２０２０）は、ブタにおける弱毒化生ウイルスワクチンとして有効かつ安全である、７個の遺伝子が欠失したＡＳＦＶ株（ＨＬＪ／１８）の作製を開示している。欠失のなかでもとりわけ、ＣＤ２ｖタンパク質をコードする遺伝子もＨＬＪ／１８においては欠失している。
本発明において使用されるＡＳＦＶ ＣＤ２ｖ抗原およびＡＳＦＶ ＣＤ２ｖ－マーカーワクチン株は例えば以下の株の１つのような任意のＡＳＦＶ遺伝子型または任意のＡＳＦＶ株に由来しうる：Ｇｅｏｒｇｉａ ２００７／１、Ｂｅｎｉｎ（ベニン）９７／１、Ｋｅｎｙａｎ（ケニア）およびＭａｌａｗｉ。好ましいＡＳＦＶ遺伝子型はＩまたはＩＩである。ＡＳＦＶの遺伝子型決定は、ＡＳＦＶ主要カプシドタンパク質に相当するｐ７２タンパク質（Ｂ６４６Ｌ遺伝子によってコードされる）のＣ末端の部分配列決定によってＡＳＦＶゲノムを遺伝的に特徴付けることに基づく。この方法は現在までに２４個の異なる遺伝子型を決定している（Ｂａｓｔｏｓら，Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．２００３ Ａｐｒ；１４８：６９３－７０６．２００３；Ｑｕｅｍｂｏら，Ｔｒａｎｓｂｏｕｎｄ．Ｅｍｅｒｇ．Ｄｉｓ．；６５，４２０－４３１，２０１８）。
好ましい実施形態においては、付随的ＬＡＶ ＣＤ２ｖ－マーカーワクチンは、ＷＯ ２０２０／０４９１９４に開示されているＡＳＦＶ株Ｌｖ１７／ＷＢ／Ｒｉｅ１に基づいており、ＡＳＦＶ ＣＤ２ｖ抗原は、重複の領域において、配列番号３（ＣＤ２「１３２－２０４」）に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性、好ましくは、配列番号３に対して少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＡＳＦＶアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
より好ましい実施形態においては、付随的ＬＡＶ ＣＤ２ｖ－マーカーワクチンは、ＷＯ ２０２０／０４９１９４に開示されているＡＳＦＶ株Ｌｖ１７／ＷＢ／Ｒｉｅ１に基づいており、ＡＳＦＶ ＣＤ２ｖ抗原は、重複の領域において、配列番号２３および２４から選択される配列に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性、より一層好ましくは、配列番号２３および２４から選択される配列に対して少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性、更により好ましくは、配列番号２３および２４から選択される配列に対して１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＡＳＦＶアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
最も好ましい実施形態においては、付随的ＬＡＶ ＣＤ２ｖ－マーカーワクチンは、ＷＯ ２０２０／０４９１９４に開示されているＡＳＦＶ株Ｌｖ１７／ＷＢ／Ｒｉｅ１に基づいており、ＡＳＦＶ ＣＤ２ｖ抗原は、重複の領域において、配列番号２５に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性、より一層好ましくは、配列番号２５に対して少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性、更により好ましくは、配列番号２５に対して１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＡＳＦＶアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
本発明において使用される付随的ＬＡＶ ＣＤ２ｖ－マーカーワクチンは、商業的に入手可能な弱毒化生ウイルスワクチンで一般的に使用される方法のような通常の方法によって製造されうる。簡潔に説明すると、感受性基質に前記の弱毒化生ＣＤ２ｖ－マーカーワクチン株を接種し、ウイルスが所望の力価まで複製するまでそれを増殖させ、その後、ＡＳＦＶ含有物質を回収する。次いで、必要に応じて精製されおよび／または濃縮された該回収物質を、薬学的に許容される担体または希釈剤と共に、免疫化特性を有する医薬製剤へと製剤化する。担体には、安定剤、保存剤およびバッファーが含まれる。適切な安定剤は、例えば、ＳＰＧＡ（スクロース、ホスファート、グルタマートおよびアルブミン）、炭水化物（例えば、ソルビトール、マンニトール、デンプン、スクロース、デキストラン、グルタマートまたはグルコース）、タンパク質（例えば、乾燥乳清、アルブミンまたはカゼイン）またはそれらの分解産物である。適切なバッファーは、例えば、ＰＢＳバッファー、ＴｒｉｓバッファーまたはＨＥＰＥＳバッファーである。適切な保存剤はチメロサール、メルチオラートおよびゲンタマイシンである。
ワクチンは、ＡＳＦ疾患に対してブタを防御するのに有効な量で、筋肉内、皮下、皮内、経口または鼻腔内の接種または注射によって投与されうる。この量は、動物の年齢および体重を考慮して、接種される動物に応じて変動しうる。
実施例においては、共に前記で定義されているＤＩＶＡ診断アッセイと付随的ＤＩＶＡ ＬＡＶ ＣＤ２ｖ－マーカーワクチンとの併用によって、成功したＡＳＦＶ ＤＩＶＡアプローチが初めて確立されたことが実証されている。本発明者らは、一方では、ＡＳＦＶ ＣＤ２ｖが野生型ＡＳＦＶにおける適切な免疫原に相当し、他方では、ＡＳＦＶ ＣＤ２ｖが、ＤＩＶＡを可能にする必要な特異性および感度でイムノアッセイにおいて使用されうる適切な抗原にも相当することを確認した。前記のＤＩＶＡ法は、感染の存在に関する血清学的監視の可能性を維持しながらワクチン接種を可能にし、それによって、容易に規模拡大可能な、動物におけるＡＳＦと闘うための強力かつ実用的な手段を初めて提供するものである。なぜなら、とりわけ、該方法は、高度な封じ込め施設においてそのような方法を実施することを要する生きた感染性ＡＳＦＶの使用を伴わないからである。
したがって、特定の実施形態においては、前記のＡＳＦＶ ＣＤ２ｖ抗原は、イムノアッセイがＤＩＶＡイムノアッセイであることを特徴とするイムノアッセイにおいて使用される。
一般に、感染動物とワクチン接種動物とを最終的に識別するためには、試験スコアが陽性または陰性として解釈される必要がある。実際には、それは、特定の閾値を上回る又は下回ることを意味する。これは、例えば実施例に記載されているとおり、試験サンプルと並行して試験される幾つかの参照サンプルを該方法に組み込むことによって簡便に行われうる。陽性および陰性の参照サンプルはブタにおいて調製可能であり、または幾つかの機関および世界中の（国内）参照試験所（例えば、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｕｎｉｏｎ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ ＡＳＦＶ，Ｃｅｎｔｒｏ ｄｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｃｉｏｎ ｅｎ ｓａｎｉｄａｄ ａｎｉｍａｌ（ＣＩＳＡ－ＩＮＩＡ），Ｍａｄｒｉｄ，Ｓｐａｉｎ）から入手可能である。
前記のイムノアッセイにおいて使用される固体支持体は、原則として、任意の固体支持体でありうる。ただし、それは、本発明による使用の性能を可能にするもの、特に、固体支持体への前記のＡＳＦＶ ＣＤ２ｖ抗原の結合を可能にするものでなければならない。それは種々のサイズ、形状または形態のものでありうる。結合は、通常の手段、例えば共有結合または非共有結合相互作用（すなわち、吸着またはコーティング）によって生じうる。あるいは、結合は、アビジンでコーティングされた固体支持体に結合したビオチン化ＣＤ２ｖ抗原を介して達成されうる。
特に、固体支持体はマイクロタイタープレート、バイアル、ビーズペーパー（ｂｅａｄ ｐａｐｅｒ）ストリップ、膜、ゲルまたは側方流動ストリップである。好ましくは、固体支持体はマイクロタイタープレートである。
もう１つの態様においては、本発明は、ＡＳＦＶ感染動物（陽性試験結果）とワクチン接種動物（陰性試験結果）とを識別するための方法を提供し、ここで、該方法はイムノアッセイであり、固体支持体に結合した前記の単離されたＡＳＦＶ ＣＤ２ｖタンパク質またはその抗原性断片が抗原として使用され、マーカーワクチンは付随的ＬＡＶ ＣＤ２ｖ－マーカーワクチンであり、該方法は、該抗原に結合するＡＳＦＶ ＣＤ２ｖ抗体の存在に関して、動物から得られた試験サンプルを試験する工程を含むことを特徴とする。
本発明のこの追加的な態様およびその実施形態においては、ここにおいて及びこの態様の種々の実施形態において言及される特定の用語の定義は、前記の第１の態様に関して記載されているものと同じである。
この態様の１つの実施形態においては、本発明は、抗原性断片が、ＣＤ２ｖタンパク質の細胞外ドメインまたは細胞外ドメインの抗原性断片を含むポリペプチドであり、より詳細には、細胞外ドメインの抗原性断片が、配列番号３（ＣＤ２「１３２－２０４」）に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、より一層詳細には、細胞外ドメインの抗原性断片が、重複の領域において、配列番号３（ＣＤ２「１３２－２０４」）に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＡＳＦＶアミノ酸配列を含む、前記方法を提供する。
この態様の好ましい実施形態においては、細胞外ドメインの抗原性断片は、重複の領域において、配列番号２３および２４から選択される配列に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性、より一層好ましくは、配列番号２３および２４から選択される配列に対して少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性、更により好ましくは、配列番号２３および２４から選択される配列に対して１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
この態様の最も好ましい実施形態においては、細胞外ドメインの抗原性断片は、重複の領域において、配列番号２５に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性、より一層好ましくは、配列番号２５に対して少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性、更により好ましくは、配列番号２５に対して１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
この態様のもう１つの実施形態においては、本発明は、付随的ＬＡＶ ＣＤ２ｖ－マーカーワクチンが、改変ＣＤ２ｖポリペプチド免疫原を含む及び／又は発現するＡＳＦＶ ＣＤ２ｖ－マーカーワクチン株を含み、より詳細には、改変ＣＤ２ｖポリペプチド免疫原がＣＤ２ｖタンパク質の細胞外ドメインまたはその断片を欠いており、あるいは、ＡＳＦＶ ＣＤ２ｖ抗原と改変ＣＤ２ｖポリペプチド免疫原とが、重複するアミノ酸配列を有さない（全て前記のとおりである）、前記方法を提供する。
前記の本発明の種々の態様において使用されるイムノアッセイの設計は、固体支持体に結合した抗原に基づく一般的に使用されるイムノアッセイに類似している。原則として、イムノアッセイは、抗体－抗原複合体の形成、およびそれに続く、そのような複合体の存在（非存在を含む）の後続試験に基づく。以下に挙げるようなハンドブックは、本明細書において使用されうる種々の診断アッセイおよびそれらの特定の特徴を記載している（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｓｈｉｓｔ，Ｓａｎｄｅｅｐ Ｋ．およびＬｕｏｎｇ，Ｊｏｈｎ Ｈ．Ｔ．，２０１８；ならびにＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｔｒｅｎｄｓ，Ｒ．Ｏ’Ｋｅｎｎｅｄｙ，Ｃ．Ｍｕｒｐｈｙ ２０１７）。
本発明において使用されるＡＳＦＶイムノアッセイのための準備、プロトコール、標準操作手順、試薬などに関する詳細な情報も、例えば、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｕｎｉｏｎ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ ＡＳＦＶ（前掲）、ＦＡＯ（Ｂｅｌｔｒａｎ－Ａｌｃｒｕｄｏら，２０１７，Ａｆｒｉｃａｎ ｓｗｉｎｅ ｆｅｖｅｒ：ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ － Ａ ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ｖｅｔｅｒｉｎａｒｉａｎｓ．ＦＡＯ Ａｎｉｍａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｍａｎｕａｌ Ｎｏ．１９，Ｒｏｍｅ）およびＧａｌｌａｒｄｏら，Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２７１，１９７６７６，２０１９に開示されている。
本発明による方法のより詳細な実施形態においては、該方法は、
１．アッセイ混合物中で試験サンプルを抗原と共にインキュベートする工程、
２．アッセイ混合物中でＡＳＦＶ ＣＤ２ｖ抗体－抗原複合体の形成を可能にする工程、および
３．アッセイ混合物中の抗体－抗原複合体の存在を検出する工程
を含む。
この実施形態においては、抗体－抗原複合体の存在の検出は、標識に結合した検出用抗体の使用を含みうる。特に、それは、該複合体を抗体標識コンジュゲートと接触させることを含みうる。
標識の性質は重要ではなく、イムノアッセイにおいて常套的に使用される任意の標識でありうる。標識は、検出可能なシグナルを与える、または検出可能なシグナルを誘発しうる実体である。
特に、標識は酵素、発蛍光団、発色団、放射性同位体、酵素基質、化学発光分子または金コロイドである。
好ましくは、標識は、特にビオチン／アビジン結合によって、検出用抗体に直接的または間接的に結合されうる酵素である。
典型的には、本明細書中で用いる酵素はホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）であり、酵素基質はＴＭＢ（３，３’，５．５’テトラメチルベンジジン）である。
前記の本発明の特に好ましい実施形態においては、イムノアッセイはＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）である。ＥＬＩＳＡの利点には、その実用性、信頼性、迅速性、および規模拡大（スケールアップ）の容易さが含まれる。ＥＬＩＳＡは当技術分野でよく知られており、形態およびプロトコルにおいて種々のタイプのものが本明細書において適用されうる。
前記のイムノアッセイは直接的または間接的な抗原抗体反応に基づきうる。直接的アッセイは抗原へのサンプル抗体の１工程の結合を含む。間接的アッセイは、一次（サンプル）抗体と、一次抗体に結合しうる標識化二次（検出用）抗体との使用を含む２工程の結合プロセスを含む。イムノアッセイは競合イムノアッセイであることも可能であり、この場合、サンプル中の抗体が、抗原に結合しうる標識化二次抗体と、限られた数の抗原結合部位に関して競合する。
前記の本発明による好ましい方法においては、
１．アッセイ混合物中で試験サンプルを固体支持体結合抗原と共にインキュベートする工程、
２．抗ＡＳＦＶ ＣＤ２ｖ抗体を認識しうる標識化抗体をアッセイ混合物に加える工程、
３．アッセイ混合物に酵素基質を加えて、検出可能なシグナルを生成させる工程、および
４．シグナルを測定する工程
を含む間接的ＥＬＩＳＡが使用される。
発色させるために発色基質をアッセイ混合物に加えると、高い抗体濃度を有するサンプルは、より低い抗体濃度を含むものより高いシグナルを生成する。
前記の本発明によるもう１つの好ましい方法においては、
１．試験サンプル、および抗原に結合しうる抗体を、固体支持体結合抗原と共にアッセイ混合物中でインキュベートする工程、
２．アッセイ混合物に酵素基質を加えて、検出可能なシグナルを生成させる工程、および
３．シグナルを測定する工程
を含む競合的ＥＬＩＳＡが使用される。
発色させるために発色基質をアッセイ混合物に加えると、高い抗体濃度を有するサンプルは、低い抗体濃度を含むサンプルより低いシグナルを生成して、サンプル中の抗体濃度とアッセイにおける発色との間に逆相関が生じる。
ＥＬＩＳＡの結果は、読み取りに使用される技術的装置の特性および設定に応じて、通常、任意の吸光度単位、典型的には、０．１～２．５の光学濃度（ＯＤ）単位で表される。通常、適切な陽性対照サンプルおよび陰性対照サンプルが含まれ、ほとんどの場合、サンプルは複数回、試験される。標準化は、定められた参照サンプル（の希釈範囲）を含めることによって達成され、これは、陽性または陰性を決定するための予め設定された閾値に或るスコアを照合することをも可能にし、生物学的意義に対する相関、例えば、野生型ウイルスに感染している動物と、マーカーワクチンでワクチン接種された動物との識別を可能にする。
特に好ましいＥＬＩＳＡは実施例に示されている。
本発明によるもう１つの方法においては、イムノアッセイは側方流動（イムノクロマトグラフィー）アッセイである。側方流動イムノアッセイは当技術分野で一般的に使用されている。原理的には、側方流動イムノアッセイは、前記のＥＬＩＳＡと同じ原理で機能する。本発明において使用される側方流動イムノアッセイにおいては、前記の抗原は、毛管活性の結果として流体を輸送する能力を有する固体支持体、例えば多孔紙または（ニトロセルロース）膜、微細構造ポリマーまたは焼結ポリマーに、試験線（ｔｅｓｔ ｌｉｎｅ）として結合しうる。本質的には、固体支持体は、検出される抗体を含有する試験サンプルのサンプル液を、支持体の表面に沿った吸収ゾーンから移動させる。次いで抗体－抗原複合体が試験線において形成され、抗原が固体支持体に結合している固体支持体の検出ゾーンにおいて検出されうる。
したがって、本発明の方法の特定の実施形態においては、本明細書中で用いるイムノアッセイは側方流動イムノアッセイである。
より詳細には、側方流動イムノアッセイは、
１．吸収ゾーンにおいて試験サンプルを固体支持体と共にインキュベートする工程、
２．抗体－抗体／標識複合体の形成を可能にする工程、
３．固体支持体を介して該複合体の側方移動を可能にする工程、
４．試験線において固体支持体に結合した抗原によって複合体を捕捉し、それによって、抗体－抗原－抗体／標識複合体の形成を可能にする工程、および
５．検出ゾーンにおいてアッセイ混合物中の複合体の存在を検出する工程
を含む。
側方流動イムノアッセイにおいて使用される標識は、ＬＦイムノアッセイにおいて通常使用される任意の標識であることが可能であり、特に、着色粒子、例えばラテックス粒子、ナノメートルサイズの粒子または金粒子、蛍光標識、磁気標識または無線周波数識別（ＲＦＩＤ）粒子でありうる。
本明細書中で用いるＬＦイムノアッセイは競合アッセイまたはサンドイッチアッセイのいずれかとして機能しうる。
本発明者らは、当初、ＡＳＦＶ ＣＤ２ｖ抗体陽性血清検査サンプルをＥＬＩＳＡにおいてＣＤ２ｖ抗原と共にインキュベートしたところ、シグナル対ノイズ比が最適以下であり、その結果、ＥＬＩＳＡの特異性が負の影響を受け、信頼しうるＤＩＶＡイムノアッセイをこれからは得ることができないことを観察した。その後、この制限は、特異的な抗原－抗体相互作用に無関係な短期的な分子間相互作用によるものであることが判明した。実施例は、これらの非特異的分子間相互作用を制限する、イムノアッセイにおける（ブタ抗血清の）希釈工程を組み込むことによって、この負の影響が克服されうることを実証している。この工程で使用されうるサンプル希釈剤はストリンジェンシーの増加を示す。
サンプル希釈剤のストリンジェンシーなる語は、特に実施例に記載されているとおりに、ＥＬＩＳＡにおいて測定される、希釈された陽性血清対照サンプルの吸収値（ＯＤ単位）／希釈された陰性血清対照サンプルの吸収値（ＯＤ単位）の比（Ｐ／Ｎ比）を表す数値として、本明細書においては定義される。
したがって、本発明の有利な方法においては、特異的な抗原－抗体相互作用に、望ましくないレベルまで影響を及ぼすことなく、望ましくない非特異的相互作用を制限するのに十分な最適ストリンジェンシーのサンプル希釈剤でブタ試験サンプルを希釈する。
本発明において使用されるサンプル希釈剤は、ＥＬＩＳＡにおいて測定された場合に、５以上、好ましくは１０以上のストリンジェンシーＰ／Ｎ比を有しうる。
実施例は、サンプル希釈工程を組み込みこむことと、サンプル希釈剤のストリンジェンシーを増加させることとが共に、前記のＣＤ２ｖ抗原に基づくイムノアッセイが高信頼性ＤＩＶＡイムノアッセイとなることを可能にすること、およびどのようにしてそれを可能にするのかの更なる指針を実証し、提供する。サンプル希釈工程は、Ｅｌｉｓａにおける抗ブタＡＳＦＶ抗血清とＣＤ２ｖ抗原との間の非特異的相互作用を低減し、したがって、Ｐ／Ｎ比を増加させる。そして該サンプル希釈工程は、ストリンジェンシーが増加した適切なサンプル希釈剤を使用することによって、同時に、陽性対照サンプルに関するＥｌｉｓａ（ＯＤ）シグナルが適切なレベルに維持されるように、当業者によって設計されうる。
本発明の方法において有利に使用されうるサンプル希釈剤は、界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ（商標）２０またはＴｗｅｅｎ８０、トリトン、デオキシコール酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、アミノキシドまたはＣＨＡＰ界面活性剤が添加された通常のバッファー、例えばＰＢＳまたはＴＲＩＳバッファーを含みうる。
本発明による識別方法の好ましい実施形態においては、あるいは本発明による決定方法の好ましい実施形態においては、サンプル希釈剤は、Ｔｗｅｅｎ（商標）２０、Ｔｗｅｅｎ８０およびアミノキシドから選択される界面活性剤の１以上を含む。好ましくは、アミノキシドは、コカミドプロピルアミンオキシドとしても公知であるアミノキシドＷＳ３５である。より好ましくは、アミノキシドＷＳ３５は、ＣＡＳ番号５３９８８－６０－６を有する化合物である。
好ましい実施形態においては、界面活性剤はサンプル希釈剤中に１～５％ ｗ／ｖ、より好ましくは２～４％ ｗ／ｖ、更には３％ ｗ／ｖで含まれる。
したがって、本発明の好ましい実施形態においては、本発明による方法は、５以上、好ましくは１０以上のＰ／Ｎ比をもたらすストリンジェンシーを有するサンプル希釈剤で試験サンプルを希釈する工程を含む。
有利なＰ／Ｎ比は、ブタ試験サンプルをサンプル希釈剤で１：１００～１：２７００の比、好ましくは１：１００～１：９００の比、より好ましくは１：１００～１：３００、より詳細には１：３００の比で希釈することによっても得られうる。
本発明による更に好ましい方法においては、ブタ試験サンプルを、５以上、好ましくは１０以上のＰ／Ｎ比をもたらすストリンジェンシーを有するサンプル希釈剤で、１：１００～１：２７００の比、好ましくは１：１００～１：９００の比、より好ましくは１：１００～１：３００、より詳細には１：３００の比の希釈度で希釈する。
本発明による識別方法の好ましい実施形態においては、あるいは本発明による決定方法の好ましい実施形態においては、サンプル希釈剤は０．０１～１Ｍ、より好ましくは０．０５～０．５Ｍ、より一層好ましくは０．１Ｍの塩を含む。好ましい実施形態においては、塩は塩化マグネシウムである。
最も好ましい実施形態においては、サンプル希釈剤はＴｗｅｅｎ、アミノキシドおよび塩化マグネシウムを含む。
前記の本発明の種々の態様は、ＡＳＦＶに感染しやすいブタに由来するサンプルを試験することによって有利に適用されうる。特に、ブタはイノシシ（Ｓｕｉｄａｅ）科のブタ動物、好ましくは、イノシシ（Ｓｕｓ）属のブタ動物、例えばブタまたは野生イノシシである。好ましくは、ブタは家畜ブタである。
したがって、本発明の種々の態様の好ましい実施形態においては、試験サンプルは家畜ブタに由来する。
本発明の種々の態様における使用のための試験サンプルは、原則として、抗ＡＳＦＶ ＣＤ２ｖ抗体を含む可能性があるブタからの任意のタイプのサンプル、例えば血漿サンプルまたは血清サンプルでありうる。好ましくは、サンプルは血清サンプルである。
本発明のもう１つの態様は、前記の付随的ＬＡＶ ＣＤ２ｖ－マーカーワクチンでワクチン接種されたブタから得られた試験サンプルにおけるＡＳＦＶ ＣＤ２ｖ抗体の存在を検出するための方法における使用のための装置であって、前記の固体支持体に結合した単離されたＡＳＦＶ ＣＤ２ｖ抗原を含む装置である。
本発明のもう１つの態様は、前記の装置を含む診断用キットである。
本発明による診断用キットは、本発明による方法において適用される追加的成分を含む単一のパッケージング単位を含みうる。
特に、診断用キットは、
・サンプル希釈剤、
・抗体－標識コンジュゲート、
・陽性対照サンプル、および／または
・陰性対照サンプル
を含む１以上の容器を更に含む。
より詳細な実施形態においては、前記の診断用キットは、前記の付随的ＬＡＶ ＣＤ２ｖ－マーカーワクチンでワクチン接種されたブタから得られた試験サンプルに関するキットの使用説明をも含む。
特に、使用説明は、診断用キットがＤＩＶＡに使用されうること、およびＡＳＦＶ感染ブタからの試験サンプルはその試験において陽性となり、これとは対照的に、ワクチン接種された未感染ブタからの試験サンプルは陰性となることを記載している。
実施例
実施例１ － ＡＳＦＶ ＣＤ２ｖに基づくＥＬＩＳＡ
ブタ血清中の抗ＣＤ２ｖ抗体がＥＬＩＳＡによって検出されうるかどうかを検証するために、ＣＤ２「１６－２０４」と称されるＡＳＦＶ ＣＤ２ｖタンパク質の断片を使用してＥＬＩＳＡを行った。ＣＤ２「１６－２０４」は細胞外ドメインに伸長し、完全長ＣＤ２ｖタンパク質のリーダー配列、膜貫通ドメインおよびプロリンに富む細胞内部分を欠いている（図１）。それはそのＮ末端にＧＰ６４シグナルペプチド：ＭＶＳＡＩＶＬＹＶＬＬＡＡＡＡＨＳＡＦＡ（配列番号６）を含有し、そのＣ末端に６×Ｈｉｓタグを含有する。それはバキュロウイルス発現およびそれに続くＧｅｎＳｃｒｉｐｔによる精製によって製造された。
血清サンプルを欧州連合アフリカブタ熱参照試験所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｕｎｉｏｎ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ａｆｒｉｃａｎ Ｓｗｉｎｅ Ｆｅｖｅｒ）（ＣＩＳＡ－ＩＮＩＡ，Ｓｐａｉｎ）から入手した。
ＥＬＩＳＡのために、９６ウェルマイクロタイタープレートを、１μｇ／ｍｌの濃度でＣＤ２ｖ断片を含有する溶液で２～８℃で一晩コーティングした。プレートを洗浄バッファー（０．０４Ｍ ＰＢＳ＋０．１５％ Ｔｗｅｅｎ２０）で４回洗浄した後、カゼインで３７℃で１時間ブロッキングした。プレートを４回洗浄した後、ＥＩＡバッファー（０．２Ｍ ＰＢＳ＋０．１％ ＢＳＡ）中の血清サンプルの３倍系列希釈物を各列のウェルＡ～ウェルＧにおいて調製した（ウェルＨはＥＩＡバッファーのみを含有し、対照として使用した）。血清サンプルをＥＩＡバッファー中で１：１００に予め希釈した。血清希釈物を含有するプレートを３７℃で１時間インキュベートし、ついで洗浄バッファーで４回洗浄した。各ウェルに、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ブタＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体を含有する溶液を加え、プレートを３７℃で１時間インキュベートし、次いでそれらを洗浄バッファーで４回洗浄した。次いで３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質溶液を各ウェルに加え、少なくとも１０分間インキュベートした。着色反応を、４Ｎ Ｈ２ＳＯ４を加えることによって停止させた。光学濃度をマイクロタイタープレートリーダーで４５０ｎｍで測定し、データを分析した。
結果を図３に示す。遺伝子型ＩＩ ＡＳＦＶ，血清型８株（Ｓ１、Ｓ２およびＳ３－ＡＳＦＶ株Ｌｖ１７／ＷＢ／Ｒｉｅ１；ＷＯ ２０２０／０４９１９４）に感染したブタの血清は、１：９００の血清希釈度で、陰性血清Ｃ－６７を上回る明らかな陽性シグナルを示した。遺伝子型Ｉ ＡＳＦＶ株に２回感染し、次いで遺伝子型ＩＩ株にも感染したブタから得られた血清サンプルＣ＋１１３は、１００％に設定された明らかな陽性シグナルを示した。遺伝子型Ｉ，血清型４ ＡＳＦＶ株（Ｓ１３、Ｓ１５、Ｓ１９、Ｓ２１）に感染したブタからの血清は陰性血清対照から識別できなかった。したがって、結果は、ＣＤ２ｖが免疫原性であること、および遺伝子型ＩＩ ＡＳＦＶ株によって誘導される抗ＣＤ２ｖ抗体を測定するために、ＣＤ２「１６－２０４」断片に基づくＥＬＩＳＡが使用可能であることを示している。
実施例２ － 遺伝子型ＩおよびＩＩ ＡＳＦＶ株の検出のためのＣＤ２ｖに基づくＥＬＩＳＡ
ＣＤ２「１６－２０４」細胞外ＣＤ２ｖ断片のトランケート化形態を設計した。この断片、すなわち、ＣＤ２「１３２－２０４」は、ＣＤ２ｖタンパク質のＮ末端の１３１アミノ酸を欠いている（図１）。それは、そのＣ末端に、５×ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ（配列番号７）リンカー、およびそれに続くＦｌａｇタグを含有し、バキュロウイルス発現およびそれに続くＧｅｎＳｃｒｉｐｔによる精製によって製造された。
実施例１に記載されているとおりにＥＬＩＳＡを行った。
結果を図４に示す。遺伝子型ＩＩ ＡＳＦＶ株（Ｓ１およびＳ２）または遺伝子型Ｉ ＡＳＦＶ株（Ｓ１３、Ｓ１５、Ｓ１９、Ｓ２１）に感染したブタからの血清は全て、１：３００の血清希釈度において、陰性血清Ｃ－６７を上回る明らかな陽性シグナルを示した。血清サンプルＣ＋１１３も、１００％に設定された明らかな陽性シグナルを示した。したがって、ＣＤ２「１３２－２０４」断片に基づくＥＬＩＳＡは、遺伝子型Ｉ／血清型４または遺伝子型ＩＩ／血清型８ ＡＳＦＶ株によって誘導される抗ＣＤ２ｖ抗体を測定するために使用されうる。
実施例３ － ＤＩＶＡイムノアッセイとしてのＣＤ２ｖに基づくＥＬＩＳＡ
実施例２で使用したＣＤ２ｖ断片、すなわち、ＣＤ２「１３２－２０４」をこの実験においても使用した。実施例１に記載されているとおりにＥＬＩＳＡを行ったが、ＥＩＡバッファーの代わりに０．０４Ｍ ＰＢＳ＋０．０５％ ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ２０において血清を希釈した（１：３００）。ＣＤ２ｖ陽性血清サンプルＣ＋１１３、Ｓ１およびＳ２、ならびに陰性血清サンプルＣ－６７がＥＬＩＳＡに含まれた。血清サンプルＳ３も含まれており、これは、Ｌｖ１７／ＷＢ／Ｒｉｅ１ワクチン株（これはＣＤ２ｖの最初の１３１アミノ酸のみを発現する）で免疫化されたブタに由来する。結果を図５に示す。１：３００の血清希釈度でＣ＋１１３血清サンプルで得られたＯＤ４５０値を１００％に設定した。無傷ＥＰ４０２Ｒ遺伝子を含有する非ワクチン遺伝子型ＩＩ株（Ｃ＋１１３、Ｓ１およびＳ２）に感染したブタの血清は、陰性血清Ｃ－６７を遥かに上回る明らかな陽性シグナルを示した。しかし、Ｌｖ１７／ＷＢ／Ｒｉｅ１で免疫化されたブタに由来する血清サンプル（Ｓ３）は、陰性対照血清に類似したシグナルを生成した。これは、サンプルＳ３中に抗ＣＤ２ｖ抗体が存在するという実施例１でなされた観察とは対照的である。それは、サンプルＳ３中の抗ＣＤ２ｖ抗体が、ＣＤ２「１３２－２０４」と重複しないＣＤ２「１６－２０４」における部分に対するものであることによって説明されうる。したがって、該データは、ワクチン株Ｌｖ１７／ＷＢ／Ｒｉｅ１がＣＤ２「１３２－２０４」に対する抗体を誘導し得ないことを証明している。したがって、ＣＤ２「１３２－２０４」断片に基づくＥＬＩＳＡは、ＣＤ２「１３２－２０４」断片と反応する抗体をＡＳＦワクチンが誘導しない場合に、ＡＳＦＶ感染動物をＡＳＦＶワクチン接種動物から識別するために使用されうる。
実施例４ － サンプル希釈剤の影響
本実施例においては、シグナル対ノイズ比に対するサンプル希釈剤の影響を調べた。
Ａ
この実験においては、ＣＤ２ｖ断片ＣＤ２「１３２－２０４」を使用した。実施例１に記載されているとおりにＥＬＩＳＡを行ったが、ＥＩＡバッファー（０．０４Ｍ ＰＢＳ＋０．２Ｍ ＮａＣｌ＋０．１％ ｗ／ｖ ＢＳＡ）、ＥＩＡ／Ｔ（ＥＩＡ＋０．０５％ ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ）、ＰＢＳ／Ｔ（０．０４Ｍ ＰＢＳ＋０．１５Ｍ ＮａＣｌ＋０．０５％ ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ２０）、または３％ ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ２０、３％ ｖ／ｖ アミノキシドＷＳ３５および０．１Ｍ 塩化マグネシウムを含有しリン酸バッファーを含有しない低金属塩・高界面活性剤（ＬＳＨＤ）バッファーのいずれかで、血清を希釈した。ＣＤ２ｖ陽性血清サンプルＣ＋１１３および陰性血清サンプルＣ－６７ならびに血清サンプルＳ３（Ｌｖ１７／ＷＢ／Ｒｉｅ１ワクチン株に感染した動物に由来する）がＥＬＩＳＡに含まれた。信頼しうるＤＩＶＡイムノアッセイのためには、Ｓ３サンプルのＯＤ４５０値は陰性血清サンプルＣ－６７のものに類似しているべきである。
図６Ａは、界面活性剤を含有せず比較的高い塩濃度を有するバッファーであるＥＩＡがサンプル希釈曲線の劣悪な分離をもたらすことを示している。そしてＳ３のＯＤ４５０シグナルはＣ－６７のものを明らかに上回っており、このことは、ＥＩＡが、ＣＤ２に基づくＤＩＶＡ ＥＬＩＳＡのための適切なバッファーではないことを意味する。低濃度の界面活性剤を含有する低塩バッファーＰＢＳ／Ｔをサンプル希釈剤として使用することによって、アッセイが改善しうる（図６Ｂ）。サンプルＳ３の希釈曲線は陰性血清サンプルのものと重なっているが、Ｃ＋１１３のＯＤ４５０値はＥＩＡの場合よりも少し低い。Ｐ／Ｎ比は５．７である。陽性シグナルを陰性シグナルから更に分離するために、ＬＳＨＤバッファーを評価した（図６Ｃ）。サンプル希釈剤としてのＬＳＨＤは、それらの３つのバッファーのなかで最も最適なシグナル対ノイズ比（Ｐ／Ｎ比１０．３）を示し、アッセイにおいて陰性であるべきサンプルを、陽性シグナルを与えるべきサンプルから、明らかに分離することを可能にする。したがって、ＣＤ２「１３２－２０４」断片に基づくＥＬＩＳＡは、ＡＳＦＶ感染動物をＡＳＦＶワクチン接種動物から識別するために、低塩・高界面活性剤バッファーと組合せて使用されうる。
ＥＩＡ／Ｔサンプル希釈剤への尿素の添加は、主に陽性対照に関するシグナルの減少ゆえに、Ｐ／Ｎ比を減少させた。
Ｂ
この実験においては、ＣＤ２ｖ断片ＣＤ２「１６－２０４」を使用した。実施例１に記載されているとおりにＥＬＩＳＡを行った。サンプル希釈剤のストリンジェンシーは、界面活性剤および金属塩の含有量を増加させることによって変化した。使用した３つのサンプル希釈剤のストリンジェンシーは、それぞれ、２．９、５．７および９．９であった。表１は、５．７以上のストリンジェンシーを有するサンプル希釈剤のみが陰性対照サンプルのＯＤ値とワクチン試験サンプルのＯＤとの間の明らかな差異をもたらしたことを示している。
Figure 2024501941000003
 Ｃ
この実験においては、ＣＤ２ｖ断片ＣＤ２「１３２－２０４」を使用した。実施例１に記載されているとおりにＥＬＩＳＡを行った。実験Ｂの同じサンプル希釈剤およびＥＩＡサンプル希釈剤を使用した。血清サンプルを、表２に示されているとおりに希釈した。高ストリンジェンシーのサンプル希釈剤を使用して１／１００の希釈度の血清を試験したところ、Ｐ／Ｎ比は５．８となり、ワクチン接種動物からの血清（Ｓ３）は陰性対照と同程度に陰性であり、一方、ノイズ（０．４）は比較的高い。
このサンプル希釈剤を使用して１／３００の希釈度の血清を試験したところ、Ｐ／Ｎ比は１０．０となり、ワクチン接種動物からの血清（Ｓ３）は陰性対照と同程度に陰性であり、ノイズ（０．２未満）は低い。その他のサンプル希釈剤で得られたＰ／Ｎの結果は、全ての希釈度に関して、それほど満足しうるものではなかった（５未満）。
Figure 2024501941000004
 実施例５ － ＥＬＩＳＡにおいて使用されるＣＤ２ｖ断片サイズの更なる特徴付け
ＣＤ２「１３２－２０４」細胞外ＣＤ２ｖ断片の幾つかの短形態および長形態を設計した。これらの断片はＣＤ２ｖからのアミノ酸「１２２－２０４」、「１４２－２０４」、「１３２－１９４」、「１３２－２１４」または「１２２－１９４」を含有していた。また、これらの断片は、それらのＣ末端に、配列番号７のリンカー、およびそれに続くＦｌａｇタグを有していた。ペプチド断片は、実施例２に記載されているとおり、バキュロウイルス発現およびそれに続くＧｅｎＳｃｒｉｐｔによる精製によって製造された。実施例１に記載されているとおりにＥＬＩＳＡを行った。
結果を図７に示す。試験した全てのペプチドに関して、遺伝子型ＩＩ ＡＳＦＶ株（Ｓ１およびＳ２）または遺伝子型Ｉ ＡＳＦＶ株（Ｓ１３、Ｓ１５、Ｓ１９、Ｓ２１）に感染したブタからの血清は、１：３００の血清希釈度において、陰性血清Ｃ－６７のシグナルを上回る明らかな陽性シグナルを示した。血清サンプルＣ＋１１３も、１００％に設定された明らかな陽性シグナルを示した。これまでと同様に、遺伝子型ＩＩ株（Ｓ３）でワクチン接種された動物の血清はＥＬＩＳＡにおいて反応しなかった。
この分析から、ＣＤ２ｖペプチド断片１３２～１９４（配列番号２３）および１４２～２０４（配列番号２４）は共に、ＥＬＩＳＡにおいて陽性シグナルを示したことが明らかである。したがって、そのペプチド上の関連エピトープはＣＤ２ｖタンパク質のアミノ酸１４２と１９４との間に位置する、と確実に結論付けられる。したがって、ペプチド１４２－１９４（配列番号２５）は本発明のＡＳＦＶ ＤＩＶＡにおいて有効に使用されうる。
実施例６ － サンプル希釈剤の変動
本実施例は、本発明のためのＥＬＩＳＡのシグナル対ノイズ比に対するサンプル希釈剤の組成の変動の影響を試験した。
Ａ：サンプル希釈剤における界面活性剤濃度の影響
ＣＤ２ｖ断片ＣＤ２「１３２－２０４」を使用し、実施例１に記載されているとおりにＥＬＩＳＡを行った。ただし、この場合は、以下の種々の形態のサンプル希釈剤において試験血清を希釈した：０．０１Ｍ ＰＢＳ＋０．３３％ ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ２０；０．０１Ｍ ＰＢＳ＋３％ ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ２０；０．０１Ｍ ＰＢＳ＋０．３３％ ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ８０；０．０１Ｍ ＰＢＳ＋３％ ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ８０：０．０１Ｍ ＰＢＳ；またはＬＳＨＤバッファー。
ＣＤ２ｖ陽性血清サンプルＣ＋１１３および陰性血清サンプルＣ－６７、ならびに血清サンプルＳ３（Ｌｖ１７／ＷＢ／Ｒｉｅ１ワクチン株に感染した動物に由来する）がＥＬＩＳＡに含まれた。信頼しうるＤＩＶＡイムノアッセイのためには、Ｓ３サンプルのＯＤ４５０値は陰性対照血清のものに類似しているべきである。
種々のサンプル希釈剤に関するＥＬＩＳＡの結果を図８に示し、対応するＰ／Ｎスコアを表３に示す。
図８のパネルＡ～Ｅは、Ｔｗｅｅｎを含有するバッファー（パネル８Ａ～Ｄ）が、Ｔｗｅｅｎを含有せずＰＢＳのみを含有する希釈剤（パネル８Ｅ）よりも良好な、陽性サンプルと陰性サンプルとの分離をもたらしたことを示している。これは、サンプル希釈剤中のＴｗｅｅｎの存在が重要であることを示した。
表３に示されている対応するＰ／Ｎ比が示すところによると、ＬＳＨＤバッファー（パネル８Ｆ）が最良の結果をもたらし、０．０１Ｍ ＰＢＳ＋０．３３％ ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ２０を含有する希釈剤がそれに次ぐ良好な結果をもたらした。これは、どのサンプル希釈剤が５以上または１０以上のストリンジェンシーを有することを満たしているかをも示している。
Figure 2024501941000005
 Ｂ：サンプル希釈剤における塩濃度の影響
再び、ＣＤ２ｖ断片ＣＤ２「１３２－２０４」を使用した。実施例１に記載されているとおりにＥＬＩＳＡを行ったが、以下の種々のサンプル希釈剤で血清を希釈した：０．０１Ｍ ＰＢＳ＋３％ ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ２０＋０．１Ｍ ＭｇＣｌ２；０．０１Ｍ ＰＢＳ＋３％ ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ２０＋０．３３Ｍ ＭｇＣｌ２；０．０１Ｍ ＰＢＳ＋３％ ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ２０＋１Ｍ ＭｇＣｌ２；またはＬＳＨＤバッファー。ＣＤ２ｖ陽性血清サンプルＣ＋１１３および陰性血清サンプルＣ－６７、ならびに血清サンプルＳ３がＥＬＩＳＡに含まれた。
ＥＬＩＳＡの結果を図９に示し、対応するＰ／Ｎ比を表４に示す。
図９のパネルＡ～Ｃは、サンプル希釈剤における塩の最低濃度（すなわち、０．１Ｍ ＭｇＣｌ２）がサンプル曲線の最良の分離をもたらしたことを示している。換言すれば、塩濃度が増加すると、陽性サンプルと陰性サンプルとを識別する能力が低下する（パネル９ＢおよびＣ）。見たところ、より低い塩濃度は陽性サンプルのシグナル強度に有益な効果をもたらし、それが今度はＰ／Ｎ比に正の効果をもたらす（表４）。サンプル希釈剤としてのＬＳＨＤは、試験した３つの希釈剤のなかで最適なシグナル対ノイズ比をもたらした（図９Ｄ；表４）。注意：パネル９Ｄにおいては、希釈度１：２４３００におけるＣ＋１１３血清に関するデータ点は明らかに異常値であり、ほぼ間違いなく実験上の過誤であろう。
Figure 2024501941000006
 Ｃ：サンプル希釈剤におけるバッファーの影響
ＣＤ２ｖ断片ＣＤ２「１３２－２０４」を使用した。ＥＬＩＳＡを、実施例１に記載されているとおりに行い、それにより、以下のものを含有するサンプル希釈剤で血清を希釈した：０．０１Ｍ ＰＢＳ＋３％ ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ２０＋０．１Ｍ ＭｇＣｌ２；３％ ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ２０＋０．１Ｍ ＭｇＣｌ２；０．０１Ｍ ＰＢＳ＋３％ ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ２０；またはＬＳＨＤ希釈剤。ＣＤ２ｖ陽性血清サンプルＣ＋１１３および陰性血清サンプルＣ－６７、ならびにＬｖ１７／ＷＢ／Ｒｉｅ１ワクチン株で接種された動物に由来する血清サンプルＳ３がＥＬＩＳＡに含まれた。
ＥＬＩＳＡの結果を図１０に示し、対応するＰ／Ｎ比を表５に示す。
図１０は、試験した全てのバッファーがサンプル希釈曲線の明らかな分離をもたらしたことを示している。ＰＢＳを含有しない（３％ ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ２０＋０．１Ｍ ＭｇＣｌ２を含有する）サンプル希釈剤はＬＳＨＤとほぼ同等の性能を示した。パネル１０ＣおよびＤ、ならびに表５におけるＰ／Ｎ比を比較されたい。したがって、本発明のためのサンプル希釈剤においてはＰＢＳを使用しないこと、または少なくともリン酸バッファーを使用しないことが好ましい。
Figure 2024501941000007

Claims (22)

  1. 固体支持体に結合した単離されたアフリカブタ熱ウイルス（ＡＳＦＶ）ＣＤ２ｖタンパク質またはその抗原性断片の、イムノアッセイにおける抗原としての使用であって、ＣＤ２ｖタンパク質またはその抗原性断片が、付随的ＡＳＦＶ弱毒化生ウイルスＣＤ２ｖ－マーカーワクチン（ＬＡＶ ＣＤ２ｖ－マーカーワクチン）でワクチン接種されたブタから得られた試験サンプルにおけるＡＳＦＶ抗体の存在を検出するために使用されること、および該抗原が、ＣＤ２ｖタンパク質の細胞外ドメインまたは該細胞外ドメインの抗原性断片を含むポリペプチドであることを特徴とする、前記使用。
  2. 細胞外ドメインの抗原性断片が、配列番号２５に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする、請求項１記載の使用。
  3. 細胞外ドメインの抗原性断片が、配列番号２５に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＡＳＦＶアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする、請求項２記載の使用。
  4. 付随的ＬＡＶ ＣＤ２ｖ－マーカーワクチンが、改変ＣＤ２ｖタンパク質を発現しうるＡＳＦＶ ＣＤ２ｖ－マーカーワクチン株を含むことを特徴とする、請求項１～３のいずれか１項記載の使用。
  5. 改変ＣＤ２ｖタンパク質がＣＤ２ｖタンパク質の細胞外ドメインまたはその断片を欠いていることを特徴とする、請求項４記載の使用。
  6. 改変ＣＤ２ｖタンパク質が、配列番号２５に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む細胞外ドメインの断片を欠いていることを特徴とする、請求項５記載の使用。
  7. 細胞外ドメインの断片が、配列番号２５に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＡＳＦＶアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項６記載の使用。
  8. ＡＳＦＶ ＣＤ２ｖ抗原が改変ＣＤ２ｖタンパク質と共通のエピトープを有さないことを特徴とする、請求項４～７のいずれか１項記載の使用。
  9. ＡＳＦＶ ＣＤ２ｖ抗原と改変ＣＤ２ｖタンパク質とが、重複するアミノ酸配列を有さないことを特徴とする、請求項８記載の使用。
  10. イムノアッセイが、ワクチン接種動物と感染動物とを識別する（ＤＩＶＡ）イムノアッセイであることを特徴とする、請求項１～９のいずれか１項記載の使用。
  11. ＣＤ２ｖタンパク質またはその抗原性断片が、野生型ＡＳＦＶに感染したブタおよび／またはＡＳＦＶに感染していないブタから得られた試験サンプルにおけるＡＳＦＶ抗体の存在を検出するためにも使用されることを特徴とする、請求項１～１０のいずれか１項記載の使用。
  12. 固体支持体がマイクロタイタープレート、バイアル、ビーズペーパーストリップ、膜、ゲルまたは側方流動ストリップであることを特徴とする、請求項１～１１のいずれか１項記載の使用。
  13. ブタが野生型ＡＳＦＶに感染しているのか、またはマーカーワクチンでワクチン接種されているのかを決定するための方法であって、該方法が、固相支持体に結合した単離されたアフリカブタ熱ウイルス（ＡＳＦＶ）ＣＤ２ｖタンパク質またはその抗原性断片をイムノアッセイにおける抗原として使用するイムノアッセイであり、該方法が、該抗原に結合するＡＳＦＶ ＣＤ２ｖ抗体の存在に関して、ブタから得られた試験サンプルを検査する工程を含み、該抗原が、ＣＤ２ｖタンパク質の細胞外ドメインまたは該細胞外ドメインの抗原性断片を含むポリペプチドであることを特徴とする、前記方法。
  14. 該方法が、
    １．アッセイ混合物中で試験サンプルを抗原と共にインキュベートする工程、
    ２．アッセイ混合物中でＡＳＦＶ ＣＤ２ｖ抗体－抗原複合体の形成を可能にする工程、および
    ３．アッセイ混合物中の抗体－抗原複合体の存在を検出する工程
    を含むことを特徴とする、請求項１３記載の方法。
  15. 該方法が、抗体－抗原複合体の存在を、標識を含む抗体と該複合体を接触させることによって、検出することを含むことを特徴とする、請求項１３または１４記載の方法。
  16. イムノアッセイがＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）であることを特徴とする、請求項１３～１５のいずれか１項記載の方法。
  17. 試験サンプルを、少なくとも５のストリンジェンシーを有するサンプル希釈剤で希釈することを特徴とする、請求項１３～１６のいずれか１項記載の方法。
  18. サンプル希釈剤が少なくとも１０のストリンジェンシーを有することを特徴とする、請求項１７記載の方法。
  19. イムノアッセイが、「感染動物をワクチン接種動物から識別する」（ＤＩＶＡ）イムノアッセイであることを特徴とする、請求項１３～１８のいずれか１項記載の方法。
  20. ブタから得られた試験サンプルにおけるＡＳＦＶ ＣＤ２ｖ抗体の存在をＤＩＶＡイムノアッセイにおいて検出するための、前記請求項のいずれか１項記載の固体支持体に結合した単離されたＡＳＦＶ ＣＤ２ｖ抗原を含む装置の使用。
  21. 請求項２１記載の装置を含む、ブタから得られた試験サンプルにおけるＡＳＦＶ ＣＤ２ｖ抗体の存在をＤＩＶＡイムノアッセイにおいて検出するための方法におけるパーツキット（ｋｉｔ－ｏｆ－ｐａｒｔｓ）の使用。
  22. キットが、
    ・サンプル希釈剤、
    ・抗体－標識コンジュゲート、
    ・陽性対照サンプル、および／または
    ・陰性対照サンプル
    を含む１以上の容器を更に含むことを特徴とする、請求項２１記載のパーツキットの使用。
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