CN102183650A - 猪圆环病毒2型elisa抗体检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及猪圆环病毒2型(PCV2)ELISA抗体检测试剂盒，所述检测试剂盒包含有：预包被猪圆环病毒2型核衣壳蛋白(PCV2-Cap)单克隆抗体和猪圆环病毒2型核衣壳蛋白(PCV2-Cap)的酶标板、封闭液、样品稀释液、酶结合物、浓缩洗涤液、酶底物溶液和终止液，其中所述的核衣壳蛋白是纯化的形成病毒样颗粒的Cap蛋白。本发明试剂盒的特异性达100％；灵敏度为1∶800。本试剂盒用于对猪群PCV2抗体水平进行监测，确切了解猪体免疫水平或感染状况。

Description

猪圆环病毒2型ELISA抗体检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种检测试剂盒，具体涉及一种猪圆环病毒2型ELISA抗体检测试剂盒。

背景技术

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)是引发断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaningmultisystemic wasting syndrome，PMWS)的主要病原，该病主要以患畜生长缓慢、进行性消瘦和多系统病例损伤为特征。除了引发PMWS外，PCV2还与仔猪先天性震颤、猪皮炎肾炎综合征、猪呼吸道综合征(PDNS)、母猪繁殖障碍等疾病相关。自1996年在加拿大首次发现PMWS以来，PCV2感染引起的相关疾病已经在全世界广泛存在。随着我国养猪业受到PCV2感染的危害日益严峻，研制PCV2血清抗体检测试剂盒的临床需求迫切。PCV基因组由一条共价闭合环状单股DNA构成，包含两个大的开放阅读框架ORF1和ORF2，分别编码病毒蛋白复制酶(Rep)和病毒衣壳蛋白(Cap)。Cap蛋白是病毒的主要结构蛋白，含有4个抗原表位，具有较好的免疫原性和抗原性，是检测该病毒特异性抗体的理想靶抗原。由于该病毒在体外培养不产生细胞病变，病毒繁殖能力低，难于获得高产量的病毒抗原用于诊断目的。而昆虫杆状病毒表达系统以其表达外源蛋白产量高、免疫活性好、产物易纯化、反应背景低等优点，在多种动物疫病诊断中得到应用。检测PCV2的衣壳蛋白抗体可以反映PCV2的抗体水平，对猪群PCV2抗体水平进行监测，可确切了解猪体免疫水平或感染状况，制定最适免疫程序或淘汰选育，有效预防和控制PCV2的侵袭和传播，避免因此而引起的重大经济损失。

目前，国内外采用的PCV2检测技术主要有：病毒分离培养，间接免疫荧光，免疫酶单层实验(IMPA)，原位杂交(ISH)，聚合酶链式反应(PCR)等等。上述技术和方法虽然可以检测PCV2或抗体水平，在实践中也取得一定的效果。但均存在试验操作复杂，耗时长，需要特定的专业技能和仪器设备等，成品昂贵等缺点，不易在基层单位普及。中国专利公开号为CN1584597A的专利申请公开了一种猪圆环病毒2型抗原或抗体ELISA检测试剂盒。上述专利抗体检测试剂盒所用检测板包被的抗原为原核表达的蛋白，且二抗为羊抗猪多克隆抗体。本发明采用双单抗结合技术检测抗体，特异性更强，灵敏度更高。

发明内容

本发明的目的是提供一种猪圆环病毒2型(PCV2)ELISA抗体检测试剂盒，本发明采用单克隆抗体包被法间接包被基因工程抗原制备反应板，进而组成用间接酶联免疫吸附实验检测猪圆环病毒2型抗体的试剂盒，本试剂盒除了具有普通ELISA试剂盒的优点外，还弥补了由于抗原问题而导致的灵敏度低的缺点，从而提高检测的灵敏度和特异性。

本发明的技术方案为：

一种猪圆环病毒2型ELISA抗体检测试剂盒，所述检测试剂盒包含有：预包被猪圆环病毒2型核衣壳蛋白(PCV2-Cap)单克隆抗体和猪圆环病毒2型核衣壳蛋白(PCV2-Cap)的酶标板、封闭液、样品稀释液、阳性对照、阴性对照、酶结合物、浓缩洗涤液、酶底物溶液和终止液，酶标板预先包被PCV2-cap蛋白单克隆抗体，包被缓冲液0.05M pH9.6的碳酸盐缓冲液，1升溶液中含1.59g Na₂CO₃，2.93g NaHCO₃，包被量为每孔0.1-1ug；封闭液为质量浓度是1-10％的BSA或脱脂牛奶；封闭完再包被PCV2-cap蛋白，包被量为每孔0.1-1ug；样品稀释液为含有质量浓度0.1-10％牛血清白蛋白BSA和含有质量浓度0.01-0.05％NaN₃的0.01mol/L及pH7.2-7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)；酶结合物为辣根过氧化物酶-小鼠抗猪IgG酶结合物；浓缩洗涤液为含体积浓度0.05％吐温-20的0.01mol/L及pH7.2-7.4的PBS；酶底物A溶液为3，3’-5，5’-四甲基联苯胺溶液，酶底物B溶液为双氧水溶液；终止液为1mol/L H₂SO₄溶液，阳性对照、阴性对照放置在盒内。

辣根过氧化物酶标记的是小鼠抗猪IgG单克隆抗体。

上述各种溶液的配制：①样品稀释液：0.1-10％BSA，0.01-0.05％NaN₃的0.01mol/L，pH7.2-7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)；②洗涤液：在1000ml的0.01M PBS溶液中加0.5ml吐温-20(Tween-20)；③酶底物3，3’-5，5’-四甲基联苯胺(TMB)溶液：i)底物A液：称取TMB100mg加入10ml二甲基亚砜(DMSO)中，使之完全溶解后即得一百倍的TMB底物浓缩液；ii)底物B液：称取乙酸钠10g溶于1L纯化水，用乙酸调PH值为5.0，加入浓度为30％H₂O₂400ul即得；④终止液：取54.3ml浓度为95-98％浓硫酸加蒸馏水至1000ml即可。

所述重组PCV2-Cap蛋白的制备方法为：利用基因工程技术Bac-to-Bac系统构建表达PCV2-ORF2基因(Cap蛋白)的重组杆状病毒，根据PCV2的基因序列设计Cap特异性引物：上游引物1：5’-TCTGGATCCATGACGTATCCAAGGAGGCG-3’，下游引物1：5’-GCGAAGCTTTAAGGGTTAAGTGGGGGGTC-3’，上游引物2：5’-TCTCTCGAGATGACGTATCCAAGGAGGCG-3’下游引物2：5’-GCGGGTACCTAAGGGTTAAGTGGGGGGTC-3’，以PCR从PCV2基因组中扩增出ORF2基因全序列，将其亚克隆至杆状病毒穿梭载体pFastBac-Dual中，构建ORF2基因双拷贝的重组质粒pFastBac-Dual-ORF2(2×)，将该重组质粒转化大肠杆菌DH10Bac，获得重组bacmid，将重组bacmid转染Sf9细胞，获得重组杆状病毒rBac-ORF2(2×)。将该重组杆状病毒感染Sf9细胞，即可表达Cap蛋白，并且该蛋白可自我组装形成病毒样颗粒(VLPs)，收集Cap蛋白，通过超速离心和CsCl密度梯度离心，即可获得纯化的形成病毒样颗粒的Cap蛋白。

本发明还提供了猪圆环病毒2型ELISA抗体检测试剂盒的制备方法，其中所述抗原酶标板制备方法是先包被猪圆环病毒2型核衣壳蛋白(PCV2-Cap)单克隆抗体，再结合纯化的猪圆环病毒2型核衣壳蛋白(PCV2-Cap)。

附图说明

图1为本发明工艺流程图。

图2为本发明检测原理示意图。

图3为表达的PCV2-cap蛋白SDS-PAGE分析图。其中M是Marker，1是纯化的PCV2-cap蛋白。

具体实施方式

实施例一.猪圆环病毒2型ELISA抗体检测试剂盒的制备方法

1.获得PCV2-cap蛋白单克隆抗体：PCV2-cap蛋白单克隆抗体抗体可商购，也可通过本领域常规方法制备，制备已知抗原的抗体的方法是本领域公知的；本发明中使用的PCV2-cap蛋白单克隆抗体购自RuralTechnologies，Incorporated；

2.获得辣根过氧化物酶(HRP)-小鼠抗猪IgG酶结合物：小鼠抗猪IgG单克隆抗体可商购，也可通过本领域常规方法制备；本发明中使用的小鼠抗猪IgG单克隆抗体购自洛阳赛尔维实验器材公司；然后用改良的过碘酸钠氧化法进行标记；最后酶标记物加入1％牛血清白蛋白、1％酪蛋白和50％的中性甘油，测定工作浓度后，-20℃保存备用；

3.所述重组PCV2-Cap蛋白的制备方法为：利用基因工程技术Bac-to-Bac系统构建表达PCV2-ORF2基因(Cap蛋白)的重组杆状病毒，根据PCV2的基因序列设计Cap特异性引物：上游引物1：5’-TCTGGATCCATGACGTATCCAAGGAGGCG-3’，下游引物1：5’-GCGAAGCTTTAAGGGTTAAGTGGGGGGTC-3’，上游引物2：5’-TCTCTCGAGATGACGTATCCAAGGAGGCG-3’下游引物2：5’-GCGGGTACCTAAGGGTTAAGTGGGGGGTC-3’，以PCR从PCV2基因组中扩增出ORF2基因全序列，将其亚克隆至杆状病毒穿梭载体pFastBac-Dual中，构建ORF2基因双拷贝的重组质粒pFastBac-Dual-ORF2(2×)，将该重组质粒转化大肠杆菌DH10Bac，获得重组bacmid，将重组bacmid转染Sf9细胞，获得重组杆状病毒rBac-ORF2(2×)。将该重组杆状病毒感染Sf9细胞，即可表达Cap蛋白，并且该蛋白可自我组装形成病毒样颗粒，收集Cap蛋白，通过超速离心和CsCl密度梯度离心，即可获得纯化的形成病毒样颗粒的Cap蛋白作为包被用抗原。

4.将PCV2-cap单克隆抗体均匀的包被在酶标板孔上，包被缓冲液为0.05M pH9.6的碳酸盐缓冲液，即1升溶液中含1.59g Na₂CO₃，2.93gNaHCO₃，包被量为每孔0.1-1ug；封闭液为BSA或脱脂牛奶，浓度是1-10％；封闭完再包被的是PCV2-cap蛋白，包被量为每孔0.1-1ug；

5.试剂盒其他溶液配制：①样品稀释液：1％BSA，0.05％NaN₃的0.01mol/L，pH7.2的磷酸盐缓冲液(PBS)；②洗涤液：在1000ml的0.01M PBS溶液中加0.5ml吐温-20(Tween-20)；③酶底物3，3’-5，5’-四甲基联苯胺(TMB)溶液：i)底物A液：称取TMB100mg加入10ml二甲基亚砜(DMSO)中，使之完全溶解后即得一百倍的TMB底物浓缩液；ii)底物B液：称取乙酸钠10g溶于1L纯化水，用乙酸调PH值为5.0，加入浓度为30％H₂O₂400ul即得；④终止液：取54.3ml浓度为95％浓硫酸加蒸馏水至1000ml即可。

实施例二.猪圆环病毒2型ELISA抗体检测试剂盒的操作步骤：

1.将待检样本用样本稀释液100倍稀释，每孔加100ul，同时加入阳性和阴性对照液，设空白对照。置37℃孵育1小时，洗涤液洗板5次，甩干，每孔加酶标抗体100ul，37℃孵育1小时；洗涤液洗板5次，甩干，加入酶底物溶液，每孔100μl，避光显色5-10分钟，加入终止液，每孔50μl。利用酶标仪在450nm测定光吸收值A_450nm.

2.结果判定：Cut off(CO值)＝阴性对照光吸收值A_450nm×2.1倍，样品值＝样品光吸收值A_450nm/CO值，样品值大于1判为阳性；样品值小于1和等于1判为阴性。

实施例三：实验结果及分析

1.特异性检测：用本发明制造的试剂盒分别检测猪PCV2灭活疫苗免疫血清，猪PCV2感染血清、猪PCV1感染血清、猪蓝耳病毒抗体阳性血清、猪瘟病毒抗体阳性血清、猪伪狂犬病毒阳性血清、猪PCV2阴性血清，操作和判定按照具体实施方式中猪圆环病毒2型ELISA抗体检测试剂盒的操作步骤进行，结果显示，猪PCV2免疫血清和感染血清检测为阳性，其他样品检测为阴性，特异性为100％。

2.灵敏度检测：用本发明制造的试剂盒检测不同稀释度的阳性参考血清，操作和判定按照具体实施方式中猪圆环病毒2型ELISA抗体检测试剂盒的操作步骤进行，检测结果为：最高检测到阳性参考样品的稀释度为1∶800。

3.与现有试剂盒的实验结果的比较实验：用本发明制造的试剂盒与同类试剂盒同时检测猪PCV2免疫血清5份、猪PCV2抗体阴性血清和不同稀释度的PCV2抗体阳性参考血清。操作和判定按照具体实施方式中猪圆环病毒2型ELISA抗体检测试剂盒的操作步骤进行，检测结果显示本发明中的试剂盒检测灵敏度显著高于其他同类产品。(见下表)

序列表

<110>武汉中博生物股份有限公司

<120>猪圆环病毒2型ELISA抗体检测试剂盒

<160>4

<210>1

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

tctggatcca tgacgtatcc aaggaggcg    29

<210>2

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

gcgaagcttt aagggttaag tggggggtc    29

<210>3

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

tctctcgaga tgacgtatcc aaggaggcg    29

<210>4

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

gcgggtacct aagggttaag tggggggtc    29

Claims (7)

1.一种猪圆环病毒2型(PCV2)ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于所述检测试剂盒包含有：预包被猪圆环病毒2型核衣壳蛋白(PCV2-Cap)单克隆抗体和猪圆环病毒2型核衣壳蛋白的酶标板、封闭液、样品稀释液、酶结合物、浓缩洗涤液、酶底物溶液和终止液，其中所述的核衣壳蛋白是纯化的形成病毒样颗粒的Cap蛋白。

2.权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于所述PCV2-Cap蛋白已自我组装形成病毒样颗粒，并通过CsCl密度梯度离心纯化获得。

3.权利要求1或2所述的检测试剂盒，其特征在于所述的PCV2-Cap蛋白通过如下方法制备：提取猪圆环病毒2型基因组，通过特异性引物扩增PCV2-Cap基因片段，利用Bac-to-Bac系统构建能表达PCV2-Cap基因的重组杆状病毒，将所述重组杆状病毒感染Sf9细胞，收获表达的Cap蛋白，通过CsCl密度梯度离心纯化后作为包被用PCV2-Cap蛋白抗原。

4.权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于所述的特异性引物是：上游引物1：5’-TCTGGATCCATGACGTATCCAAGGAGGCG-3’，下游引物1：5’-GCGAAGCTTTAAGGGTTAAGTGGGGGGTC-3’，上游引物2：5’-TCTCTCGAGATGACGTATCCAAGGAGGCG-3’下游引物2：5’-GCGGGTACCTAAGGGTTAAGTGGGGGGTC-3’。

5.权利要求1-4任一项所述的检测试剂盒，其特征在于酶标板预先包被PCV2-cap蛋白单克隆抗体，包被缓冲液是0.05M pH9.6的碳酸盐缓冲液，1升溶液中含1.59g Na₂CO₃，2.93g NaHCO₃，包被量为每孔0.1-1ug；封闭液为质量浓度是1-10％的牛血清白蛋白BSA或脱脂牛奶；封闭完再包被纯化的PCV2-Cap蛋白，包被量为每孔0.1-1ug；样品稀释液为含有质量浓度0.1-10％牛血清白蛋白BSA和含有质量浓度0.01-0.05％NaN₃的0.01mol/L及pH7.2-7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)；酶结合物为辣根过氧化物酶(HRP)-小鼠抗猪IgG单抗酶结合物；浓缩洗涤液为含体积浓度0.05％吐温-20的0.01mol/L及pH7.2-7.4的PBS；酶底物A溶液为3，3’-5，5’-四甲基联苯胺溶液(TMB)，酶底物B溶液为双氧水溶液；终止液为1mol/L H₂SO₄溶液。

6.权利要求1-4任一项所述的检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包含阳性对照和阴性对照。

7.制备如权利要求1-4任一项所述的试剂盒的方法，其特征在于所述抗原酶标板制备方法是先包被猪圆环病毒2型核衣壳蛋白(PCV2-Cap)单克隆抗体，再结合纯化的猪圆环病毒2型核衣壳蛋白(PCV2-Cap)。

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