KR101756736B1 - 다중 실시간 pcr을 통해서 임상샘플로부터 돼지 흉막폐렴균을 신속 탐지하는 방법 및 그 장치 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 다중 실시간 PCR을 통해서 임상샘플로부터 돼지 흉막폐렴균을 신속 탐지하는 방법 및 그 장치에 관한 것으로, 돼지의 폐조직으로부터 임상샘플을 수집하고, 상기 수집한 임상샘플로부터 DNA를 추출하며, 상기 추출한 DNA를 탬플릿으로 하여 돼지 흉막 폐렴균 혈청형 1, 2, 7 및 12의 동시적 종식별과 혈청형 결정을 수행함으로써, 유전자 증폭을 수행하는 특정 프라이머를 사용해서 실시간 다중 PCR을 수행하는 돼지 흉막폐렴균의 신속탐지 방법 및 그 장치에 관한 것이다.

Description

다중 실시간 PCR을 통해서 임상샘플로부터 돼지 흉막폐렴균을 신속 탐지하는 방법 및 그 장치{METHOD FOR RAPIDLY DETECTING ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE FROM CLINICAL SAMPLES THROUGH MULTIPLEX REAL-TIME PCR ASSAY AND THE APPARATUS THEREOF}
본 발명은 다중 실시간 PCR을 통해서 임상샘플로부터 돼지 흉막폐렴균을 신속 탐지하는 방법 및 그 장치에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 돼지의 폐조직으로부터 임상샘플을 수집하고, 상기 수집한 임상샘플로부터 DNA를 추출하며, 상기 추출한 DNA를 탬플릿으로 하여 돼지 흉막 폐렴균 혈청형 1, 2, 7 및 12의 동시적 종식별과 혈청형 결정을 수행함으로써, 유전자 증폭을 수행하는 특정 프라이머를 사용해서 실시간 다중 PCR을 수행하는 돼지 흉막폐렴균의 신속탐지 방법 및 그 장치에 관한 것이다.
종래에 박테리아 흉막폐렴균(Actinobacillus pleuropneumoniae, App)은 헤모필루스 를레우롭네우모니애(Haemophilus pleuropneumoniae)로 불리었으며, 이는 적어도 12개의 서로 다른 혈청형으로 구성된다. 이 중에서 일부는 질병을 유발하지 않는 비병원성이지만, 다른 것들은 매우 심각한 질병을 유발한다. 균주 1, 5, 9, 11 및 12는 매우 치명적이고, 균주 3과 6은 매우 온순하다. 혈청형을 결정하는 것은 질병의 전파력이 얼마나 되는지 이해하고, 질병을 치료 및 예방하고, 무리 및/또는 지역들에 있는 혈청형들의 유전병학적 감시를 위해 중요한 것이다. 흉막폐렴균의 혈청형에 대한 특수성은 혈청의 표면에 있는 캡슐 다당류(capsular polysaccharide)에 의해 결정된다.
흉막폐렴균은 편도선과 호흡기 상부 지역에서 옮겨진다. 복합(mixed) 호흡기 질병은 돼지를 사육하는데 영향을 주는 가장 일반적인 임상 조건들 중 하나로 보고되고 있다. 돼지 흉막폐렴의 원인성 미생물은(혹은 기병성 인자, etiologic agent)는 이유기에서 돼지를 젖떼기에서 도살기까지 영향을 주지만, 보통은 생후 8에서 16주 사이에서 영향을 미친다. 잠복기가 12시간으로 매우 짧다. 독소는 매우 전염성이 강해서 폐에 심각한 피해를 주고 떼죽음을 야기할 수 있다. 이것은 비말감염(droplet infection)을 통해 짧은 거리로 전파되고, 돼지 바깥에선 며칠밖에 살지 못한다.
PCR은 세균 식별에서 강력하고 점점 인기 있는 도구가 되어 왔다. 극미량의 DNA에서 유전적 시퀀스를 탐지할 수 있는 PCR의 성능은 여러 이유들에서 탐지의 혈청학적 형태들과 비교해서 유리하다. 즉, 항원과 항체 사이의 교차 반응이 방지되고, 자동 접합으로 인한 분류할 수 없는(untypeable) 것이 특징인 균주는 PCR에 의해 분류될 수 있고, PCR에 의한 DNA 확대(amplification)는 극도로 예민하게 하고, 그리고 PCR은 박테리아의 배양을 기다릴 필요 없이 샘플상에서 직접 수행될 수 있다. 다중 PCR은 돼지 축산업에 심각한 경제적 손실에 책임이 있는 돼지의 중요한 병원균인 흉막폐렴균(Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida and Haemophilus parasuis)을 병행해서 식별하기 위해 개발되었다.
다음은 본 발명의 기술 분야에 존재하는 선행기술에 대하여 간단하게 설명하고, 이어서 본 발명이 상기 선행기술에 비해서 차별적으로 이루고자 하는 기술적 사항에 대해서 기술하고자 한다.
먼저 한국등록특허 제1527847호(215.06.04.)는 돼지 세균성 호흡기 질병 원인체 감별을 위한 프라이머 세트 및 이를 포함하는 진단키트에 관한 것으로, 돼지 세균성 호흡기 질병을 유발하는 원인체 검출 및 감별하기 위한 프라이머 세트, 상기 원인체를 포함하는 조성물 및 상기 조성물을 이용하여 돼지 세균성 호흡기 질병의 원인체를 검출할 수 있는 돼지 세균성 호흡기 질병 원인체 검출방법에 관한 것이다.
또한 한국등록특허 제1491793호(2015.02.03.)는 신규한 액티노바실러스 플로르뉴모니아 혈청형 12균주, 이를 포함하는 진단용 조성물 및 백신 조성물에 관한 것으로, 돼지 흉막폐렴에 대한 예방 효과를 갖는 신규한 액티노바실러스 프로르뉴모니아 혈청형 12번 균주 KACC 91770P, 상기 균주를 포함하는 돼지 흉막폐렴 진단용 조성물 및 상기 균주를 포함하는 돼지 흉막폐렴 예방용 백신 조성물에 관한 기술이 구현되어 있다.
상기 선행기술들은 돼지의 흉막폐렴균에 대한 원인체를 검출하고 예방하는 점에서 본 발명과 일부분 유사하나, 본 발명은 돼지의 폐 조직으로부터 임상샘플을 수집하여, 흉막폐렴균 혈청형을 검출하기 위한 다중 PCR 방법에 관한 것이라는 점에서 차이가 있고, 특히 본 발명은 상기 흉막폐렴균에 노출된 돼지의 폐 조직으로부터 유전자 증폭을 수행하는 특정 프라이머를 설계하고 이를 사용하여 실시간 다중 PCR분석방법을 이용하여 흉막폐렴균의 혈청형의 동시적 종식별과 혈청형 결정을 하기 위한 수행 방법에 대해서는 기재하거나 시사하고 있지 않다.
이러한 문제점을 해결하기 위해 창안된 본 발명은 가장 널리 퍼져있는 혈청형으로 진단 연구실에서 실질적으로 중요한 흉막폐렴균 혈청형 1, 2, 7, 12 및 omlA의 동시적 종식별과 혈청형 결정을 위한 PCR 분석기를 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
또한 본 발명은 캡슐 다당류(cps genes)의 생체합성에 관련된 특정 혈청형 DNA 구역의 증폭에 기초한 PCR 분석기를 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
본 발명의 일 실시에에 따른 다중 실시간 PCR을 통해서 임상샘플로부터 돼지 흉막폐렴균을 신속 탐지하는 방법은 돼지의 폐조직으로부터 임상샘플을 수집하는 임상샘플수집단계, 상기 수집한 임상샘플로부터 DNA를 추출하는 DNA추출단계 및 상기 추출한 DNA를 탬플릿으로 하여 돼지 흉막 폐렴균 혈청형 1, 2, 7 및 12의 동시적 종식별과 혈청형 결정을 수행함으로써, 유전자 증폭을 수행하는 특정 프라이머를 사용해서 실시간 다중 PCR을 수행하는 다중 PCR 수행단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한 상기 임상샘플로부터 흉막폐렴균 박테리아 균주를 배양하는 배양단계를 더 포함하며, 상기 박테리아 균주는 ml당 5μg의 NAD(BHI-NAD)를 포함하거나 BHI-NAD 액체(broth)안에서 37oC 뇌심장침출액(BHI) 한천 평판에서 배양되는 것을 특징으로 한다.
또한 상기 프라이머는 올리고뉴클레오티드 프라이머이며, 혈청형 1, 2, 7 및 12의 cps 유전자와 omlA 유전자를 사용한 혈청형-특정 프라이머가 설계되는 것을 특징으로 한다.
또한 상기 다중 PCR 수행단계에서 총 부피 20μl의 PCR 반응 혼합물은 2μl 게놈 DNA, 2μl 포워드와 리버스 프라이머 (각각 5 pmol/μl), 2μl 초순수, Prime Taq DNA Polymerase을 포함한 2X 프리믹스(Premix), 2X 반응 버퍼, 4 mM MgCl2, 효소 안정제, 앙금, 적재 염료, 각각 pH 9.0, 0.5 mM의 dATP, dCTP, dGTP, dTTP로 구성되는 것을 특징으로 한다.
또한 상기 다중 PCR 수행단계는 5분 동안 94oC, 30초 동안 94oC, 30초 동안 54oC, 1분 동안 72oC를 35 사이클과 10분 동안 72oC를 마지막 사이클로 이루어져 있으며, 증폭된 산물은 1.2%의 아가로오스겔(agarose gel)에서의 전기영동에 의해 분리되고 브롬화 에티듐으로 착색되는 것을 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한 상기 다중 PCR 수행단계에서, 총 부피 20 μl의 M-PCR 반응 혼합물은 1 μl 포워드와 리버스 프라이머 (각각 5 pmol/μl), 4 μl 초순수, Prime Taq DNA Polymerase를 포함한 2X 프리믹스, 2X 반응 버퍼, 4 mM MgCl2, 효소 안정제, 앙금, 적재 염료, 각각 pH 9.0, 0.5 mM의 dATP, dCTP, dGTP, dTTP를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 한다.
또한 상기 다중 PCR 수행단계는, 5분 동안 94oC, 30초 동안 94oC, 30초 동안 Tm, 1분 동안 72oC를 35사이클과 10분 동안 72oC를 마지막 사이클로 이루어져 있으며, 12 마이크로리터의 각 반응 혼합물은 1.2%의 아가로오스겔에서 전기영동에 의해 분석되고, 브롬화 에티듐(10 μg/ml)에 의해 착색되고 UV 빛 아래에서 보여지는 것을 특징으로 한다.
아울러 본 발명의 일실시예에 따른 돼지 흉막폐렴균의 신속탐지 장치는 돼지의 폐조직으로부터 임상샘플을 수집하여, 상기 수집한 임상샘플로부터 추출한 DNA를 탬플릿으로 하여 돼지 흉막 폐렴균 혈청형 1, 2, 7 및 12의 동시적 종식별과 혈청형 결정을 수행함으로써, 유전자 증폭을 수행하는 특정 프라이머를 사용해서 실시간 다중 PCR을 수행하는 것을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 다중 실시간 PCR을 통해서 임상샘플로부터 돼지 흉막폐렴균을 신속 탐지하는 방법 및 그 장치에 관한 것으로, 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 cps 유전자와 omlA 유전자를 위한 혈청형-특정 프라이머를 설계함으로써, 흉막페렴균 혈청형 1, 2, 7, 12 및 omlA 유전자에 대한 동시 식별과 혈청형 결정을 매우 효과적으로 명확하고, 민감하게 혈청형 결정을 할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 다중 실시간 PCR을 통해서 임상샘플로부터 돼지 흉막페렴균을 신속 탐지하는 방법 및 그 장치에 있어서, 증폭된 산물의 프라이머 시퀀스와 예측된 사이즈를 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 다중 실시간 PCR을 통해서 임상샘플로부터 돼지 흉막폐렴균을 신속 탐지하는 방법 및 그 장치에 있어서, 다중 PCR을 이용하여 설계된 혈청형-특정 프라이머를 전기영동한 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 다중 실시간 PCR을 통해서 임상샘플로부터 돼지 흉막폐렴균을 신속 탐지하는 방법 및 그 장치에 있어서, Gradient-PCR을 통한 프라이머들을 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 다중 실시간 PCR을 통해서 임상샘플로부터 돼지 흉막폐렴균을 신속 탐지하는 방법 및 그 장치에 있어서, 돼지의 흉막폐렴균의 혈청형에서 다중 PCR을 이용하여 산출한 전기영동을 보인 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 다중 실시간 PCR을 통해서 임상샘플로부터 돼지 흉막폐렴균을 신속 탐지하는 방법을 나타내는 흐름도이다.
이하 참조된 도면을 참조하여 본 발명의 일 실시예에 따른 실시예를 상세히 설명하도록 한다.
캡슐 다당류의 생합성에 관련된 특정 혈청형(Serotype-specific)에 대한 DNA 부분(cps region)들은 흉막 폐렴균 혈청형 1, 2, 7 및 12의 동시적 종식별과 혈청형 결정을 위한 다중 PCR 분석 방법을 개발하는데 사용되었다.
혈청형 1, 2, 7 및 12의 특정 프라이머들(primers)은 omlA 유전자에 기반한 PCR 분석에 사용된 이미 존재하는 특정 종에 대한 프라이머들과 결합되었다. 다중 PCR 분석이 농장균주(field strains)를 분석하는데 사용될 때, 임상질환을 가진 돼지에서 격리된 모든 균주의 약 94%에 해당하는 혈청형을 식별하는 것이 가능하였다. 라텍스 접합 시험에 의해 교차 반응된 상기 격리된 균주들의 90%이상이 1, 2, 7 및 12의 혈청형이었다. 다른 흉막폐렴균 혈청형의 생체합성 부분에 특정 프라이머들을 사용하는 것은 본 분석기의 진단과 유전병학의 능력을 확장한다. PCR에 의한 혈청형의 결정은 진단 연구실들에서 흉막폐렴균의 혈청형을 결정하기 위한 편리하고 특징적인 방법이다.
또한 본 발명은 흉막폐렴균 혈청형 5 캡슐 다당류 액스포트(cpx)와 다당류 생체합성(cps)에 관련된 유전자들이 최근 Ward와 Inzana에 의해 복제되고 배열되었는데, 여기서 cpx 유전자들은 매우 보존적인 반면 cps 유전자들은 혈청형 1, 2, 7 및 12의 cps 구역에 특정된 혈청형 특정 올리고 뉴클레오티드 프라이머다. 다중 PCR 분석기의 특수성과 민감성이 시험되었고, 다중 PCR의 결과는 전통적인 혈청학의 분류 방법에서 얻어진 것과 비교되었다.
도 1은 본 발명의 일 실이셰에 따른 다중 실시간 PCR을 통해서 임상샘플로부터 돼지 흉막 폐렴균을 신속 탐지하는 방법 및 그 장치에 있어서, 증폭된 산물의 프라미어 시퀀스와 예측된 사이즈를 나타낸 도면이다.
우선, 본 발명에서 사용된 재료와 방에 대해서 설명하도록 한다. 먼저, 돼지 폐 조직 샘플은 흉막페렴균 혈청형 5 X 107의 5 X 107집락형성단위(Colony-Forming Unit, CFU)로 기관지염을 유발시킨 돼지로부터 수집되고, -20oC에서 저장된다.
또한 상기 수집된 돼지 폐의 샘플로부터 분리된 혈청형 1( = 5 ), 2( = 5 ), 5( = 5 ), 6( = 5 ), 7( = 5 ), 8( = 5 )과 타입을 지정할 수 없는 ( n = 8 )을 나타내는 돼지 흉막폐렴균의 분리주(균주)들은 멀티플렉스 PCR 분석에서 종 특성을 평가하는데 사용된다.
한편 상기 분리된 모든 박테리아 균주는 ml당 5 μg 의 NAD(BHI-NAD)를 포함하거나 BHI-NAD 액체(broth)안에서 37oC 뇌심장침출액(BHI) 한천 배지(Difco Laboratories, Detroit, Mich.)에서 배양된다.
또한 상기 분리되어 배양되는 박테리아 균주의 DNA는 100 μl의 초순수에 희석된 콜로니(colony)에서 추출된다. 또한 하루 동안 배양한 상기 박테리아의 배양균의 loopful은 한천 배지의 표면에서 채취되고, 200μl의 멸균수에 현탁된다.
또한 상기 현탁된 한 루프에 해당하는 액체의 양(loopful)을 얻은 후, 제조사의 프로토콜에 따른 AccuPrep® Genomic DNA Extraction Kit (Bioneer, South Korea)에 따라 DNA추출이 이루어진다.
또한 상기 DNA의 질과 집중은 260 nm에서 eppendorf BioPhotometer를 사용하여 측정되고 -20oC에서 저장된다. 이렇게 추출된 DNA는 PCR과 M-PCR의 템플릿(template)으로 사용된다.
도 1에 도시한 바와 같이, 본 발명에서 사용되는 올리고뉴클레오티드 프라이머의 시퀀스는 cps-region 혈청형 및 omlA-유전자의 유형에 따라 다섯 가지의 다른 쌍으로 이루어진다.
또한 상기 올리고뉴클에오티드 프라이머의 다섯 가지의 다른 쌍은 다중 PCR 분석에 사용되어지며, cps-gene(혈청형 1, 2, 7, 12)와 omlA-유전자를 위한 혈청형-특정 프라이머로 설계된다.
본 발명에서 설계된 DNA 프라이머는 Primer 3 tool program을 사용해서 선택되었다.
또한 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR)은 타겟 박테리아의 특정 프라이머를 사용해서 eppendorf mastercycler gradient (유전자 증폭기)에서 수행된다. 총 부피 20μl의 PCR 반응 혼합물은 2μl 게놈 DNA, 2μl 포워드와 리버스 프라이머 (각각 5 pmol/μl), 2μl 초순수, Prime Taq DNA Polymerase을 포함한 2X 프리믹스(Premix), 2X 반응 버퍼, 4 mM MgCl2, 효소 안정제, 앙금, 적재 염료, 각각 pH 9.0, 0.5 mM의 dATP, dCTP, dGTP, dTTP를 포함해서 다음의 온도와 시간 프로그램은 5분동안 94oC, 30초 동안 94oC, 30초 동안 54oC, 1분 동안 72oC의 35사이클 구간과 10분 동안 72oC를 마지막 사이클 구간으로 구성된다.
또한 상기 폴리머라아제 연쇄 반응에 의해 확대된 산물은 1.2%의 아가로오스겔(agarose gel)에서의 전기 이동에 의해 분리되고 브롬화 에티듐으로 착색되어 분리된 DNA결과물을 시각화하여 볼 수 있다.
다음으로 다중 폴리머라아제 연쇄 반응(M-PCR)에 대해서 설명하고자 한다.
PCR은 타겟 박테리아의 2μl 게놈 DNA 특정 프라이머를 사용해서 eppendorf mastercycler gradient(유전자 증폭기)에서 수행된다. 총 부피 20μl의 MPCR 반응 혼합물은 1μl 포워드와 리버스 프라이머 (각각 5 pmol/μl), 4μl 초순수, Prime Taq DNA Polymerase를 포함한 2X 프리믹스, 2X 반응 버퍼, 4 mM MgCl2, 효소 안정제, 앙금, 적재 염료, 각각 pH 9.0, 0.5 mM의 dATP, dCTP, dGTP, dTTP를 포함하며, 다음 온도와 시간 프로그램은 5분 동안 94oC, 30초 동안 94oC, 30초 동안 Tm, 1분동안 72oC의 35 사이클 구간과 10분동안 72oC의 마지막 사이클 구간으로 이루어져 있다. 12μl의 각 반응 혼합물은 1.2%의 아가로오스겔에서 전기 이동에 의해 분석된다. PCR 산물은 브롬화 에티듐(10 μg/ml)에 의해 착색되고 UV 빛 아래에서 보여진다.
결과적으로 상기 흉막페렴균의 혈청형은 그들의 유일한 캡슐 다당류(cps)에 의해 구별된다. 이는 교차-반응이 전통적인 혈청학적 분석과 혈청형 결정에서 종종 발생하기 때문이다.
또한 PCR은 항원과 항체를 이용하지 않는 실질적인 대안을 제공하며, 이러한 속성은 캡슐 유전자를 PCR에 의해 분류하기 위한 이상적인 타겟으로 만들어준다.
그러나 흉막페렴균의 배양은 제출된 표본량의 50% 또는 그 이하로 성공한다. 이는 돼지가 상기 표본을 추출하기 전에 죽었을 때는, 죽음으로 인한 오염이 흉막폐렴균의 분리를 막기 때문이다.
하지만 PCR은 박테리아의 배양균보다 민감하고, 설명된 다중 PCR은 오염의 원인의 존재에 영향을 받지 않을 만큼 충분히 명확하다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 다중 실시간 PCR을 통해서 임상샘플로부터 돼지 흉막폐렴균을 신속 탐지하는 방법 및 그 장치에 있어서, 다중 PCR을 이용하여 설계된 혈청형-특정 프라이머를 전기영동한 도면이다.
도 2에 도시한 바와 같이 cps-region의 부분들과 omlA-유전자를 위한 프라미어를 각각 증폭하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 전기영동하여 보이고 있다.
상술한 바와 같이 돼지의 흉막폐렴균 혈청형을 식별하기 위한 상기 올리고뉴클레이티드 프라이머의 네 쌍은 혈청형 1, 2, 7 및 12로부터 혈청형-특정 cps-region의 부분과 omlA-유전자를 위한 프라이머 한 쌍을 각각 증폭하도록 설계되었다.
또한 올리고뉴클레오티드 프라이머 중 Ap7F와 Ap7R은 혈청형 7 분리체로부터 대략 1500bp의 PCR 조각을 생산하도록 설계하였고, 반면에 cps-region serovar(혈청형변이주) 1, 2 및 12를 위한 프라이머는 대략 320bp, 720bp 및 900bp의 PCR 조각을 생산하도록 설계하였다.
또한 상기 세 개의 프라미머의 쌍은 기존 종-특정 흉막폐렴균 PCR 분석에 사용되는 프라이머와 결합된다.
또한 omlA-유전자을 위한 HPF-HPR 프라이머 쌍은 상기 omlA-유전자를 대략 1000bp로 증폭할 수 있다.
또한 상기 프라이머들은 돼지의 흉막폐렴균 혈청형을 식별하기 위하여 각 혈청형 유전자에 결합하기 위해 상보적으로 디자인되었으며, 상기 프라이머들은 애널링을 하기 위한 최적의 온도를 찾기 위해 Gradient-PCR을 이용하여, 각 혈청형에 개별적으로 최적화된다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 다중 실시간 PCR을 통해서 임상샘플로부터 돼지 흉막폐렴균을 신속 탐지하는 방법 및 그 장치에 있어서, Gradient-PCR을 통한 프라이머들을 나타낸 도면이다.
상술한 바와 같이 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머들은 다섯 가지 다른 쌍으로 설계되었으며, 각 프라이머들은 cps-region 부분과 omlA유전자를 위해 각각 증폭하도록 설계되었다.
도 3에 도시한 바와 같이 상기 각 프라이머가 결합하기 위한 최적의 온도를 Gradient-PCR에 의해 개별적으로 최적화 된다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 다중 실시간 PCR을 통해서 임상샘플로부터 돼지 흉막폐렴균을 신속 탐지하는 방법 및 그 장치에 있어서, 돼지의 흉막폐렴균의 혈청형에서 다중 PCR을 이용하여 산출한 전기영동을 보인 도면이다.
도 4에 도시한 바와 같이 다중 PCR 분석은 혈청형 5 박테리아의 추출물을 이용하여 최적화된다. 또한 대략 1000bp 및 320bp의 종-특정 조각은 분석된 모든 폐렴균 균들로부터 증폭된다.
한편 전통적인 혈청형 결정 방법들 중에 하나로부터 혈청형 2, 5 또는 6의 흉막폐렴균 분리균주들은 다중 PCR 분석에 의해 같은 타입의 혈청형을 할당받는다.
또한 어널링 온도는 49oC에서 56oC이다.
또한 비특이성 산물을 제거하기 위해 어널링 온도를 올리는 것은 특정 PCR 산물의 손실을 야기하므로 PCR 분석을 최적화 하는 데에는 도움이 되지 않는다.
또한 상기 혈청형 4의 cps-region은 정제된 DNA, 박테리아 콜로니, 폐 조식의 샘플을 이용하여 성공적으로 증폭된다.
또한 상기 프라이머를 결합하는 것은 PCR 환경들의 변화를 요구하지 않는다(예를 들어 온도의 변화).
또한 다중 PCR의 사용은 단일 반응과 동시결정에서 다중 프라이머 셋을 사용함에 있어 이점을 제공한다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 다중 실시간 PCR을 통해서 임상샘플로부터 돼지 흉막폐렴균을 신속 탐지하는 방법을 나타내는 흐름도이다.
도 5에 도시된 바와 같이, 우선 돼지의 폐조직으로부터 임상샘플을 수집한다(S110).
한편 상기 임상샘플은 돼지의 폐 조직 샘플로서, 상기 흉막폐렴균 혈청형 1, 2, 6 및 12에 의해 감염된 돼지로부터 수집되어진다.
다음으로 상기 수집한 임상샘플로부터 DNA를 추출한다(S120).
다음으로 상기 추출한 DNA를 템플릿으로 하여, 흉막 폐렴균의 동시적 종식별과 혈청형 결정을 수행하며, 유전자 증폭을 수행하는 특정 프라이머를 사용하여 실시간 다중 PCR을 수행한다(S130).
다음으로 상기 실시간 다중 PCR을 통하여 증폭된 결과물을 전기영동시켜 분리하고, 상기 분리된 결과물을 UV 빛 아래에서 시각화될 수 있도록 브롬화 에티듐으로 착색한다(S140).
한편 다중 PCR 분석기의 설계는 덴마크에서의 흉막폐렴균 혈청형의 분포에 따라 결정되었다. 또한 격리된 농장 균주의 거의 94%가 혈청형 1, 2, 7 및 12에 속한다. 모든 혈청형에서, cpx 밴드(band)를 유지하는 동안, 몇 몇 혈청형, 특히 혈청형 7과 12로부터 증폭된 비특이성 밴드의 존재는 매우 보존적인 것으로 나타났다.
또한 그 영역에서 선택된 프라이머들은 혈청형 샘플 DNA의 배열에서 설계되었다. 다중 PCR 분석기의 박테리아 콜로니에 대한 성공적인 적용은 흉막폐렴균의 식별과 혈청형 결정에 효과적인 방법을 제공한다.
또한 희귀한 혈청형 4의 예외적인 경우에는, 별도로 0.7-kb 밴드가 모든 혈청혈으로부터 증폭되었다. 지금까지, 흉막폐렴균에 대해서 보고된 대부분의 PCR 분석기는 종식별과 격리된 균주의 하위분류를 위해서 사용되었고, 종과 혈청형을 동시에 식별하지 않는다.
또한 다양한 PCR 분석기가 흉막폐렴균의 종식별을 위해 개발되었다. 이러한 PCR 분석기들의 공통된 특징은 증폭을 위해 사용된 프라이머가 다른 어떤 흉막폐렴균 혈청형이 아닌 흉막폐렴균에 특화되게 하고 있다는 것이다. 이러한 분석기들은 단지 유기체의 식별을 위해서만 사용되고, 그러므로 혈청형 결정을 위해 다른 방법들이 여전히 필요한 실정이다.
따라서 본 발명에서 얻어진 결과는 다중 PCR 분석기가 흉막폐렴균 혈청형 1, 2, 7, 12 및 omlA 유전자에 대한 동시 식별과 혈청형 결정을 위한 민감하고, 명확하고, 그리고 매우 효과적인 진단 도구임을 나타낸다. 더욱이 혈청학적 교차-반응의 문제점은 다중 PCR을 사용해서 진단 연구실에서 방지될 수 있다. 또한 상기 결과는 캡슐 다당류의 생체합성에서 관련된 유전자가 흉막폐렴균 혈청형 2, 6 및 12와 omlA 유전자의 혈청형-특정 영역을 포함한다는 것을 확인해 준다.
상기 설명한 바와 같이, 본 발명은 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 cps 유전자와 omlA 유전자를 위한 혈청형-특정 프라이머를 설계함으로써, 흉막페렴균 혈청형 1,2,7,12 및 omlA 유전자에 대한 동시 식별과 혈청형 결정을 매우 효과적으로 명확하고, 민감하게 혈청형 결정을 할 수 있는 효과가 있다.
이상으로 본 발명은 첨부된 도면에 도시된 실시예를 참고로 설명되었으나, 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 타 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 기술적 보호범위는 아래의 특허청구범위에 의해서 정하여져야 할 것이다.
100 : 올리고뉴클레오티드 프라이머

Claims (8)

  1. 돼지의 폐조직으로부터 임상샘플을 수집하는 임상샘플수집단계;
    상기 수집한 임상샘플로부터 DNA를 추출하는 DNA추출단계;
    상기 추출한 DNA를 탬플릿으로 하여 돼지 흉막 폐렴균 혈청형 1, 2, 7 및 12의 동시적 종식별과 혈청형 결정을 수행함으로써, 유전자 증폭을 수행하는 특정 프라이머를 사용해서 실시간 다중 PCR을 수행하는 다중 PCR 수행단계; 및
    상기 임상샘플로부터 흉막폐렴균 박테리아 균주를 배양하는 배양단계;를 포함하며,
    상기 프라이머는, 올리고뉴클레오티드 프라이머이며,
    상기 혈청형 1, 2, 7 및 12의 cps 유전자와 omlA 유전자를 사용한 혈청형-특정 프라이머가 설계되며,
    상기 프라이머는, 돼지의 흉막폐렴균 혈청형을 식별하고, 각 혈청형 유전자에 결합하기 위해 상보적으로 디자인되며,
    상기 혈청형 1, 2, 7, 12는 각각 320bp, 470bp, 1500bp, 900bp의 PCR 조각을 생성하도록 설계되며, omlA 유전자는 1000bp인 PCR 조각을 생성하도록 설계되며,
    상기 박테리아 균주는 ml당 5μg의 NAD를 포함한 BHI 한천 평판에서, 혹은 BHI-NAD 액체(broth)안에서, 37oC의 온도로 배양되는 것을 특징으로 하는 돼지 흉막폐렴균의 신속탐지 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 다중 PCR 수행단계에서, PCR 반응 혼합물은 게놈 DNA, 포워드와 리버스 프라이머, 초순수, Prime Taq DNA Polymerase을 포함한 2X 프리믹스(Premix), 2X 반응 버퍼, MgCl2, 효소 안정제, 앙금, 적재 염료, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP로 구성되는 것을 특징으로 하는 돼지 흉막폐렴균의 신속탐지 방법.
  5. 청구항 4에 있어서,
    상기 다중 PCR 수행단계는,
    5분 동안 94oC, 30초 동안 94oC, 30초 동안 54oC, 1분 동안 72oC를 35 사이클 진행하고, 10분 동안 72oC를 마지막 사이클 진행하는 것으로 이루어져 있으며, 증폭된 산물은 1.2%의 아가로오스겔(agarose gel)에서의 전기영동에 의해 분리되고 브롬화 에티듐으로 착색되는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 돼지 흉막폐렴균의 신속탐지 방법.
  6. 청구항 1에 있어서,
    상기 다중 PCR 수행단계에서, M-PCR 반응 혼합물은 포워드와 리버스 프라이머, 초순수, Prime Taq DNA Polymerase를 포함한 2X 프리믹스, 2X 반응 버퍼, MgCl2, 효소 안정제, 앙금, 적재 염료, dATP, dCTP, dGTP, dTTP를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 돼지 흉막폐렴균의 신속탐지 방법.
  7. 청구항 6에 있어서,
    상기 다중 PCR 수행단계는,
    5분 동안 94oC, 30초 동안 94oC, 30초 동안 Tm, 1분 동안 72oC를 35 사이클 진행하고, 10분 동안 72oC를 마지막 사이클 진행하는 것으로 이루어져 있으며, 12 마이크로리터의 각 반응 혼합물은 1.2%의 아가로오스겔에서 전기영동에 의해 분석되고, 브롬화 에티듐에 의해 착색되고 UV 빛 아래에서 보여지는 것을 특징으로 하는 돼지 흉막폐렴균의 신속탐지 방법.
  8. 돼지의 폐조직으로부터 임상샘플을 수집하는 수단;
    상기 수집한 임상샘플로부터 추출한 DNA를 탬플릿으로 하여 돼지 흉막 폐렴균 혈청형 1, 2, 7 및 12의 동시적 종식별과 혈청형 결정을 수행하는 수단;
    유전자 증폭을 수행하는 특정 프라이머를 사용해서 실시간 다중 PCR을 수행하는 수단; 및
    상기 임상샘플로부터 흉막폐렴균 박테리아 균주를 배양하는 수단;을 포함하며,
    상기 프라이머는, 올리고뉴클레오티드 프라이머이며,
    상기 혈청형 1, 2, 7 및 12의 cps 유전자와 omlA 유전자를 사용한 혈청형-특정 프라이머가 설계되며,
    상기 프라이머는, 돼지의 흉막폐렴균 혈청형을 식별하고, 각 혈청형 유전자에 결합하기 위해 상보적으로 디자인되며,
    상기 혈청형 1, 2, 7, 12는 각각 320bp, 470bp, 1500bp, 900bp의 PCR 조각을 생성하도록 설계되며, omlA 유전자는 1000bp인 PCR 조각을 생성하도록 설계되며,
    상기 박테리아 균주는 ml당 5μg의 NAD를 포함한 BHI 한천 평판에서, 혹은 BHI-NAD 액체(broth)안에서, 37oC의 온도로 배양되는 것을 특징으로 하는 돼지 흉막폐렴균의 신속탐지 장치.
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