JP5183635B2

JP5183635B2 - Ｐｖｌ産生黄色ブドウ球菌のインビトロにおける診断方法

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Publication number: JP5183635B2
Application number: JP2009532863A
Authority: JP
Inventors: セドリクバディゥ，; ジェロームエティエンヌ，; ジェラールリナ，; カトリーヌラタ，
Original assignee: Biomerieux SA
Current assignee: Biomerieux SA
Priority date: 2006-10-18
Filing date: 2007-10-16
Publication date: 2013-04-17
Anticipated expiration: 2027-10-16
Also published as: JP2010507092A; ES2398412T3; AU2007310738A1; EP2082233A1; EP2082233B1; EP2388593A3; EP2388593A2; US8936791B2; WO2008050041A1; AU2007310738B2; US20100129839A1

Description

本発明はブドウ球菌属及びStaphylococcus aureus種（黄色ブドウ球菌）に属するバクテリアであって、Panton-Valentineロイコシジン（ＰＶＬ）を産生するものの存在に関連する感染症の分野に関する。より詳しくは、本発明の目的は、黄色ブドウ球菌を含みうる生物試料中において、ルーチンの免疫学的検査を使用して、ＰＶＬを産生する黄色ブドウ球菌を決定する方法である。

ＰＶＬを産生する黄色ブドウ球菌による感染症は、基本的にコミュニティ感染症の原因となる。黄色ブドウ球菌は多様な病原性因子を発現し、その中でPanton-Valentineロイコシジン（ＰＶＬ）は組織損傷を促進する細胞毒素である（文献１）。ＰＶＬは、世界中に広がっているメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＣＡＭＲＳＡ）株に獲得された、コミュニティに一般に存在する毒素である（文献２）。

ＰＶＬ、及び他のロイコシジンも、synergohymenotropic毒素の一系統に属するタンパク質である。この系統の全ての毒素は、Ｓ及びＦと表示される相乗作用を有する２つのポリペプチド構成要素で構成される。ＰＶＬは、２つの共に転写される隣接する遺伝子、ｌｕｋＦ−ＰＶとｌｕｋＳ−ＰＶにコードされる。バクテリアの溶菌があろうとなかろうと細胞外の媒体に排出されるので、ＰＶＬはエキソトキシンである。エンドトキシンまたはリポ多糖体は、それらを分泌するグラム陰性（Ｇｒａｍ−）菌が破壊された時のみ放出されるので、それらとは違う。

ＰＶＬ産生黄色ブドウ球菌はグラム陽性（Ｇｒａｍ＋）菌であり、吹出物、膿瘍、蜂巣炎と筋炎タイプの皮膚の感染症または皮下の感染症、骨関節の感染症、更には約７０％の死亡率である主に小児及び若年成人を襲う重症の壊死性肺炎のような特異的なヒト感染症に関連する。

病因論は完全にはわかっていないが、証拠のいくつかの傾向はＰＶＬがＰＶＬ産生黄色ブドウ球菌による感染症の生理病理学において重要な役割を果たすことを示唆する：
ｉ）ＰＶＬを合成する黄色ブドウ球菌の分離株と感染症の臨床症状の強い疫学的な関連、
ｉｉ）高頻度の白血球減少症（ＰＶＬの知られている影響）、
ｉｉｉ）ウサギのＰＶＬの皮内注射によって誘発される壊死に似ている、気道の壊死病斑、
ｉｖ）多形核細胞を標的とする肺におけるＰＶＬの存在、
ｖ）ＰＶＬ産生株だけ、または精製されたＰＶＬだけが、実験モデルで壊死性肺炎を誘発する（文献７）。

ＰＶＬ産生黄色ブドウ球菌は、現在、核酸を検出する検査を使用して、特にＰＣＲによってｌｕｋＦ−ＰＶとｌｕｋＳ−ＰＶ遺伝子を検出することによって、検出されている。
このような検査は、それにより遺伝子が機能的であること及び／又は発現したことを確認することができないので間接的であり、特別な機器の必要性のために高価であり、あまり迅速でなく、実施が難しいという欠点がある。加えて、ＰＣＲの使用において、コンタミネーション問題が起こる可能性がある（文献３）。
また、ＰＶＬの検出は、時々、ポリクローナル抗体を使用する免疫拡散法によって実施されているが（文献４）、実施があまり容易でなく、標準化することが難しく、それはルーチンの使用のための良好なツールを構成しないので、遺伝子の検出が支持され、この技術は急速に見捨てられた。
ＰＶＬ産生黄色ブドウ球菌によるいくつかの感染症の重症度のために、実施が簡単で、ＰＶＬ産生黄色ブドウ球菌を検出するために、現在使用されている検査の欠点を解決する迅速な検査を利用可能にすることは、急務になっている。

特許出願ＥＰ５９７１１０ＡにはＭＲＳＡの検出が抗ＰＶＬモノクローナル抗体を使用するルーチンの免疫学的検査によって実施できるという事実が記載されている。しかしながら、これらの検査は上記の欠点を解決するけれども、検出の特異性は充分でない。
全ての予想に対して、出願人は今回、ルーチンの免疫学的検査を使用するＰＶＬ産生黄色ブドウ球菌の検出の特異性が、ＰＶＬを変性するために生物試料の前処理を実施することによって向上しうることを証明したが、何れかのエキソトキシンのように、ＰＶＬが温度のような物理化学的因子に影響されることは、当業者に知られていることである。
したがって、本発明の患者は、黄色ブドウ球菌に冒されやすい又は感染しやすい個体に由来する生物試料を使用する、Panton-Valentineロイコシジン（ＰＶＬ）を産生する黄色ブドウ球菌のインビトロ診断の方法であり、ここで診断は、ＰＶＬを変性させるために前記生物試料を前処理するという点を特徴とするルーチンの免疫学的検査を使用するＰＶＬの検出によって実施される。

「ＰＶＬを産生する黄色ブドウ球菌」なる表現は、ＰＶＬを産生することができる全ての黄色ブドウ球菌株、すなわち、メチシリン感受性株（別名ＭＳＳＡ）とメチシリン耐性株（別名ＭＲＳＡ）の両方を意味することを目的とする。
「黄色ブドウ球菌に冒されやすい個体」なる表現は、危険にさらされている個体を意味することを目的とし、病院スタッフのようなこの菌の健康保菌者であってもよい。「黄色ブドウ球菌に感染しやすい個体」なる表現は、黄色ブドウ球菌による感染の症状を示している患者を意味することを目的とする。
「黄色ブドウ球菌による感染」なる表現は、これらの感染症がＰＶＬ産生黄色ブドウ球菌によるものであるか又はそのような性質を有しない黄色ブドウ球菌によるものであるかを問わず、生物体でこのバクテリアの存在によって引き起こされる何らかの感染症を意味することを目的とする。このような感染症の例として、皮膚及び軟組織の化膿性の感染症、気道感染症、中枢神経系感染症、尿路感染症、噴門弁及び血管内感染症、及び筋肉及び骨の感染症を記載することができる。このような感染症及びその関連する症状は、当業者に広く知られていて、特に臨床細菌学のハンドブック（文献５）に記載されている。
「黄色ブドウ球菌に冒されやすい又は感染しやすい個体に由来する生物試料」なる表現は、これらの菌、あるいは排出されたＰＶＬを含む何らかのサンプル、例えば膿、呼吸器からの試料、鼻の試料、尿または血液培養を意味することを目的とする。

本発明の方法で使用する生物試料は変更されていない試料であってもよく、あるいはこの試料に由来するバクテリアの培養物であってもよい。培養は、シャーレのような固体の培地上で、または培養液で実施されてもよく、培養液は前記試料と共に、あるいは、当業者に知られている方法、例えばシャーレ上のシーディングによって、前もって前記生物試料から分離される黄色ブドウ球菌のコロニーと共に、インキュベートされてもよい。それから、免疫学的検査は、直接、固形培地上において、または培養液中で実施される。一般に、関心のまたは前記試料の菌の培養は、ほぼ２４時間、続けられる。培養がどうであれ、培地が、阻害濃度以下のオキサシリンとバシトラシン（bactracin）のようなＰＶＬの多量の産生を可能にする分子の使用の有無にかかわらず、ＣＣＹ媒体（カゼイン加水分解物と酵母エキス培地）のようなＰＶＬ産生の促進剤を含む点に注意される。

「免疫学的検査」なる表現は、ＰＶＬのＬｕｋＦ部分であろうと、ＰＶＬのＬｕｋＳ部分であろうと、あるいは両方部分が同時であろうと、ＰＶＬに特異的に結合することができる結合パートナーを使用する任意の免疫学的検査を意味することを目的とする。
「ルーチンの免疫学的検査」なる表現は、研究所のルーチンの仕事において広く使用される任意の免疫学的検査を意味することを目的とする。ルーチンの免疫学的検査の例として、ＥＬＩＳＡまたは免疫クロマトグラフィー（別名、側方流動）タイプのサンドイッチ試験、及び、ポリスチレン粒子のような粒子の凝集検査を挙げることができる。これらの試験の全ては、当業者に広く知られている。サンドイッチ試験は、一つ以上の工程で、すなわち洗浄工程なしで、又は１以上の洗浄工程を有して、実施されてもよい。
ＰＶＬ特異的な結合パートナーの例として、ＰＶＬに結合が可能な抗体、抗体の一部、レセプター、ミモトープ及び任意の他の分子を挙げることができる。
結合パートナー抗体は、例えば、ポリクローナル抗体かモノクローナル抗体のどちらかである。
ポリクローナル抗体はＰＶＬ、ＰＶＬの部分またはＰＶＬペプチドによる動物の免疫化と、それに続く前記動物の血清の回収によって得ることができる。本発明の方法では、抗体は、精製されて又は未精製で用いられてもよい。ポリクローナル抗体の精製は、例えば前記動物の血清を採取し、他の血清構成成分から抗体を分離することによって、特に抗体によって認識される抗原、特定のＰＶＬ、が付けられたカラムにおける親和性クロマトグラフィーによって、実施されてもよい。

モノクローナル抗体はハイブリドーマ技術によって得ることができる。その一般の原理について以下に要約する。
第一工程において、動物、一般にはマウス（またはインビトロ免疫化における培養の細胞）は、ＰＶＬ、ＰＶＬの部分またはＰＶＬペプチドによって免疫化され、従ってこのマウスのＢリンパ球は前記抗原に対して抗体を産生することができる。これらの抗体を産生するリンパ球は、その後、ハイブリドーマを産生するために、「不滅の」骨髄腫細胞（例えばマウス）と融合される。従って、得られた細胞の異種混合物を、特定の抗体を産生すること及び無制限に増殖することが可能な細胞の選抜を形成するために用いる。各ハイブリドーマはクローンの形で増殖し、それぞれがＰＶＬを特に認識するモノクローナル抗体の産生に結果としてなる。本発明の方法では、抗体は、精製されて又は未精製で用いられてもよい。モノクローナル抗体は、上に記載されている親和性クロマトグラフィー技術に従って、特に精製することができる。
また、モノクローナル抗体は、当業者によく知られている技術を用いて、遺伝子工学によって得られる組換え抗体であってもよい。
「本発明の方法に有用な抗体断片」は、天然抗体のＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’又はｓｃＦｖタイプの断片であってＰＶＬに特異的な結合能力を保ったものを意味する。

本発明の方法は、以下の特徴を単独で又は組合せて、実施することが好ましい：
−ルーチンの免疫学的検査はサンドイッチ法である、
−ＬｕｋＳ−ＰＶ−またはＬｕｋＦ−ＰＶ−特異的結合パートナーを使用する、
−抗体断片、特にＦ（ａｂ’）２断片を使用する。
２つのＰＶＬ特異的結合パートナーを使用するサンドイッチ試験において、使用は、２つのモノクローナル抗体、２つのポリクローナル抗体またはそれらの断片、あるいは、１つのモノクローナル抗体と１つのポリクローナル抗体またはそれらの断片からなってもよい。粒子凝集検査において、単一のＰＶＬ特異的結合パートナーが使用され、例えばモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体のどちらかであり、断片の形であってもなくてもよい。

ある特定の実施態様によれば、免疫学的検査は、少なくとも一つの抗ＰＶＬモノクローナル抗体を使用する。
粒子凝集検査において、ＰＶＬ特異的結合パートナーが、捕獲方法で使われる。サンドイッチ試験において、それらは捕獲方法と検出方法で使われる。

結合パートナーは検出試薬として使われるときに、ＰＶＬ／結合パートナーの結合を明らかにするために標識化される。
「結合パートナーの標識」なる表現は、直接的にまたは間接的に検出可能なシグナルを生成することが可能な標識の付加を意味することを目的とする。これらの標識の非限定的リストは、
・西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、α‐ガラクトシダーゼまたはグルコース‐６‐リン酸デヒドロゲナーゼのような比色法、蛍光または発光によって検出可能なシグナルを生じる酵素、
・蛍光、発光又は染料化合物のような発色団、
・^３２Ｐ、^３５Ｓまたは^１２５Ｉのような放射性分子、及び
・アレクサまたはフィコシアニンのような蛍光分子
を含む。

また、間接的な検出システムを使用してもよく、例えば抗リガンドと反応可能なリガンドである。リガンド／抗リガンドの組は当業者にとって周知であり、こういう場合では、例えば、以下の組である：ビオチン／ストレプトアビジン、ハプテン／抗体、抗原／抗体、ペプチド／抗体、糖／レクチン、ポリヌクレオチド／ポリヌクレオチドに相補的な配列。この場合、結合パートナーを担持するのは、リガンドである。抗リガンドは、前の段落に記載されている標識を、直接に介して検出されてもよく、またはリガンド／抗リガンドを介してそれ自身が検出されてもよい。
特定の条件下では、これらの間接的な検出システムは、シグナルの増幅を生じることがある。このシグナル増幅技術は当業者によく知られており、J.Histochem.Cytochem. 45:481-491, 1997（文献６）の論文を参照してもよい。
使用する標識のタイプに従い、当業者は、標識を視覚化するための試薬を添加する。
「競合」法の場合、ＰＶＬは、結合パートナーのために上に記載したとおり標識される。
そして、それが捕獲方法で使われる場合、ＰＶＬ特異的結合パートナーは当業者に知られている方法を使用して固相に直接的または間接的に固定される。
本発明の方法で使用する試料の前処理は、当業者に広く知られている任意のタンパク質変性処理であってもよい。この処理は、例えばｐＨの変更によって、尿素、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）またはグアニジウムイオンのような化学変性剤を用いて、あるいは、変性するタンパク質を含む試料を加熱することによって、実施することができる。
ある実施態様によれば、前記試料の前処理は６０と１００℃の間の温度で加熱することを含む。好ましくは、加熱は８０と１００℃の間、より好ましくは９０と１００℃の間の温度で実施される。
当然ながら、ルーチンの免疫学的検査が前記試料に実施される場合には、試料の前処理は試料自体に適用され、あるいは免疫学的検査が培養物に実施される場合には、それは前記培養物に適用される。

また、本発明の方法は、前記生物試料中で黄色ブドウ球菌の存在を確認する追加の工程を含んでもよく、この工程は前もってまたは付随して実施することが可能である。これらのバクテリアを検出する方法は当業者に知られており、例として出願人のうちの１人により出願された特許出願ＷＯ０２／０７９４８６の、このバクテリアに特異的な発色剤を含む培地の使用をあげることができる。

同様に、本発明の方法は、前記生物試料に存在する黄色ブドウ球菌が、メチシリン耐性（ＭＲＳＡ）菌であるかメチシリン感受性（ＭＳＳＡ）菌であるかを決定することを含む追加の工程を含んでもよく、このことにより本発明の特定の実施態様を構成する。
メチシリン感受性（ＭＲＳＡまたはＭＳＳＡ）を決定するこの工程は、例えば、ＭＲＳＡだけによって発現されるタンパク質であるＰＢＰ２のタンパク質に特異的な結合パートナーを使用する免疫学的検査、核酸検出検査、あるいはオキサシリンまたはセファロスポリン（例えばセホキシチン）のような抗生物質を含む培地を使用する微生物学的試験法のような当業者に広く知られている方法によって、実施することができる。
本発明は、非限定的例として示される以下の実施例によって、更に、添付の図１から３によって、より明らかに理解される：

ＰＶＬを産生する（ＰＶＬ＋）か、またはＰＶＬを産生しない（ＰＶＬ−）黄色ブドウ球菌株を含む生物試料における、ＰＶＬの検出用のＥＬＩＳＡ試験の結果（株ごとのＯＤ）を示すグラフ。ＰＶＬを産生する（ＰＶＬ＋）か、またはＰＶＬを産生しない（ＰＶＬ−）黄色ブドウ球菌株を含む生物試料であって、ＰＶＬを変性させるために加熱によって前処理された前記試料における、ＰＶＬ検出用のＥＬＩＳＡ試験の結果（株ごとのＯＤ）を示すグラフ。ＰＶＬを産生する（ＬＹ９９００８４、Ａ９２００７、ＬＵＧ８５５）か、またはＰＶＬを産生しない（ＬＹ９９０３３３、ＬＹ９９１３２１、ＲＮ６９１１）黄色ブドウ球菌株を含む生物試料における、ＰＶＬ検出用のＥＬＩＳＡ試験の結果（株ごとのＯＤ）を示すグラフであって、前記試料はＰＶＬを変性させるために加熱によって前処理されたもの（処理１）、化学変性剤を使用して前処理されたもの（処理２）、または変性剤の使用と加熱によって前処理されたもの（処理３）であり、状態０は前処理なしの試料に対応する。

実施例１：抗ＰＶＬ抗体の調製
１．組換え体ＰＶＬの作出
それぞれ配列番号１及び配列番号２のＬｕｋＳＨｉｓ-ＴａｇとＬｕｋＦＨｉｓ-Ｔａｇタンパク質は、大腸菌株ＢＬ２１ｓｔａｒ（ＤＥ３）ｐＬｙｓ（インビトロゲン）の形質転換に用いられるベクターｐＩＶＥＸ２．４ｄ（ロシュ）を使用して、３７℃２リットルでの振盪培養の間に作成し、１ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド、Eurobio）と共に３７℃で３時間インキュベートし、そして更に５時間培養した。培養は、６つの異なるチューブに分配する。
各細胞ペレットは、２０分間、４０００ｇの遠心分離及び上清の除去によって回収する。組換えタンパク質は、供給元（キアゲン）の推奨に従ってQIAexpressionistキットを使用して精製する。ペレットは４℃の２０ｍｌの非変性細胞溶解溶液（キアゲン）で溶解し、それから−８０℃で一晩保存した。解凍後、Vibracell (Bioblock)を使用する１００ワット、６秒サイクルの２分間の音波破砕の前に、細胞溶解を４℃で１時間、１ｍｇ／ｍｌのリゾチーム(Eurobio)による処理を使用して続ける。
溶液は、４℃で３０分間、１００００ｇで遠心する。上清は４℃で３時間の穏やかな循環振動で、５ｍｌのアガロース-ＮｉＮＴＡ（キアゲン）と接触させられる。それから、アガロースを２０ｍｌのカラム（Biorad）に入れる。カラムを２００ｍｌの洗浄バッファー（キアゲン）で洗浄し、それから２５０ｍＭのイミダゾールを溶出バッファーとして溶出させる。この精製は、monoSPイオン交換カラム（アマシャム）による精製によって完了する。
組換えタンパク質を、Centricon（Vivaspin）で濃縮し、５０ｍＭのＭＥＳ（２-（Ｎ-モルホリノ）エタンスルホン酸）バッファーに対して透析し、それからＮａＣｌの勾配（０から１Ｍ）によって溶出する。それから、タンパク質は非火成（apyrogenic）滅菌水に対して透析される。

２．モノクローナル抗体の産生
以下のモノクローナル抗体：
−抗ＬｕｋＦ：１０Ｄ１Ａ１０、１６Ａ１０Ａ３、６Ｈ１０Ｅ５および
−抗ＬｕｋＳ：２Ｈ２Ｈ１２、３Ｄ９Ｄ１２、７Ｃ１Ｆ９、７Ｆ８Ｄ７、１８Ａ４Ｅ１０を、以下のようにして得た。

（抗ＬｕｋＦモノクローナル抗体：１０Ｄ１Ａ１０、１６Ａ１０Ａ３、６Ｈ１０Ｅ５）
マウスを以下のプロトコルに従って免疫化した：日数Ｄ０に、完全フロイントアジュバントの存在下で１０μｇの組換えＬｕｋＦタンパク質を腹腔内に注射した。日数Ｄ１４、Ｄ２８に、不完全フロインドアジュバントの存在下で同一量の組換えＬｕｋＦタンパク質を更に腹腔内に注射した。融合の４日前に、生食水中に希釈した５０μｇのＬｕｋＦ抗原を静脈内に注射した。
１６００の上清を間接ＥＬＩＳＡ技術でスクリーニングした。プレートを、１μｇ／ｍｌの抗原（組換えＬｕｋＦタンパク質）のＰＢＳバッファー（ｐＨ７．２）溶液１００μｌで「被覆」した。「被覆した」プレートは１８−２２℃の温度でオーバーナイトでインキュベートした。プレートを、２００μｌのＰＢＳ-１％ミルクで飽和させ、３７°±２℃で１時間のインキュベートに供した。１００μｌの上清またはＰＢＳバッファー-０．０５％ｔｗｅｅｎ２０で希釈した腹水を加え、プレートを３７°±２℃で１時間インキュベートした。アルカリホスファターゼ（Jackson Immunoresearch ref:115-055-062）にコンジュゲートしたヤギ抗マウスＩｇ（Ｈ＋Ｌ）ポリクローナル抗体であって、ＰＢＳバッファー-１％ＢＳＡに１／２０００に希釈したもの１００μｌを加え、続いてプレートを３７°±２℃で１時間インキュベートした。濃度２ｍｇ／ｍｌのＰＮＰＰ（ビオメリュー参照番号６０００２９９０）のＤＥＡ−ＨＣｌ（ビオメリュー参照番号６０００２９８９）溶液（ｐＨ＝９．８）を１００μｌ加えた。プレートは、３７°±２℃で３０分間のインキュベートに供した。反応は１００μｌの１ＮＮａＯＨの添加によって止めた。３回の洗浄を各工程の間に３００μｌのＰＢＳ-０．０５％ｔｗｅｅｎ２０で実施する。蒸留水中での更なる洗浄は、ＰＮＰＰを加える前に行われる。
７２の上清が、間接ＥＬＩＳＡでＯＤ＞０．６を有する陽性であるとわかった。特異性試験の後、上述した３つの抗体を産生する。

（抗ＬｕｋＳモノクローナル抗体：２Ｈ２Ｈ１２、３Ｄ９Ｄ１２、７Ｃ１Ｆ９、７Ｆ８Ｄ７、１８Ａ４Ｅ１０）
マウスを以下のプロトコルに従って免疫化した：日数Ｄ０に、完全フロイントアジュバントの存在下で１０μｇの組換えＬｕｋＳタンパク質を腹腔内に注射した。日数Ｄ１４、Ｄ２８に、不完全フロインドアジュバントの存在下で同一量の組換えＬｕｋＳタンパク質を更に腹腔内に注射した。融合の４日前に、生食水中に希釈した５０μｇの組換えＬｕｋＳタンパク質を静脈内に注射した。
１８００の上清を間接ＥＬＩＳＡ技術でスクリーニングした。プレートを、１μｇ／ｍｌの組換えＬｕｋＳタンパク質のＰＢＳバッファー（ｐＨ７．２）溶液１００μｌで「被覆」した。「被覆した」プレートは１８−２２℃の温度でオーバーナイトでインキュベートした。プレートを、２００μｌのＰＢＳ-１％ミルクで飽和させ、３７°±２℃で１時間のインキュベートに供した。１００μｌの上清またはＰＢＳバッファー-０．０５％ｔｗｅｅｎ２０で希釈した腹水を加え、プレートを３７°±２℃で１時間インキュベートした。アルカリホスファターゼ（Jackson Immunoresearch ref:115-055-062）にコンジュゲートしたヤギ抗マウスＩｇ（Ｈ＋Ｌ）ポリクローナル抗体であって、ＰＢＳバッファー-１％ＢＳＡに１／２０００に希釈したもの１００μｌを加え、そしてプレートを３７°±２℃で１時間インキュベートした。濃度２ｍｇ／ｍｌのＰＮＰＰ（ビオメリュー参照番号60002990）のＤＥＡ-ＨＣｌ（ビオメリュー参照番号60002989）溶液（ｐＨ＝９．８）を１００μｌ加えた。プレートは、３７°±２℃で３０分間のインキュベートに供した。反応は１００μｌの１ＮＮａＯＨの添加によって止めた。３回の洗浄を各工程の間に３００μｌのＰＢＳ-０．０５％ｔｗｅｅｎ２０で実施する。蒸留水中での更なる洗浄は、ＰＮＰＰを加える前に行われる。
５１の上清が、間接ＥＬＩＳＡでＯＤ＞０．６を有する陽性であるとわかった。特異性試験の後、上述した３つの抗体を産生する。

３．ポリクローナル抗体の産生
３．１．抗ＬｕｋＳポリクローナル抗体の産生
抗ＬｕｋＳポリクローナル抗体の番号１７３／８９及び１７６／８９を以下のとおりに得た：
日数Ｄ０に、ウサギ（ニュージランドホワイト種）は、２００μｇの、Ｎ末端がＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシニアン）（Agro-Bio）に結合された、配列ＣＳＧＨＤＰＮＬＦＶＧＹＫＰＹＳＱＮ（配列番号３）のＬｕｋＳ−ＰＶ合成ペプチドの皮内注射を接種された。日数Ｄ１４、Ｄ２８、Ｄ４２及びＤ８１に、ウサギは、ＫＬＨに結合された合成ペプチドの同一量の更なる皮下注射を受けた。動物の血清は、Ｄ０、Ｄ４９及びＤ８９に採取される。Ｄ８９でとられたウサギ血清は、前記合成ペプチド上の親和性クロマトグラフィーによって精製される。このために、前記ペプチドは、製造者（アマシャム−ファルマシア）の推奨に従って、１ｍｌのＨｉ−Ｔｒａｐセファロースカラム上へ連結される。血清はＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）で５０／５０に希釈され、そして１ｍｌ／分の速度でカラム上に注入される。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）による洗浄、そして５０ｍＭのグリシン／ＨＣｌ混合物（ｐＨ３）による溶出後に、溶出した分画は直ちに中和されて、そして０．１５ＭのＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対して透析された。

３．２．抗ＬｕｋＦポリクローナル抗体の産生
抗ＬｕｋＦポリクローナル抗体を以下のとおりに得た：
日数Ｄ０に、ウサギ（ニュージランドホワイト種）は、２００μｇの、Ｎ末端がＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシニアン）（Agro-Bio）に結合された、配列ＣＮＦＮＷＩＧＮＮＹＫＤＥＮＲＡＴＨＴＳ（配列番号４）のＬｕｋＦ−ＰＶ合成ペプチドの皮内注射を受けた。日数Ｄ１４、Ｄ２８、Ｄ４２及びＤ８１に、ウサギは、ＫＬＨに結合された合成ペプチドの同一量の更なる皮下注射を受けた。動物の血清は、Ｄ０、Ｄ４９及びＤ８９に採取される。Ｄ８９でとられたウサギ血清は、前記合成ペプチド上の親和性クロマトグラフィーによって精製される。このために、前記ペプチドは、製造者（アマシャム−ファルマシア）の推奨に従って、１ｍｌのＨｉ−Ｔｒａｐセファロースカラム上へ連結される。血清はＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）で５０／５０に希釈され、そして１ｍｌ／分の速度でカラム上に注入される。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）による洗浄、そして５０ｍＭのグリシン／ＨＣｌ混合物（ｐＨ３）による溶出後に、溶出した分画は直ちに中和されて、そして０．１５ＭのＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対して透析された。

４．抗体断片の産生と結合
抗ＬｕｋＳポリクローナル抗体１７３／８９及び１７６／８９は、それらのＦｃ断片を除去して、Ｆ（ａｂ’）断片を得るために、３７℃、ｐＨ３．５で１時間３０分間、アガロースに結合させたペプシンで消化した。
これらの断片は、以下の通りにペルオキシダーゼで標識化した：Ｆ（ａｂ’）２断片は、炭酸バッファー（ｐＨ９）に対して透析され、２モルのペルオキシダーゼにつき１モルのＦ（ａｂ’）２の割合で、１８−２５℃で２時間、ＮａＩＯ_４によって前もって酸化したペルオキシダーゼ（ロシュ）に結合される。それから、結合は２−８℃で１時間のＮａＢＨ_４によって止められ、次に産生物は防腐剤を含むＰＢＳバッファに対して透析される。
続いて、それらは、以下の通りにビオチンで標識化された：Ｆ（ａｂ’）２断片は、炭酸バッファー（ｐＨ９）に対して透析され、１０モルのビオチンにつき１モルのＦ（ａｂ’）２の割合で、１８−２５℃で１時間、ビオチン−ＮＨＳ（ロシュ）に結合される結合は２−８℃で２０分間のリシンによって止められ、次に産生物はＰＢＳ＋アジドに対して透析される。

実施例２：ＰＶＬ産生黄色ブドウ球菌の診断
１．生物試料の調製
黄色ブドウ球菌の臨床株は、ＧＰアガー（ディフコ：１０ｇ／ｌのペプトン、５ｇ／ｌのイースト抽出物、１７ｇ／ｌのアガー；シグマ：５ｇ／ｌのＮａＣｌ、１ｇ／ｌのグルコース）上で前培養される。３７℃で１８時間後、いくつかのコロニー（おおよそ１０^７ＣＦＵ／ｍｌ）を、２５ｍｌのガラスのエルレンマイヤーフラスコ中の、５ｍｌのＣＣＹ培地（ディフコ：３０ｇ／ｌのイースト抽出物、２０ｇ／ｌのカザミノ酸；シグマ：３．１１ｇ／ｌのＮａ_２ＨＰＯ_４２Ｈ_２Ｏ、０．４１ｇ／ｌのＫＨ_２ＰＯ_４、２３ｇ／ｌのピルビン酸）に接種する前に、純度を確認した。３７℃、１８時間の振盪培養の後、培養上清を遠心分離（８０００ｇ、４℃、１０分）の後で回収し、それから使用前に４℃又は−２０℃で短期間保存する。
各株には、識別子（Ａ又はＬＹに６つの数字を加えたもの）が与えられており、ＰＶＬを産生するならば「＋」、又はＰＶＬを産生しないならば「−」と表示する。

２．ＥＬＩＳＡ試験
ＥＬＩＳＡプレートのウェル（グライナー、１００μｌ／ウェル）は、抗ＬｕｋＳ抗体１８Ａ４Ｅ１０で被覆され、それはＰＢＳ（シグマＰＢＳ、ｐＨ７．４；０．１％のアジ化ナトリウム）中に１０μｇ／ｍｌで希釈したこの抗体の溶液により、周囲温度（ほぼ２２℃）で１８時間でのインキュベーションによって行われる。ＰＢＳＴｗｅｅｎ２０で５回洗浄（装置：Biorad ImmunoWash 1575）の後、プレートはＰＢＳＴｗｅｅｎ（０．０５％）／１０％ミルク／０．５％ＢＳＡ（シグマ）の溶液で周囲温度で２時間する（１５０μｌ／ウェル）。
ＰＢＳＴｗｅｅｎ（０．０５％）による５回の洗浄後、培養液上清を３７℃で７５分間インキュベートする。
ＰＢＳＴｗｅｅｎ（０．０５％）による５回の洗浄後、ＰＢＳ−Ｔ５％ミルク中に１／１００に溶解した、ウサギ抗体１７６−８９のペルオキシダーゼで標識したＦ（ａｂ’２）断片の溶液を３７℃で７５分間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎによる５回の洗浄後、７５μｌのＴＭＢ溶液（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジン基質、シグマ）を加えて、暗所で３０分間インキュベートした。反応は、７５μｌの１ＮＨ_２ＳＯ_４の添加により、止めた。プレートは、マイクロプレートＭＰリーダー６８０（Biorad）を使用して４５０ｎｍで読んだ（ＯＤ）。

３．結果
結果は、各株のＯＤを示すグラフである図１に示す。
結果は、１５のＰＶＬ＋株の中で１２株が明らかに検出され、１４のＰＶＬ−株の中で３つの偽陽性結果が観察されたことを示す。
これらの結果は、ルーチンの免疫学的検査を使用してＰＶＬ＋株とＰＶＬ−株を区別することが可能であるが、後者が特異性を欠いていることを明らかに示す。

実施例３：加熱による生物試料の前処理後のＰＶＬ産生黄色ブドウ球菌株の診断
１．試料の処理
生物試料は、実施例２で調製されたように、１０から３０分にわたる時間で、９５℃で加熱によって処理され、それらのＯＤは実施例２に記載されているプロトコルに従って決定された。
ＯＤ結果は下の表１に示す。それはＰＶＬの変性が１０分の処理の先から得られることを示す。
表１

２．ＥＬＩＳＡ試験
９５℃で１時間変性した２９株（１５のＰＶＬ＋と１４のＰＶＬ−）の培養液上清を使用したことを除いては、上記実施例２のポイント２に記載の手順を繰り返した。
３．結果
結果は、各株のＯＤを示すグラフである図２に示す。
結果は、ＰＶＬ−株を識別をするために十分に高いＯＤレベルで、全てのＰＶＬ＋株が本発明の方法によって識別されることを示す。
従って、前処理により、本発明の方法の特異性を高めることができる。

実施例４：数種類の変性処理を使用する生物試料の前処理後のＰＶＬ産生黄色ブドウ球菌株の診断
１．試料の処理
３つの臨床ＰＶＬ＋株（ＬＹ９９００８４、Ａ９２００７、ＬＵＧ８５５）と３つの臨床ＰＶＬ−株（ＬＹ９９０３３３、ＬＹ９９１３２１、ＲＮ６９１１）を使用し、以下の処理にかけられた：
−処置なし（０）、
−９５℃で１時間の加熱による変性（１）、
−最終濃度０．１ＭのＫＨ_２ＰＯ_４の酸で変性し、３０分間ボルテックスにかけ、そしてＮａＯＨの添加による中和（２）、
−最終濃度０．１ＭのＫＨ_２ＰＯ_４の酸で変性し、１０分間ボルテックスにかけ、そして９５℃で１０分間沸騰し、続いてＮａＯＨの添加による中和（３）。

２．ＥＬＩＳＡ試験
上記ポイント１に従って調製した株及びペルオキシダーゼで標識化したウサギ抗体１７６−８９、Ｆ（ａｂ’２）断片の溶液であってＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ５％ミルクで１／１０００で希釈したものを使用したことを除いては、実施例２に記載の手順を繰り返した。
３．結果
結果は、各株のＯＤを示すグラフである図３に示す。
試料の処理が何であれ、結果は、全てのＰＶＬ−株が０．０９と０．１８１との間のＯＤ値を有することを示す。
ＰＶＬ＋株では、処置後にＯＤ値はＰＶＬ−株のそれらより高い。熱処理がこれらの条件下で最も効果的に見えるけれども、化学処理によって、熱処理によって及び２つの組合せによって得られたＯＤの増加は統計学的に有意である（それぞれ、ｐ＝０．０２４、ｐ＜０．００１、ｐ＝０．０１８）。
従って、前処理によりルーチンの免疫学的検査の特異性を高めることができる。

実施例５：本発明の方法を使用するＰＶＬ産生黄色ブドウ球菌の早期検出の実証
１．生物試料の調製
黄色ブドウ球菌の４つの臨床株（２つのＰＶＬ＋株と２つのＰＶＬ−株）を、実施例２に記載されている手順に従って、前培養した。コロニーは、２５ｍｌのガラスのエーレンマイヤーフラスコで、５ｍｌのＣＣＹ培地に豊富に接種を行うために用いられる。培地から、接種の直後に、そして連続して１時間、２時間、３時間及び１８時間、３７℃の振盪培養後に試料をとった。培養液上清を遠心分離（８０００ｇ、４℃、１０分）の後で回収し、それ後、使用前に４℃または−２０℃で短期間、保存した。試料は、実施例３に記載されるように、加熱によって処理される。
２．ＥＬＩＳＡ試験
上のポイント１に記載したとおりに調製した株の培養液上清を使用したことを除いては、上の実施例２のポイント２に記載されている手順を繰り返した。
３．結果
ＯＤ結果を表２に示す。それはＰＶＬが本発明の方法によって非常に迅速に検出できることを示す（時間の培養組織の先から明確な検出）。
表２

実施例６：本発明の方法を使用する生体試料のＰＶＬの早期検出の実証
１．生物試料の調製
臨床標本は、ＰＶＬ＋株またはＰＶＬ−株のどちらかの黄色ブドウ球菌感染を有する患者の気管支肺吸引物、気管支肺胞洗浄液及び皮膚膿瘍の膿、又は深い化膿の膿である。これらの標本は、本発明の方法を使用して解析される前に−２０℃で保存した。標本は、周囲温度での解凍後に、１５分間のボルテックスによって均質化される。遠心分離（１０分、１５°Ｃで４０００ｒｐｍ）の後、上清をエッペンドルフチューブに移し、そして９５℃で１時間変性した。
非常に粘りけのある試料のために、試料は、はじめにＰＢＳ（ｐＨ７．４）で５０／５０に希釈し、そして１５分間ボルテックスした。遠心分離（１０分、１５°Ｃで４０００ｒｐｍ）の後、上清をエッペンドルフチューブに移し、そして９５℃で１時間変性した。
粘りけのある試料の場合、後者をｎ−ヘプタン（メルク）で５０／５０に希釈し、再び１０分間ボルテックスした。遠心分離（１０分、１５°Ｃで４０００ｒｐｍ）の後、ｎ−ヘプタンに対応する上相を完全に取り除き、下相を９５℃で１時間変性するために他のエッペンドルフチューブに移した。
２．ＥＬＩＳＡ試験
上のポイント１に記載したとおりに処理した生物試料を使用することを除いては、上の実施例２のポイント２に記載されている手順を繰り返した。
３．結果
ＰＶＬ分析の結果を表３と４に示す。それは、メチシリン感受性株であろうと、ＰＶＬが、標本で直接検出できること、及び偽陽性がないこと（ＰＶＬ−株を有する試料は、ＰＶＬを含むものとして検出されないこと）を示す。さらに、ｎ−ヘプタンによる標本の前処理は、ＰＶＬの検出をそこなわない。
表３

＊株がＰＶＬ−またはＰＶＬ＋であったか否かの決定は、Vandenesch等（文献２）によって記載された方法に従って、黄色ブドウ球菌分離株のなかで、ＰＣＲによる、ＰＶＬをコードするＬｕｋＳ−ＰＶ及びＬｕｋＦ−ＰＶ遺伝子の存在の検出によって実施された。
表４

表４のつづき

＊株がＰＶＬ−またはＰＶＬ＋であったか否かの決定は、Vandenesch等（文献２）によって記載された方法に従って、黄色ブドウ球菌分離株のなかで、ＰＣＲによる、ＰＶＬをコードするＬｕｋＳ−ＰＶ及びＬｕｋＦ−ＰＶ遺伝子の存在の検出によって実施された。
＊＊メチシリン耐性をコードするｍｅｃＡ遺伝子の検出は、Vandenesch等（文献２）によって記載された方法に従って、黄色ぶどう球菌分離株で実施された。

（文献）
1:Ward PD, Turner WD, 1980, Infect. Immun., 28(2): 393-397
2:Vandenesch等, 2003, Emerg Infect Dis, 9(8): 978-984
3:Dufour P等, 2002, Clin Infect Dis , 35: 819-824
4:Cribier B等, 1992, Dermatology, 185: 175-185
5:Freney J等, 2000, Precis de Bacteriologie Clinique [Handbook of clinical bacteriology], 40: 298 及び 793-794
6:J. Histochem. Cytochem. 45: 481-491, 1997
7:Labandeira-Rey M等, Science 2007, 印刷中

Claims

黄色ブドウ球菌に冒されやすいか又は感染しやすい個体に由来する生物試料を使用する、Panton-Valentineロイコシジン（ＰＶＬ）を産生する黄色ブドウ球菌のインビトロ診断の方法であって、診断はルーチンの免疫学的検査としてＥＬＩＳＡ、側方流動免疫クロマトグラフィー又は凝集検査を使用してＰＶＬを検出することによって実施されるものであり、前記生物試料はＰＶＬを変性させるために前処理されることを特徴とする方法。
ルーチンの免疫学的検査がサンドイッチ法を用いたＥＬＩＳＡ又は側方流動免疫クロマトグラフィーであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
免疫学的検査が少なくとも一つの抗ＰＶＬモノクローナル抗体を使用することを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
前処理が６０と１００℃の間の温度における少なくとも１０分間の加熱を含むことを特徴とする、請求項１から３の何れか一項に記載の方法。
前記生物試料に存在する黄色ブドウ球菌が、メチシリン耐性（ＭＲＳＡ）菌であるか又はメチシリン感受性（ＭＳＳＡ）菌であるかを決定することを含む追加の工程を含むことを特徴とする請求項１から４の何れか一項に記載の方法。