CN1880959A - 一种指示高剂量钩状效应的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及体外检测技术领域，具体地涉及一种在免疫检测样本时指示高剂量钩状(HD－HOOK)效应的方法和相应的试剂盒。

Description

一种指示高剂量钩状效应的方法
技术领域
本发明涉及体外检测技术领域，具体地涉及一种在免疫检测血清样本时指示高剂量钩状(HD-HOOK)效应的方法。
背景技术
HD-HOOK效应是指在双位点夹心免疫实验中，其剂量反应曲线的高剂量(HIGH DOSE，HD)区段，线性走向不是呈平台状无限后延，而是向下弯曲状，似一只钩子或一把镰刀(HOOK)，根据此现象写实性地称之为″HD-HOOK″效应(Miles LEM，Lipschitz DA，Bieber CP and Cook JD：Measurement of serum ferritinby a 2-site immunoradiometric assay.Analyt Biochem 61：209-224，1974.)
产生HD-HOOK效应的分子机理有″分子变构说″和″浓度效应″等推论(《临床免疫学检验的进展》南京军区南京总医院全军医学检验中心，武建国；《ELISA的质量管理》江苏省临床检验中心，许斌；《肿瘤标志物检测的影响因素和应用原则》华中科技大学同济医学院附属协和医院，吴健民)。
HD-HOOK效应在免疫检测中经常发生，其发生率在占阳性样本30％左右。由于HD-HOOK效应的存在导致被检测样本不能被正确区分为是由于其浓度超出检测试剂盒的线性范围还是本身浓度就是该值，以至于实验误诊，尤其是导致假阴性率上升。
因此，本领域迫切需要开发新的简便的、有效指示HD-HOOK效应的方法，提高双位点夹心免疫测定的准确性，同时降低双位点夹心免疫测定的假阴性率。
发明内容
本发明的目的就是提供一种简便的、有效指示HD-HOOK效应的方法，提高双位点夹心免疫测定的准确性，从而降低双位点夹心免疫测定的假阴性率。
在本发明的第一方面，提供了一种检测样品中目标抗原的免疫夹心检测方法，包括以下步骤：
(a)将样品、检测微球和标记了可检测信号的第二抗体混合，形成一反应体系，其中所述的检测微球是如I式所示的第一抗体-微球的二元复合物，
                         anti1X-bead                    (I)
式中，“X”表示目标抗原，“anti1X”表示针对所述目标抗原“X”的第一抗体，“bead”表示微球，“-”表示第一抗体与微球之间的结合方式(如共价键或非共价键)，
并且所述的第二抗体与第一抗体可同时结合于目标抗原的不同表位，
从而形成“第二抗体-抗原-第一抗体-微球”四元复合物；
(b)将指示微球加入到步骤(a)的体系中，其中指示微球是式II所示的目标抗原-微球的二元复合物，
                         X-bead’                       (II)
式中，“bead’”表示可与“bead”互相区别的不同微球，“-”表示目标抗原X与微球之间的结合方式(如共价键或非共价键)，
从而在带有可检测信号的第二抗体存在下，形成“第二抗体-抗原-微球”三元复合物；
(c)检测反应体系中所述四元复合物中微球上的可检测信号，并与标准值或标准曲线比较，从而确定反应体系中目标抗原的存在与否和/或数量；
并且检测反应体系中所述三元复合物中微球上的可检测信号，得到指示微球的信号值，并与无HD-HOOK效应时的指示微球信号值(正常值)比较，当指示微球测量值小于指示微球正常值时，则判定目标抗原的测定结果不可靠；如果指示微球测量值大于或等于指示微球正常值时，则判定样品中目标抗原的浓度处于可测量范围。
在另一优选例中，在步骤(b)中，目标抗原与微球之间的结合方式有共价键或配基反应或非特异性吸附。
在另一优选例中，在步骤(c)中，当指示微球测量值≤0.9×指示微球正常值时，则判定样品存在HD-HOOK效应。
在另一优选例中，目标抗原数量为1-100种。
在另一优选例中，所述的抗原是蛋白质。
在另一优选例中，第一抗体与相应的第二抗体的摩尔比为1∶0.1-1∶2。
在另一优选例中，所述的各种微球bead与bead’是带不同荧光的微球。
在另一优选例中，所述指示微球正常值是用以下方法确定的：
(a’)将浓度已知且处于测量范围的目标抗原标准品系列分别与所述检测微球、所述带有可检测信号的第二抗体混合，形成一反应体系，从而形成不同目标抗原标准品浓度的“第二抗体-抗原-第一抗体-微球”四元复合物；
(b’)将所述的指示微球加入到步骤(a’)的体系中，从而在带有可检测信号的第二抗体存在下，形成不同目标抗原标准品浓度的“第二抗体-抗原-微球”三元复合物；
(c’)检测所述三元复合物中微球上的可检测信号，以P+2SD为指示微球正常值，式中P表示不同目标抗原标准品浓度时，三元复合物中微球信号值的平均值，2SD为2倍的微球信号值的标准偏差。
在本发明的第二方面，提供了一种用于检测目标抗原的试剂盒，它包括：多个容器，以及分别装于容器中的下列物质：
(a)检测微球，其中所述的检测微球是如I式所示的第一抗体-微球的二元复合物，
                         anti1X-bead                    (I)
式中，“X”表示目标抗原，“anti1X”表示针对所述目标抗原“X”的第一抗体，“bead”表示微球，“-”表示第一抗体与微球之间的结合方式(如共价键或非共价键)；
(b)带有可检测信号的第二抗体，其中，所述的第二抗体与第一抗体可同时结合于目标抗原的不同表位；
(c)指示微球，所述指示微球是式II所示的目标抗原-微球的二元复合物，
                         X-bead’                       (II)
式中，“bead’”表示可与“bead”互相区别的不同微球，“-”表示目标抗原X与微球之间的结合方式(如共价键或非共价键)。
在另一优选例中，所述的试剂盒含有针对1-100种目标抗原的相应的检测微球、带有可检测信号的第二抗体，和指示微球，并且所述的各种微球bead与bead’是带不同荧光的微球。
本发明的其他方面，在阅读了本申请之后，对于本领域技术人员而言是显而易见的。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究发现，通过设立HD-HOOK指示微球，可以简便有效地排除双位点夹心免疫测定中HD-HOOK效应所导致的假阴性率，从而提高双位点夹心免疫测定的准确性。
如本文所用，术语“第一抗体”、“一抗”可互换使用，指可特异性结合于某一抗原(如肿瘤标志物)的一种抗体。
如本文所用，术语“第二抗体”、“二抗”可互换使用，指可特异性结合于某一抗原(如肿瘤标志物)的另一种抗体。例如，对于同一种抗原(如肿瘤标志物)而言，相应的第一抗体和第二抗体是不同的，并且可同时结合于所述的抗原的不同表位。
如本文所用，术语“抗原”指具有免疫原性的物质，例如蛋白质、多肽。代表性的抗原例子包括(但并不限于)：细胞因子、肿瘤标志物、金属蛋白类、心血管糖尿病相关蛋白等。
如本文所用，术语“肿瘤标志物”是指在肿瘤的发生和增殖过程中，由肿瘤细胞本身所产生的或者是由机体对肿瘤细胞反应而产生的，反映肿瘤存在和生长的一类物质。代表性的肿瘤标志物包括(但并不限于)：甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、癌抗原125(CA125)、糖抗原19-9(CA19-9)、总前列腺特异性抗原(PSA)、游离前列腺特异性抗原(f-PSA)、神经原特异性烯醇化酶(NSE)、糖链抗原(CA242)、癌抗原(CA15-3)、人绒毛膜促性腺激素(β-HCG)。
基本原理
(a)双抗夹心法的原理
双抗夹心免疫检测法的基本原理是本领域技术人员所熟知的。常规的做法是将一抗固定于固相载体，然后一抗与抗原反应，洗涤后再与标有酶的二抗反应，洗涤，最后进行化学发光或酶联显色反应检测信号。
(b)Luminex xMAP法的原理
Luminex xMAP是一个非常灵活的多功能技术平台。其原理是把微小的乳胶颗粒(Beads，简称为“微球”)分别染成不同的荧光色，然后再把针对不同检测物的蛋白(如抗原抗体)以共价方式结合到特定颜色的微球上。应用时，先把针对不同检测物的、用不同颜色编码的微球混合，再加入被检测物(被测物可以是血清中的抗原、抗体、或酶等)。在悬液中的微球与被检测物特异性地结合，并加上荧光标记。然后，微球成单列通过两束激光，一束判定微球的颜色从而决定被测物的特异性(定性)；另一束测定微球上的荧光标记强度从而决定被测物的量(定量)，所得到的数据经电脑处理后可以直接用来判断结果。
在一个优选例中，充分利用了一抗固定在不同流动微球(Beads)的特点，同时优化藻红蛋白(PE)标记的二抗的浓度，将交联了一抗的微球溶液与血清样本或抗原标准质控品液、PE标记的二抗溶液依次或同时一并加入反应容器中，从而发生以下反应：
①微球上的一抗与血清或标准质控品液中相应的抗原(即肿瘤标志物抗原)结合，形成“肿瘤标志物-第一抗体-微球”三元复合物，
②二抗与血清或标准质控品液中相应的抗原(即肿瘤标志物抗原)结合，最终形成“第二抗体-肿瘤标志物-第一抗体-微球”四元复合物(包括微球交联的一抗-血清相应抗原-PE标记的复合物或微球交联的一抗-标准质控品液的抗原-PE标记的复合物)，反应过程中不须离心洗涤，在液相中即可通过Luminex xMAP检测复合物的荧光，达到从反应到定性定量分析一步完成的效果，即：一步法。
在Luminex检测仪上，这些微球被微量液体传送系统排成单列，通过两束激光，一束判定微球的编码从而决定被测肿瘤标志物的种类；另一束测定微球上PE的荧光强度，经数据处理得出被测肿瘤标志物的含量。
关于Luminex xMAP的技术平台详细资料，请参见产品说明书或文献，(1)Cancer Chemotherapy and Pharmacology，51：321-327，(2)Journal ofImmunological Methods，227：41-52；(3)www.luminexcorp.com。
(c)指示HD-HOOK方法的原理
一方面，在本发明方法中，首先在1种荧光编码的微球(称为1号球)上以共价键方式交联针对某种抗原的一抗；加入血清样本或标准质控品液、藻红蛋白(PE)标记的对应于该种抗原的二抗溶液(正常检测这种抗原浓度，与普通的、不具有HD-HOOK效应指示功能的方法相同)。这时同时发生以下反应：
①1号微球上的一抗与血清或标准质控品液中相应的抗原结合，
②二抗与血清或标准质控品液中相应的抗原结合，最终形成“1号荧光编码微球交联的一抗-血清相应抗原-PE标记的二抗”构成的四元复合物，或“1号荧光编码的微球交联的一抗-标准质控品液的抗原-PE标记的二抗”构成的四元复合物。
在Luminex检测仪上，荧光编码的微球被微量液体传送系统排成单列，通过两束激光，一束判定微球的编码从而决定被测抗原的种类；另一束测定微球上PE的荧光强度，经数据处理得出被测抗原的含量。
另一方面，在2号荧光编码的微球上以共价键方式交联被检测抗原纯品。在1号交联有一抗的微球和样本、二抗-PE反应结束之后，将所述交联有抗原的2号荧光编码的微球(称为“HD-HOOK指示微球”)加入反应系统中。
此时，如果样品中待检测抗原的浓度处于非HD-HOOK区(即样品中含有待检测抗原的数量并不明显大于检测体系中二抗的数量，因此有一部分或较多的二抗呈未结合状态)，那么会发生以下反应：2号微球上的抗原与反应系统中剩余的游离的二抗-PE结合，最终形成“2号荧光编码微球交联的抗原-PE标记的二抗”的三元复合物。这导致后续检测中，可检测到一定数量的所述三元复合物。
与此相反，如果样品中待检测抗原的浓度超过检测的线性区域而处于HD-HOOK区(即样品中含有目标抗原的数量明显大于检测体系中二抗的数量，则几乎所有的二抗都结合于样品中的目标抗原，故体系中没有或基本上没有未结合状态的二抗)，那么2号微球上的抗原将很难遇到与反应系统中剩余的游离的二抗-PE结合，因此难以形成“2号荧光编码微球交联的抗原-PE标记的二抗”构成的三元复合物。这导致后续检测中，检测不到“2号荧光编码微球交联的抗原-PE标记的二抗”构成的三元复合物或读数很低。
在Luminex检测仪上，荧光编码的2号与1号微球同时进行处理，微球被微量液体传送系统排成单列，通过两束激光，一束判定微球的编码从而决定为HD-HOOK指示微球；另一束测定微球上PE的荧光强度，根据荧光信号强弱判断该血清样本是否为HD-HOOK血清样本。如果来自2号微球(HD-HOOK指示微球)的荧光强度较低(如低于无HD-HOOK效应时的指示微球荧光信号值(正常值)的90％，较佳地低于50％，更佳地低于30％，最佳地低于10％)，则可判定样品中待测抗原的浓度处于HD-HOOK区，即样品是HD-HOOK样品。
以下，以抗原是肿瘤标志物的情况为例，进一步说明本发明的相关操作细节。
第一抗体-微球的二元复合物
在本发明中，第一抗体-微球的二元复合物具有式(I)结构：
                         anti1X-bead                    (I)
式中，X表示肿瘤标志物，anti1X表示抗肿瘤标志物X的第一抗体，bead表示微球，-表示第一抗体与微球之间的共价键；
一抗与微球的交联
针对不同肿瘤标志物抗原的一抗(anti1X，X代表肿瘤标志物抗原)与微球共价交联的详细操作程序可用常规方法，例如按照Luminex公司的产品说明书或网站： www.luminexcorp.com中所述的方法进行偶连，从而得到不同微球与相应一抗形成偶连物anti1X-Beads。
分别取针对不同肿瘤标志物的anti1X-Beads，按一定比例混合就可得到第一抗体溶液(简称为A液)。
抗原-微球的二元复合物(HD-HOOK指示微球)
按上述类似方法，将被检测抗原纯品与另一种号码的微球共价交联，形成抗原-微球的二元复合物(即HD-HOOK指示微球)，相应的溶液简称为H液(HD-HOOK效应指示微球悬液)。
二抗的标记
虽然二抗可用各种本领域已知的可检测信号进行标记。然而，优选的是用荧光信号进行标记，尤其是通过生物素-亲和素连接方式标记PE。
在一优选例中，二抗的生物素(Biotin)标记方法如下：分别取针对不同肿瘤标志物抗原的二抗(anti2X，X代表肿瘤标志物抗原)透析纯化后加入生物素二甲基亚砜(DMSO)溶液，避光反应，透析去除未反应的生物素，保存备用。
分别取针对不同肿瘤标志物抗原的生物素标记的anti2X，按比例混合，加入亲和素(Streptavidin)标记的PE，使生物素与Streptavidin结合，生成带荧光素标记的第二抗体(即PE-anti2X，其中PE表示藻红蛋白)，得到第二抗体溶液(简称为C液)。
质控或标准
为了消除假阳性和假阴性，宜在检测过程中设置质控。用某种抗原的标准品配制一定浓度范围内的标准品溶液，为B液。
此外，为了获得定量结果，可以在检测过程中设置含已知浓度的多个肿瘤标志物的标准品。
例如，抗原标准(STDn，n＝0～5)和质控品(质控1、质控2)溶液的配制可按下表配制
表1：混合抗原标准质控品溶液配制表
肿瘤标志物TM STD0 STD1 STD2 STD3 STD4 STD5 质控1 质控2
1 0 C1-1 C1-2 C1-3 C1-4 C1-5 C1-6 C1-7
2 0 C2-1 C2-2 C2-3 C2-4 C2-5 C2-6 C2-7
3 0 C3-1 C3-2 C3-3 C3-4 C3-5 C3-6 C3-7
4 0 C4-1 C4-2 C4-3 C4-4 C4-5 C4-6 C4-7
5 0 C5-1 C5-2 C5-3 C5-4 C5-5 C5-6 C5-7
6 0 C6-1 C6-2 C6-3 C6-4 C6-5 C6-6 C6-7
······ 0 ······ ······ ······ ······ ······ ······ ······
40 0 C40-1 C40-2 C40-3 C40-4 C40-5 C40-6 C40-7
表中第1列为不同的肿瘤标志物，STD0表示该标准溶液中的所有肿瘤标志物的浓度均为0，为标准曲线的起始点；STD1表示该标准溶液中的不同肿瘤标志物的浓度分别为C1-1、C2-1、C3-1……C40-1，为标准曲线的第2点；依此类推STD2、STD3、STD4、STD5的含义；质控1表示该标准溶液中的不同肿瘤标志物的浓度分别为C1-6、C2-6、C3-6……C40-6，介于STD0和STD5之间，为内部质控点；质控2表示该标准溶液中的不同肿瘤标志物的浓度分别为C1-7、C2-7、C3-7……C40-7，介于STD0和STD5之间，为另1内部质控点。STD0～STD5及质控1和质控2构成质控液(简称为B液)。
将上述的第一抗体溶液、质控液和第二抗体溶液(即A、B和C液)依次或同时混匀，然后充分反应(如在37±5℃反应10-100min)，随后在luminex100上读数，即可得到多条标准曲线(具体数目由肿瘤标志物组合中不同的肿瘤标志物数目决定)。
样品的检测
可用本发明方法检测的样品没有特别限制，可以是任何含有肿瘤标志物的样品，代表性的例子包括血清样本、尿液样本、唾液样本等。优选的样品是血清样品。
(a)测定无HD-HOOK效应时2号微球的荧光信号值
以仅检测一种抗原为例，1号微球为交联有一抗的微球(称为检测微球)；2号微球为交联有抗原的微球(HD-HOOK指示微球)，其中HD-HOOK指示微球的编码荧光不同于检测微球的检测荧光。将A、B和C液混匀，37℃反应30min，然后加入H液，37℃反应10min，在luminex100上读数，1号微球上得到不同抗原浓度与对应的荧光信号作标准曲线；2号微球上对应的为无HD-HOOK效应时的指示微球信号值(正常值)；
(b)HD-HOOK效应的指示和样本中抗原的定量检测
将A、人血清样本和C液混匀，37℃反应30min，然后加入H液，37℃反应10min，在luminex100上读数，1号微球上的荧光信号根据标准曲线换算出某种抗原的浓度。2号微球上的荧光信号与上述步骤确定HD-HOOK效应阴性的荧光信号值比较其大小。
如果指示微球的荧光信号值等于或小于无HD-HOOK效应时的指示微球信号值(正常值)的90％(较佳地等于或低于50％，更佳地等于或低于30％，最佳地等于或小于10％))，则判断该样本为HD-HOOK效应阳性。
如果同时检测样品中的多种抗原，可以相应地使用多种检测微球和HD-HOOK指示微球，即对每一种可以使用一种检测微球和HD-HOOK指示微球，并且各种检测微球和指示微球的具有不同的编码荧光，从而可以相互区分。
本发明的主要优点在于：
(a)显著提高双位点夹心免疫测定的准确性，同时降低双位点夹心免疫测定的假阴性率。
(b)操作简单。
(c)非常适用于同时检测样品中的多种抗原。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例
材料：
抗原和抗体来源：
  原料   批号/货号   厂商
  CA125-抗体   M86306M(groupA)   Biodesign
  CA125-抗体   M86294M(groupB)   Biodesign
  CA125Ag   30AC20   Fitzgerald
  CA153-抗体   M37901M(clone695)   Biodesign
  CA153-抗体   M37552M(clone552)   Biodesign
  CA153Ag   30AC16   Fitzgerald
  f-PSA-抗体   M86209M(total)   Biodesign
  f-PSA-抗体   M86806M(PEree)   Biodesign
  PSA抗原   A86878H Pure   Biodesign
  T-PSA-抗体   M86506M(total)   Biodesign
  T-PSA-抗体   M86209M(total)   Biodesign
  PSA抗原   A86878H Pure   Biodesign
  CA199-抗体   M8073022   Fitzgerald
  CA19-9Ag   30AC14   Fitzgerald
  原料   批号/货号   厂商
  NSE-抗体   9601   Medix
  NSE-抗体   9602   Medix
  NSE Ag   30-AN10   Fitzgerald
  β-HCG-抗体   5012   Medix
  β-HCG-抗体   5006   Medix
  β-HCG Ag   A81455M   Biodesign
  CA242-抗体   101-01   Canag
  CA242Ag   Canag
  AFP-抗体   G4   上海第二军医大学
  AFP-抗体   C2   上海第二军医大学
  AFP Ag   Biodesign
  CEA-抗体   A1   上海第二军医大学
  CEA-抗体   C9   上海第二军医大学
  CEA Ag   A86808H   Biodesign
微球(Beads)购自美国Luminex公司，规格为5.0μm，微球表面为-COOH修饰，其他常规试剂为市售品。
实施例1：
10种肿瘤标志物并行检测(无HD-HOOK指示)
1.准备
1.1一抗预先去除含氨基小分子和杂蛋白(透析或过层析柱)，测量其浓度。
1.2在1.5ml聚丙烯离心管中，精确称取5mg左右N-hydroxysulfosuccinimide(NHS)，备用(防潮)。
1.3在1.5ml聚丙烯离心管中，精确称取5mg左右N-ethyl-N’(3-dimethylainopropyl)-carbodiimide(EDC)，备用(防潮)。
2.微球(Beads)活化
2.1微球原液旋涡混旋仪混悬20秒，移取200μL微球(相当于2.5×106微球)于1.5ml聚丙烯离心管中。
2.2 15000rpm离心2分钟(设置3分钟)，移去上清液。
2.3加入100μL蒸馏水，旋涡混旋仪混悬20秒，15000rpm离心2分钟，移去上清液。
2.4重复2.3。
2.5加入80μL 0.1mol/L磷酸缓冲液(PBS)，pH 6.2，旋涡混旋仪混悬20秒。
2.6用蒸馏水将(NHSS)稀释至50mg/ml。(现配现用)
2.7取10μL 50mg/ml(NHSS)加到Beads溶液中，旋涡混旋仪混悬20秒。
2.8用蒸馏水将EDC稀释至50mg/ml。(现配现用)
2.9取10μL 50mg/ml EDC加到Beads溶液中，旋涡混旋仪混悬20秒。
2.10避光、37℃孵育20分钟。
2.11 15000rpm离心2分钟，移去上清液。
2.12加入250μL 50mmol/L 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid(MES)(MES)pH5.0。
2.13 15000rpm离心2分钟，移去上清液。
2.14重复2.12，2.13，马上进行下步实验。
3.交联、封闭和储存
3.1加20μg已处理的一抗到已活化的Beads中，旋涡混旋仪混悬20秒。
3.2避光、37℃反应2小时，每十五分钟混匀一次。
3.3加入1ml PBS-TBN，旋涡混旋仪混悬20秒，15000rpm离心2分钟。移去上清液(PBS-TBN的组成为10mmol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液、0.02％吐温20、1mg/ml的小牛血清白蛋白和0.05％叠氮钠)。
3.4加入500μL PBS-TBN，旋涡混旋仪混悬20秒，15000rpm离心2分钟。移去上清液。
3.5加入500μL PBS-TBN，旋涡混旋仪混悬20秒。
3.6 2-8℃避光保存。
4.二抗(anti2X)的生物素标记
4.1二抗预处理
  二抗中含有叠氮钠、甘氨酸等含氨基的小分子和其它小分子   用pH7.4的1×PBS充分透析。
  二抗中含有牛血清白蛋白等大分子   Protein A柱或其它柱子纯化。
  二抗浓度标定   分光光度计测其OD280(1OD280相当于0.7mg/ml单克隆抗体)。最终用1×PBS，pH7.4将浓度定于2mg/ml(浓缩使用Pall公司脱盐离心柱)。
4.2生物素标记反应
取上述预处理的二抗25μL，加入25μL的1mg/ml NHSS-biotin DMSO溶液，混匀，4℃冰箱避光反应2小时。
5.混合抗原标准、质控品(B液)的配制
  TM   STD0   STD1   STD2   STD3   STD4   质控1   质控2
  β-HCG   0mIU/ml   0.5mIU/ml   2mIU/ml   20mIU/ml   100mIU/ml   2mIU/ml   20mIU/ml
  CA19-9   0U/ml   5U/ml   40U/ml   200U/ml   800U/ml   40U/ml   200U/ml
  free-PSA   0ng/ml   0.5ng/ml   2ng/ml   20ng/ml   100ng/ml   2ng/ml   20ng/ml
  total-PSA   0ng/ml   0.5ng/ml   2ng/ml   20ng/ml   100ng/ml   2ng/ml   20ng/ml
  NSE   0ng/ml   5ng/ml   20ng/ml   60ng/ml   120ng/ml   20ng/ml   60ng/ml
  CA125   0U/ml   40U/ml   200U/ml   400U/ml   800U/ml   200U/ml   400U/ml
  CA15-3   0U/ml   1U/ml   5U/ml   30U/ml   240U/ml   5U/ml   30U/ml
  CA242   0U/ml   10U/ml   50U/ml   200U/ml   400U/ml   50U/ml   200U/ml
  AFP   0ng/ml   5ng/ml   20ng/ml   200ng/ml   500ng/ml   20ng/ml   200ng/ml
  CEA   0ng/ml   5ng/ml   50ng/ml   200ng/ml   800ng/ml   50ng/ml   200ng/ml
用pH7.4的磷酸盐缓冲液按上表配制B液。
6.A液的配制
取10种不同Beads的下列anti1β-HCG-Beads，anti1PEree-PSA-Beads，anti1total-PSA-Beads，anti1NSE-Beads，anti1CA15-3-Beads，anti1CA19-9-Beads，anti1CA125-Beads，anti1CA242-Beads，anti1APEP-Beads，anti1CEA-Beads溶液，按4×105个/种混合，加在pH7.4PBS中，体积为5ml，4℃避光保存备用。
7.混合二抗-PE混合物(C液)配制
分别取标记好biotin的PEree-PSA，total-PSA，NSE，CA242，CA19-9，CA125，β-HCG，CA15-3，APEP，CEA二抗加入pH7.4PBS中，每种二抗终浓度为5μg/ml，同时加入PE总浓度为60μg/ml，混合二抗-PE混合物总体积为5ml，4℃避光保存备用。
8.病人血清消化道肿瘤标志物含量检测
8.1收集病人血样10份2ml/份，5000rpm×5min，取上清，备用。
8.2分别加入A液于96孔酶标板，50μl/孔；然后加入标准品(STD0、STD1、STD2、STD3、STD4、STD5)、质控品(Contol1、Contol2)、血清样品1-9号，5μl/孔；再加入C液，50μl/孔。在旋涡混旋仪上充分混匀，放入37℃摇床孵育40min.
8.3孵育完成后于旋涡混旋仪上充分混匀在Luminex100上读数。
8.4检测结果见下表：
  位置   样品   β-HCG   CA199   f-PSA   t-PSA   NSE   CA125   CA153   CA242   AFP   CEA   总事件
  1   20ul-0   51   68   85.5   77   64   64   79   69   33.5   47   1286
  2   20ul-1   130   231   88   112   124   48   343   103   75   107   1243
  3   20ul-2   300.5   435   338   1006   639.5   329.5   442   160   418.5   244.5   1282
  4   20ul-3   2256   678.5   2812   7041.5   1313   751   336   469.5   2417   540   1268
  5   20ul-4   5087.5   822   8409   18835   2091   1112.5   281   678   3553   850   1359
  6   1   78.5   196   104   81.5   560   91.5   123   75.5   115.5   102   1258
  7   2   109   117   91   239.5   662   78.5   90.5   95   113   80   1177
  8   3   71.5   56   105   61   182   65.5   86   68   82   97   1344
  9   4   70   90   109   97   140   76   126   67   59   53   1229
  10   5   91   44   120.5   401.5   67   84.5   116   49   35   60   1216
  11   6   77.5   73.5   177   95   499   299   121   133   2187   99.5   1279
  12   7   76.5   88   4397   10944   421.5   71   186.5   67   174   50   1355
  13   8   39.5   59   90.5   56.5   456   74.5   136.5   71.5   60.5   21   1253
  14   9   77   67.5   91.5   76   353   56.5   102   57   86   77   1250
注：表格中粗斜体部分为标准品检测结果，其他为样本检测结果。
结果表明，用本发明方法可同时获得多个肿瘤标志物的定量测定结果，例如第7号样品中存在大量的肿瘤标志物t-PSA，从而可为临床诊断提供辅助性的参考指标。
实施例2
人血清样本HD-HOOK效应的指示和血清中甲胎蛋白(AFP)定量的检测
针对AFP的一抗和二抗由上海第二军医大学提供，AFP抗原纯品由Biodesign提供，微球由Luminex公司提供，常规试剂为市售品。
1.准备
1.1一抗和AFP抗原预先去除含氨基小分子和杂蛋白(透析或过层析柱)，测量其浓度。
1.2在1.5ml聚丙烯离心管中，精确称取5mg左右N-hydroxysulfosuccini-mide(NHS)，备用(防潮)。
1.3在1.5ml聚丙烯离心管中，精确称取5mg左右N-(3-dimethylainopropyl)-N-ethyl-carbodiimide(EDC)，备用(防潮)。
2.微球活化
2.1分别取33号和51号微球(Luminex公司)原液旋涡混旋仪混悬20秒，移取200μL微球(相当于2.5×106微球)于两个1.5ml聚丙烯离心管中。
2.2 15000rpm离心2分钟(设置3分钟)，移去上清液。
2.3加入100μL蒸馏水，旋涡混旋仪混悬20秒，15000rpm离心2分钟，移去上清液。
2.4重复2.3。
2.5在两管中分别加入80μL 0.1mol/L磷酸缓冲液(PBS)，pH 6.2，旋涡混旋仪混悬20秒。
2.6用蒸馏水将(NHSS)稀释至50mg/ml。(现配现用)
2.7分别取10μL 50mg/ml(NHSS)加到两种微球溶液中，旋涡混旋仪混悬20秒。
2.8用蒸馏水将EDC稀释至50mg/ml。(现配现用)
2.9分别取10μL 50mg/ml EDC加到两种微球溶液中，旋涡混旋仪混悬20秒。
2.10避光、37℃孵育20分钟。
2.11 15000rpm离心2分钟，移去上清液。
2.12分别加入250μL 50mmol/L 2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid(MES)pH5.0。
2.13 15000rpm离心2分钟，移去上清液。
2.14重复2.12，2.13，马上进行下步实验。
3.交联、封闭和储存
3.1取20μg已处理好的AFP一抗加入到已活化的33号微球中；取20μg已处理好的AFP抗原加入到已活化的51号微球中。旋涡混旋仪混悬20秒。
3.2避光、37℃反应2小时，每十五分钟混匀一次。
3.3分别加入1ml PBS-TBN，旋涡混旋仪混悬20秒，15000rpm离心2分钟。移去上清液(PBS-TBN的组成为10mmol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液、0.02％吐温20、1mg/ml的小牛血清白蛋白和0.05％叠氮钠)。
3.4分别加入500μL PBS-TBN，旋涡混旋仪混悬20秒，15000rpm离心2分钟。移去上清液。
3.5分别加入500μL PBS-TBN，旋涡混旋仪混悬20秒。
3.6用显微镜计数两种微球的浓度分别是：
33号：1×106个/ml，51号：1×106个/ml。
3.7 2-8℃避光保存。
4.二抗的生物素标记
4.1二抗预处理
  二抗中含有叠氮钠、甘氨酸等含氨基的小分子和其它小分子   用pH7.4的1×PBS充分透析。
  二抗中含有牛血清白蛋白等大分子   Protein A柱或其它柱子纯化。
  二抗浓度标定   分光光度计测其OD280(1OD280相当于0.7mg/ml单克隆抗体)。最终用1×PBS，pH7.4将浓度定于2mg/ml(浓缩使用Pall公司脱盐离心柱)。
4.2生物素标记反应
取上述预处理的AFP二抗10μL，加入25μL的1mg/ml生物素DMSO溶液，混匀，4℃冰箱避光反应2小时。透析过夜备用。
5.抗原标准品(B液)的配制
用pH7.4的磷酸盐缓冲液配制浓度为0ng/ml、5ng/ml、20ng/ml、200ng/ml、500ng/ml的AFP标准品液。
6.A液的配制
取上述标记了一抗的33号微球加入到1ml pH7.4的磷酸盐缓冲液中，使溶液中约含10000个微球。
7.二抗-PE(C液)的配制
取上述标记好生物素AFP二抗，加入pH7.4磷酸盐缓冲液中，二抗终浓度为5μg/ml，同时加入链亲和素标记的PE总浓度为60μg/ml，二抗-PE总体积为5ml，4℃避光保存备用。
8.H液的配制
取上述标记了AFP抗原的51号微球加入到1ml pH7.4的磷酸盐缓冲液中，使1ml溶液中约含10000个微球。
9.HD-HOOK效应的指示和人血清中AFP的检测
9.1收集AFP检测高值＞20000ng/ml的人血清样本5份和AFP检测高值＜1000ng/ml的人血清样本5份，2ml/份，5000rpm×5min，取上清，备用。
9.2在96孔反应板的5个反应孔内依次加入5个不同浓度的B液各5μL，每孔再分别加入25μL A液及25μL C液，混匀；另选10孔分别加入10种上述人血清样本5μL/孔和25μL/孔A液及25μL/孔C液，混匀；于37℃避光孵箱反应30mins，然后加入5μL/孔的H液，混匀；于37℃避光孵箱反应10mins。
9.3孵育完成后于旋涡混旋仪上充分混匀，在Luminex100上读数。
9.4检测结果如下：
  实验检测结果
  样本或已知浓度  检测微球(33#)   指示微球(51#)
  标准品   0ng/ml5ng/ml20ng/ml200ng/ml500ng/ml  56.7250.8768.84829.57439.5   11205.511304110981119611245
  检测样品   样品1样品2样品3样品4样品5样品6样品7样品8样品9样品10  79455678.56745.537259875115.03478.0257.06473.0578.5   100201542301452851245612378137951124511659.5
9.5实验结果判断
51#微球(指示微球)在不同抗原标准品浓度时荧光信号数值的平均值为11209.7，2SD为151.0，故指示微球的正常值为11360.7；样品1到5的反应系统中指示微球荧光信号值均低于指示微球正常值的90％(10224.63)，因此指示样品1到5的血清样本有HD-HOOK效应。其中样品1有轻微的HOOK效应，导致读数偏低，而样品2-4有显著的HOOK效应(低于正常值的10％)，导致读数严重偏低，造成假阴性。而样品6到10为HD-HOOK阴性(即测定的数值是可信的，可排除HD-HOOK效应引起的假阴性)。
实施例3
5种肿瘤标志物并行检测(带HD-HOOK指示)
基本上按照实施例1和2的步骤，进行带HD-HOOK指示的5种肿瘤标志物并行检测，不同点在于选用SCCA、CA125、CA15-3、CEA、β-HCG作为待检测的抗原。针对每一种使用一种检测微球和HD-HOOK指示微球，并且5种检测微球和5种指示微球的具有不同的编码荧光。
另外，混合抗原标准(B液)的配制浓度如下：
  TM   STD0   STD1   STD2   STD3   STD4   STD5
  SCCA   0ng/ml   2ng/ml   20ng/ml   200ng/ml   1000ng/ml   2000ng/ml
  CA125   0U/ml   40U/ml   200U/ml   600U/ml   1200U/ml   2400U/ml
  CA15-3   0U/ml   1U/ml   10U/ml   100U/ml   400U/ml   800U/ml
  CEA   0ng/ml   2ng/ml   20ng/ml   200ng/ml   1200ng/ml   2400ng/ml
  β-HCG   0ng/ml   2ng/ml   20ng/ml   200ng/ml   1000ng/ml   2000ng/ml
用pH7.4的磷酸盐缓冲液按上表配制B液。
另外，A液、C液和H液的配制同实施例1和2。
8.3用制备的微球对病人血清消化道肿瘤标志物含量进行检测，方法同实施例2。
检测结果见下表：
样品 β-HCG   β-HCG-HOOK指示微球荧光值 CA153   CA153-HOOK指示微球荧光值 CA125   CA125-HOOK指示微球荧光值 SCCA   SCCA-HOOK指示微球荧光值 CEA   CEA-HOOK指示微球荧光值
  STD0   51   11110   79   12457   64   5421   31.5   7543   47   9534
  STD1   130   11045   343   11789   128   4978   145   7478   107   9745
  STD2   300.5   9876   442   13121   329.5   5246   410.5   7369   244.5   9324
  STD3   2256   11132   2145   12346   751   5347   2400   7274   2147   9218
  STD4   5087.5   11095   6257   11975   1112.5   5124   3535   7345   5495   9635
  STD5   9546.5   11115   12375   12678   5325   5074   7365   7510   9372.5   9415
  HOOK指示微球正常荧光值 11896.0 13356.33 5537.13 7631.7 9872.82
  样品1   81   12431   598   12475   125   5142   97   7542   411   9547
  样品2   5748   11456   35   13456   116.5   5147   37   7568   1419   9684
  样品3   68.5   11345   1271   12695   113.5   5263   4570   7648   150   9387
  样品4   66   12785   3915   15437   61   5347   64   7489   955   9574
  样品5   47.5   13456   102   14289   2154   5289   59   7398   1784   9471
  样品6   7421   11873   10471   15432   164.5   5478   120   7345   7459   7216
  样品7   124   13452   98   13487   4712   3621   5741   5487   421   9350
  样品8   5321   5483   7962   6425   458   1425   75   7456   58   9415
  样品9   75   14782   59   13756   982   1578   645   1459   6579   5215
  样品10   8035   7425   245   1457   3545   5374   3785   2478   1463   987
检测结果判断：表格中粗斜体部分为标准品检测结果，其他为样本检测结果，带下划线的数值表明样品有HOOK效应。
实施例4
检测试剂盒
将实施例1-2中制备的33号检测微球和51号HD-HOOK指示微球分别装于容器中，制得一可指示HD-HOOK效应的试剂盒。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1、一种检测样品中目标抗原的免疫夹心检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a)将样品、检测微球和标记了可检测信号的第二抗体混合，形成一反应体系，其中所述的检测微球是如I式所示的第一抗体-微球的二元复合物，
             anti1X-bead                   (I)
式中，“X”表示目标抗原，“anti1X”表示针对所述目标抗原“X”的第一抗体，“bead”表示微球，“-”表示第一抗体与微球之间的结合方式，
并且所述的第二抗体与第一抗体可同时结合于目标抗原的不同表位，
从而形成“第二抗体-抗原-第一抗体-微球”四元复合物；
(b)将指示微球加入到步骤(a)的体系中，其中指示微球是式II所示的目标抗原-微球的二元复合物，
              X-bead’                   (II)
式中，“bead’”表示可与“bead”互相区别的不同微球，“-”表示目标抗原X与微球之间的结合方式，
从而在带有可检测信号的第二抗体存在下，形成“第二抗体-抗原-微球”三元复合物；
(c)检测反应体系中所述四元复合物中微球上的可检测信号，并与标准值或标准曲线比较，从而确定反应体系中目标抗原的存在与否和/或数量；
并且检测反应体系中所述三元复合物中微球上的可检测信号，得到指示微球的信号值，并与无HD-HOOK效应时的指示微球信号值(正常值)比较，当指示微球测量值小于指示微球正常值时，则判定目标抗原的测定结果不可靠；如果指示微球测量值大于或等于指示微球正常值时，则判定样品中目标抗原的浓度处于可测量范围。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(b)中，目标抗原与微球之间的结合方式有共价键或配基反应或非特异性吸附。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(c)中，当指示微球测量值≤0.9×指示微球正常值时，则判定样品存在HD-HOOK效应。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，目标抗原数量为1-100种。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的抗原是蛋白质。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，第一抗体与相应的第二抗体的摩尔比为1∶0.1-1∶2。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的各种微球bead与bead’是带不同荧光的微球。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述指示微球正常值是用以下方法确定的：
(a’)将浓度已知且处于测量范围的目标抗原标准品系列分别与所述检测微球、所述带有可检测信号的第二抗体混合，形成一反应体系，从而形成不同目标抗原标准品浓度的“第二抗体-抗原-第一抗体-微球”四元复合物；
(b’)将所述的指示微球加入到步骤(a’)的体系中，从而在带有可检测信号的第二抗体存在下，形成不同目标抗原标准品浓度的“第二抗体-抗原-微球”三元复合物；
(c’)检测所述三元复合物中微球上的可检测信号，以P+2SD为指示微球正常值，式中P表示不同目标抗原标准品浓度时.三元复合物中微球信号值的平均值，2SD为2倍的微球信号值的标准偏差。
9.一种用于检测目标抗原的试剂盒，其特征在于，它包括：容器，以及分别装于容器中的下列物质：
(a)检测微球，其中所述的检测微球是如I式所示的第一抗体-微球的二元复合物，
              anti1X-bead                  (I)
式中，“X”表示目标抗原，“anti1X”表示针对所述目标抗原“X”的第一抗体，“bead”表示微球，“-”表示第一抗体与微球之间的结合方式，
(b)带有可检测信号的第二抗体，其中，所述的第二抗体与第一抗体可同时结合于目标抗原的不同表位，
(c)指示微球，所述指示微球是式II所示的目标抗原-微球的二元复合物，
            X-bead’                (II)
式中，“bead’”表示可与“bead”互相区别的不同微球，“-”表示目标抗原X与微球之间的结合方式。
10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，它含有针对1-100种目标抗原的相应的检测微球、带有可检测信号的第二抗体，和指示微球，并且所述的各种微球bead与bead’是带不同荧光的微球。
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