CN100347548C - 固相免疫层析试验方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及检测液相样品中分析物的固相层析方法。在本发明的方法中，偶联颗粒性标记物的结合试剂以液体形式使用前即时加入。
Description
本发明涉及一种在液体样品中检测分析物的方法。
技术领域
本领域普通技术人员熟知的固相免疫层析试验。这类试验采用的多孔固相载体中，样品和试剂通过毛细管扩散作用迁移。装置中特别为人所知的是该固相载体为一种“浸渍棒”形式。这类试验使用的固相层析载体包含一检测区域，该区中固定有对于分析物具特异性的捕获试剂。使该固相载体首先与含待测样品的溶液相接触，与分析物的特异性标记的结合试剂。所述溶液在固相载体中通过毛细管扩散作用迁移至含固定有捕获试剂的区带。在夹心试验中，标记的连结合剂与分析物结合，通过捕获试剂将分析物固定在固相载体上。检测该标记试剂即可测定样品中是否存在分析物。
背景技术
欧洲专利EP 0 284 232描述的固相免疫层析试验方法中，固相载体直接带有冷冻干燥或脱水形式的偶联颗粒标记物的结合试剂。偶联颗粒标记物的试剂呈冷冻干燥形式下不能移动，但在湿润状态下可在固相载体中移动。因此，当固相载体接触液体样品时，液体在载体内通过毛细管扩散作用而迁移，并带动偶联颗粒标记物的结合试剂。在这些试验中，不需要事先混合偶联试剂和样品，而是将试验试验所需的所有试剂加到固相载体中。此外，用颗粒性标记物标记的分析物特异性结合试剂用可直接用肉眼观测，不需要多余操作来读取试验结果。因此这些试验只需要少量操作，并且使用方便迅捷。
欧洲专利EP 0291194，EP 0560411和EP 0560410描述的测试装置中，也使用固相载体承载偶联颗粒标记物的结合试剂。此外这类装置中固相载体装在一种盒子中，该盒子具有存放样品的孔和供读取结果用的供读结果用的观测窗口。盒子便于夹持该装置，同时保护固相载体。此外，这些专利还描述一种装置，该装置中载体一端从盒体凸出、便于存放液体样品。例如，固相载体的这种凸起端可以直接接触尿液流。
WO 00/00288描述的改进后装置包括一盒体和固相载体。该固相载体含有移动性促集组分，从而更好地收集样品。
EP-A1-0458231涉及固相免疫层析试验用于检测液体样品中的分析物。这些试验使用的固相载体，一般为膜，膜上固定有能捕获分析物的试剂。加入样品后，固定于固相载体上的分析物可用偶联尿素酶的结合试剂测得。在该文件描述的方法中，样品和其后标记的结合试剂沉积在固相载体上。
然而，这些固相免疫层析试验时常显现灵敏度和重复性上的不足。这些问题常常在如下特定情况下出现：被检测分析物的浓度低时，或是被测分析物样品是例如全血那样的复合物形式时。此外由于此类缺陷，此种试验适合检测样品中分析物的存在与否，因此只能够获得定性结果难于进行定量测定。除此之外，常见相当大的背景干扰以及区带效应(又称“胡克效应”，Hook effect)，从而防碍了结果的可读性。在免疫试验中，胡克效应是一种众所周知的不利影响。它通常出现在样品中分析物浓度很高的情况下。该效应可产生一种阴性结果，导致样品中不含分析物的偏离性结论。
为了弥补这类缺陷，本发明提出一种固相免疫层析试验方法，可获得更高的灵敏度和可重复性，同时限制背景干扰和胡克效应。本发明的方法特别适用于诸如血液的复合物型样品。鉴于可减少背景干扰、同时增加灵敏度和可重复性，本发明方法的优点是能在同一载体上同时检测几种不同的分析物。此外，由于本发明方法的性能水平，可以测定液体样品中的分析物并加以定量。
按照本发明的方法，偶联颗粒标记物的结合试剂以液体形式用前即时加入。于是依照本发明的方法，样品和各类试剂加入的次序对该检测试验的效果相当重要。
发明内容
第一个实施例中，本发明检测液体样品中分析物的方法包含以下步骤：
a)提供一种具有一个收集区和一个检测区的多空固相载体，检测区固定有捕获试剂；
b)将以下物质分别依次加入到多孔固相载体的收集区中：
i)偶联颗粒标记物的结合试剂，
ii)液体样品，
c)提供充足时间，让偶联颗粒标记物的结合试剂和液体样品通过毛细管扩散作用从多孔固相载体上的收集区迁移至检测区，
d)观测检测区中偶联颗粒标记物的试剂结合的程度。
有利的是在b步骤中，迁移方向从多孔固相载体收集区至检测区，液体样品加在偶联颗粒标记物结合试剂的上游。
本发明还涉及检测液体样品中分析物的方法，它包括以下几个步骤：
a)提供一种具有一个收集区和一个检测区的多孔固相载体，检测区固定有一捕获试剂；
b)以下物质分别依次加入到多孔固相载体的收集区中：
i)一种偶联颗粒标记物的结合试剂，该结合试剂为液体形式，
ii)液体样品，
iii)液体形式的稀释液，
c)提供充足时间，让多孔固相载体的偶联颗粒标记物的结合试剂、液体样品以及稀释液通过毛细管扩散作用从收集区迁移至检测区，
d)观测检测区偶联颗粒标记物的试剂结合的程度。
本发明的主题也是一种检测液体样品中分析物的方法，包含以下步骤：
a)提供一种具有一个收集区和一个检测区的多孔固相载体，检测区固定有一捕获试剂；
b)将以下物质分别依次加入到多孔固相载体的收集区中：
i)液体样品，
ii)偶联颗粒标记物的结合试剂，该结合试剂为液体形式，
iii)液体形式的稀释液，
c)提供充足时间，让偶联颗粒标记物的结合试剂、液体样品以及稀释液通过毛细管扩散作用从多孔固相载体上的收集区迁移至检测区，
d)观测检测区偶联颗粒标记物的试剂结合的程度。
有利的是在b步骤中，迁移方向从相对多孔固相载体收集区至检测区，液态稀释液加入到偶联颗粒标记物的结合试剂上游中。
在本发明的优选实施方案中，偶联颗粒标记物的结合试剂和固定在检测区中的捕获试剂使得能用夹心试验检测分析物。
本发明的另一个优选实施方案中，偶联颗粒标记物的结合试剂，和固定在检测区中的捕获试剂，使得能够通过竞争试验检测分析物。
多孔固相载体优选层析条带或窄条带形式的多孔固相载体。
优选将多孔固相载体整装到可持握载体中，该载体至少有一个窗口可观察多孔固相载体检测区中偶联颗粒标记的程度。
在本发明的具体实施例中，所述可持握载体具有至少一个以上的加样孔，分别用于加入液体样品、偶联颗粒标记物的结合试剂以及(在合适地方开孔)稀释液至多孔固相载体的收集区。
在本发明的一个优选实施例中，将多孔固相载体整装到可持握载体中，该载体至少有一个以上的观测窗口，可以观察多孔固相载体检测区中偶联颗粒标记物的反应剂结合的程度；多孔固相载体也收集区中具有用于加入偶联颗粒标记物的结合试剂的第一开口、和位于第一开口上游的第二开口，用于加入液体样品。
在另一优选实施例中，将多孔固相载体整装在可持握载体中，该载体具有一个观测窗口可观察检测区中偶联颗粒标记物的反应剂结合的程度；多孔固相载体收集区中也具有用于加入偶联颗粒标记物的结合试剂和样品的第一开口，和位于第一开口上游的第二开口，用于加入液体稀释液样品。
所述可持握载体优选装载盒子中。
本发明的另一个主题是用于检测液体样品中分析物的试剂盒，该试剂盒包含：(a)具有一个收集区和一个检测区的多空固相载体，检测区中固定有捕获试剂；(b)液体形式的偶联颗粒标记物的结合试剂。
本发明的用于检测液体样品中分析物的试剂盒优选含有稀释液。
优选将多孔固相载体整装到可持握载体中。
多孔固相载体整装到的可持握载体优选具有至少一个观测窗口，用以观察该多孔固相载体的检测区。
在一个优选实施例中多孔固相载体整装到可持握载体中，在该多孔固相载体的收集区中具有至少一个开口用以加入液体样品和/或偶联颗粒标记物的结合试剂和/或稀释液。
优选将多孔固相载体整装在盒子形式的可持握载体中。
“分析物”一词指样品中需要检测的任何化学、生化、生物性实体。本发明方法可检测的分析物中，特别要提到的是传染因子或是肿瘤产生的蛋白质、肽、抗体、激素、类固醇和抗原。传染因子如有细菌、病毒或其他寄生生物、核酸(DNA或RNA)，治疗性分子，药剂或抗生素。
“检测”一词指检测样品中分析物存在与否，但也包括检测和定量样品中的分析物。这是因为本发明的方法性能水平高可以实现定量或半定量的检测。
在本发明的一个特定实施例中，所述分析物是hCG(人绒毛膜促性腺素)或是PSA(前列腺特异抗原)。
在本发明的另一个特定实施例中，所述分析物是核酸。此例中，宜依照本领域技术人员熟知的技术(PCR等)事先扩大样品中的核酸。这种扩增步骤优选同时能标记扩增的核酸，例如利用生物素酰化的引物或通过掺入生物素标记的核苷酸等。或者，例如采用适当的末端转移酶用生物素标记核酸的3端。加样前，样品用热震荡、或是0.2N NaOH和0.05M EDTA溶液环境下、或是其他任何适当方法进行变性。该变性步骤可获得单链核酸。
“液体样品”一词指分析物样品的以溶液或悬液。液体样品具体可以是任何生物液或体液，也可以直接或间接获自生物液或体液这种样品，也可以是某固体样品的提取液。
在本发明的优选实施例中，所述液体样品为尿液、全血、血浆或血清。
对于本领域技术人员熟知可用于本发明方法的各种试剂。
偶联颗粒标记物的结合试剂以及捕获试剂对于样品中待测的分析物应具有特异性。
在本发明的一个特定实施例中，采用偶联颗粒标记物的结合试剂和固定在固相载体中检测区中的捕获试剂，从而能够通过夹心试验检测分析物。
在本发明另一个特定实施例中，利用固定在固相载体中检测区的偶联颗粒标记物的结合试剂以及分析物特异性捕获试剂，能竞争试验检测分析物。
本领域熟练技术人员熟知，夹心试验和竞争试验是已知的。夹心试验中，要预先测定分析物特异性捕获试剂和标记的结合试剂是否能分别地、特异地结合分析物，例如结合该分析物的两个相同或不同的表位。竞争试验中，标记的结合试剂应与分析物相同或近似，从而能与分析物竞争同捕获试剂结合。
“捕获试剂”一词指能够特异性结合分析物的任何化学、生化、生物性实体。
就竞争试验而言，捕获试剂同样能结合结合试剂。分析物和捕获试剂一般形成配体-抗配体，抗原-抗体，DNA-RNA，或是DNA-DNA配对。因此，如果分析物是抗原或半抗原，捕获试剂就是该分析物的特异性抗体。如果分析物是抗体，捕获试剂是该抗体所识别的抗原或是能特异识别该分析物的抗体。如果分析物是一种核酸，捕获试剂则是其互补的DNA探针。
被固定的捕获试剂优选对分析物具有高度亲和力的多克隆或单克隆抗体；更优选单克隆抗体。
可将分析物特异性的捕获试剂依照本领域技术人员已知的技术固定在固相载体上。以此方式固定的捕获试剂在湿环境下不应移动。进行这种固定例如可通过吸附或共价偶联。当俘获试剂是核酸时，可以用紫外线处理或其它本领域技术使之结合于硝化纤维素载体上。
“结合试剂”一词指任何能特异性结合分析物或与分析物竞争结合捕获试剂的化学、生化、生物性实体。
“连接”一词，指任何强力结合，如共价结合；或弱结合，如抗原-抗体或亲和素-链霉亲和素键类型结合。
结合试剂可以是一种抗体、抗原或核酸。
可采用本领域技术人员已知的任何其他结合试剂，例如一种(或多种)抗生物素单克隆抗体、亲和素、链霉亲和素或多聚链霉亲和素。这些试剂可以是天然的或重组的。
在竞争试验中，所述结合试剂是分析物自身或分析物的合适同类物。“分析物的合适同类物”一词指能结合该分析物特异性捕获试剂的同类物。因此，标记的结合试剂是偶联颗粒性标记物的该分析物，或该分析物的偶联颗粒性标记物的同类物。
在夹心试验中，结合试剂特异性连接到分析物上。标记结合试剂可以是一种共价颗粒标记物上的、具分析物特异性的抗体。当分析物是生物素标记的核酸时，结合试剂一般是一种偶合至诸如胶体金颗粒标记物的抗生物素抗体。
结合试剂共价至颗粒标记，得以直接观测得测试结果。当颗粒标记在固相载体检测区浓集时可直接用肉眼观测到。使用肉眼或测量仪器可直接度量该微粒。该度量度通过直接观测，并不需要任何附加操作。颗粒标记一般由水溶性细小微粒组成，形成悬浮液，即的固体微粒分散在液体中。
颗粒标记对于本领域技术人员是已知的，其中最为熟悉的是有色或荧光的颗粒标记。特别要例举胶体金、照色胶乳微粒、荧光胶乳微粒以及与亲和素或链霉亲和素偶联的微粒。
用于肉眼直接观测的标记中，还要特别提及右旋糖酐类型的标记(HansenT.M.，IVD Technology 4，35-40，2003)。结合试剂可与至具荧光团的右旋糖酐链(多糖衍生物)相偶联。
结合试剂依照现有技术与颗粒标记偶联。
在本发明的方法中，与颗粒标记偶联的结合试剂呈液体形式。
“液体形式的试剂”一词指结合试剂的溶液或悬液。液体形式的偶联颗粒标记物的结合试剂可按文献所述的技术来制备实现。通常将偶联的结合试剂用缓冲盐溶液配成溶液或悬液。该溶液也可以含稳定剂和其它化合物，例如抗菌素或抗真菌剂。稳定剂中，特别提到的有BSA(牛血清蛋白)和酪蛋白。
在本发明的某些方法中，当液体样品是例如血浆、血清或全血的液体样品须使用稀释液。稀释液可在固相载体中夹带样品和标记的结合试剂一起移动。一般这种稀释液包括缓冲盐溶液；也可含洗涤剂或其他反应所需组份。
在检测核苷酸的方法中，稀释液可包括杂交缓冲液。该类杂交缓冲液是本领域技术人员所熟知的。
本发明免疫层析法中所使用的多孔固相载体是为本领域技术人员所熟知的(EP 0284232)。该载体的多孔性使液体或潮润状态样品和试剂通过毛细管作用而扩散。
例如，多孔固相载体可以包含多种层析载体，如纤维素、尼龙、硝酸纤维、聚乙烯和玻璃纤维等各种有层析性能的载体。
固相载体可具有一种或多种不同部分，各部分可由不同材料组成。当该固相载体包含各不同部位或不同材料时，这些元件的排列应使固相载体中的毛细液流能够连续流动。
优选层析条带或窄条带形式的多孔固相载体。
固相载体可以是含有多个叠加窄带或重叠窄带的层析带。
通常，该多孔固相载体包括一个收集样品的区域和一个承载捕获试剂的检测区。这些区域的排列，以利于收集区流至检测区毛细液流的延续性。收集区和检测区是固相载体中两个相异并分开的区域。样品和标记的结合试剂，需要时还有稀释液，加入收集区并通过多孔固相载体迁移至检测区。比如层析带，多空固相载体部分一端构成收集区，而检测区紧靠条带的另一端。
这些区域在一种材料组成的条带上处于同一平面。优选该固相载体的两个区域各选择使用一种特定的材料。例如样品收集区可以使用一种多孔吸收性材料于，该固相载体的样品收集区为吸收性材料制成的收集组件，可使该收集组件可直接同尿液流柱等接触。该固相载体也可包括如专利WO 00/0028所述的可移动性收集组件。
该多孔固相载体的检测区也可含有第二捕获试剂，固定在此多孔载体第一捕获试剂的下游。该固定的第二捕获试剂通过核实偶联颗粒标记物的结合试剂于固相载体中的迁移，从而核对试验进程是否无误。第二捕获试剂可以是结合试剂的一个特异性抗体。
在本发明的方法中，标记的结合试剂及样品，需要时还有稀释液，分别依次以液体形式加到固相载体的收集区中。应在加入样品之前和/或在加稀释液前即时加入液体形式的标记的结合试剂，从而使得样品与标记的结合试剂之间立即完全接触而尽可能减小背景干扰或胡克效应并提高灵敏度。液体形式的标记结合试剂加入剂量如果精确，可大大提高本发明方法的重复性。
此外，本发明方法中在加入样品前、和/或加稀释液前即时加入液体形式的标记结合试剂可能获得洗涤效应从而减少背景干和胡克效应。该方法对血液等复合物样品中分析物的检测特别有有益。
优选将样品或稀释液加入到标记的结合试剂上游的收集区中。
为了控制标记的结合试剂加入到收集区的量，优选使用移液管、滴管或滴瓶加入。
液体样品也可以通过移液管、滴管或滴瓶加入。在另一实施例中，样品加入通过将收集区浸润于液体样品来实现。当液体样品为尿液时，收集区也可直接接触尿液注。
本发明的一个优选实施例中，多孔固相载体整装入可持握载体。后者可部分或全部包含被多孔固相载体。通常，该可持握载体是盒体形式。
在EP 029194，EP 056411，EP 0560410和WO 00/00288中具体描述了该类可持握载体或盒体。
这种可持握载体利于多孔固相载体的操作，特别是保护其不受水汽影响。
这种可持握载体可由各种材料，例如纸板、增塑纸板或(更优选)塑料组成。优选的载体包含一类硬质防渗材料。
一般，可持握载体具有至少一个观测窗口，用来观测多孔固相载体的检测区。
在本发明的一个实施例中，多孔固相载体可具有一个凸出可持握载体的收集区，用于加入液体样品并/或标记的结合试剂并/或稀释液。
在本发明另一项实施例中，可持握载体或盒体具有至少一个开口用以于收集区加入液体样品和/或标记的结合试剂和/或稀释液。
现通过以下附图和实施例更清楚地说明本发明：
附图说明
图1本发明的免疫层析方法的原理
阴影区域代表由吸收材料组成的固相载体部分。
图2免疫层析试验装置
图2显示含多孔固相载体的盒体的装置。盒体具有用以沉积液体的开口(O)；以及观测窗口(F)。图2a显示通过盒体开口将液体样品加入固相载体。图2b显示通过观测窗口(F)所见的阴性结果。图2c显示通过观测窗口(F)观察到的夹心试验的阳性结果。
T＝测试线，C＝控制线，O＝开口，F＝观测窗口。
图3双孔免疫层析试验装置
图3显示含有多孔固相载体的盒体。该盒体具有2个独立开口(01和02)用于加入液体，还具有一个观测窗口。箭头指向毛细管扩散作用的迁移方向。
01＝1号开口，02＝2号开口，T＝测试线，C＝控制线。
图4用稀释液的对比例子
R＝标记的结合试剂，E＝样品，D＝稀释液，T＝测试线，C＝控制线。
图5未用稀释液的对比例子
R＝标记的结合试剂，E＝样品，T＝测试线，C＝控制线。
具体实施方式
实施例1 使用稀释液的免疫层析法
装置
使用图2、3中的装置实施此方法。
分析物和样品
分析物为血清中的PSA(前列腺特异性抗原)。试验可用全血或血浆同法实施。
试剂和稀释液
标记的结合试剂是偶联胶体金的抗PSA单克隆或多克隆抗体，用稳定剂1％BSA(牛血清蛋白)的缓冲液(0.1M PBS，pH 8)配制。
第一捕获试剂固定于检测区测试线，是抗PSA单克隆或多克隆抗体。
第二捕获试剂固定于检测区控制线，是针对所述标记的结合试剂抗体的单克隆或多克隆抗体(抗抗体)。
稀释液为含0.05％吐温20洗涤剂的PBS缓冲液(0.1M，pH8)。
操作方法
图4中比较了各种方法。方法A，B和C同本发明一致。在所有情况下，无论实施方法如何，为了不使结果失真，每次测试的样品量和偶联颗粒标记物的结合试剂用量都相同。
样品量＝25微升(A、B、C、D、E法)。
稀释液量＝100微升(A、B、C、D法)；150微升(E法)。
标记的结合试剂用量＝35微升(A、B、C、D法)；同量，但为脱水形式(E法)。
这些方法的实施如下：
A法
1)标记的结合试剂
2)液体样品
3)稀释液
B法
1)加样品于开口2
2)加标记的结合试剂于开口2
3)加稀释液于开口1(开口2的上游)
C法
1)样品
2)标记的结合试剂
3)稀释液
D法
1)样品和标记的结合试剂事先混合
2)稀释液
E法
1)样品
2)稀释液
最后一种方法中，固相载体直接带有标记的结合试剂。
结果
使用反射仪测量和定量各方法的性能水平。使用分析物高浓度的样品评价胡克效应。
| 方法 | 背景干扰 | 胡克效应 | 灵敏度 | 可重复性 |
| A | 4 | 5 | 5 | 4 |
| B | 5 | 3 | 4 | 4 |
| C | 4 | 4 | 3 | 4 |
| D | 4 | 4 | 2 | 4 |
| E | 3 | 2 | 1 | 2 |
分1到5级(有效性1最差5最好)。
实施例2 不使用稀释液的免疫层析法
装置
使用图2、3中的装置实施各种方法。
分析物和样品
分析物为尿液中的hCG(人绒毛膜促性腺素)。试验也可用全血或血浆同法实施。
试剂和稀释液
标记的结合试剂为一种共价胶体金的抗hCG单克隆或多克隆抗体，其环境为所含稳定剂为1％BSA(牛血清蛋白)的缓冲溶液(0.1M PBS，pH 8)配制。
第一捕获试剂固定于检测区测试线，是抗hCG单克隆或多克隆抗体。
第二捕获试剂固定于检测区控制线，是针对所述标记的结合试剂抗体的单克隆或多克隆抗体。
操作方法
图5中比较了各种方法。
方法A，B和C同本发明一致。在所有情况下，无论实施方法如何，为了不使结果失真，每次测试的样品量和偶联颗粒标记的结合试剂用量都相同。
样品量＝100微升(A、B、D法)；100微升+35微升(E法)。
标记的结合试剂量＝35微升(A、B、D法)；同量，但为脱水形式(E法)。
这些方法的实施如下：
A法
1)标记的结合试剂
2)样品
B法
1)加标记的结合试剂于开口2
2)加样品于开口1
D法
1)样品和标记的结合试剂事先混合
E法
1)样品
最后一种方法中，固相载体直接带有标记的结合试剂。
结果
使用反射仪测量和定量各方法的性能水平。使用分析物高浓度的样品来评价胡克效应。
| 方法 | 背景干扰 | 胡克效应 | 灵敏度 | 可重复性 |
| A | 4 | 4 | 4 | 4 |
| B | 5 | 5 | 1 | 4 |
| D | 3 | 1 | 5 | 4 |
| E | 3 | 3 | 3 | 2 |
分1到5级(有效性1最差5最好)。
实施例3
装置
使用图2中的装置实施此方法。
分析物和样品
分析物为尿液中的吗啡。
试剂
标记的结合试剂为偶联胶体金颗粒的吗啡半抗原-BSA，悬浮于含稳定剂1％BSA(牛血清白蛋白)的缓冲溶液(0.1M PBS，pH 8)中。
第一捕获试剂固定于检测区测试线，是抗抗吗啡单克隆抗体。
方法
在该盒体的同一开口中加入35微升偶联颗粒标记物的结合试剂，然后加入150微升尿液。5分钟后读取结果。
结果
与采用携带脱水形式偶联结合试剂的固相载体的试验相比，背景干扰降低，重复性提高。
实施例4
装置
使用图2中的装置实施此法。
该装置含硝酸纤维素窄条带，通过紫外线法或任何其他技术使大肠杆菌或衣原体核酸的特异探针附着其上。窄条带埋在具有一加试剂开口和一观测窗口的塑料盒体中。
分析物和样品
样品中待测的分析物为大肠杆菌或衣原体的DNA或RNA。核酸事先用常规技术扩增，例如用PCR技术。DNA用生物素的引物或掺入了生物素标记的核苷酸进行标记。或者，也可用末端转化酶将核酸的3端用生物素标记。
试剂
标记的结合试剂是用胶体金标记的兔抗生物素多克隆抗体。
杂交缓冲是PBS缓冲液，含0.1％Tween20。也可使用其它杂交缓冲液。
方法
将扩增的生物素标记核酸(样品)用热激休克或用1.2N NaOH、0.05M EDTA进行变性。
将25微升变性样品置于加样孔(开口)中。
然后将40微升标记的结合试剂(抗生物素偶联物)加入加样孔中。以上两个步骤可倒置。
将150-200微升杂交缓冲液加入加样孔中。
结果
当待测核酸存在于样品中时，它通过扩散从收集区迁移至检测区，并在那里固定在载体上的探针相结合。检测区出现红条带(加样后10-20分钟读数)。控制线也显现于检测区，显示试剂的功能正常。
Claims (13)
1.一种检测一个液体样品中分析物的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
a)提供一种多孔固相载体，该固相载体具有一个收集区和一个检测区，检测区中固定有一种捕获试剂；
b)在该多孔固相载体的收集区中分别、依次、用前即时地加入以下物质：
i)偶联颗粒标记物的结合试剂，该试剂为液体形式，
ii)液体样品，
c)提供充足时间让偶联颗粒标记物的结合试剂和液体样品，通过毛细管扩散作用从收集区迁移到检测区。
d)观测检测区中偶联颗粒标记物的结合试剂的结合程度。
2.如权利要求1所述的方法，其中步骤b中，液体样品加到偶联颗粒标记的结合试剂的上游，迁移方向从多孔固相载体由收集区到检测区。
3.一种检测液体样品中分析物的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
a)提供具有一个收集区和一个检测区的固相载体，检测区中固定有捕获试剂：
b)将以下物质分别、依次、用前即时地加入该多孔固相载体的收集区中：
i)偶联颗粒标记物的结合试剂，该试剂为液体形式，
ii)液体样品，
iii)液体形式的稀释液，
c)提供充足时间让供偶联颗粒标记物的结合试剂、液体样品以及稀释液，通过毛细管扩散作用从收集区迁移到检测区。
d)偶联颗粒标记物观测检测区中结合试剂的结合程度。
4.一种检测液体样品中分析物的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
a)提供具有一个收集区和一个检测区的固相载体，检测区中固定有捕获试剂：
b)将以下物质分别、依次、用前即时地加入多孔固相载体的收集区中：
i)液体样品，
ii)偶联颗粒标记物的结合试剂，该试剂为液体形式，
iii)液体形式的稀释液，
c)以充足时间让偶联颗粒标记物的结合试剂、液体样品以及稀释液，通过毛细管扩散作用进行从收集区迁移到检测区。
d)观测检测区中结合试剂偶联颗粒标记物的结合试剂的结合程度。
5.如权利要求3或4所述，其步骤b中，液体形式的稀释液加在偶联颗粒标记物的结合试剂的上游和液体样品的上游，迁移方向相从多孔固相载体的收集区到检测区。
6.如权利要求1至5任何一项所述的方法中，其中所述偶联颗粒标记物的结合试剂以及固定于检测区的捕获试剂，使得能够用夹心试验能检测分析物。
7.如权利要求1至5任何一项所述的方法，其中所述偶联颗粒标记物的结合试剂和固定于检测区的捕获试剂，使得能够用竞争试验检测分析物。
8.如权利要求1至7中任何一项所述的方法，其中多孔固相载体是一种层析条带或窄条带形式的多孔固相载体。
9.如权利要求1至8任何一项所述的方法，其中多孔固相载体整装一个可持握载体中，该载体具有一个观察窗，用以观测偶联颗粒标记物的试剂在检测区中结合的程度。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述可持握载体具有至少一个开口，用以将样品、偶联颗粒标记物的结合试剂，需要时还有稀释液加入到多孔固相载体的收集区中。
11.如权利要求2所述的方法，其中多孔固相载体整装在一可持握载体中，该载体具有至少一个观测窗口，用以观测偶联颗粒标记物的试剂在检测区中结合的程度；该多孔固相载体还具有一个第一开口用于将偶联颗粒标记物的试剂加入到多孔固相载体的收集区，一个第一开口上游的第二开口用于将液体样品加入到多孔固相载体的收集区中。
12.如权利要求5所述的方法，其中多孔固相载体整装在一可持握载体，该载体具有至少一个观测窗口，用以观测偶联颗粒标记物的试剂在检测区的程度；该可持握载体具有一个第一开口用于将偶联颗粒标记物的结合试剂和液体样品加入到往多孔固相载体的收集区中，一个位于第一开口上游的第二开口用于将液体形式的稀释液加入到多孔固相载体的收集区中。
13.如权利要求9至12任何一项所述的方法，其中所述可持握载体包括一个盒体。
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