CN1105757A - 用于内毒素测定的试剂以及使用该试剂进行测定的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了(1)一种用于内毒素测定的试剂； (2)一种用于内毒素测定的药盒；(3)一种用鲎血液变 形细胞溶解物试剂测定样品中内毒素的方法；(4)一 种用鲎血液变形细胞溶解物试剂测定含丝氨酸蛋白 酶样品中内毒素的方法；(5)一种用于预处理含丝氨 酸蛋白酶样品的载体；(6)一种抑制G因子激活的方 法；(7)一种G因子激活抑制剂。

Description

本发明涉及一种用于内毒素测定的试剂、一种用于内毒素测定的药盒、一种进行内毒素测定的方法、一种用于预处理样品的载体、一种抑制G因子激活的方法以及一种G因子激活抑制剂，其中使用了鲎血液变形细胞溶解物试剂。
利用鲎血液变形细胞溶解物（本文此处以后简称为“溶解物”）进行内毒素测定（本文此处以后称为“Et”）的方法被人们熟称为鲎试验。由溶解物的反应构成的该测定称为鲎反应。鲎试验灵敏度很高，已广泛用于对药物和水的致热原检测、诊断用途等等。鲎试验是建立在在痕量内毒素存在的情况下溶解物凝集的基础之上的。最新的生化研究已经阐明鲎试验是由数种凝集因子逐步激活所构成的事实（J.Protein Chem，5，255-268（1986））。
下面参考图1，以鲎（Tachypleus Tridentatus）的溶解物说明鲎反应。当内毒素加至溶解物中后，溶解物中的C因子（一种对内毒素敏感的因子，分子量：123，000）被激活。激活的C因子局限地在特异位点水解B因子（分子量：64，000），产生激活的B因子。已激活的B因子激活前凝固酶（分子量：54，000）使其转化为凝固酶。凝固酶在环袢中由二硫键交联的特异位点上局限地水解凝固蛋白原（coagulogen）（促凝蛋白质;分子量：19，723），即在…Arg18与Thr19…之间和…Arg46与Gly47…之间水解，释放相当于H-Thr19……Arg46-OH的C肽（28个氨基酸残基）并将剩余部分转化成凝固活素凝胶。因而，鲎反应是由一系列反应组成的（由内毒素引起的级联反应本文此处以后称为C因子系统反应）。
上述的溶解物级联反应不仅由内毒素引起，也由（1→3）-β-D-葡聚糖（本文此处以后称为β-葡聚糖）引起，即，图1中的G因子（β-葡聚糖敏感因子）被β-葡聚糖激活，激活后的G因子将前凝固酶转化为凝固酶，凝固酶以前述的内毒素同样的方法作用于凝固蛋白原，产生凝固素凝胶（由β-葡聚糖引起的级联反应本文此处以后称为G因子系统反应）。
通过级联反应产生的凝固酶也能水解另外加入到反应系统中的合成肽底物的酰胺键，这种底物如叔丁氧羰基-亮氨酰-甘氨酰-精氨酸-对硝苯胺（Boc-Leu-Gly-Arg-pNA），水解后释放对硝苯胺。因而，借助测定所释放的对硝苯胺的吸收值可以定量测定内毒素或β-葡聚糖。
由于一般使用的溶解物含有有关C因子和G因子系统反应中的成分，因此将它用于测定样本中内毒素有时会得到不精确的结果，因为样本中可能含有的β-葡聚糖激发了G因子系统反应。
所以，鲎试验已被证明对内毒素测定是非特异性的，已用许多尝试试图发展一种内毒素特异性测定的方法。例如，已报导的一种方法为借助使用只含C因子系统反应相关成分的溶解物馏分可以有效地进行内毒素特异性测定（Obayashi T.et al.，Clin.Chim. Acta，149，55-65（1985））。
然而，该方法需要极其复杂的操作以制备无G因子系统，包括用含固定其上的葡聚糖硫酸盐的亲和载体进行亲和层析，使溶解物分馏从而消除β-葡聚糖敏感因子即G因子，以及重建用于内毒素特异性测定的C因子、B因子和前凝固酶。
另一方面，已知所有这些涉及鲎反应（C因子和G因子系统反应）的激活因子均为丝氨酸蛋白酶，并且鲎试验在其它的丝氨酸蛋白酶存在时会产生假阳性而无论Et和β-D-葡聚糖是否存在，这些丝氨酸蛋白酶如胰蛋白酶和凝血酶，它们可以通过其限制性水解将凝固蛋白原转化为凝固活素凝胶或水解上述合成底物（Harada T.et al.，J. Med. Enzymol.，3，43-60（1978））。因此，目前应用鲎试验不可能测定含丝氨酸蛋白酶样品中的内毒素。
本发明的第一目的在于应用一种溶解物试剂，通过避免溶解物所含的β-葡聚糖敏感因子（G因子）的影响而只基于C因子系统反应特异性地测定样本中的内毒素。
本发明的第二目的在于应用一种溶解物试剂，通过特异性抑制样品中丝氨酸蛋白酶活性但不抑制溶解物中C因子系统反应所涉及的激活因子的活性排除假阳性反应，从而准确测定含丝氨酸蛋白酶样品中的内毒素。
带着上述的第一目的，本发明人筛选了能选择性抑制溶解物中G因子系统反应也称为由β-葡聚糖激活G因子和/或激活的G因子活性而不抑制C因子系统反应的物质。其结果是，发现了在不同的丝氨酸蛋白酶抑制剂中适量的抑肽酶能很强地抑制G因子系统反应而基本上不抑制C因子系统反应。
带着上述的第二目的，本发明人也筛选了能选择性抑制样品中丝氨酸蛋白酶而不抑制溶解物中C因子系统反应的物质。结果发现通过在作为多种丝氨酸蛋白酶抑制剂之一的适量抑肽酶存在的情况下进行鲎反应或者在反应前将样品与适量抑肽酶接触可以选择性抑制样品中丝氨酸蛋白酶而不抑制C因子系统反应。
除抑肽酶外，我们还筛选了许多丝氨酸蛋白酶抑制物如α1-抗胰蛋白酶、抗凝血酶Ⅲ、α2-纤维蛋白溶酶抑制物、类卵粘蛋白抑制物、水蛭素、gabexate Mesylate等等，并且发现仅用抑肽酶即能优先抑制鲎反应中的G因子系统反应，而其它的丝氨酸蛋白酶抑制物不仅使样本中丝氨酸蛋白酶失活，而且同时抑制了C因子系统和G因子系统反应，从而抑制整个鲎反应。在进一步发展这些发现的基础上完成了本发明。
本发明提供了一种用于内毒素测定的试剂，它包括一种鲎血液变形细胞溶解物试剂和抑肽酶。
本发明也提供了一种用于内毒素测定的药盒，它含有一种鲎血液变形细胞溶解物试剂和一种含抑肽酶的试剂。
本发明进一步提供了一种应用鲎血液变形细胞溶解物试剂进行内毒素测定的方法，其中将抑肽酶加入到鲎血液变形细胞溶解物试剂中和/或样本中。
特别地在上面的测定方法中，加入到鲎血液变形细胞溶解物试剂和/或样品中的抑肽酶是以能够抑制鲎血液变形细胞溶解物试剂中存在的G因子激活的有效量应用的。并且，以抑制样品中丝氨酸蛋白酶的有效量，向鲎血液变形细胞溶解物试剂和/或含丝氨酸蛋白酶的样品中加入抑肽酶。
本发明进一步提供了一种用鲎血液变形细胞溶解物试剂测定含丝氨酸蛋白酶样品中内毒素的方法，其中在测定前将样品与固定了抑肽酶的不溶性载体接触。
本发明进一步提供了一种在用鲎血液变形细胞溶解物试剂进行内毒素测定前对含丝氨酸蛋白酶样品进行预处理的不溶性载体，在其上固定有抑肽酶。
此外，本发明提供了一种用于抑制G因子激活的方法，它包括向含有G因子的鲎血液变形细胞溶解物试剂中加入抑肽酶;一种G因子激活抑制物，它含有作为活性成分的、能够抑制存在于鲎血液变形细胞溶解物试剂中的G因子活化的抑肽酶;和一种为C因子与内毒素反应维持理想pH范围的缓冲剂。
图1显示了鲎反应的机制。图2为显示实施例1-2结果的图，其中标定曲线是通过绘制作为抑肽酶加入量作用的吸收值对内毒素浓度的图获得的（-O：未加，-△-：2.0mg，-□-：4.0mg和-●●-：6.0mg）。
抑肽酶，也称为碱性胰蛋白酶抑制物，是一种含有58个氨基酸残基和等电点为10.5的碱性多肽，它是从牛肺、胰腺或腮腺中提取的，它能抑制多种细胞内蛋白酶如激肽释放酶、血纤维蛋白溶酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶等。作为药物，抑肽酶由Bayer AG生产，其商品名为Trasylol。
本发明中使用的鲎血液变形细胞溶解物试剂（本文此处以后简称为“溶解物试剂”）的例子包括以常规方法从马蹄蟹（horseshoe Crab）如Limulus polyphemus、Tachypleus tridentatus、Tachypleus gigas、Carcinoscorpius rotundicauda等血淋巴中制备的变形细胞提取物（Cf. J. Biochem.，80，1011-1021（1976））。向这些提取物中可以加入一种对C因子激活有效的二价金属盐，例如氢卤化物（如氯化物）、硫酸盐或碱土金属这一类（如镁、钙、锶或类似的物质）;一种凝固酶的底物，如上述的合成底物，Boc-Leu-Gly-Alg-pNA，以及一种pH调节剂，如Tris-Hcl或类似缓冲液。也可用商售的溶解物试剂。溶解物试剂可以是任何形式，如液体、粉末、固体等。
根据本发明，优先使用含有G因子的溶解物试剂，但那些G因子已被去除或已用抑肽酶以外的抑制物使G因子失活的溶解物试剂也可以使用。
前述的本发明的第一目的可通过内毒素测定达到，该测定包括（A）应用通过将抑肽酶加至溶解物试剂以使G因子系统反应相关成分（本文此处以后称为“含抑肽酶溶解物试剂”）失活制备的一种试剂，（B）将抑肽酶加入样品并使用常用溶解物试剂测定样品从而抑制溶解物试剂中的G因子系统反应相关成分的激活，或者将（A）和（B）相结合的方法，其中将抑肽酶加至溶解物试剂和样本两者中。
在该情况下，尽管用于完全抑制G因子系统反应所必须的抑肽酶的量决定于溶解物试剂的类型，但该领域技术人员很容易地通过下面的预实验确定其适合的量。
以冰浴冷却，将抑肽酶（不含内毒素）以不用量加至预订量的溶解物试剂中，然后再加入在常规测量条件下能完全激活溶解物试剂量的不含内毒素的β-葡聚糖，再在常用条件下进行反应。在这些条件下，可以确定能完全抑制由β-葡聚糖对溶解物试剂激活的抑肽酶的量。
基于因此确定的抑肽酶的量，能够确定相应于样品中内毒素的浓度使C因子系统反应继续进行的抑肽酶适宜的量。使用的抑肽酶的量约为每1ml溶解物试剂中5mg至500mg。
上述本发明的第二目的可通过内毒素测定达到，该测定包括（C）使抑肽酶与样品中丝氨酸蛋白酶反应和随后所产生的反应混合物与含抑肽酶的溶解物试剂反应，（D）向样品中加入能使溶解物试剂中G因子活性抑制的量的抑肽酶，并使样品与溶解物试剂反应，（E）预先向溶解物试剂中加入能使溶解物试剂中G因子以及样品中丝氨酸蛋白酶活性抑制的量的抑肽酶或（F）先使含丝氨酸蛋白酶的样品与有抑肽酶固定的不溶性载体接触，然后去除或失活丝氨酸蛋白酶，继而检测用溶解物试剂如此处理后的样品。
然而应该注意到方法（E）在抑肽酶以不抑制C因子活性的用量范围使用时有效。
而且，在应用（C）至（E）的方法时，由于使用的抑肽酶仅为抑制丝氨酸蛋白酶所需的用量，因此用Et特异性溶解物试剂使Et测定更准确和简单，C因子系统反应因而更易控制。在该情况下，可以从前述的抑肽酶剂量范围中去掉G因子所需的用量。除非所给定的量足以进行内毒素测定，否则量也可不减少。
在应用（C）至（E）的方法时，样品可以是丝氨酸蛋白酶制备物（换句话说，即确知丝氨酸蛋白酶制备物中Et存在）或者样品可能被丝氨酸蛋白酶污染。在该情况下，按下述方法可确定抑肽酶的用量。
在合成的底物方法中，将不同浓度的抑肽酶和样品加至使用合成底物方法的鲎试剂中，该试剂中其溶解物成分被蒸馏水替代，所得混合物在37℃下孵育以使通常的鲎反应有效进行，然后确定显示与空白试验同样值的抑肽酶的量，该剂量可用于测定样品。
在凝胶化方法或混浊性方法中，将不同浓度的抑肽酶和样品加至去除或失活了C因子和G因子并含有凝固蛋白原的溶解物试剂中，所得混合物于37℃下孵育以使通常的鲎反应有效进行，然后确定显示与空白试验同样值的抑肽酶的量。通过向样品中加入所确定量的抑肽酶而进行Et测定。
在该情况下，前述的抑肽酶的量为所需值，在不影响内毒素测定的范围内其用量可以稍有增加。
尽管抑肽酶的量决定于样品中所含丝氨酸蛋白酶的类型和量，但抑肽酶可以以足以完全抑制样品中所含丝氨酸蛋白酶的量进行应用，而且它基本上不干扰C因子系统反应。特殊的是，在实际应用中通常加入抑肽酶总的用量约为1～2000mole/每mole蛋白酶，或约为300ug到10mg。
因此，当测试样品含有丝氨酸蛋白酶以及溶解物试剂含G因子时，抑肽酶的用量为抑制G因子和丝氨酸蛋白酶两者所需量的总和。
在应用方法（F）时，固定于不溶性载体上抑肽酶的量可由每个样品中所含丝氨酸蛋白酶及类似因子的量加以确定，但一般在2～100mole/mole丝氨酸蛋白酶的范围内。如果不溶性载体不含Et而且可化学固定抑肽酶而不降低预期的活性，不溶性载体就无特别限定。这类载体的示例包括酰胺化合物、纤维素化合物、琼脂糖化合物、聚丙烯酰胺化合物、葡聚糖化合物、乙烯基聚合化合物（含异丁烯酸缩水甘油酯的有孔共聚物）等等。可以用常用的方法固定抑肽酶，如将甲酰基导入纤维素凝胶，然后在NaCNBH3存在的情况下使抑肽酶与处理过的凝胶结合的方法，以及重氨化法、CNBr法、酸性重氨化物法等等。
不溶性载体可以任何形式使用。它可以塑成珠状、尖头状、管状、薄膜状等等。不溶性载体的例子包括用于亲和层析的任何商售的载体如由CNBr法激活的琼脂糖凝胶（如可从Pharmacia得到的琼脂糖凝胶等）以及含有如甲酰基或羧基活性基团的纤维素载体（如甲酰基-Cellulofine、羧基-Cellulofine等，两者可从SeikagaRu Corporation得到）。
方法（F）中，将含丝氨酸蛋白酶的样品与抑肽酶固定的不溶性载体接触，所得到的未吸收溶液用于测定。在该处理中，有必要采取特殊预防措施防止Et污染。根据（C）到（E）的方法，可以简单而快速测定Et而Et污染样品的危险最小。
内毒素测定法如除方法（F）外的（A）至（E）的方法可在抑肽酶存在的情况下进行，例如，按照下面（ⅰ）至（ⅸ）的方法。
（ⅰ）一种将抑肽酶加入变形细胞中，然后提取用作测定Et的含抑肽酶溶解物试剂的方法。
（ⅱ）一种将抑肽酶加入提取的溶解物中用作测定Et的含抑肽酶溶解物试剂的方法。
（ⅲ）一种将冻干的溶解物试剂制备物溶解在含抑肽酶溶液中用作测定Et的含抑肽酶溶解物试剂的方法。
（ⅳ）一种将抑肽酶加入溶解在适宜溶液中的冻干溶解物试剂制备物中、用作测定Et的含抑肽酶溶解物试剂的方法。
（ⅴ）一种将冻干制备物溶于适宜溶液中、用作测定Et的含抑肽酶溶解物试剂的方法，其中的冻干制备物是通过将抑肽酶加至变形细胞中，然后提取、冻干或者是将必需量的抑肽酶加至溶解物试剂中、然后冻干的方法制备的。
（ⅵ）一种将含溶解物试剂和一种合成底物的冻干制备物溶解于含抑肽酶溶液中或者将抑肽酶加入在适宜溶液中溶解冻干制备物而制备的溶液中、用作测定Et的含抑肽酶溶解物试剂的方法。
（ⅶ）一种将由向溶解物试剂与合成底物的混合液中加入必需量抑肽酶、然后冻干制备的试剂溶解于适宜溶液中、用作测定Et的含抑肽酶溶解物试剂的方法。
（ⅷ）一种将必需量抑肽酶加入受测试样品中的方法。
（ⅸ）一种将受测样品加至溶解物试剂中、然后立即加入抑肽酶的方法。
在此情形下，方法（ⅷ）可单独应用或者与方法（ⅰ）至（ⅶ）一同应用。
在上述方法（ⅳ）、（ⅴ）、（ⅵ）和（ⅶ）中用来溶解冻干制备物的试剂为一适宜缓冲液，该缓冲液能够稳定地维持溶解物试剂中涉及C因子系统反应的成分并能维持C因子与内毒素反应的理想pH范围（pH7.0至8.5）。该溶液的例子包括水和能维持上述pH范围的缓冲液，缓冲液含有缓冲剂如Tris（羟甲基）氨基甲烷、Tris（羟甲基）-氨基甲烷马来酸盐、1.4-哌嗪二乙烷基磺酸盐、码啉代丙烷磺酸盐、N-2羟乙基哌嗪-N′乙烷磺酸盐、三乙醇胺、咪唑和Tris（羟甲基）咪唑。上述方法（ⅲ）和（ⅵ）中使用的含抑肽酶溶液是通过将必需量的抑肽酶加至前述的溶液中而制备的。
由上面所述，如果在溶解物试剂中C因子系统反应可正常进行或在一合理的功能范围内进行并且可进行Et的定量或定性测定，那么在本发明的Et测定法中，抑肽酶可以任选方式进行应用。
通过确定由图1所示级联反应激活形成的凝固酶的活性可以以通常方法进行应用本发明试剂的内毒素测定。
为测定凝固酶的酰胺酶活性，可以应用前述含有生色残基的合成肽底物以及其类似合成肽底物，该类似底物具有同样肽顺序但其C末端氨基酸的羧基被取代，在前述的生色残基的位置上以已知的荧光残基、发光残基、氨等通过酰氨键替代。借助测定由凝固酶作用合成底物生成的反应产物而确定酰胺酶活性。例如，将上述合成底物与含本发明的试剂和内毒素的反应系统共存，则可以分光光度计、荧光光度计、化学发光探测器、氨检测电极（JP-A-62-148860;这里所用的词“JP-A”表示“未审查公开的日本专利申请）等方法分别检测由反应（级联反应和必要时的将反应产物转变为其它染色物质的反应）生成的染色物质、荧光物质或氨。
借助一种方法可以测定凝固酶的蛋白酶活性，该方法为将凝固酶与含于本发明试剂中或另外加入的凝固原（底物）反应，然后用例如适宜仪器如浊度测量仪、粘度测量仪等或用肉眼判断测定所产生的凝＃固活素凝胶化。
在本发明测定的实际应用中，有必要应用对前述级联反应系统激活有效的二价金属盐。这些二价金属盐的例子包括如镁、钙、锶等碱土金属的氢卤化物（氯化物）和硫酸盐。
尽管这些金属盐可单独加入鲎反应中，但最好是将二价金属盐加至溶解物试剂中并将混合物在无加热条件下如冻干干燥至固体状。用于测定酰胺酶活性的试剂除二价金属盐外优选与前述合成肽底物共存，它还可进一步干燥。
借助应用含上述试剂的药盒可使根据本发明的内毒素测定更容易和更迅速。本发明的药盒包括溶解物试剂和含抑肽酶的试剂。含抑肽酶试剂可进一步包括前述的缓冲剂。该药盒的特殊例子包括：（1）一种冻干的溶解物试剂和溶有溶解物试剂的溶液;（2）冻干的抑肽酶和溶有抑肽酶的溶液;（3）冻干的标准内毒素和溶有标准内毒素的溶液;以及（4）用于合成生色底物法的试剂，包括用于空白试验的蒸馏水。
对进行Et测定的受试样品并无特别限制，任何需要测定Et的样品或证实其存在的样品均可以使用。这些样品的例如包括生物制品、药物、医疗用水等。正如前述，本发明尤其在测定含丝氨酸蛋白酶样品时有用。
根据本发明，对受试样品中所含的丝氨酸蛋白酶类型无特别限定，条件是其活性可被抑肽酶抑制。这些丝氨酸蛋白酶的例子包括激肽释放酶、血纤维素蛋白溶酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、凝血酶等。
下面提供的实施例用于进一步说明本发明，但不应被理解为限制本发明的范围。
实施例1
用由将抑肽酶加至溶解物试剂而制备的试剂进行的Et测定
1）将1.0升T.tridentatus的血淋巴于4℃以1，500rpm离心10分钟，所获得的约21g的沉淀物（变形细胞）与210ml0.02M Tris-Hcl缓冲液（pH8.0）混合并在搅匀器（Polytron R RT10，Kinematica生产的商标名）搅匀以进行提取。所产生的均浆在冰冷却的条件下以10，000XG离心30分钟以获得190ml上清液（溶解物试剂）。
将0.04ml的含0.5、1.0、2.0、4.0或6.0mg抑肽酶的0.5M Tris-Hcl/0.4M硫酸镁缓冲液（pH8.0）和0.02ml的4.0mM Boc-Leu-Gly-Arg-pNA加至0.04ml所获得的溶解物试剂中，从而获得含抑肽酶的溶解物试剂（发明）。另外，将0.04ml不含抑肽酶的0.5M Tris-Hcl/0.4M硫酸镁缓冲液（pH8.0）和0.02ml4.0mM  Boc-Leu-Gly-Arg-pNA加至0.04ml溶解物试剂中。向这些体系中各加入0.1ml蒸馏水（空白，本文此处以后称为“DW”）或β-葡聚糖（500ng/ml，以下述的方法制备）成为受试样品。在所得的每种混合物于37℃反应30分钟后，按顺序向反应混合物中加入0.5ml0.04%亚硝酸钠（0.48M盐酸溶液）、0.5ml0.3%氨基磺酸铵和0.5ml0.07%N-1-荼乙烯二胺二盐酸盐使所生成的对-硝基苯胺进行重氮偶合。然后测定于545nm处的吸收值，这些样品与空白吸收值的差异被认为是反应性。结果见于表1（表中差异表示为“△”，其它表和图中也是如此）。
表1
抑肽酶量(mg)  反应性(△A545nm/30min)
0  >1.5
0.5  0.437
1.0  0.153
2.0  0.000
4.0  0.000
6.0  0.000
正如表1所显示，当0.04ml溶解物试剂中加入2.0mg或更多抑肽酶时，溶解物试剂中G因子的激活可被完全抑制。
2）将0.04ml含能完全抑制溶解物试剂中G因子系统反应的2.0、4.0或6.0mg抑肽酶的0.5MTris-Hcl/0.4M硫酸镁缓冲液（pH8.0）和0.02ml4.0mM Boc-Leu-Gly-Arg-pNA加至0.04ml上述1）制得的溶解物试剂中，以获得含抑肽酶溶解物试剂。另外，将0.04ml不含抑肽酶的0.5M Tris-Hcl/0.4M硫酸镁缓冲液（pH8.0）和0.02ml 4.0mM Boc-Leu-Gly-Arg-pNA加至0.04ml溶解物试剂中。向这些体系中各加入0.1mlDW（空白）或源自大肠杆菌0111∶B4（Westphal型，可从Sigma所得;6.25、12.5、25.0或50.0pg/ml）的Et制成样品。此后，以前面1）所描述的相同的办法进行反应以制备Et的校正曲线。结果见于图2。
由图2可以发现当加入的抑肽酶的量增加时与Et的反应性减小。借助于应用校正曲线，可以选出相应于每个样品中Et浓度激活溶解物试剂中C因子系统反应的抑肽酶的量。
而且，很明显使用鲎试剂可以有效进行Et测定而没有β-葡聚糖的影响，鲎试剂是将抑肽酶加至常规溶解物试剂中制成的。
β-葡聚糖的制备
按照WO90/02951公开的方法进行。将1克凝胶多糖（可从Wako Pure Chemical lndustries得到）悬浮于大约100ml5mM NaOH 水溶液中，并用SonicatorTM（Model5202 PZT，由Ohtakc Seisakusho，Tokyo生产）在冰冷却条件下以20KHz、80W声波处理12分钟以降解凝胶多糖。用5M NaOH水溶液将所产生的溶液调至NaOH终浓度为3M，然后进行凝胶渗透层析（GPC柱，2个TSK凝胶G3000PWXL和一个G2500PWXL;流动相，0.3MNaOH水溶液;流量，0.5ml/min）。收集产生的馏分并再次进行层析以收集分子量为216，000的馏分，从而获得GPC-分馏纯化的β-葡聚糖制备物。
所得的β-葡聚糖制备物也用于下面的实施例
实施例2
用由将抑肽酶加至变形细胞然后提取制备的试剂进行的Et测定
将1.0升T. tridentatus的血淋巴于4℃以1，500rpm离心10分钟，所得的约21g沉淀物（变形细胞）与210ml含12g抑肽酶的0.02M Tris-Hcl缓冲液（pH8.0）混合并于Polytron R pT10中搅匀以进行提取。所得均浆在冷却条件下以10，000XG离心30分钟以获得190ml上清液（含抑肽酶的溶解物试剂）。
向0.04ml如此获得的含抑肽酶溶解物试剂（发明）和0.04ml以同样方法制得但不加抑肽酶的溶解物试剂（对照）中均加入0.01ml 2M Tris-Hcl缓冲液（pH8.0）、0.03ml0.4M氯化镁和0.02ml3.0mM Boc-Leu-Gly-Arg-pNA，然后再加0.1ml的DW（空白）、Et或β-葡聚糖制成样品。进一步地加入含两倍浓度的Et和β-葡聚糖各0.05ml制成另外一种样品。将所得每种混合物于37℃孵育30分钟，然后加入0.4ml0.8M乙酸中止反应，通过测定405nm处的吸收值确定生成的硝基苯胺以比较反应性。结果示于表2。
从结果中明显看出用含抑肽酶的溶解物试剂可有效地进行Et测定而不受β-葡聚糖的影响，该 抑肽酶的溶解物试剂是在提取前将抑肽酶加至鲎血淋巴变形细胞中制得的。换句话说，证实了在本发明的测定系统中G因子系统反应基本被抑制而未抑制C因子系统反应。
表2
反应性(△A405nm/30min)
样品  发明  对照
Et*  0.317  0.344
β-葡聚糖**0.000 0.183
Et+β-葡聚糖  0.317  0.526
*Et浓度  :3.0pg/0.1ml样品
**β-葡聚糖浓度  :5.0pg/0.1ml样品
实施例3
用将冻干溶解物试剂溶于含抑肽酶溶液制备的试剂进行的Et测定
将一管形瓶“Pyrotel-T”（用于凝胶化方法的、由L. Polyphemus制备的冻干溶解物试剂制备物，由Capecod生产，可从Seikagaku Corporation得到）溶于5.0ml预先已溶入270mg抑肽酶的DW中（发明）。将另一管形瓶冻干鲎试剂制备物溶于5.0ml不含抑肽酶的DW中（对照）。将这些溶液以0.1ml的量分散于试管中，然后加入0.1mlDW（空白）、Et或β-葡聚糖制成样品。进一步地，加入含两倍浓度的Et和β-葡聚糖各0.05ml制成另一种样品。在轻柔混合反应混合物后，将每支试管排列于附于浊度分析仪（Toxinometer ET-201，可从Wako Pure ChemicalIndustries购得）上的分析仓上，于37℃温育60分钟以记录凝胶化时间（Tg）并从而检测本发明试剂的反应性。结果示于表3。
从该结果明显看出在样品加入之前，向商售冻干溶解物试剂（凝胶化法鲎试验试剂）中加入抑肽酶可使Et测定有效地进行而不受β-葡聚糖的影响。
表3
反应性(Tg,min)
样品  发明  对照
DW(空白)  >60  >60
Et*  33.5  29.7
β-葡聚糖**  >60  32.3
Et+β-葡聚糖  33.3  19.6
*Et浓度  :2.0pg/0.1ml样品
**β-葡聚糖浓度  :40.0pg/0.1ml样品
实施例4
用将含溶解物试剂和含合成底物的冻干制备物溶于含抑肽酶的溶液中制备的试剂进行Et测定
将一管形瓶“Toxicolor System LS-200 Set”（一种含由T.tridentatus制备的溶解物试剂和用于生色合成底物法的Boc-Leu-Gly-Arg-pNA，由Seikagaku Corporation生产和销售的冻干制备物）溶于2.8ml预先溶入140mg抑肽酶的0.2M Tris-Hcl缓冲液（pH8.0）中以获得本发明的试剂。将另一管形瓶冻干制备物溶于2.8ml不含抑肽酶的0.2M Tris-Hcl缓冲液（pH8.0）中以作为对照试剂。向这些溶液中的每种溶液的0.1ml中加入0.1mlDW（空白）、Et或β-葡聚糖制成受试样品。进一步地，加入含两倍浓度的Et和β-葡聚糖各0.05ml制成另一样品。这些混合中的每一种都以实施例1-1）所描述的同样方法反应从而可评估本发明试剂的反应性。结果示于表4。
表4
反应性(△A545nm/30min)
样品  发明  对照
Et*  0.863  0.891
β-葡聚糖**0.000 >1.5
Et+β-葡聚糖  0.863  >1.5
*Et浓度  :5.0pg/0.1ml样品
**β-葡聚糖浓度  :50.0ng/0.1ml样品
由该结果明显看出在样品加入之前向商售生色合成底物法鲎试验试剂（冻干制备物）中加入抑肽酶可有效地进行Et测定而不受β-葡聚糖的影响。
实施例5
用将抑肽酶加至变形细胞中，然后提取，冻干混合物和将其溶于溶液中制备的试剂进行Et测定
将2.0ml以实施例2同样的方式提取前加入抑肽酶至变形细胞制备的含抑肽酶溶解物试剂与0.4ml0.4M氯化镁混合，然后冻干以得到用于本发明Et测定的试剂。也将2.0ml以实施例1-1）同样的方式制备的不含抑肽酶溶解物试剂与0.4ml 0.4M氯化镁混合，然后冻干得到对照试剂。将这两种冻干制备物分别溶于2.0mlDW中。向各为0.1ml的这两种溶液中加入0.1mlDW（空白）、Et或β-葡聚糖制成样品。轻轻混合后，将混合物静置于37℃温育60分钟，然后将试管倾斜180°通过肉眼判断凝胶的生成以评估本发明试剂的反应性。结果示于表5。表中“+”表示凝胶生成，“-”表示无凝胶生成。
表5
反应性
样品  发明  对照
DW(空白)  -  -
Et*  +  +
β-葡聚糖**  -  +
*Et浓度  :4.0pg/0.1ml样品
**β-葡聚糖浓度  :40.0ng/0.1ml样品
由该结果明显看出由冻干在提取前将抑肽酶加至变形细胞制成的含抑肽酶溶解物试剂可以有效地进行Et测定而不受β-葡聚糖的影响。
实施例6
用将含溶解物试剂、合成底物和抑肽酶的冻干制备物溶于溶液中制成的试剂进行Et测定
将2.0ml由实施例1-1）制得的不含抑肽酶溶解物试剂与0.9ml3.4mM生色合成底物（Boc-Leu-Gly-Arg-pNA）、1.0ml0.8M硫酸镁和0.5ml抑肽酶水溶液（240mg/ml）混合。冻干混合物得到用于本发明Et测定的试剂。按同样的方法制备对照试剂，只是用0.5mlDW替代抑肽酶水溶液。将获得的每种冻干制备物溶于5.0ml0.2M Tris-Hcl缓冲液（pH8.0）中。向各为0.1ml的所产生的溶液中加入0.1mlDW（空白）、Et或β-葡聚糖制成样品。进一步地，将含两倍浓度的Et和β-葡聚糖各0.05ml加入制成另一样品。每种混合物均以实施例1-1）所述同样的方法反应以评估本发明试剂的反应性。结果示于表6。
表6
反应性(△A545nm/30min)
样品  发明  对照
Et*  0.669  0.697
β-葡聚糖**  0.000  >1.5
Et+β-葡聚糖  0.669  >1.5
*Et浓度  :4.0pg/0.1ml样品
**β-葡聚糖浓度  :40.0ng/0.1ml样品
由该结果明显看出应用由冻干含溶解物试剂、合成底物和抑肽酶制备的试剂可以有效地进行Et测定而不受β-葡聚糖的影响。
实施例7
先将抑肽酶加入样品中的Et测定
制备DW（空白）、Et、β-葡聚糖和含两倍浓度的Et和β-葡聚糖同体积混合物，以其作为受试样品。向0.05ml各样本中加入0.05ml抑肽酶水溶液（100mg/ml），然后加入0.1ml已溶于2.8ml0.2M Tris-Hcl缓冲液（pH8.0）中的“Toxicolor System Ls-200 Set”。而后，使各如此制备的混合物以实施例1-1）所述同样的方式反应。重复同样步骤，只是用同体积DW取代抑肽酶水溶液以比较其反应性。结果示于表7。
表7
反应性(△A545nmn/30min)
样品  加抑肽酶  不加抑肽酶
Et*  0.883  0.928
β-葡聚糖**  0.000  >1.5
Et+β-葡聚糖  0.885  >1.5
*Et浓度  :5.0pg/0.05ml样品
**β-葡聚糖浓度  :30.0ng/0.05ml样品
由该结果明显看出将抑肽酶先加至样品可以有效地进行Et测定而不受β-葡聚糖的影响。
实施例8
将样品加至溶解物试剂中然后立即再加入抑肽酶所进行的Et测定
将一管形瓶“Pyrotel”（用于凝胶化法的、由L.Polyphemus制备的溶解物试剂冻干制备物，由Capecod生命、可从Seikagaku Corporation得到）溶于5.0mlDW中。将制得的溶液在冰冷条件下以0.1ml每份分散于试管中，然后向试管中加入0.05mlDW（空白）、Et或β-葡聚糖制成样品。其后立即分别向试管中加入0.05ml抑肽酶水溶液（110mg/ml）。轻轻混合，将各混合物于37℃静置温育60分钟，以实施例5所述同样的方法判断凝胶的生成。重复同样步骤，只是以同体积DW替代抑肽酶水溶液以比较其反应性。结果示于表8。
表8
反应性
样品  加抑肽酶  不加抑肽酶
DW(空白)  -  -
Et*  +  +
β-葡聚糖**  -  +
*Et浓度  :2.0pg/0.05ml样品
**β-葡聚糖浓度  :20.0ng/0.05ml样品
由该结果明显看出将样品加至溶解物试剂中然后立即再加入抑肽酶可有效地进行Et测定而不受β-葡聚糖的影响。
实施例9
将抑肽酶加至含丝氨酸蛋白酶样品中进行的Et测定
将0.01mlDW或Et溶液（400pg/ml）加至0.01ml100ug/ml的胰蛋白酶（来源于牛胰腺，由Miles Laboratories生产，可从Seikagaku Corporation得到）溶液或DW中，再向其加入0.08ml抑肽酶水溶液（5.0mg/ml），然后混合。各种制得的混合物进一步与0.1ml用于Et-特异性生色合成底物法的鲎试验试剂（Endospecy，可从Seikagaku Corporation得到）混合，然后按实施例1-1）所述进行同样的反应，以测定加至胰蛋白酶样品中的Et的回收率。重复同样步骤，只是以0.08mlDW取代抑肽酶水溶液。结果示于表9。
表9
样品中加入  加入Et  未加入Et  △A545nm  Et的回收率
样品  抑肽酶  (A545nm)  (A545nm)  (%)
DW  有  0.729  0.070  0.659  100
胰蛋白酶  有  0.743  0.095  0.648  98.3
DW  无  0.701  0.031  0.670  100
胰蛋白酶  无  >1.5  >1.5  -  -
由表9所示结果明显看出预先将抑肽酶加至胰蛋白酶样品中进行鲎试验可以准确地进行含胰蛋白酶样品的Et测定。
实施例10
将抑肽酶加至溶解物试剂中所进行的含丝氨酸蛋白酶样品的Et测定
将0.08ml抑肽酶水溶液（8mg/ml）加至0.1ml Toxicolar System Ls-200 Set中，然后混合。再向其中加入0.02ml由10单位/ml凝血酶（源于牛血清，可以从Sigma得到）溶液或DW与同体积Et溶液（400pg/ml）混合制成的溶液。使每一种制得的混合物按实施例1-1）所述进行同样反应以测定加至凝血酶样品中的Et的回收率。重复同样步骤，只是以0.08mlDW取代抑肽酶水溶液。结果示于表10。
表10
溶解物试剂中  加入Et  未加入Et  △A545nm  Et的回收率
样品  加入抑肽酶  (A545nm)  (A545nm)  (%)
DW  有  0.718  0.068  0.650  100
凝血酶  有  0.764  0.116  0.648  99.7
DW  无  0.693  0.028  0.665  100
凝血酶  无  >1.5  >1.5  -  -
由表10所示结果明显看出将抑肽酶加至鲎试验试剂中可准确地进行含凝血酶样品中的Et测定。
实施例11
在鲎试验前将含丝氨酸蛋白酶的样品用固定有抑肽酶的不溶性载体预处理所进行的Et测定
将10ml200ug/ml胰蛋白酶（源于猪胰腺，Sigma生产）溶液应用于层析柱（1.2×400m）上，该柱装有已用含0.15MNacl的0.1M Tris-Hcl缓冲液（pH8.0）平衡过的无Et的、固定有抑肽酶的Cellulofine（按下面的方法制备）。然后用含0.15MNacl的0.1M Tris-Hcl缓冲液（pH8.0）洗脱，收集过柱的馏分。向0.1ml收集的馏分或0.1mlDW中加入0.01mlET溶液（400pg/ml），再加0.1ml Endospecy。所得混合物按实施例1-1）中同样的方法反应以测定馏分中Et的回收率。重复同样步骤，只是将0.1mlDW或Et溶液以及之后加的0，1ml Endospecy加至0.01ml未处理的胰蛋白酶溶液中。结果示于表11。
表11
加Et  不加Et  Et的回收率
样品  (A545nm)  (A545nm)  △A545nm  (%)
DW  0.709  0.032  0.677  100
过柱馏分  0.710  0.034  0.676  99.9
未处理胰蛋白酶  >1.5  >1.5  -  -
由表11所示的结果明显看出将胰蛋白酶预先与固定有抑肽酶的不溶性载体接触后进行鲎试验可准确地测定含胰蛋白酶样品中的Et。固定有抑肽酶的Cellulofine的制备。
将10g甲酰-Cellulofine（由Chisso生产并可从Seikaqaku Corporation得到）以0.1M磷酸钠缓冲液（pH7.1）充分洗涤，并悬浮于20ml抑肽酶溶液（溶于0.1M磷酸钠缓冲液中，pH7.1浓度为20mg/ml）中。向悬浮液中加入50mgNaCNBH3。室温下轻轻搅动8小时后，将悬浮物用0.2M Tris-Hcl缓冲液（pH7.0）洗涤并过滤。然后向所得残留物中加含10mgNaCNBH3的5ml上述缓冲液，再于室温下摇动3小时。其后，用含0.15MNacl的0.1MTris-Hcl缓冲液（pH8.0）充分洗涤所得的悬浮物。
实施例12
重复实施例2的步骤，只是应用了0.1ml来自被怀疑患有并发脓毒症病人的富含血小板血浆作为样品，该血浆按照美国专利4，495，294所述的方法用高氯酸处理过并被中和。改样品也按通常方法进行培养以检测微生物感染。结果，与Et定量反应性一致，测出了许多大肠杆菌菌落。
当将同一样品按照与实施例3至8的一致步骤试验时，也证实了本发明试剂或方法的有效性。
因此，用于Et测定的试剂可以通过将溶解物试剂与抑肽酶联合起来这一简单和经济的方法制备。它对于测定来自于被怀疑患有感染性疾病或脓毒症病人、但又未证实含有内毒素的临床样品尤其有用，并且它能准确地判断真正的革兰氏阴性菌感染（内毒素血症）。而且，本发明的优点还在于许多含丝氨酸蛋白酶样品中所含的内毒素能容易和准确地被测出，而这些样本由于丝氨酸蛋白酶很强地干扰鲎反应所以不能以常规鲎试验进行测定，或者需要进行复杂的预处理。
由于已详细描述了本发明及有关特殊实施例，本领域技术人员应清楚在不离开本发明的精神和范围的情况下可以在其中进行许多变化和修改。

Claims (14)

1、一种包括鲎血液变形细胞溶解物试剂和抑肽酶的用于内毒素测定的试剂。
2、根据权利要求1用于内毒素测定的试剂，其中所说的抑肽酶含量为能有效抑制存在于所说鲎血液变形细胞溶解物试剂中G因子的激活的量。
3、一种包括鲎血液变形细胞溶解物试剂和含抑肽酶的试剂、用于内毒素测定的药盒。
4、根据权利要求3的药盒，其中所说含抑肽酶的试剂进一行含有缓冲剂。
5、一种用鲎血液变形细胞溶解物试剂测定样品中内毒素的方法，其中将抑肽酶加至所说鲎血液变形细胞溶解物试剂和/或样品中。
6、根据权利要求5用于内毒素测定的方法，其中加至鲎血液变形细胞溶解物试剂中的抑肽酶的量为能有效抑制存在于鲎血液变形细胞溶解物中G因子的激活的量。
7、根据权利要求5用于内毒素测定的方法，其中所说的样本含丝氨酸蛋白酶，加至所述鲎血液变形细胞溶解物试剂和/或样品中的抑肽酶的量为能有效抑制样品中所说的丝氨酸蛋白酶的量。
8、根据权利要求5用于内毒素测定的方法，其中抑肽酶是以能有效抑制存在于鲎血液变形细胞溶解物试剂中的G因子激活和有效抑制样品中存在的丝氨酸蛋白酶的量应用的。
9、一种用鲎血液变形细胞溶解物试剂测定样品中内毒素的方法，其中鲎血液变形细胞溶解物试剂中的G因子被去除或失活，加入含丝氨酸蛋白酶样品中的抑肽酶的量为能有效抑制所说丝氨酸蛋白酶的量。
10、一种用鲎血液变形细胞溶解物试剂测定含丝氨酸蛋白酶样品中内毒素的方法，其中测定前样本与固定有抑肽酶的不溶性载体接触。
11、一种根据权利要求10测定内毒素的方法，其中鲎血液变形细胞溶解物试剂含有能有效抑制鲎血液变形细胞溶解物试剂中存在的G因子激活量的抑肽酶。
12、一种在用鲎血液变形细胞溶解物试剂进行内毒素测定之前预处理含丝氨酸蛋白酶样品的不溶性载体，其上固定有抑肽酶。
13、一种用于抑制鲎血液变形细胞溶解物试剂中存在的G因子激活的方法，它包括将抑肽酶加至鲎血液变形细胞溶解物试剂中。
14、一种G因子激活抑制剂，它包括作为一种活性成分、能抑制鲎血液变形细胞溶解物试剂中存在的G因子激活的抑肽酶和一种用于为C因子与内毒素反应维持理想pH范围的缓冲剂。
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