CN104884952A - 付之鲎试验的抗凝血酶iii用的前处理剂及前处理方法 - Google Patents

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Abstract

提供一种手段，其可减少将抗凝血酶III付之鲎试验时的反应干扰作用，因此可高精度地实施抗凝血酶III的鲎试验。在与二价金属盐共存的状态下，将付之鲎试验的抗凝血酶III供至使蛋白质失活的处理中，由此降低将抗凝血酶III付之鲎试验时的反应干扰作用。

Description

付之鲎试验的抗凝血酶III用的前处理剂及前处理方法
技术领域
本发明涉及付之使用了鲎试剂的内毒素等靶标物质的检测试验的抗凝血酶III用的前处理剂和包含该处理剂的鲎试剂盒、以及使用了它们的抗凝血酶III的前处理方法和使用了鲎试剂的内毒素等靶标物质的测定方法。
本发明中，有时使用下述简称。
Et：内毒素
BG：(1→3)-β-D-葡聚糖
ATIII：抗凝血酶III
背景技术
内毒素是存在于革兰氏阴性细菌的细胞壁外膜上的脂多糖，且己知是强致热原。此外，己知的是，除了发热以外，内毒素还会引起休克症状等各种病状。因此，从确保医药品等的安全性的观点出发，注射剂等医药品、水、医疗器具等中的内毒素的检测、定量很重要。
己知的是，若革兰氏阴性细菌感染鲎，则会引起血液凝固，该现象被用于内毒素的检测。即，可以使用鲎血细胞提取液(鲎的变形细胞溶解物，下文中也称为“LAL”)测定内毒素。这被称为鲎试验，利用存在于LAL中的各种蛋白质(均为丝氨酸蛋白酶)的级联反应，该反应是通过内毒素与LAL接触而发生的。
ATIII为血液中的抗凝血因子，被用于弥散性血管内凝血(DIC)等的治疗。此处，由于ATIII为丝氨酸蛋白酶抑制剂，因此可抑制参与存在于LAL中的级联反应的蛋白质的活性(非专利文献1)。这样，有时通过待测试样而显示出对于鲎试剂的抑制作用。这种抑制作用有时可通过待测试样的稀释来避免(非专利文献2)。但是，ATIII对于鲎试剂的抑制作用极强，为了将ATIII制剂(注射剂)付之鲎试验，需要稀释64倍以上(非专利文献2)。由此，若考虑鲎试剂的检测灵敏度(校准曲线的最小内毒素浓度)，则认为难以将鲎试验适用于ATIII制剂(非专利文献2)。实际上，关于包含ATIII的试样，现在也利用兔发热试验进行内毒素的检测(非专利文献1)。
非专利文献1中公开了一种测定ATIII制剂的Et的方法，其特征在于，将ATIII制剂稀释100倍，在70℃加热20分钟进行前处理后，与LAL反应，通过光散射法进行测定。该方法的技术特征在于，为了使Et的检测高灵敏度化，代替使用分光光度计的比浊法而采用了使用光散射测定装置的光散射法。但是，该方法与上述同样地必须进行高倍率的稀释，而且至少还存在以下的问题。
(1)作为鲎试验的测定装置而广泛普及的是分光光度计，为了实施光散射法而需要另行新导入、使用光散射测定装置。
(2)在日本药典中，作为Et的光学定量法仅规定了比浊法和比色法，未规定光散射法。
另外，在专利文献1中记载了下述生物体来源的试样的Et及BG的测定方法，其特征在于，使生物体来源的试样与碱土金属硫酸盐或碱土金属卤化物接触，加热进行前处理后，付之使用鲎试剂的测定。
另外，在专利文献2中记载了下述血液来源的试样的Et及BG的测定方法，其特征在于，将生物体来源的试样与海地美铵(hexadimethrine)化合物、碱金属氢氧化物、非离子性表面活性剂及碱土金属卤化物混合，加热进行前处理后，付之使用鲎试剂的测定。
另外，在专利文献3中记载了下述有可能含有ATIII的试样的Et测定方法，其特征在于，使生物体来源的试样与固定有脂多糖和/或脂质A结合肽的载体接触，吸附回收Et后，付之使用鲎试剂等的测定。
但是，在所有文献中均未有关于下述内容的记载：为了实施ATIII的鲎试验，在与二价金属盐共存的状态下，将ATIII供至使蛋白质失活的处理中，进行前处理。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开2006/080448号小册子
专利文献2：日本特开平6-70796
专利文献3：日本特开2010-243342
非专利文献
非专利文献1：内毒素·自然免疫研究15―飞跃的自然免疫研究―(エンドトキシン·自然免疫研究15―飛躍する自然免疫研究―)、医学图书出版、p.27～30、2012
非专利文献2：内毒素研究12―自然免疫学的新展开―(エンドトキシン研究12―自然免疫学の新たな展開―)、医学图书出版、p.93～97、2009
发明内容
发明要解决的问题
本发明的课题在于提供一种手段，其可减少将ATIII付之鲎试验时的反应干扰作用，因此可高精度地实施ATIII的鲎试验。此处所说的“反应干扰作用”是指，由于鲎试验的测定对象物质(Et、BG等)以外的因素引起、并且对鲎试验的结果产生影响的所有作用。因此，“反应干扰作用”例如包括：ATIII本身、与ATIII共存的添加物或杂质等成分、在前处理时共存的前处理剂以外的试剂等成分、和/或鲎试剂中的成分等所引起的、这些成分自身不溶化的作用、促进或抑制鲎试剂的反应的作用、改变Et的胶束结构或BG的高级结构而使它们的活性(对于鲎试剂中的C因子或G因子的反应性)发生变化的作用等对鲎试验的结果产生影响的所有作用。
用于解决问题的方案
本发明人为了解决上述课题进行了深入研究，结果发现，在与二价金属盐共存的状态下，将ATIII付之热处理或酸处理等使蛋白质失活的处理中，由此能够降低将ATIII付之鲎试验时的反应干扰作用，从而能够高精度地实施ATIII的鲎试验，由此完成了本发明。
即，本发明包括以下的方案。
[1]
一种前处理剂，其为付之鲎试验的抗凝血酶III用的前处理剂，
该前处理剂含有二价金属盐，
该前处理剂用于在将抗凝血酶III付之鲎试验前，在与上述前处理剂共存的状态下，将该抗凝血酶III供至使蛋白质失活的处理中。
[2]
上述前处理剂，其中，上述二价金属盐为选自由二价金属氯化物、二价金属乙酸盐及二价金属硫酸盐组成的组中的一种或一种以上的金属盐。
[3]
上述前处理剂，其中，构成上述二价金属盐的二价金属为选自由镁、钙、锰及锌组成的组中的一种或一种以上的金属。
[4]
上述前处理剂，其中，使抗凝血酶III与上述前处理剂共存时，来自上述二价金属盐的二价金属离子的浓度为0.5mM以上。
[5]
上述前处理剂，其中，上述鲎试验的测定对象物质为内毒素。
[6]
一种抗凝血酶III用的鲎试剂盒，其包含上述前处理剂。
[7]
一种付之鲎试验的抗凝血酶III的前处理方法，其包括：在与上述前处理剂共存的状态下，将抗凝血酶III供至使蛋白质失活的处理中。
[8]
上述前处理方法，其中，使上述蛋白质失活的处理为热处理或酸处理。
[9]
上述前处理方法，其中，上述热处理在超过50℃的温度下进行。
[10]
上述前处理方法，其中，用于上述酸处理的酸为盐酸。
[11]
一种测定抗凝血酶III中的鲎试验的测定对象物质的方法，其包括：利用上述前处理方法对抗凝血酶III进行前处理；以及将经前处理的抗凝血酶III付之鲎试验。
[12]
一种制造抗凝血酶III的方法，其包括：利用上述方法测定抗凝血酶III中的鲎试验的测定对象物质。
附图说明
图1是示出使用平行线定量法的试验的结果的图。
图2是示出使用平行线定量法的试验的结果的图。
图3是示出使用平行线定量法的试验的结果的图。
具体实施方式
(1)本发明的前处理剂
本发明的前处理剂是含有二价金属盐的、付之鲎试验的ATIII用的前处理剂。本发明的前处理剂用于在将ATIII付之鲎试验前，在与本发明的前处理剂共存的状态下，将该ATIII供至使蛋白质失活的处理中。
此处所说的“鲎试验”是指，利用鲎试剂检测(测定)靶标物质的试验。也将该靶标物质称为“鲎试验的测定对象物质”。鲎试验的测定对象物质只要是能够通过鲎试验检测的物质就没有特别限制，优选为Et或BG、更优选为Et。
此处所说的“ATIII”只要是含有ATIII的试样就没有特别限制，可以为由ATIII构成的物质，也可以为包含ATIII以外的成分的物质。对ATIII的形状也没有特别限制，例如可以为液态，也可以为冷冻干燥物、粉末、颗粒、片剂等固态。
作为ATIII，例如可以举出ATIII的注射用制剂。作为这种注射用制剂，具体来说可以举出例如Neuart(注册商标：株式会社Benesis制)、Ansuronbin(财团法人化学及血清疗法研究所制)、Nonthron(注册商标：日本制药株式会社制)。在将这种ATIII的注射用制剂付之本发明的前处理和鲎试验时，可以直接将原液用作待测物，也可以将浓缩后的溶液用作待测物，还可以将用水或缓冲液等水性溶剂以任意倍率稀释而成的溶液用作待测物。此处所说的“原液”是指，以通常将ATIII用作注射用制剂时的浓度50Unit/mL的浓度含有的溶液。“原液”例如如下得到：根据各ATIII的注射用制剂的所附文件中记载的方法，将ATIII溶解于水性溶剂中，从而得到。此处所说的“浓缩后的溶液”是指，以超过50Unit/mL的浓度含有ATIII的溶液。作为“浓缩后的溶液”，例如可以举出在各ATIII的注射用制剂的制造工序中得到的中间纯化物。
另外，关于用水性溶剂稀释原液时的稀释倍率，只要能够检测鲎试验的测定对象物质就没有特别限制，例如优选为超过1倍且小于64倍、更优选为超过1倍且为16倍以下、进一步优选为超过1倍且为10倍以下、更进一步优选为超过1倍且为4倍以下、特别优选为超过1倍且为2.5倍以下、极其优选为1.1倍以上且2.5倍以下、特别极其优选为1.2倍以上且2.5倍以下。需要说明的是，此处所说的“稀释倍率”是指，在本发明的前处理剂的共存下进行使蛋白质失活的处理的反应液相对于所述“原液”的稀释的倍率。由此，稀释倍率“1倍”是指，在本发明的前处理剂的共存下进行使蛋白质失活的处理的反应液中的ATIII浓度与所述“原液”的ATIII浓度相同(原液原本的状态。不稀释原液，ATIII以50Unit/mL的浓度存在)。
另外，ATIII也可以为重组蛋白。重组ATIII可以通过在宿主细胞中表达来获得。利用宿主细胞的表达可以根据常规方法进行。例如，根据山田等人(国际公开第2005/035563号)的方法进行。ATIII的氨基酸序列或编码该序列的基因的碱基序列可以由公知的数据库获得。作为公知的数据库，例如可以举出NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)。所表达的重组蛋白可以为与天然的ATIII具有相同的氨基酸序列的蛋白质。另外，所表达的重组蛋白只要可维持作为ATIII的功能，则也可以为天然的ATIII的变体。变体还包括公知的ATIII的同系物或人工变异体。
此处所说的“二价金属盐”只要是在本发明所属的技术领域中作为二价金属盐被认识的金属盐就没有特别限制。作为二价金属盐，例如可以举出二价金属氟化物、二价金属氯化物、二价金属溴化物、二价金属碘化物、二价金属氢氧化物、二价金属氰化物、二价金属硝酸盐、二价金属亚硝酸盐、二价金属次氯酸盐、二价金属亚氯酸盐、二价金属氯酸盐、二价金属高氯酸盐、二价金属高锰酸盐、二价金属乙酸盐、二价金属碳酸氢盐、二价金属磷酸二氢盐、二价金属硫酸氢盐、二价金属硫化氢盐、二价金属硫氰酸盐、二价金属氧化物、二价金属硫化物、二价金属过氧化物、二价金属硫酸盐、二价金属亚硫酸盐、二价金属硫代硫酸盐、二价金属碳酸盐、二价金属铬酸盐、二价金属重铬酸盐、二价金属磷酸一氢盐、二价金属磷酸盐。作为二价金属盐，可以仅使用一种，也可以组合使用两种或其以上。二价金属盐例如优选为选自由二价金属氯化物、二价金属乙酸盐及二价金属硫酸盐组成的组中的一种或两种以上的金属盐。
在使ATIII与本发明的前处理剂共存时，二价金属盐可以提供二价的金属离子。“在使ATIII与本发明的前处理剂共存时”具体是指，进行后述的使蛋白质失活的处理时。二价金属盐例如可以为溶解于水性溶剂中并提供二价的金属离子的物质。作为水性溶剂，可以举出水或缓冲液。
此处所说的“二价金属”只要是在本发明所属的技术领域中作为二价金属被认识的金属就没有特别限制。“二价金属”可以指在离子化时提供二价的金属离子的金属。作为二价金属，例如可以举出铍、镁、钙、锶、钡、镭、镉、镍、锌、铜、汞、铁、钴、锡、铅、锰。作为二价金属，可以仅使用一种，也可以组合使用两种或其以上。二价金属例如优选为选自由镁、钙、锰及锌组成的组中的一种或其以上的金属。
作为二价金属盐，具体来说，例如可以举出硫酸镁(MgSO4)、例如氯化镁(MgCl2)、乙酸镁(Mg(CH3COO)2)、氯化钙(CaCl2)、乙酸钙(Ca(CH3COO)2)、硫酸锰(MnSO4)、硫酸锌(ZnSO4)。本发明的前处理剂例如可以仅含有硫酸镁(MgSO4)作为二价金属盐。另外，本发明的前处理剂例如也可以除了硫酸镁(MgSO4)外进一步含有一种或其以上的其它二价金属盐。
另外，本发明的前处理剂还可以进一步含有其它成分。“其它成分”只要是在试剂·诊断药学上允许的成分就没有特别限制，例如可以使用混配于试剂或诊断药中使用的成分。作为此处所说的“其它成分”，例如可以举出碱金属氯化物、碱金属乙酸盐、碱金属硫酸盐、表面活性剂及各种添加剂。作为各种添加剂，例如可以举出稳定化剂、乳化剂、渗透压调节剂、缓冲剂、等渗剂、保存剂、pH调节剂、着色剂、赋形剂、缩合剂、润滑剂、崩解剂，但不限定于这些。
另外，对本发明的前处理剂的剂型没有特别限制。本发明的前处理剂例如可以作为液剂提供，也可以作为粉末剂、颗粒剂或片剂等使用时溶解用的固态制剂提供。另外，本发明的前处理剂例如还可以作为将本发明的前处理剂保持于孔内的微孔板提供。这种微孔板例如通过将制备成液态的本发明的前处理剂分注到孔内并使其干燥而得到。另外，在作为液剂提供本发明的前处理剂的情况下，本发明的前处理剂可以以冻结状态提供，也可以以液体状态(融化状态)提供。
本发明的前处理剂中，二价金属盐可以以盐的状态存在，也可以以离子化的状态存在，还可以作为其混合物存在。所有这些情况均符合“本发明的前处理剂含有二价金属盐”的情况。
关于本发明的前处理剂，除了含有二价金属盐以外，可以通过与在制造试剂或诊断药时通常使用的方法同样的方法来制造。
对本发明的前处理剂中的二价金属盐的浓度没有特别限制，可以根据二价金属盐的种类或本发明的前处理剂的用量等各种条件适当设定。本发明的前处理剂中的二价金属盐的浓度例如可以为0.001质量％以上、0.01质量％以上、0.1质量％以上、1质量％以上、5质量％以上、10质量％以上、30质量％以上、或50质量％以上。本发明的前处理剂中的二价金属盐的浓度例如可以为100质量％以下、50质量％以下、30质量％以下、10质量％以下、5质量％以下、或1质量％以下。
对本发明的前处理剂的用量没有特别限制，可以根据二价金属盐的种类或浓度等各种条件适当设定。本发明的前处理剂例如可以按照在使ATIII与本发明的前处理剂共存时来自二价金属盐的二价金属离子的浓度(下文中也称为“处理时的二价金属离子浓度”)在以下例示的浓度范围的方式来使用。“使ATIII与本发明的前处理剂共存时的浓度”具体是指，进行后述的使蛋白质失活的处理的反应体系中的浓度。处理时的二价金属离子浓度只要可得到本发明的前处理的效果就没有特别限制，例如优选为0.5mM以上。处理时的二价金属离子浓度例如优选为0.5mM～100mM、更优选为0.5mM～50mM、进一步优选为0.5mM～25mM、更进一步优选为5mM～25mM、特别优选为5mM～12.5mM。需要说明的是，在本发明的前处理剂中含有2种以上的二价金属盐的情况下，此处所说的“处理时的二价金属离子浓度”是指来自这些二价金属盐的二价金属离子的浓度的总和。
通过使用这种本发明的前处理剂进行ATIII的前处理，可以减少将ATIII付之鲎试验时的反应干扰作用，由此能够以高精度实施ATIII的鲎试验。
(2)本发明的试剂盒
本发明的试剂盒是包含本发明的前处理剂作为构成物品的鲎试剂盒。本发明的试剂盒也可以包含其它的构成物品。作为此处所说的“其它的构成物品”，例如可以举出鲎试剂、鲎反应的检测用底物、缓冲液、蒸馏水、标准物质(Et或BG等)及微孔板，但不限定于这些。
本发明中使用的鲎试剂只要含有参与与鲎试验的测定对象物质对应的级联反应的蛋白质就没有特别限定。作为鲎试剂，例如可以举出鲎血细胞提取液(LAL(溶解物试剂))。LAL可以将鲎的血液作为原料、通过常规方法获得。LAL也可以在适当分级和/或纯化等后再使用。鲎可以为任意种类的鲎。作为鲎，可以举出作为日本产鲎的东方鲎(Tachypleus tridentatus)、作为美国产鲎的美洲鲎(Limulus polyphemus)、以及作为东南亚产鲎的圆尾鲎(Carcinoscorpius rotundicauda)和南方鲎(Tachypleus gigas)。例如，作为使用了美洲鲎来源的溶解物的鲎试剂，可以举出Endospecy(注册商标)ES-50M(生化学工业株式会社)、Pyrochrome(Associates of Cape Cod,Inc.)、Pyrotell(注册商标)-T(Associates of Cape Cod,Inc.)、Pyrotell(注册商标)Multi-Test(Associates ofCape Cod,Inc.)、Kinetic-QCL(LONZA WALKERSVILLE,INC.)、Endochrome-K(Charles River Laboratories Inc.)。
另外，作为鲎试剂，也可以例示出人工重构的物质。重构的鲎试剂只要按照包含参与与鲎试验的测定对象物质对应的级联反应的蛋白质的方式构成就没有特别限制。也将参与级联反应的蛋白质统称为“因子”。此处所说的“级联反应”是指，通过鲎试验的测定对象物质的存在而进行的一系列反应。例如，在存在Et等使C因子活化的物质时，进行下述一系列反应：C因子被该物质所活化而成为活化型C因子，B因子被活化型C因子所活化而成为活化型B因子，凝固酶原被活化型B因子所活化而成为凝固酶。即，在Et等使C因子活化的物质为测定对象物质的情况下，重构的鲎试剂例如只要包含C因子、B因子及凝固酶原作为构成级联体系的因子即可。另外，例如在存在BG等使G因子活化的物质的情况下，进行下述一系列反应：G因子被该物质所活化而成为活化型G因子，凝固酶原被活化型G因子所活化而成为凝固酶。即，在BG等使G因子活化的物质为测定对象物质的情况下，重构的鲎试剂例如只要包含G因子及凝固酶原作为构成级联体系的因子即可。级联反应的进行例如可以通过使用后述的鲎反应的检测用底物检测凝固酶的存在来检测。
另外，作为后述的鲎反应的检测用底物，在利用能够检测级联反应的中间阶段的底物的情况下，重构的鲎试剂只要包含参与至该中间阶段为止的因子即可。具体来说，例如在Et等使C因子活化的物质为测定对象物质、且利用能够检测活化C因子的存在的鲎反应的检测用底物的情况下，重构的鲎试剂只要包含C因子即可。
重构的鲎试剂中包含的各因子可以为天然得到的物质，也可以为重组蛋白。
天然的各因子可以由上述各种鲎的血细胞提取液(LAL)获得。这些因子可以纯化为所期望的程度后使用。纯化例如可以通过公知的方法(Nakamura T.et al.,J Biochem.1986Mar；99(3)：847-57.)进行。
另外，各因子可以通过在宿主细胞中表达而获得。利用宿主细胞的表达可以根据常规方法进行。例如，可以根据水村等人(国际公开第2012/118226号)的方法进行。各因子的氨基酸序列或编码该序列的基因的碱基序列可以由公知的数据库获得。作为公知的数据库，例如可以举出NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)。所表达的各重组蛋白可以根据需要纯化为所期望的程度后使用。
通过适当组合各因子，得到重构的鲎试剂。例如，重构的鲎试剂中包含的因子可以全部为天然的因子，也可以全部为重组蛋白，还可以为它们的任意的组合。另外，重构的鲎试剂例如可以通过对LAL自身、或者将LAL适当分级和/或纯化等而得到的物质适当组合各因子而得到。
鲎反应的检测用底物(下文中也简称为“检测用底物”)是指用于检测级联反应的进行的底物。
作为检测用底物，可以举出凝固蛋白原。凝固蛋白原是作为级联反应的最终产物的凝固酶的检测底物。通过凝固蛋白原与凝固酶发生接触，作为凝固素而凝固。凝固反应的进行可以通过测定反应液的浊度或观测凝胶的形成而测定。凝固蛋白原可以由鲎血细胞提取液(LAL)进行回收。此外，编码凝固蛋白原的基因的碱基序列已明确(宫田等人、蛋白质核酸酶(蛋白質核酸酶)增刊No.29；P30-43；1986)，可以根据常规方法以基因工程学的方式进行生产。
另外，作为检测用底物，可以使用合成底物。合成底物只要具有适合于检测级联反应的进行的性质就没有特别限制。作为“适合于检测级联反应的进行的性质”，例如可以为用于检测凝固酶的存在的性质、用于检测级联反应的中间阶段的性质。作为“用于检测凝固酶的存在的性质”，可以举出通过凝固酶的酶反应而显色的性质、通过凝固酶的酶反应而发出荧光的性质。作为“用于检测级联反应的中间阶段的性质”，可以举出通过活化C因子等的酶反应而显色的性质、通过活化C因子等的酶反应而发出荧光的性质。作为合成底物，例如可以举出通式X-Y-Z(式中，X为保护基，Y为肽，Z为与Y形成了酰胺键的色素)所表示的底物。例如，在包含C因子、B因子及凝固酶原的反应体系中存在Et等使C因子活化的物质的情况下，通过作为级联反应的结果所产生的凝固酶的酶反应，Y-Z间的酰胺键被切断，色素Z游离而显色，或者发出荧光。在利用含有G因子及凝固酶原的反应体系的情况下、或检测级联反应的中间阶段的情况下，分别通过凝固酶、或在级联反应的中间阶段产生的蛋白质，色素Z发生游离即可。作为保护基X，没有特别限制，可以适当地使用肽的公知的保护基。作为这种保护基，可以举出叔丁氧羰基、苯甲酰基。对色素Z没有特别限制，例如，可以为在可见光下被检测出的色素，也可以为荧光色素。作为色素Z，可以举出pNA(对硝基苯胺)、MCA(7-甲氧香豆素-4-乙酸)、DNP(2,4-二硝基苯胺)、Dansyl(丹磺酰)系色素。作为肽Y，可以举出Leu-Gly-Arg(LGR)、Ile-Glu-Gly-Arg(IEGR)(序列号1)、Val-Pro-Arg(VPR)、Asp-Pro-Arg(DPR)。这些合成底物均可以用于检测凝固酶的存在，也可以用于检测级联反应的中间阶段。另外，这些合成底物也可以根据检测对象选择使用适当的物质。例如，从底物特异性的方面出发，包含LGR作为肽Y的底物可以适合用于凝固酶的检测，包含VPR或DPR作为肽Y的底物可以适合用于活化C因子的检测。游离的色素Z通过与色素的性质相符的方法进行测定即可。
需要说明的是，在使用鲎血细胞提取液(LAL)作为鲎试剂的情况下，可以利用LAL中原本含有的凝固蛋白原作为检测用底物。另外，也可以将适当选择的检测用底物与LAL组合使用。
在使用重构的鲎试剂作为鲎试剂的情况下，可以将适当选择的检测用底物与重构的鲎试剂组合使用。
各因子及检测用底物可以作为混合物包含于本发明的试剂盒中，也可以分别个别地或以任意的组合个别地包含于本发明的试剂盒中。
通过使用这种本发明的试剂盒进行ATIII的前处理，可以减少将ATIII付之鲎试验时的反应干扰作用，能够以高精度实施ATIII的鲎试验。
(3)本发明的前处理方法
本发明的前处理方法为付之鲎试验的ATIII的前处理方法，其包括：在与本发明的前处理剂共存的状态下，将ATIII供至使蛋白质失活的处理中。
此处所说的“使蛋白质失活的处理”只要是使ATIII失活的处理即可，具体来说，只要是以不抑制鲎试验的程度使ATIII失活的处理即可。作为使蛋白质失活的处理，例如可以举出热处理、酸处理、碱处理，但不限定于这些。作为使蛋白质失活的处理，可以单独进行任一种处理，也可以组合进行两种或两种以上的处理。
使蛋白质失活的处理例如可以在水或缓冲液等水性溶剂中进行。即，使蛋白质失活的处理例如可以在使ATIII与本发明的前处理剂在水性溶剂中共存的状态下进行。
此处所说的“热处理”是指，对与本发明的前处理剂共存的ATIII进行加热的处理。对加热的方法没有特别限定，优选使用加热块、水浴、空气浴、微波炉等设备的方法。另外，关于热处理的温度，只要蛋白质失活就没有特别限制，例如通常超过50℃。热处理的温度例如优选为55℃～100℃、更优选为55℃～95℃、进一步优选为60℃～90℃、更进一步优选为65℃～85℃、特别优选为65℃～75℃。另外，关于热处理的时间，只要蛋白质失活就没有特别限制，例如优选为1分钟以上。热处理的时间例如优选为1分钟～2小时、更优选为1分钟～1小时、进一步优选为5分钟～30分钟、更进一步优选为5分钟～20分钟、特别优选为5分钟～15分钟。
另外，此处所说的“酸处理”是指，使与本发明的前处理剂共存的ATIII与酸接触的处理。作为用于酸处理的酸，例如可以举出盐酸、硫酸、硝酸，但不限定于这些。这些之中，优选盐酸。酸的添加量可以根据酸的种类等各种条件适当设定。酸的添加量例如可以为酸处理时的反应体系中的酸浓度达到0.001N～1N、优选达到0.01N～0.5N、更优选达到0.01N～0.1N的量。关于酸处理的时间，只要蛋白质失活就没有特别限制，例如可以为通常用于酸处理的时间。酸处理的时间例如可以为0.1秒～2小时。
另外，此处所说的“碱处理”是指，使与本发明的前处理剂共存的ATIII与碱接触的处理。作为用于碱处理的碱，例如可以举出氢氧化钠、氢氧化钾，但不限定于这些。这些之中，优选氢氧化钠。碱的添加量可以根据碱的种类等各种条件适当设定。碱的添加量例如可以为碱处理时的反应体系中的碱浓度达到0.001N～1N、优选达到0.01N～0.5N、更优选达到0.01N～0.1N的量。关于碱处理的时间，只要蛋白质失活就没有特别限制，例如可以为通常用于碱处理的时间。碱处理的时间例如可以为0.1秒～2小时。
本发明的前处理方法可以包括使蛋白质失活的处理以外的工序。
例如，在进行使蛋白质失活的处理前，可以适当对ATIII进行处理。例如，可以进行将ATIII的干燥粉末微粉化等对ATIII进行加工的处理。另外，例如可以对ATIII进行稀释或浓缩等。这些处理可以在与本发明的前处理剂共存前进行，也可以在与本发明的前处理剂共存后且在进行使蛋白质失活的处理之前进行。
另外，例如在进行使蛋白质失活的处理后，也可以适当进行后处理。后处理例如为在将经前处理的ATIII付之鲎试验时，使鲎试验不受到抑制的处理。例如，在进行热处理作为使蛋白质失活的处理的情况下，可以降低处理物的温度。另外，例如在进行酸处理作为使蛋白质失活的处理的情况下，可以利用碱将处理物中和。另外，例如在进行碱处理作为使蛋白质失活的处理的情况下，可以利用酸将处理物中和。另外，例如也可以对处理物进行稀释或浓缩等。
通过使用这种本发明前处理方法进行ATIII的前处理，可以减少将ATIII付之鲎试验时的反应干扰作用，因此可高精度地实施ATIII的鲎试验。
(4)本发明的测定方法
本发明的测定方法是测定ATIII中的鲎试验的测定对象物质的方法，其包括：利用本发明的前处理方法对ATIII进行前处理；以及将经前处理的ATIII付之鲎试验。
鲎试验例如可以利用公知的方法进行。作为公知的方法，例如可以举出比色法、比浊法、凝胶化法。
具体来说，鲎试验可以通过使ATIII与鲎试剂接触来进行。在ATIII中存在鲎试验的测定对象物质的情况下，级联反应进行。由此，通过测定级联反应的进行，可以测定ATIII中的鲎试验的测定对象物质。在鲎试验时，各因子可以在使ATIII与鲎试剂接触的工序的最初就包含于反应体系中，也可以逐次添加至反应体系中。
级联反应的进行可以使用检测用底物进行测定。即，关于级联反应的进行，可以根据检测用底物的种类，通过测定该底物的反应(显色或凝固等)来测定。检测用底物可以在任意的时刻添加至反应体系中。例如，检测用底物可以在使ATIII与鲎试剂接触的工序的最初就包含于反应体系中，也可以在该工序的进行中或完成后添加至反应体系中。另外，在使用预先含有检测用底物的鲎试剂的情况下，可以不将检测用底物另行添加至反应体系中。
关于本发明的测定方法，只要在ATIII中存在鲎试验的测定对象物质的情况下级联反应进行，则也可以包括其它任意的工序。例如，如上所述，本发明的测定方法也可以包括向反应体系中添加检测用底物的工序。另外，例如，本发明的测定方法也可以包括将通过测定得到的数据转换为其它数据的工序。作为将通过测定得到的数据转换为其它数据的工序，例如可以举出下述工序：基于通过测定得到的数据，计算出ATIII中的鲎试验的测定对象物质的量。
本发明的测定方法中，反应优选在水或缓冲液等水性溶剂中进行。
根据本发明的测定法，可以减少将ATIII付之鲎试验时的反应干扰作用，因此可高精度地实施ATIII的鲎试验。
另外，如此可得到确认到不存在鲎试验的测定对象物质导致的污染的ATIII。即，本发明提供一种制造ATIII的方法，其包括：利用本发明的测定方法测定ATIII中的鲎试验的测定对象物质。如此制造的ATIII能够以注射剂等任意的形态提供。
实施例
下面，通过实施例来具体地说明本发明，但这些实施例并不对本发明的技术范围进行任何限定。需要说明的是，在实施例中记载的所有试验中，水、试剂、塑料制品及玻璃制品等均使用可保证未检测出内毒素及不包含对于鲎试剂的反应的反应干扰因子的物质。
<Et添加回收率的定义>
在利用比色法或比浊法实施的试验中，按照以下的步骤计算出Et添加回收率。即，在向ATIII中添加已知量的内毒素的待测物的鲎试验的同时，代替ATIII而将等量的水作为待测物而进行鲎试验，将该鲎试验作为阳性对照来实施。将包含ATIII的待测物的吸光度变化率(mAbs/min)的值除以阳性对照的吸光度变化率的值，对所得到值进行百分率换算，作为Et添加回收率。需要说明的是，在ATIII或水中存在内毒素污染的情况下，从与污染相当的值减去测定值后计算出Et添加回收率即可。即，Et添加回收率可以指，在包含ATIII的待测物中实际检测出的Et量相对于不存在ATIII导致的反应干扰作用时应当检测出的Et量的比例(％)。
<参考例1>基于稀释加热法的ATIII的Et添加回收试验
向原液、或用水稀释4倍、16倍、64倍或者256倍的50Unit/mL的ATIII制剂(Neuart(注册商标)：株式会社Benesis：以下相同)0.4mL中加入制备成0.5EU/mL的Et(JPRSE：日本药典内毒素标准物品：以下相同)的标准液0.04mL，使用试管混合器剧烈搅拌1分钟。之后，将0.2mL分注至其它容器中，使用加热块以70℃加热10分钟。之后，将0.05mL分注至微孔板，加入比色法用的Et测定试剂(Endospecy(注册商标)ES-50M：生化学工业株式会社：以下相同)0.05mL。接着，使用具有恒温槽功能和搅拌功能的酶标仪(WellreaderMP-96：生化学工业株式会社：以下相同)剧烈搅拌1分钟后，在37℃一边加热30分钟一边测定在测定波长405nm和对照波长492nm下的吸光度的经时变化，计算出Et添加回收率。将结果示于表1。
【表1】
表1基于稀释加热法的ATIII的Et检测结果
如表1所示，在稀释倍率为16倍以下的情况下，Et添加回收率小于10％，无法以良好的精度检测出Et。另一方面，在稀释倍率为64倍以上的情况下，得到了几乎100％的Et添加回收率。该结果和与稀释加热法有关的公知的结果(非专利文献1)大体一致。
<实施例1>共存硫酸镁或氯化钙进行热处理时的Et添加回收试验
向25Unit/mL的ATIII制剂(用水稀释2倍的ATIII制剂)0.9mL中加入0.5EU/mL的Et标准液0.1mL，使用试管混合器剧烈搅拌1分钟。之后，将0.18mL分注至其它容器中，加入15.6mM、125mM、250mM、500mM、或者1000mM的MgSO4水溶液、或15.6mM、56mM、125mM、250mM、或者500mM的CaCl2水溶液0.02mL，使用试管混合器剧烈搅拌1分钟。使用加热块将各溶液在70℃加热10分钟后，立即冰冷。使各溶液恢复至室温后，将0.05mL分注至微孔板中。添加Endospecy ES-50M 0.05mL，使用酶标仪剧烈搅拌1分钟后，一边在37℃加热30分钟，一边测定在测定波长405nm和对照波长492nm下的吸光度的经时变化，计算出Et添加回收率。将结果示于表2、3。表中，“MgSO4浓度”和“CaCl2浓度”表示热处理时的反应液中的浓度。另外，本实施例中的ATIII制剂的稀释倍率为约2.5倍。
【表2】
表2共存硫酸镁进行热处理时的Et检测结果
【表3】
表3共存氯化钙进行热处理时的Et检测结果
如表2、3所示，通过使ATIII和Et与硫酸镁或氯化钙共存而进行热处理，即便不如稀释加热法那样稀释64倍以上，也能够以良好的精度检测出Et。特别是，在硫酸镁的浓度为12.5mM以上的情况下，能够以良好的精度检测出Et。
<实施例2>二价金属盐的种类的研究
向50Unit/mL的ATIII制剂0.2mL中加入0.5EU/mL的Et标准液0.22mL，使用试管混合器剧烈搅拌1分钟后、加入水1.8mL，进一步使用试管混合器剧烈搅拌1分钟。之后，将0.1mL分注至其它容器中，加入1/10量(0.011mL)的制备成50mM或5mM的各种二价金属盐的水溶液，使用试管混合器剧烈搅拌1分钟。使用加热块将各溶液在70℃加热10分钟后，立即冰冷。使各溶液恢复至室温后，将0.05mL分注至微孔板。添加Endospecy ES-50M 0.05mL，使用酶标仪剧烈搅拌1分钟后，一边在37℃加热30分钟，一边测定在测定波长405nm和对照波长492nm下的吸光度的经时变化，计算出Et添加回收率。将结果示于表4。表中，二价金属盐浓度表示热处理时的反应液中的浓度。另外，本实施例中的ATIII制剂的稀释倍率为约12倍。
【表4】
表4共存各种二价金属盐进行热处理时的Et检测结果
如表4所示，在使Mg(CH3COO)2、MgCl2、Ca(CH3COO)2、MnSO4、或ZnSO4与ATIII共存而进行热处理的情况下，也能够检测出Et。
<实施例3>热处理的温度和时间的研究
向50Unit/mL的ATIII制剂0.9mL中加入0.5EU/mL的Et标准液0.1mL，使用试管混合器剧烈搅拌1分钟，将0.18mL分注至其它容器中。之后，加入200mM的CaCl2水溶液0.02mL，使用试管混合器剧烈搅拌1分钟。将各溶液静置于冰上，或使用加热块在37℃、50℃、60℃、70℃、80℃或者90℃进行5分钟、10分钟或20分钟热处理后立即冰冷。使各溶液恢复至室温后，将0.05mL分注至微孔板中。添加Endospecy ES-50M 0.05mL，使用酶标仪剧烈搅拌1分钟后，一边在37℃加热30分钟，一边测定在测定波长405nm和对照波长492nm下的吸光度的经时变化，计算出Et添加回收率。将结果示于表5。热处理时的反应液中的CaCl2浓度为20mM。另外，本实施例中的ATIII制剂的稀释倍率为约1.2倍。
【表5】
表5在各条件下进行热处理时的Et检测结果
如表5所示，在热处理的温度为60℃以上的情况下，能够检测出Et。另外，在热处理的时间为5分钟以上的情况下，能够检测出Et。另外，由在各温度(60℃、70℃、80℃、或90℃)下加热10分钟的结果可知，热处理的温度优选为Et添加回收率最高的70℃。
<参考例2>热处理后加入二价金属盐的效果的研究
向用水稀释4倍或者16倍的50Unit/mL的ATIII制剂或水0.9mL中加入0.5EU/mL的Et标准液0.1mL，使用试管混合器剧烈搅拌1分钟。之后，将0.18mL分注至其它容器中，静置于冰上，或使用加热块在70℃热处理10分钟后立即冰冷。使各溶液恢复至室温后，加入水、或7mM、28mM或者112mM的CaCl2水溶液0.02mL，使用试管混合器剧烈搅拌1分钟后，将0.05mL分注至微孔板中。添加Endospecy ES-50M 0.05mL，使用酶标仪剧烈搅拌1分钟后，一边在37℃加热30分钟，一边测定在测定波长405nm和对照波长492nm下的吸光度的经时变化，计算出Et添加回收率。将结果示于表6。
【表6】
表6热处理后加入二价金属盐时的Et检测结果
如表6所示，在热处理后加入二价金属盐的方法中，Et添加回收率小于10％，无法以良好的精度检测Et。由此可知，二价金属盐需要在热处理前预先与ATIII和Et共存。
<实施例4>酸处理的研究
向50Unit/mL的ATIII制剂0.2mL中加入0.5EU/mL的Et标准液0.22mL，使用试管混合器剧烈搅拌1分钟。之后，加入水1.8mL，进一步使用试管混合器剧烈搅拌1分钟。之后，将0.1mL分注至其它容器中，加入1/10量(0.011mL)的制备成50mM或5mM的各种二价金属盐的水溶液，使用试管混合器剧烈搅拌1分钟。之后，加入5N、2N、1N、0.5N或0.1N的盐酸0.011mL，进一步使用试管混合器剧烈搅拌1分钟。之后，将0.05mL分注至微孔板中，添加Endospecy ES-50M 0.05mL，使用酶标仪剧烈搅拌1分钟后，一边在37℃加热30分钟，一边测定在测定波长405nm和对照波长492nm下的吸光度的经时变化，计算出Et添加回收率。将结果示于表7。表中，二价金属盐浓度和盐酸浓度表示酸处理时的反应液中的浓度(估算)。另外，本实施例中的ATIII制剂的稀释倍率为约14倍。
【表7】
表7共存各种二价金属盐进行酸处理时的Et检测结果
如表7所示，通过在共存二价金属的状态下进行酸处理，与热处理时同样地能够检测出Et。特别是，在盐酸浓度为0.01N～0.1N的情况下，能够高效地检测出Et。
<实施例5>使用Pyrochrome(比色法用的Et测定试剂)的试验
向50Unit/mL的ATIII制剂0.1mL中加入0.4EU/mL的Et标准液0.1mL，使用试管混合器剧烈搅拌1分钟。之后，加入水0.1mL，使用试管混合器剧烈搅拌1分钟后，加入25mM的CaCl2水溶液0.1mL，进一步使用试管混合器剧烈搅拌1分钟，将0.2mL作为ATIII的4倍稀释液分注至其它容器中。向剩余的0.2mL中加入水0.2mL，使用试管混合器剧烈搅拌1分钟后，将0.2mL作为ATIII的8倍稀释液分注至其它容器中。重复该操作，制备ATIII的16倍稀释液及32倍稀释液，分别分注至其它容器中。使用加热块将各溶液在70℃热处理10分钟后，立即冰冷。使各溶液恢复至室温后，将0.05mL分注至微孔板中。添加比色法用的Et测定试剂(Pyrochrome：Associates of Cape Cod,Inc.)0.05mL，使用酶标仪剧烈搅拌1分钟后，一边在37℃加热60分钟，一边测定在测定波长405nm和对照波长492nm下的吸光度的经时变化，计算出Et添加回收率。将结果示于表8。
【表8】
表8基于比色法(Pyrochrome)的Et检测结果
如表8所示，在使用Pyrochrome代替Endospecy ES-50M作为比色法用的Et测定试剂的情况下，与ATIII制剂的稀释倍率无关，Et添加回收率也几乎为100％，能够以良好的精度检测Et。由此可知，通过实施本发明的前处理法，即便在使用Pyrochrome作为比色法用的Et测定试剂的情况下，也能够以高精度测定与ATIII共存的Et。
<实施例6>使用Pyrotell-T(比浊法用的Et测定试剂)的试验
向50Unit/mL的ATIII制剂0.1mL中加入0.4EU/mL的Et标准液0.1mL，使用试管混合器剧烈搅拌1分钟。之后，加入水0.1mL，使用试管混合器剧烈搅拌1分钟后，加入25mM的CaCl2水溶液0.1mL，进一步使用试管混合器剧烈搅拌1分钟，将0.2mL作为ATIII的4倍稀释液分注至其它容器中。向剩余的0.2mL中加入水0.2mL，使用试管混合器剧烈搅拌1分钟后，将0.2mL作为ATIII的8倍稀释液分注至其它容器中。重复该操作，也制备ATIII的16倍稀释液及32倍稀释液，分别分注至其它容器中。使用加热块将各溶液在70℃热处理10分钟后，立即冰冷。使各溶液恢复至室温后，将0.1mL分注至微孔板中。添加比浊法用的Et测定试剂(Pyrotell(注册商标)-T：Associates of Cape Cod,Inc.)0.1mL，使用酶标仪剧烈搅拌1分钟后，一边在37℃加热60分钟，一边测定在测定波长405nm和对照波长660nm下的吸光度的经时变化，计算出Et添加回收率。将结果示于表9。
【表9】
表9基于比浊法(Pyrotell-T)的Et检测结果
如表9所示，在使用Pyrotell-T代替Endospecy ES-50M作为Et测定试剂的情况下，与ATIII制剂的稀释倍率无关，Et添加回收率也几乎为100％，能够以良好的精度检测Et。由此可知，通过实施本发明的前处理法，即便在使用比浊法用的Et测定试剂作为鲎试剂的情况下，也能够以高精度测定与ATIII共存的Et。
<实施例7>使用Pyrotell Multi-Test(凝胶化法用的Et测定试剂)的试验
向50Unit/mL的ATIII制剂0.1mL中加入0.24EU/mL的Et标准液0.1mL，使用试管混合器剧烈搅拌1分钟。之后，加入水0.1mL，使用试管混合器剧烈搅拌1分钟后，加入25mM的CaCl2水溶液0.1mL，进一步使用试管混合器剧烈搅拌1分钟，将0.2mL作为ATIII的4倍稀释液分注至其它容器中。向剩余的0.2mL中加入水0.2mL，使用试管混合器剧烈搅拌1分钟后，将0.2mL作为ATIII的8倍稀释液分注至其它容器中。重复该操作，也制备ATIII的16倍稀释液及32倍稀释液，分别分注至其它容器中。使用加热块将各溶液在70℃热处理10分钟后，立即冰冷。使各溶液恢复至室温后，将0.1mL分注至圆底试管中。添加凝胶化法用的Et测定试剂(Pyrotell(注册商标)Multi-Test：Associates of CapeCod,Inc.)0.1mL，使用试管混合器剧烈搅拌1分钟后，使用加热块在37℃加热1小时。之后，将试管缓慢地倒置，确认是否形成了内容物不流出的坚固凝胶。将结果示于表10。
【表10】
表10基于凝胶化法(Pyrotell Multi-Test)的Et检测结果
如表10所示，在包含Pyrotell Multi-Test的检测界限0.03EU/mL以上的Et的ATIII溶液中，确认到内容物的凝胶化。由此可知，通过实施本发明的前处理法，即便在使用凝胶化法用的Et测定试剂作为鲎试剂的情况下，也能够以高精度测定与ATIII共存的Et。
<实施例8>使用平行线定量法的试验(1)
向50Unit/mL的ATIII制剂0.475mL中加入1EU/mL的Et标准液0.11mL，使用试管混合器剧烈搅拌1分钟。之后，加入水0.475mL，使用试管混合器剧烈搅拌1分钟后，加入500mM的MgSO4水溶液0.05mL，进一步使用试管混合器剧烈搅拌1分钟，使用加热块将溶液在70℃热处理10分钟后，立即冰冷。使溶液恢复至室温后，将0.5mL作为ATIII的2倍稀释液分注至其它容器中。向剩余的0.5mL中加入水0.5mL，使用试管混合器剧烈搅拌1分钟后，将0.5mL作为ATIII的4倍稀释液分注至其它容器中。重复该操作，也制备ATIII的8倍稀释液、16倍稀释液及32倍稀释液，分别分注至其它容器中。另外，代替ATIII制剂而使用内毒素试验用水，不实施本发明的前处理法而制备同样的稀释系列，准备出该稀释系列作为对照试样。将各溶液0.05mL分注至微孔板中。添加Endospecy ES-50M 0.05mL，使用酶标仪剧烈搅拌1分钟后，一边在37℃加热30分钟，一边测定在测定波长405nm及对照波长492nm下的吸光度的经时变化。将结果示于表11和图1。
【表11】
表11使用平行线定量法的试验的结果
①将内毒素试验用水作为待测物的测定结果
②将ATIII制剂作为待测物的测定结果
如图1所示，关于对于包含ATIII的试样的稀释倍率的测定值和对于对照试样(内毒素标准液的利用内毒素试验用水的2倍稀释系列液)的内毒素浓度的测定值，分别作出双对数图，通过平行线定量法进行了平行性检验。通过平行线定量法的专用软件(PL603：生化学工业株式会社)进行了统计学分析，结果两者的回归和平行性成立，适应试验。将通过平行线定量法计算出的Et浓度(0.275EU/mL)除以对照试样的Et浓度(0.232EU/mL)，由此算出的Et添加回收率为118.5％。
<实施例9>使用平行线定量法的试验(2)
向50Unit/mL的ATIII制剂0.8mL中加入1EU/mL的Et标准液0.1mL，使用试管混合器剧烈搅拌1分钟。之后，加入水0.02mL，使用试管混合器剧烈搅拌1分钟后，加入500mM的MgSO4水溶液0.08mL，进一步使用试管混合器剧烈搅拌1分钟，使用加热块将溶液在70℃热处理10分钟后，立即冰冷。使溶液的温度恢复至室温后，将0.5mL作为ATIII的1.25倍稀释液分注至其它容器中。向剩余的0.5mL中加入40mM的MgSO4水溶液0.5mL，使用试管混合器剧烈搅拌1分钟后，将0.5mL作为ATIII的2.5倍稀释液分注至其它容器中。重复该操作，也制备ATIII的5倍稀释液、10倍稀释液、20倍稀释液，分别分注至其它容器中。另外，代替ATIII制剂而使用内毒素试验用水，不实施本发明的前处理法而制备同样的稀释系列，准备出该稀释系列作为对照试样。将各溶液0.05mL分注至微孔板中。添加Endospecy ES-50M 0.05mL，使用酶标仪剧烈搅拌1分钟后，一边在37℃加热30分钟，一边测定在测定波长405nm及对照波长492nm下的吸光度的经时变化。将结果示于表12和图2。
【表12】
表12使用平行线定量法的试验的结果
①将内毒素试验用水作为待测物的测定结果
②将ATIII制剂作为待测物的测定结果
如图2所示，关于对于包含ATIII的试样的稀释倍率的测定值和对于对照试样(内毒素标准液的利用内毒素试验用水的2倍稀释系列液)的内毒素浓度的测定值，分别作出双对数图，通过平行线定量法进行了平行性检验。通过平行线定量法的专用软件(PL603：生化学工业株式会社)进行了统计学分析，结果两者的回归和平行性成立，适应试验。将通过平行线定量法计算出的Et浓度(0.122EU/mL)除以对照试样的Et浓度(0.125EU/mL)，由此算出的Et添加回收率为97.6％。
<实施例10>使用平行线定量法的试验(3)
向50Unit/mL的ATIII制剂472.5μL中加入20EU/mL的Et标准液2.5μL，使用试管混合器剧烈搅拌1分钟。接着，加入水6.25μL，使用试管混合器剧烈搅拌1分钟后，加入2M的MgSO4水溶液18.75μL，进一步使用试管混合器剧烈搅拌1分钟。之后，使用加热块将溶液在70℃热处理20分钟后，立即冰冷。使溶液的温度恢复至室温后，将250μL作为ATIII的1.06倍稀释液分注至其它容器中。向剩余的250μL中加入水250μL，使用试管混合器剧烈搅拌1分钟后，将250μL作为ATIII的2.12倍稀释液分注至其它容器中。重复该操作，也制备ATIII的4.23倍稀释液、8.47倍稀释液、16.93倍稀释液，分别分注至其它容器中。另外，代替ATIII制剂而使用内毒素试验用水，不实施本发明的前处理法而制备同样的稀释系列，准备出该稀释系列作为对照试样。将各溶液50μL分注至微孔板中。添加Endospecy ES-50M 50μL，使用酶标仪剧烈搅拌1分钟后，一边在37℃加热30分钟，一边测定在测定波长405nm和对照波长492nm下的吸光度的经时变化。将结果示于表13和图3中。
【表13】
表13使用平行线定量法的试验的结果
①将内毒素试验用水作为待测物的测定结果
②将ATIII制剂作为待测物的测定结果
如图3所示，关于对于包含ATIII的试样的稀释倍率的测定值和对于对照试样(内毒素标准液的利用内毒素试验用水的2倍稀释系列液)的内毒素浓度的测定值，分别作出双对数图，通过平行线定量法进行了平行性检验。通过平行线定量法的专用软件(PL603：生化学工业株式会社)进行了统计学分析，结果两者的回归和平行性成立，适应试验。将通过平行线定量法计算出的Et浓度(0.111EU/mL)除以对照试样的Et浓度(0.106EU/mL)，由此算出的Et添加回收率为104.7％。
由此，如<实施例8>～<实施例10>所示，可知：通过实施本发明的前处理法，即便在根据生物学的制剂基准中记载的平行线定量法进行试验的情况下，也能够以高精度测定与ATIII共存的Et。
产业上的可利用性
根据本发明，通过进行付之鲎试验的ATIII的前处理，可以减少将ATIII付之鲎试验时的反应干扰作用，因此可高精度地实施ATIII的鲎试验。另外，根据本发明，可期待能够简便、迅速、且廉价地实施ATIII的鲎试验。

Claims (12)

1.一种前处理剂，其为付之鲎试验的抗凝血酶III用的前处理剂，
该前处理剂含有二价金属盐，
该前处理剂用于在将抗凝血酶III付之鲎试验前，在与所述前处理剂共存的状态下，将该抗凝血酶III供至使蛋白质失活的处理中。
2.根据权利要求1所述的前处理剂，其中，所述二价金属盐为选自由二价金属氯化物、二价金属乙酸盐及二价金属硫酸盐组成的组中的一种或一种以上的金属盐。
3.根据权利要求1或2所述的前处理剂，其中，构成所述二价金属盐的二价金属为选自由镁、钙、锰及锌组成的组中的一种或一种以上的金属。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的前处理剂，其中，使抗凝血酶III与所述前处理剂共存时，来自所述二价金属盐的二价金属离子的浓度为0.5mM以上。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的前处理剂，其中，所述鲎试验的测定对象物质为内毒素。
6.一种抗凝血酶III用的鲎试剂盒，其包含权利要求1～5中任一项所述的前处理剂。
7.一种付之鲎试验的抗凝血酶III的前处理方法，其包括：在与权利要求1～5中任一项所述的前处理剂共存的状态下，将抗凝血酶III供至使蛋白质失活的处理中。
8.根据权利要求7所述的前处理方法，其中，使所述蛋白质失活的处理为热处理或酸处理。
9.根据权利要求8所述的前处理方法，其中，所述热处理在超过50℃的温度下进行。
10.根据权利要求8所述的前处理方法，其中，用于所述酸处理的酸为盐酸。
11.一种测定抗凝血酶III中的鲎试验的测定对象物质的方法，其包括：利用权利要求7～10中任一项所述的前处理方法对抗凝血酶III进行前处理；以及将经前处理的抗凝血酶III付之鲎试验。
12.一种制造抗凝血酶III的方法，其包括：利用权利要求11所述的方法测定抗凝血酶III中的鲎试验的测定对象物质。
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