JP6432083B2

JP6432083B2 - リムルス試験に付されるアンチトロンビンｉｉｉ用の前処理剤及び前処理方法

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Publication number: JP6432083B2
Application number: JP2014554617A
Authority: JP
Inventors: 真紀相沢; 俊男小田; 純明田川
Original assignee: Seikagaku Corp
Current assignee: Seikagaku Corp
Priority date: 2012-12-28
Filing date: 2013-12-27
Publication date: 2018-12-05
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Also published as: EP2940468B1; EP3470846B1; ES2816550T3; JPWO2014104352A1; US20190025309A1; ES2731595T3; CN109085357B; US20160061838A1; EP2940468A4; KR102115633B1; CN104884952A; EP3470846A1; US10132812B2; KR20150101454A; JP6674993B2; JP2019015740A; CN109085357A; WO2014104352A1; EP2940468A1

Description

本発明は、リムルス試薬を用いたエンドトキシン等の標的物質の検出試験に付されるアンチトロンビンIII用の前処理剤及び該処理剤を含むリムルス試薬キット、並びにこれらを用いたアンチトロンビンIIIの前処理方法及びリムルス試薬を用いたエンドトキシン等の標的物質の測定方法に関する。

本発明においては、以下の略号を使用する場合がある。
Ｅｔ：エンドトキシン
ＢＧ：（１→３）−β−Ｄ−グルカン
ＡＴIII：アンチトロンビンIII

エンドトキシンは、グラム陰性細菌の細胞壁外膜に存在するリポ多糖であり、強い発熱性物質として知られている。また、エンドトキシンは、発熱以外にも、ショック症状等の様々な病態を引き起こすことが知られている。そのため、注射剤等の医薬品、水、医療器具等におけるエンドトキシンの検出や定量は、医薬品等の安全性確保の観点から重要である。

カブトガニにグラム陰性細菌が感染すると、血液凝固を引き起こすことが知られており、この現象はエンドトキシンの検出に利用されてきた。すなわち、カブトガニ血球抽出液（カブトガニ・アメボサイト・ライセート；以下「ＬＡＬ」ともいう）を使用して、エンドトキシンを測定することができる。これは、リムルス試験と呼ばれ、エンドトキシンがＬＡＬに接触することによって起きるＬＡＬ中に存在する種々のタンパク質（いずれもセリンプロテアーゼ）のカスケード反応を利用するものである。

ＡＴIIIは、血液中の抗凝固因子であり、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）等の治療に用いられる。ここで、ＡＴIIIはセリンプロテアーゼインヒビターであるため、ＬＡＬ中に存在するカスケード反応に関与するタンパク質の活性を阻害する（非特許文献１）。このように、被検試料によっては、リムルス試薬に対する阻害作用を示す場合がある。このような阻害作用は、被検試料の希釈により回避できる場合がある（非特許文献２）。しかし、ＡＴIIIはリムルス試薬に対する阻害作用が極めて強く、ＡＴIII製剤（注射剤）をリムルス試験に付すには６４倍以上に希釈する必要があった（非特許文献２）。よって、リムルス試薬の検出感度（検量線の最小エンドトキシン濃度）を考慮すると、ＡＴIII製剤にリムルス試験を適用することは困難であると考えられてきた（非特許文献２）。現に、ＡＴIIIを含む試料については、現在でもウサギ発熱試験を用いてエンドトキシンの検出が行われている（非特許文献１）。

非特許文献１には、ＡＴIII製剤を１００倍希釈し、７０℃で２０分間加熱して前処理した後、ＬＡＬと反応させて、光散乱法で測定することを特徴とする、ＡＴIII製剤のＥｔを測定する方法が開示されている。この方法は、Ｅｔの検出を高感度化するために、分光光度計を用いた比濁法に代わって光散乱測定装置を用いた光散乱法を採用したことが技術的特徴である。しかし、この方法は、前記と同様に高倍率の希釈が必要不可欠であることに加え、少なくとも以下の問題があった。
（１）リムルス試験の測定装置として広く普及しているのは分光光度計であり、光散乱法を実施するには光散乱測定装置を別途新たに導入し、使用する必要があること。
（２）日本薬局方では、Ｅｔの光学的定量法として比濁法および比色法のみが規定されており、光散乱法は規定されていないこと。

また、特許文献１には、生体由来試料をアルカリ土類金属硫酸塩又はアルカリ土類金属ハロゲン化物と接触させ、加温して前処理した後、リムルス試薬を用いた測定に付すことを特徴とする、生体由来試料のＥｔ及びＢＧの測定方法が記載されている。

また、特許文献２には、生体由来試料をヘキサジメトリン化合物、アルカリ金属水酸化物、非イオン性界面活性剤及びアルカリ土類金属ハロゲン化物と混合し、加温して前処理した後、リムルス試薬を用いた測定に付すことを特徴とする、血液由来試料のＥｔ及びＢＧの測定方法が記載されている。

また、特許文献３には、生体由来試料をリポ多糖及び／又はリピッドＡ結合性ペプチドを固定化した担体と接触させてＥｔを吸着回収した後、リムルス試薬等を用いた測定に付すことを特徴とする、ＡＴIIIを含有する可能性のある試料のＥｔ測定方法が記載されている。

しかし、いずれの文献にも、ＡＴIIIのリムルス試験を実施するために、ＡＴIIIを二価金属塩と共存させた状態でタンパク質を失活させる処理に供して前処理することについては、記載も示唆もされていない。

国際公開２００６／０８０４４８号パンフレット特開平６−７０７９６特開２０１０−２４３３４２

エンドトキシン・自然免疫研究１５―飛躍する自然免疫研究―、医学図書出版、ｐ．２７〜３０、２０１２エンドトキシン研究１２―自然免疫学の新たな展開―、医学図書出版、ｐ．９３〜９７、２００９

本発明は、ＡＴIIIをリムルス試験に付す際の反応干渉作用を低減し、以て、ＡＴIIIのリムルス試験を高精度に実施する手段を提供することを課題とする。ここにいう「反応干渉作用」とは、リムルス試験の測定対象物質（ＥｔやＢＧ等）以外の要因によって引き起こされ、かつ、リムルス試験の結果に影響を与えるあらゆる作用を意味する。したがって、「反応干渉作用」には、例えば、ＡＴIIIそのもの、ＡＴIIIと共存している添加物又は不純物等の成分、前処理時に共存させる前処理剤以外の試薬等の成分、および／またはリムルス試薬中の成分等に起因する、これらの成分自体が不溶化する作用、リムルス試薬の反応を促進又は阻害する作用、Ｅｔのミセル構造やＢＧの高次構造を変化させてそれらの活性（リムルス試薬中のＣ因子やＧ因子に対する反応性）を変化させる作用等、リムルス試験の結果に影響を与えるあらゆる作用が含まれる。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、ＡＴIIIを二価金属塩と共存させた状態で、熱処理や酸処理等のタンパク質を失活させる処理に供することにより、ＡＴIIIをリムルス試験に付す際の反応干渉作用を低減でき、よって、ＡＴIIIのリムルス試験を高精度に実施できることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は以下の態様を包含する。
[１]
リムルス試験に付されるアンチトロンビンIII用の前処理剤であって、
二価金属塩を含有し、
アンチトロンビンIIIをリムルス試験に付す前に、該アンチトロンビンIIIを前記前処理剤と共存させた状態でタンパク質を失活させる処理に供するために用いられる、前処理剤。
[２]
前記二価金属塩が、二価金属塩化物、二価金属酢酸塩、及び二価金属硫酸塩からなる群より選択される１又はそれ以上の金属塩である、前記前処理剤。
[３]
前記二価金属塩を構成する二価金属が、マグネシウム、カルシウム、マンガン、及び亜鉛からなる群より選択される１又はそれ以上の金属である、前記前処理剤。
[４]
アンチトロンビンIIIを前記前処理剤と共存させた時の、前記二価金属塩に由来する二価金属イオンの濃度が、０．５ｍＭ以上である、前記前処理剤。
[５]
前記リムルス試験の測定対象物質が、エンドトキシンである、前記前処理剤。
[６]
前記前処理剤を含む、アンチトロンビンIII用のリムルス試薬キット。
[７]
アンチトロンビンIIIを前記前処理剤と共存させた状態でタンパク質を失活させる処理に供することを含む、リムルス試験に付されるアンチトロンビンIIIの前処理方法。
[８]
前記タンパク質を失活させる処理が、熱処理または酸処理である、前記前処理方法。
[９]
前記熱処理が、５０℃超の温度で行われる、前記前処理方法。
[１０]
前記酸処理に用いられる酸が、塩酸である、前記前処理方法。
[１１]
前記前処理方法によりアンチトロンビンIIIを前処理すること、および前処理されたアンチトロンビンIIIをリムルス試験に付すことを含む、アンチトロンビンIII中のリムルス試験の測定対象物質を測定する方法。
[１２]
前記方法によりアンチトロンビンIII中のリムルス試験の測定対象物質を測定すること
を含む、アンチトロンビンIIIを製造する方法。

図１は、平行線定量法を用いた試験の結果を示す図である。図２は、平行線定量法を用いた試験の結果を示す図である。図３は、平行線定量法を用いた試験の結果を示す図である。

（１）本発明の前処理剤
本発明の前処理剤は、二価金属塩を含有する、リムルス試験に付されるＡＴIII用の前処理剤である。本発明の前処理剤は、ＡＴIIIをリムルス試験に付す前に、該ＡＴIIIを本発明の前処理剤と共存させた状態でタンパク質を失活させる処理に供するために用いられる。

ここにいう「リムルス試験」とは、リムルス試薬を用いて標的物質を検出（測定）する試験をいう。同標的物質を、「リムルス試験の測定対象物質」ともいう。リムルス試験の測定対象物質は、リムルス試験により検出可能な物質であれば特に制限されないが、Ｅｔ又はＢＧであることが好ましく、Ｅｔであることがより好ましい。

ここにいう「ＡＴIII」とは、ＡＴIIIを含有する試料であれば特に制限されず、ＡＴIIIからなるものであってもよく、ＡＴIII以外の成分を含むものであってもよい。ＡＴIIIの形状も特に制限されず、例えば、液状であってもよく、凍結乾燥物、粉末、顆粒、錠剤等の固形状であってもよい。

ＡＴIIIとしては、例えば、ＡＴIIIの注射用製剤が挙げられる。このような注射用製剤として、具体的には、例えば、ノイアート（登録商標;株式会社ベネシス製）、アンスロンビン（財団法人化学及血清療法研究所製）、ノンスロン（登録商標；日本製薬株式会社製）が挙げられる。このようなＡＴIIIの注射用製剤を本発明の前処理およびリムルス試験に付す際には、原液そのままを被検体として用いてもよいし、濃縮された溶液を被検体として用いてもよいし、水や緩衝液等の水性溶媒で任意の倍率に希釈した溶液を被検体として用いてもよい。ここにいう「原液」とは、ＡＴIIIを注射用製剤として通常用いる際の濃度である５０Ｕｎｉｔ／ｍＬの濃度で含む溶液を意味する。「原液」は、例えば、各ＡＴIIIの注射用製剤の添付文書に記載された方法に従ってＡＴIIIを水性溶媒に溶解することによって得られる。ここにいう「濃縮された溶液」とは、ＡＴIIIを５０Ｕｎｉｔ／ｍＬ超の濃度で含む溶液を意味する。「濃縮された溶液」としては、例えば、各ＡＴIIIの注射用製剤の製造工程において得られる中間精製物が挙げられる。

また、原液を水性溶媒で希釈する場合の希釈倍率は、リムルス試験の測定対象物質を検出可能である限り特に制限されないが、例えば、１倍超６４倍未満であることが好ましく、１倍超１６倍以下であることがより好ましく、１倍超１０倍以下であることがさらに好ましく、１倍超４倍以下であることがよりさらに好ましく、１倍超２．５倍以下であることが特に好ましく、１．１倍以上２．５倍以下であることが極めて好ましく、１．２倍以上２．５倍以下であることが特に極めて好ましい。なお、ここにいう「希釈倍率」とは、本発明の前処理剤の共存下でタンパク質を失活させる処理を行っている反応液の、前記「原液」に対する希釈の倍率を意味する。よって、希釈倍率「１倍」とは、本発明の前処理剤の共存下でタンパク質を失活させる処理を行っている反応液におけるＡＴIII濃度が、前記「原液」のＡＴIII濃度と同じであること（原液のまま。原液が希釈されておらず、ＡＴIIIが５０Ｕｎｉｔ／ｍＬの濃度で存在していること。）を意味する。

また、ＡＴIIIは、組換えタンパク質であってもよい。組換えＡＴIIIは、宿主細胞に発現させることで取得できる。宿主細胞による発現は常法に従って行うことができる。例えば、山田ら（国際公開第2005/035563号）の方法に従って行うことができる。ＡＴIIIのアミノ酸配列やそれをコードする遺伝子の塩基配列は、公知のデータベースから取得できる。公知のデータベースとしては、例えば、ＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）が挙げられる。発現させる組換えタンパク質は、天然のＡＴIIIと同一のアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。また、発現させる組換えタンパク質は、ＡＴIIIとしての機能を維持している限り、天然のＡＴIIIのバリアントであってもよい。バリアントには、公知のＡＴIIIのホモログや人為的改変体も含まれる。

ここにいう「二価金属塩」は、本発明の属する技術分野において二価金属塩として認識される金属塩である限り特に制限されない。二価金属塩としては、例えば、二価金属フッ化物、二価金属塩化物、二価金属臭化物、二価金属ヨウ化物、二価金属水酸化物、二価金属シアン化物、二価金属硝酸塩、二価金属亜硝酸塩、二価金属次亜塩素酸塩、二価金属亜塩素酸塩、二価金属塩素酸塩、二価金属過塩素酸塩、二価金属過マンガン酸塩、二価金属酢酸塩、二価金属炭酸水素塩、二価金属リン酸二水素塩、二価金属硫酸水素塩、二価金属硫化水素塩、二価金属チオシアン酸塩、二価金属酸化物、二価金属硫化物、二価金属過酸化物、二価金属硫酸塩、二価金属亜硫酸塩、二価金属チオ硫酸塩、二価金属炭酸塩、二価金属クロム酸塩、二価金属二クロム酸塩、二価金属リン酸一水素塩、二価金属リン酸塩が挙げられる。二価金属塩としては、１種のみを用いてもよく、２種またはそれ以上を組み合わせて用いてもよい。二価金属塩は、例えば、二価金属塩化物、二価金属酢酸塩、及び二価金属硫酸塩からなる群より選択される１又はそれ以上の金属塩であることが好ましい。

二価金属塩は、ＡＴIIIを本発明の前処理剤と共存させた時に、二価の金属イオンを与えるものであってよい。「ＡＴIIIを本発明の前処理剤と共存させた時」とは、具体的には、後述するタンパク質を失活させる処理が行われている時をいう。二価金属塩は、例えば、水性溶媒に溶解し二価の金属イオンを与えるものであってよい。水性溶媒としては、水や緩衝液が挙げられる。

ここにいう「二価金属」は、本発明の属する技術分野において二価金属として認識される金属である限り特に制限されない。「二価金属」とは、イオン化した際に二価の金属イオンを与える金属を意味してよい。二価金属としては、例えば、ベリリウム、マグネシウム、カルシウム、ストロンチウム、バリウム、ラジウム、カドミウム、ニッケル、亜鉛、銅、水銀、鉄、コバルト、スズ、鉛、マンガンが挙げられる。二価金属としては、１種のみを用いてもよく、２種またはそれ以上を組み合わせて用いてもよい。二価金属は、例えば、マグネシウム、カルシウム、マンガン、及び亜鉛からなる群より選択される１又はそれ以上の金属であることが好ましい。

二価金属塩として、具体的には、例えば、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ₄）、例えば、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ₂）、酢酸マグネシウム（Ｍｇ（ＣＨ₃ＣＯＯ）₂）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ₂）、酢酸カルシウム（Ｃａ（ＣＨ₃ＣＯＯ）₂）、硫酸マンガン（ＭｎＳＯ₄）、硫酸亜鉛（ＺｎＳＯ₄）が挙げられる。本発明の前処理剤は、例えば、二価金属塩として硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ₄）のみを含有していてもよい。また、本発明の前処理剤は、例えば、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ₄）に加えて、さらに１又はそれ以上の他の二価金属塩を含有していてもよい。

また、本発明の前処理剤は、さらに他の成分を含有していてもよい。「他の成分」は、試薬・診断薬学的に許容される成分であれば特に制限されず、例えば、試薬や診断薬に配合して用いられる成分を用いることができる。ここにいう「他の成分」としては、例えば、アルカリ金属塩化物、アルカリ金属酢酸塩、アルカリ金属硫酸塩、界面活性剤、及び各種添加剤が挙げられる。各種添加剤としては、例えば、安定化剤、乳化剤、浸透圧調整剤、緩衝剤、等張化剤、保存剤、ｐＨ調整剤、着色剤、賦形剤、縮合剤、滑沢剤、崩壊剤が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

また、本発明の前処理剤の剤形は特に制限されない。本発明の前処理剤は、例えば、液剤として提供されてもよく、粉末剤、顆粒剤、又は錠剤等の用時溶解用の固形剤として提供されてもよい。また、本発明の前処理剤は、例えば、本発明の前処理剤をウェル内に保持するマイクロプレートとして提供されてもよい。そのようなマイクロプレートは、例えば、液状に調製した本発明の前処理剤をウェル内に分注し、乾燥させることにより得られる。また、本発明の前処理剤が液剤として提供される場合は、本発明の前処理剤は、凍結状態で提供されてもよいし、液体状態（融解状態）で提供されてもよい。

本発明の前処理剤において、二価金属塩は、塩の状態で存在していてもよく、イオン化した状態で存在していてもよく、その混合物として存在していてもよい。これらいずれの場合も、「本発明の前処理剤が二価金属塩を含有する」ことに該当する。

本発明の前処理剤は、二価金属塩を含有させること以外は、試薬や診断薬を製造するのに通常用いられるのと同様の手法によって製造することができる。

本発明の前処理剤における二価金属塩の濃度は特に制限されず、二価金属塩の種類や本発明の前処理剤の使用量等の諸条件に応じて適宜設定することができる。本発明の前処理剤における二価金属塩の濃度は、例えば、０．００１質量％以上、０．０１質量％以上、０．１質量％以上、１質量％以上、５質量％以上、１０質量％以上、３０質量％以上、または５０質量％以上であってよい。本発明の前処理剤における二価金属塩の濃度は、例えば、１００質量％以下、５０質量％以下、３０質量％以下、１０質量％以下、５質量％以下、または１質量％以下であってよい。

本発明の前処理剤の使用量は特に制限されず、二価金属塩の種類や濃度等の諸条件に応じて適宜設定することができる。本発明の前処理剤は、例えば、ＡＴIIIを本発明の前処理剤と共存させた時の二価金属塩に由来する二価金属イオンの濃度（以下、「処理時の二価金属イオン濃度」ともいう）が以下に例示するような濃度範囲となるように用いることができる。「ＡＴIIIを本発明の前処理剤と共存させた時の濃度」とは、具体的には、後述するタンパク質を失活させる処理が行われている反応系での濃度をいう。処理時の二価金属イオン濃度は、本発明の前処理の効果が得られる限り特に制限されないが、例えば、０．５ｍＭ以上であるのが好ましい。処理時の二価金属イオン濃度は、例えば、０．５ｍＭ〜１００ｍＭであることが好ましく、０．５ｍＭ〜５０ｍＭであることがより好ましく、０．５ｍＭ〜２５ｍＭであることがさらに好ましく、５ｍＭ〜２５ｍＭであることがよりさらに好ましく、５ｍＭ〜１２．５ｍＭであることが特に好ましい。なお、本発明の前処理剤に２種類以上の二価金属塩が含有されている場合には、ここにいう「処理時の二価金属イオン濃度」は、それら二価金属塩に由来する二価金属イオンの濃度の総和を意味する。

このような本発明の前処理剤を用いてＡＴIIIの前処理を行うことにより、ＡＴIIIをリムルス試験に付す際の反応干渉作用を低減することができ、よって、ＡＴIIIのリムルス試験を高精度に実施できる。

（２）本発明のキット
本発明のキットは、本発明の前処理剤を構成物品として含む、リムルス試薬キットである。本発明のキットは、他の構成物品を含んでいてもよい。ここにいう「他の構成物品」としては、例えば、リムルス試薬、リムルス反応の検出用基質、緩衝液、蒸留水、標準物質（ＥｔやＢＧ等）、及びマイクロプレートが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

本発明において用いるリムルス試薬は、リムルス試験の測定対象物質に対応したカスケード反応に関与するタンパク質を含有している限り、特に限定されない。リムルス試薬としては、例えば、カブトガニ血球抽出液（ＬＡＬ（ライセート試薬））が挙げられる。ＬＡＬは、カブトガニの血液を原料として常法により取得することができる。ＬＡＬは、適宜分画および／または精製等してから利用してもよい。カブトガニは、いずれの種類のカブトガニであってもよい。カブトガニとしては、日本産カブトガニであるタキプレウス・トリデンタツス（Tachypleus tridentatus）、アメリカ産カブトガニであるリムルス・ポリフェムス（Limulus polyphemus）、ならびに東南アジア産カブトガニであるカルシノスコルピウス・ロツンディカウダ（Carcinoscorpius rotundicauda）およびタキプレウス・ギガス（Tachypleus gigas）が挙げられる。例えば、リムルス・ポリフェムス由来ライセートを用いたリムルス試薬としては、エンドスペシー（登録商標）ＥＳ−５０Ｍ（生化学工業株式会社）、パイロクロム（アソシエーツオブケープコッドインク）、パイロテル（登録商標）−Ｔ（アソシエーツオブケープコッドインク）、パイロテル（登録商標）マルチテスト（アソシエーツオブケープコッドインク）、カイネティック−ＱＣＬ（ロンザウォーカーズヴィルインク）、エンドクロム−Ｋ（チャールズリバーラボラトリーズインク）が挙げられる。

また、リムルス試薬としては、人為的に再構成されたものも例示できる。再構成されたリムルス試薬は、リムルス試験の測定対象物質に対応したカスケード反応に関与するタンパク質を含むように構成されていれば特に制限されない。カスケード反応に関与するタンパク質を総称して「因子」ともいう。ここにいう「カスケード反応」とは、リムルス試験の測定対象物質の存在により進行する一連の反応のことをいう。例えば、Ｅｔ等のＣ因子を活性化する物質が存在する場合、同物質によりＣ因子が活性化されて活性型Ｃ因子となり、活性型Ｃ因子によりＢ因子が活性化されて活性型Ｂ因子となり、活性型Ｂ因子によりプロクロッティングエンザイムが活性化されてクロッティングエンザイムとなる一連の反応が進行する。すなわち、Ｅｔ等のＣ因子を活性化する物質が測定対象物質である場合は、再構成されたリムルス試薬は、カスケード系を構成する因子として、例えば、Ｃ因子、Ｂ因子、およびプロクロッティングエンザイムを含んでいればよい。また、例えば、ＢＧ等のＧ因子を活性化する物質が存在する場合、同物質によりＧ因子が活性化されて活性型Ｇ因子となり、活性型Ｇ因子によりプロクロッティングエンザイムが活性化されてクロッティングエンザイムとなる一連の反応が進行する。すなわち、ＢＧ等のＧ因子を活性化する物質が測定対象物質である場合は、再構成されたリムルス試薬は、カスケード系を構成する因子として、例えば、Ｇ因子およびプロクロッティングエンザイムを含んでいればよい。カスケード反応の進行は、例えば、後述するリムルス反応の検出用基質を用いてクロッティングエンザイムの存在を検出することにより検出できる。

また、後述するリムルス反応の検出用基質として、カスケード反応の途中段階を検出できるものを利用する場合は、再構成されたリムルス試薬は、当該途中段階までに関与する因子を含んでいればよい。具体的には、例えば、Ｅｔ等のＣ因子を活性化する物質が測定対象物質であり、且つ、活性化Ｃ因子の存在を検出できるリムルス反応の検出用基質を利用する場合は、再構成されたリムルス試薬は、Ｃ因子を含んでいればよい。

再構成されたリムルス試薬に含まれる各因子は、天然に得られるものであってもよく、組換えタンパク質であってもよい。

天然の各因子は、上記各種カブトガニの血球抽出液（ＬＡＬ）から取得することができる。これらの因子は、所望の程度に精製して用いることができる。精製は、例えば、公知の手法（Nakamura T. et al., J Biochem. 1986 Mar; 99(3): 847-57.）により行うことができる。

また、各因子は、宿主細胞に発現させることで取得できる。宿主細胞による発現は常法に従って行うことができる。例えば、水村ら（国際公開第2012/118226号）の方法に従って行うことができる。各因子のアミノ酸配列やそれをコードする遺伝子の塩基配列は、公知のデータベースから取得できる。公知のデータベースとしては、例えば、ＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）が挙げられる。発現された各組換えタンパク質は、必要に応じ、所望の程度に精製して用いることができる。

各因子を適宜組み合わせることで再構成されたリムルス試薬が得られる。例えば、再構成されたリムルス試薬に含まれる因子は、全て天然の因子であってもよく、全て組換えタンパク質であってもよく、それらの任意の組み合わせであってもよい。また、再構成されたリムルス試薬は、例えば、ＬＡＬ自体に、あるいはＬＡＬを適宜分画および／または精製等したものに、各因子を適宜組み合わせることで得られたものであってもよい。

リムルス反応の検出用基質（以下、単に「検出用基質」ともいう）とは、カスケード反応の進行を検出するための基質をいう。

検出用基質としては、コアギュローゲンが挙げられる。コアギュローゲンは、カスケード反応の最終産物であるクロッティングエンザイムの検出基質である。コアギュローゲンとクロッティングエンザイムが接触することで、コアギュリンとして凝固する。凝固反応の進行は、反応液の濁度を測定することやゲルの形成を観測することで測定することができる。コアギュローゲンはカブトガニ血球抽出液（ＬＡＬ）から回収することができる。また、コアギュローゲンをコードする遺伝子の塩基配列は明らかになっており（宮田ら、蛋白質核酸酵素別冊 No.29; P30-43; 1986）、常法に従い遺伝子工学的にコアギュローゲンを生産することもできる。

また、検出用基質としては、合成基質を用いてもよい。合成基質は、カスケード反応の進行を検出するのに好適な性質を有する限り特に制限されない。「カスケード反応の進行を検出するのに好適な性質」とは、例えば、クロッティングエンザイムの存在を検出するための性質であってもよく、カスケード反応の途中段階を検出するための性質であってもよい。「クロッティングエンザイムの存在を検出するための性質」としては、クロッティングエンザイムの酵素反応により発色する性質や、クロッティングエンザイムの酵素反応により蛍光を発する性質が挙げられる。「カスケード反応の途中段階を検出するための性質」としては、活性化Ｃ因子等の酵素反応により発色する性質や、活性化Ｃ因子等の酵素反応により蛍光を発する性質が挙げられる。合成基質としては、例えば、一般式Ｘ−Ｙ−Ｚ（式中、Ｘは保護基、Ｙはペプチド、ＺはＹとアミド結合した色素である）で表される基質が挙げられる。例えば、Ｃ因子、Ｂ因子、およびプロクロッティングエンザイムを含有する反応系にＥｔ等のＣ因子を活性化する物質が存在する場合には、カスケード反応の結果として生ずるクロッティングエンザイムの酵素反応によりＹ−Ｚ間のアミド結合が切断され、色素Ｚが遊離して発色する、あるいは蛍光を発する。Ｇ因子およびプロクロッティングエンザイムを含有する反応系を利用する場合や、カスケード反応の途中段階を検出する場合も、それぞれ、クロッティングエンザイムや、カスケード反応の途中段階で生ずるタンパク質により、色素Ｚが遊離すればよい。保護基Ｘとしては、特に制限されず、ペプチドの公知の保護基を好適に用いることができる。そのような保護基としては、ｔ−ブトキシカルボニル基、ベンゾイル基が挙げられる。色素Ｚは、特に制限されず、例えば、可視光下で検出される色素であってもよく、蛍光色素であってもよい。色素Ｚとしては、ｐＮＡ（パラニトロアニリン）、ＭＣＡ（７−メトキシクマリン−４−酢酸）、ＤＮＰ（２，４−ジニトロアニリン）、Ｄａｎｓｙｌ（ダンシル）系色素が挙げられる。ペプチドＹとしては、Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（ＬＧＲ）、Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（ＩＥＧＲ）（配列番号１）、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（ＶＰＲ）、Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（ＤＰＲ）が挙げられる。これらの合成基質は、いずれも、クロッティングエンザイムの存在を検出するために用いてもよく、カスケード反応の途中段階を検出するために用いてもよい。また、これらの合成基質は、検出対象に応じて好適なものを選択して用いてもよい。例えば、基質特異性の点からは、ペプチドＹとしてＬＧＲを含む基質はクロッティングエンザイムの検出に好適に用いることができ、ペプチドＹとしてＶＰＲまたはＤＰＲを含む基質は活性化Ｃ因子の検出に好適に用いることができる。遊離した色素Ｚは、色素の性質に応じた手法により測定すればよい。

なお、リムルス試薬としてカブトガニ血球抽出液（ＬＡＬ）を用いる場合、ＬＡＬにもともと含有されるコアギュローゲンを検出用基質として利用することができる。また、適宜選択した検出用基質をＬＡＬと組み合わせて用いてもよい。

リムルス試薬として再構成されたリムルス試薬を用いる場合、適宜選択した検出用基質を再構成されたリムルス試薬と組み合わせて用いることができる。

各因子や検出用基質は、混合物として本発明のキットに含まれていてもよく、それぞれ別個に、または、任意の組み合わせで別個に、本発明のキットに含まれていてもよい。

このような本発明のキットを用いてＡＴIIIの前処理を行うことにより、ＡＴIIIをリムルス試験に付す際の反応干渉作用を低減することができ、ＡＴIIIのリムルス試験を高精度に実施できる。

（３）本発明の前処理方法
本発明の前処理方法は、ＡＴIIIを本発明の前処理剤と共存させた状態でタンパク質を失活させる処理に供することを含む、リムルス試験に付されるＡＴIIIの前処理方法である。

ここにいう「タンパク質を失活させる処理」とは、ＡＴIIIを失活させる処理であればよく、具体的には、リムルス試験を阻害しない程度にＡＴIIIを失活させる処理であればよい。タンパク質を失活させる処理としては、例えば、熱処理、酸処理、アルカリ処理が挙げられるが、これらに限定されない。タンパク質を失活させる処理としては、いずれかの処理を単独で行ってもよく、２またはそれ以上の処理を組み合わせて行ってもよい。

タンパク質を失活させる処理は、例えば、水や緩衝液等の水性溶媒中で行うことができる。すなわち、タンパク質を失活させる処理は、例えば、ＡＴIIIと本発明の前処理剤を水性溶媒中で共存させた状態で行うことができる。

ここにいう「熱処理」とは、本発明の前処理剤と共存させたＡＴIIIを加熱する処理をいう。加熱の方法は特に限定されないが、ヒートブロック、ウォーターバス、エアーバス、マイクロウェーブオーブン等の機器を使用する方法が好ましい。また、熱処理の温度は、タンパク質が失活する限り特に制限されないが、例えば、通常５０℃超である。熱処理の温度は、例えば、５５℃〜１００℃であることが好ましく、５５℃〜９５℃であることがより好ましく、６０℃〜９０℃であることがさらに好ましく、６５℃〜８５℃であることがよりさらに好ましく、６５℃〜７５℃であることが特に好ましい。また、熱処理の時間は、タンパク質が失活する限り特に制限されないが、例えば、１分間以上であるのが好ましい。熱処理の時間は、例えば、１分間〜２時間であることが好ましく、１分間〜１時間であることがより好ましく、５分間〜３０分間であることがさらに好ましく、５分間〜２０分間であることがよりさらに好ましく、５分間〜１５分間であることが特に好ましい。

また、ここにいう「酸処理」は、本発明の前処理剤と共存させたＡＴIIIと酸を接触させる処理をいう。酸処理に用いられる酸としては、例えば、塩酸、硫酸、硝酸が挙げられるが、これらに限定されない。これらの中では、塩酸が好ましい。酸の添加量は、酸の種類等の諸条件に応じて適宜設定することができる。酸の添加量は、例えば、酸処理時の反応系における酸濃度が０．００１Ｎ〜１Ｎ、好ましくは０．０１Ｎ〜０．５Ｎ、より好ましくは０．０１Ｎ〜０．１Ｎとなるような量であってよい。酸処理の時間は、タンパク質が失活する限り特に制限されないが、例えば、酸処理に通常用いられる時間であってよい。酸処理の時間は、例えば、０．１秒〜２時間であってもよい。

また、ここにいう「アルカリ処理」は、本発明の前処理剤と共存させたＡＴIIIとアルカリを接触させる処理をいう。アルカリ処理に用いられるアルカリとしては、例えば、水酸化ナトリウムや水酸化カリウムが挙げられるが、これらに限定されない。これらの中では、水酸化ナトリウムが好ましい。アルカリの添加量は、アルカリの種類等の諸条件に応じて適宜設定することができる。アルカリの添加量は、例えば、アルカリ処理時の反応系におけるアルカリ濃度が０．００１Ｎ〜１Ｎ、好ましくは０．０１Ｎ〜０．５Ｎ、より好ましくは０．０１Ｎ〜０．１Ｎとなるような量であってよい。アルカリ処理の時間は、タンパク質が失活する限り特に制限されないが、例えば、アルカリ処理に通常用いられる時間であってよい。アルカリ処理の時間は、例えば、０．１秒〜２時間であってもよい。

本発明の前処理方法は、タンパク質を失活させる処理以外の工程を含んでいてもよい。

例えば、タンパク質を失活させる処理を行う前に、適宜、ＡＴIIIに処理を行ってもよい。例えば、ＡＴIIIの乾燥粉末を微粉化する等、ＡＴIIIを加工する処理を行うことができる。また、例えば、ＡＴIIIを希釈または濃縮等してもよい。これらの処理は、本発明の前処理剤と共存させる前に行ってもよく、本発明の前処理剤と共存させた後且つタンパク質を失活させる処理を行う前に行ってもよい。

また、例えば、タンパク質を失活させる処理を行った後には、適宜、後処理を行ってもよい。後処理は、例えば、前処理されたＡＴIIIをリムルス試験に付す際に、リムルス試験が阻害されないようにする処理であってよい。例えば、タンパク質を失活させる処理として熱処理を行った場合は、処理物の温度を下げることができる。また、例えば、タンパク質を失活させる処理として酸処理を行った場合は、アルカリにより処理物を中和することができる。また、例えば、タンパク質を失活させる処理としてアルカリ処理を行った場合は、酸により処理物を中和することができる。また、例えば、処理物を希釈または濃縮等してもよい。

このような本発明前処理方法を用いてＡＴIIIの前処理を行うことにより、ＡＴIIIをリムルス試験に付す際の反応干渉作用を低減することができ、よって、ＡＴIIIのリムルス試験を高精度に実施できる。

（４）本発明の測定方法
本発明の測定方法は、本発明の前処理方法によりＡＴIIIを前処理すること、および前処理されたＡＴIIIをリムルス試験に付すことを含む、ＡＴIII中のリムルス試験の測定対象物質を測定する方法である。

リムルス試験は、例えば、公知の手法により行うことができる。公知の手法としては、例えば、比色法、比濁法、ゲル化法が挙げられる。

リムルス試験は、具体的には、ＡＴIIIとリムルス試薬を接触させることにより行うことができる。ＡＴIII中にリムルス試験の測定対象物質が存在する場合には、カスケード反応が進行する。よって、カスケード反応の進行を測定することにより、ＡＴIII中のリムルス試験の測定対象物質を測定することができる。リムルス試験の際には、各因子は、ＡＴIIIとリムルス試薬を接触させる工程の当初から反応系に含まれていてもよく、逐次反応系に添加されてもよい。

カスケード反応の進行は、検出用基質を用いて測定できる。すなわち、カスケード反応の進行は、検出用基質の種類に応じて、当該基質の反応（発色や凝固等）を測定することで測定できる。検出用基質は、任意のタイミングで反応系に添加してよい。例えば、検出用基質は、ＡＴIIIとリムルス試薬を接触させる工程の当初から反応系に含まれていてもよく、当該工程の進行中または完了後に反応系に添加されてもよい。また、検出用基質を予め含有しているリムルス試薬を用いる場合は、検出用基質を反応系に別途添加しなくてもよい。

本発明の測定方法は、ＡＴIII中にリムルス試験の測定対象物質が存在する場合にカスケード反応が進行する限り、その他の任意の工程を含んでいてよい。例えば、本発明の測定方法は、上述の通り、反応系に検出用基質を添加する工程を含んでいてもよい。また、例えば、本発明の測定方法は、測定により得られたデータを他のデータに変換する工程を含んでいてもよい。測定により得られたデータを他のデータに変換する工程としては、例えば、測定により得られたデータに基づき、ＡＴIII中のリムルス試験の測定対象物質の量を算出する工程が挙げられる。

本発明の測定方法において、反応は水あるいは緩衝液等の水性溶媒中で行われるのが好ましい。

本発明の測定法によれば、ＡＴIIIをリムルス試験に付す際の反応干渉作用を低減することができ、よって、ＡＴIIIのリムルス試験を高精度に実施できる。

また、このようにして、リムルス試験の測定対象物質による汚染がないことが確認されたＡＴIIIが得られる。すなわち、本発明は、本発明の測定方法によりＡＴIII中のリムルス試験の測定対象物質を測定することを含む、ＡＴIIIを製造する方法を提供する。このように製造されたＡＴIIIは、注射剤等の任意の形態で提供できる。

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を何ら限定するものではない。なお、実施例に記載したすべての試験において、水、試薬、プラスチック製品、及びガラス製品等は、エンドトキシンが検出されないこと及びリムルス試薬の反応に対する反応干渉因子を含まないことが保証されたものを使用した。

＜Ｅｔ添加回収率の定義＞
比色法または比濁法で実施した試験においては、以下の手順でＥｔ添加回収率を算出した。すなわち、ＡＴIIIに既知量のエンドトキシンを添加した被検体のリムルス試験と同時に、ＡＴIIIの代わりに等量の水を被検体としたリムルス試験を陽性対照として実施した。ＡＴIIIを含む被検体の吸光度変化率（ｍＡｂｓ／ｍｉｎ）の値を陽性対照の吸光度変化率の値で除した値を百分率換算し、Ｅｔ添加回収率とした。なお、ＡＴIIIまたは水にエンドトキシン汚染がある場合には、汚染に相当する値を測定値から差し引いた後にＥｔ添加回収率を算出すればよい。すなわち、Ｅｔ添加回収率とは、ＡＴIIIによる反応干渉作用がない場合に検出されるべきＥｔ量に対する、ＡＴIIIを含む被検体において実際に検出されたＥｔ量の比率（％）、を意味し得る。

＜参考例１＞希釈加熱法によるＡＴIIIのＥｔ添加回収試験
原液、又は水で４倍、１６倍、６４倍、若しくは２５６倍に希釈した５０Ｕｎｉｔ／ｍＬのＡＴIII製剤（ノイアート（登録商標）；株式会社ベネシス；以下、同じ）０．４ｍＬに、０．５ＥＵ／ｍＬに調製したＥｔ（ＪＰＲＳＥ：日本薬局方エンドトキシン標準品；以下、同じ）の標準液０．０４ｍＬを加え、試験管ミキサーを用いて１分間激しく撹拌した。その後、０．２ｍＬを別容器に分注し、ヒートブロックを用いて７０℃で１０分間加熱した。その後、０．０５ｍＬをマイクロプレートに分注し、比色法用のＥｔ測定試薬（エンドスペシー（登録商標）ＥＳ−５０Ｍ；生化学工業株式会社；以下、同じ）０．０５ｍＬを加えた。次いで、恒温槽機能および撹拌機能を有するウェルリーダー（ウェルリーダーＭＰ−９６；生化学工業株式会社；以下、同じ）を用いて１分間激しく撹拌した後、３７℃で３０分間加温しながら測定波長４０５ｎｍ及び対照波長４９２ｎｍにおける吸光度の経時変化を測定し、Ｅｔ添加回収率を算出した。結果を表１に示す。

表１に示すように、希釈倍率が１６倍以下の場合には、Ｅｔ添加回収率が１０％未満となり、Ｅｔを精度よく検出することができなかった。一方、希釈倍率が６４倍以上の場合には、ほぼ１００％のＥｔ添加回収率が得られた。この結果は、希釈加熱法に関する公知の結果（非特許文献１）とも概ね一致するものであった。

＜実施例１＞硫酸マグネシウムまたは塩化カルシウムを共存させて熱処理した場合のＥｔ添加回収試験
２５Ｕｎｉｔ／ｍＬのＡＴIII製剤（水で２倍に希釈したＡＴIII製剤）０．９ｍＬに０．５ＥＵ／ｍＬのＥｔ標準液０．１ｍＬを加え、試験管ミキサーを用いて１分間激しく撹拌した。その後、０．１８ｍＬを別容器に分注し、１５．６ｍＭ、１２５ｍＭ、２５０ｍＭ、５００ｍＭ、若しくは１０００ｍＭのＭｇＳＯ₄水溶液、又は、１５．６ｍＭ、５６ｍＭ、１２５ｍＭ、２５０ｍＭ、若しくは５００ｍＭのＣaＣｌ₂水溶液を０．０２ｍＬ加え、試験管ミキサーを用いて１分間激しく撹拌した。各溶液をヒートブロックを用いて７０℃で１０分間加熱した後、ただちに氷冷した。各溶液を室温まで戻した後、０．０５ｍＬをマイクロプレートに分注した。エンドスペシーＥＳ−５０Ｍを０．０５ｍＬ添加し、ウェルリーダーを用いて１分間激しく撹拌した後、３７℃で３０分間加温しながら測定波長４０５ｎｍ及び対照波長４９２ｎｍにおける吸光度の経時変化を測定し、Ｅｔ添加回収率を算出した。結果を表２、３に示す。表中、「ＭｇＳＯ₄濃度」および「ＣaＣｌ₂濃度」は、熱処理時の反応液中での濃度を示す。また、本実施例におけるＡＴIII製剤の希釈倍率は、約２．５倍である。

表２、３に示すように、ＡＴIIIおよびＥｔと硫酸マグネシウムまたは塩化カルシウムを共存させて熱処理することにより、希釈加熱法のように６４倍以上に希釈せずとも、精度よくＥｔを検出できた。特に、硫酸マグネシウムの濃度が１２．５ｍＭ以上の場合に、精度よくＥｔを検出できた。

＜実施例２＞二価金属塩の種類の検討
５０Ｕｎｉｔ／ｍＬのＡＴIII製剤０．２ｍＬに０．５ＥＵ／ｍＬのＥｔ標準液０．２２ｍＬを加え、試験管ミキサーを用いて１分間激しく撹拌した後、水を１．８ｍＬ加え、さらに試験管ミキサーを用いて１分間激しく撹拌した。その後、０．１ｍＬを別容器に分注し、５０ｍＭまたは５ｍＭに調製した各種二価金属塩の水溶液を１／１０量（０．０１１ｍＬ）加え、試験管ミキサーを用いて１分間激しく撹拌した。各溶液をヒートブロックを用いて７０℃で１０分間加熱した後、ただちに氷冷した。各溶液を室温まで戻した後、０．０５ｍＬをマイクロプレートに分注した。エンドスペシーＥＳ−５０Ｍを０．０５ｍＬ添加し、ウェルリーダーを用いて１分間激しく撹拌した後、３７℃で３０分間加温しながら測定波長４０５ｎｍ及び対照波長４９２ｎｍにおける吸光度の経時変化を測定し、Ｅｔ添加回収率を算出した。結果を表４に示す。表中、二価金属塩濃度は、熱処理時の反応液中での濃度を示す。また、本実施例におけるＡＴIII製剤の希釈倍率は、約１２倍である。

表４に示すように、Ｍｇ（ＣＨ₃ＣＯＯ）₂、ＭｇＣｌ₂、Ｃａ（ＣＨ₃ＣＯＯ）₂、ＭｎＳＯ₄、又はＺｎＳＯ₄をＡＴIIIと共存させて熱処理した場合にも、Ｅｔを検出できた。

＜実施例３＞熱処理の温度と時間の検討
５０Ｕｎｉｔ／ｍＬのＡＴIII製剤０．９ｍＬに０．５ＥＵ／ｍＬのＥｔ標準液０．１ｍＬを加え、試験管ミキサーを用いて１分間激しく撹拌し、０．１８ｍＬを別容器に分注した。その後、２００ｍＭのＣａＣｌ₂水溶液を０．０２ｍＬ加え、試験管ミキサーを用いて１分間激しく撹拌した。各溶液を、氷上に静置、又はヒートブロックを用いて３７℃、５０℃、６０℃、７０℃、８０℃若しくは９０℃で５分間、１０分間又は２０分間熱処理した後にただちに氷冷した。各溶液を室温まで戻した後、０．０５ｍＬをマイクロプレートに分注した。エンドスペシーＥＳ−５０Ｍを０．０５ｍＬ添加し、ウェルリーダーを用いて１分間激しく撹拌した後、３７℃で３０分間加温しながら測定波長４０５ｎｍ及び対照波長４９２ｎｍにおける吸光度の経時変化を測定し、Ｅｔ添加回収率を算出した。結果を表５に示す。熱処理時の反応液中でのＣａＣｌ₂濃度は２０ｍＭである。また、本実施例におけるＡＴIII製剤の希釈倍率は、約１．２倍である。

表５に示すように、熱処理の温度が６０℃以上の場合に、Ｅｔの検出が可能であった。また、熱処理の時間が５分間以上の場合に、Ｅｔの検出が可能であった。また、各温度（６０℃、７０℃、８０℃、又は９０℃）で１０分間加熱した結果から、熱処理の温度はＥｔ添加回収率が最も高かった７０℃が好適であると考えられる。

＜参考例２＞熱処理後に二価金属塩を加える効果の検討
水で４倍若しくは１６倍に希釈した５０Ｕｎｉｔ／ｍＬのＡＴIII製剤又は水０．９ｍＬに０．５ＥＵ／ｍＬのＥｔ標準液０．１ｍＬを加え、試験管ミキサーを用いて１分間激しく撹拌した。その後、０．１８ｍＬを別容器に分注し、氷上に静置、又はヒートブロックを用いて７０℃で１０分間熱処理した後にただちに氷冷した。各溶液を室温まで戻した後、水、又は７ｍＭ、２８ｍＭ、若しくは１１２ｍＭのＣａＣｌ₂水溶液を０．０２ｍＬ加え、試験管ミキサーを用いて１分間激しく撹拌した後、０．０５ｍＬをマイクロプレートに分注した。エンドスペシーＥＳ−５０Ｍを０．０５ｍＬ添加し、ウェルリーダーを用いて１分間激しく撹拌した後、３７℃で３０分間加温しながら測定波長４０５ｎｍ及び対照波長４９２ｎｍにおける吸光度の経時変化を測定し、Ｅｔ添加回収率を算出した。結果を表６に示す。

表６に示すように、熱処理後に二価金属塩を加える方法ではＥｔ添加回収率が１０％未満となり、Ｅｔを精度よく検出することができなかった。よって、二価金属塩は熱処理の前にＡＴIIIおよびＥｔと共存させておく必要があることが明らかとなった。

＜実施例４＞酸処理の検討
５０Ｕｎｉｔ／ｍＬのＡＴIII製剤０．２ｍＬに０．５ＥＵ／ｍＬのＥｔ標準液０．２２ｍＬを加え、試験管ミキサーを用いて１分間激しく撹拌した。その後、水を１．８ｍＬ加え、さらに試験管ミキサーを用いて１分間激しく撹拌した。その後、０．１ｍＬを別容器に分注し、５０ｍＭもしくは５ｍＭに調製した各種二価金属塩の水溶液を１／１０量（０．０１１ｍＬ）加え、試験管ミキサーを用いて１分間激しく撹拌した。その後、５Ｎ、２Ｎ、１Ｎ、０．５Ｎ、又は０．１Ｎの塩酸を０．０１１ｍＬ加え、さらに試験管ミキサーを用いて１分間激しく撹拌した。その後、０．０５ｍＬをマイクロプレートに分注し、エンドスペシーＥＳ−５０Ｍを０．０５ｍＬ添加し、ウェルリーダーを用いて１分間激しく撹拌した後、３７℃で３０分間加温しながら測定波長４０５ｎｍ及び対照波長４９２ｎｍにおける吸光度の経時変化を測定し、Ｅｔ添加回収率を算出した。結果を表７に示す。表中、二価金属塩濃度および塩酸濃度は、酸処理時の反応液中での濃度（概算）を示す。また、本実施例におけるＡＴIII製剤の希釈倍率は、約１４倍である。

表７に示すように、二価金属を共存させた状態で酸処理することにより、熱処理した場合と同様に、Ｅｔを検出できた。特に、塩酸濃度が０．０１Ｎ〜０．１Ｎの場合に、Ｅｔを効率的に検出できた。

＜実施例５＞パイロクロム（比色法用のＥｔ測定試薬）を用いた試験
５０Ｕｎｉｔ／ｍＬのＡＴIII製剤０．１ｍＬに０．４ＥＵ／ｍＬのＥｔ標準液０．１ｍＬを加え、試験管ミキサーを用いて１分間激しく撹拌した。その後、水０．１ｍＬを加え、試験管ミキサーを用いて１分間激しく撹拌した後、２５ｍＭのＣａＣｌ₂水溶液０．１ｍＬを加え、さらに試験管ミキサーを用いて１分間激しく撹拌し、０．２ｍＬをＡＴIIIの４倍希釈液として別容器に分注した。残りの０．２ｍＬに水０．２ｍＬを加え、試験管ミキサーを用いて１分間激しく撹拌した後、０．２ｍＬをＡＴIIIの８倍希釈液として別容器に分注した。この操作を繰り返し、ＡＴIIIの１６倍希釈液及び３２倍希釈液も調製し、それぞれを別容器に分注した。各溶液をヒートブロックを用いて７０℃で１０分間熱処理した後にただちに氷冷した。各溶液を室温まで戻した後、０．０５ｍＬをマイクロプレートに分注した。比色法用のＥｔ測定試薬（パイロクロム；アソシエーツオブケープコッドインク）０．０５ｍＬを添加し、ウェルリーダーを用いて１分間激しく撹拌した後、３７℃で６０分間加温しながら測定波長４０５ｎｍ及び対照波長４９２ｎｍにおける吸光度の経時変化を測定し、Ｅｔ添加回収率を算出した。結果を表８に示す。

表８に示すように、比色法用のＥｔ測定試薬としてエンドスペシーＥＳ−５０Ｍに代えてパイロクロムを用いた場合においても、ＡＴIII製剤の希釈倍率によらずＥｔ添加回収率はほぼ１００％であり、Ｅｔを精度よく検出できた。よって、本発明の前処理法を実施することにより、比色法用のＥｔ測定試薬としてパイロクロムを用いた場合においても、ＡＴIIIと共存するＥｔの高精度な測定が可能であることが明らかとなった。

＜実施例６＞パイロテル−Ｔ（比濁法用のＥｔ測定試薬）を用いた試験
５０Ｕｎｉｔ／ｍＬのＡＴIII製剤０．１ｍＬに０．４ＥＵ／ｍＬのＥｔ標準液０．１ｍＬを加え、試験管ミキサーを用いて１分間激しく撹拌した。その後、水０．１ｍＬを加え、試験管ミキサーを用いて１分間激しく撹拌した後、２５ｍＭのＣａＣｌ₂水溶液０．１ｍＬを加え、さらに試験管ミキサーを用いて１分間激しく撹拌し、０．２ｍＬをＡＴIIIの４倍希釈液として別容器に分注した。残りの０．２ｍＬに水０．２ｍＬを加え、試験管ミキサーを用いて１分間激しく撹拌した後、０．２ｍＬをＡＴIIIの８倍希釈液として別容器に分注した。この操作を繰り返し、ＡＴIIIの１６倍希釈液及び３２倍希釈液も調製し、それぞれを別容器に分注した。各溶液をヒートブロックを用いて７０℃で１０分間熱処理した後にただちに氷冷した。各溶液を室温まで戻した後、０．１ｍＬをマイクロプレートに分注した。比濁法用のＥｔ測定試薬（パイロテル（登録商標）−Ｔ；アソシエーツオブケープコッドインク)０．１ｍＬを添加し、ウェルリーダーを用いて１分間激しく撹拌した後、３７℃で６０分間加温しながら測定波長４０５ｎｍ及び対照波長６６０ｎｍにおける吸光度の経時変化を測定し、Ｅｔ添加回収率を算出した。結果を表９に示す。

表９に示すように、Ｅｔ測定試薬としてエンドスペシーＥＳ−５０Ｍに代えてパイロテル−Ｔを用いた場合においても、ＡＴIII製剤の希釈倍率によらずＥｔ添加回収率がほぼ１００％であり、Ｅｔを精度よく検出できた。よって、本発明の前処理法を実施することにより、リムルス試薬として比濁法用のＥｔ測定試薬を用いた場合においても、ＡＴIIIと共存するＥｔの高精度な測定が可能であることが明らかとなった。

＜実施例７＞パイロテルマルチテスト（ゲル化法用のＥｔ測定試薬）を用いた試験
５０Ｕｎｉｔ／ｍＬのＡＴIII製剤０．１ｍＬに０．２４ＥＵ／ｍＬのＥｔ標準液０．１ｍＬを加え、試験管ミキサーを用いて１分間激しく撹拌した。その後、水０．１ｍＬを加え、試験管ミキサーを用いて１分間激しく撹拌した後、２５ｍＭのＣａＣｌ₂水溶液０．１ｍＬを加え、さらに試験管ミキサーを用いて１分間激しく撹拌し、０．２ｍＬをＡＴIIIの４倍希釈液として別容器に分注した。残りの０．２ｍＬに水０．２ｍＬを加え、試験管ミキサーを用いて１分間激しく撹拌した後、０．２ｍＬをＡＴIIIの８倍希釈液として別容器に分注した。この操作を繰り返し、ＡＴIIIの１６倍希釈液及び３２倍希釈液も調製し、それぞれを別容器に分注した。各溶液をヒートブロックを用いて７０℃で１０分間熱処理した後にただちに氷冷した。各溶液を室温まで戻した後、０．１ｍＬを丸底試験管に分注した。ゲル化法用のＥｔ測定試薬(パイロテル（登録商標）マルチテスト；アソシエーツオブケープコッドインク)０．１ｍＬを添加し、試験管ミキサーを用いて１分激しく撹拌した後、ヒートブロックを用いて３７℃で１時間加温した。その後、試験管をゆっくり転倒させ、内容物が流出しない堅固なゲルを形成しているか確認した。結果を表１０に示す。

表１０に示すように、パイロテルマルチテストの検出限界である０．０３ＥＵ／ｍＬ以上のＥｔを含むＡＴIII溶液で内容物のゲル化が確認された。よって、本発明の前処理法を実施することにより、リムルス試薬としてゲル化法用のＥｔ測定試薬を用いた場合においても、ＡＴIIIと共存するＥｔの高精度な検出が可能であることが明らかとなった。

＜実施例８＞平行線定量法を用いた試験（１）
５０Ｕｎｉｔ／ｍＬのＡＴIII製剤０．４７５ｍＬに１ＥＵ／ｍＬのＥｔ標準液０．１１ｍＬを加え、試験管ミキサーを用いて１分間激しく撹拌した。その後、水０．４７５ｍＬを加え、試験管ミキサーを用いて１分間激しく撹拌した後、５００ｍＭのＭｇＳＯ₄水溶液０．０５ｍＬを加え、さらに試験管ミキサーを用いて１分間激しく撹拌し、溶液をヒートブロックを用いて７０℃で１０分間熱処理した後にただちに氷冷した。溶液を室温まで戻した後、０．５ｍＬをＡＴIIIの２倍希釈液として別容器に分注した。残りの０．５ｍＬに水０．５ｍＬを加え、試験管ミキサーを用いて１分間激しく撹拌した後、０．５ｍＬをＡＴIIIの４倍希釈液として別容器に分注した。この操作を繰り返し、ＡＴIIIの８倍希釈液、１６倍希釈液及び３２倍希釈液も調製し、それぞれを別容器に分注した。また、ＡＴIII製剤の代わりにエンドトキシン試験用水を用い、本発明の前処理法を実施せずに調製した同様の希釈系列を対照試料として用意した。各溶液０．０５ｍＬをマイクロプレートに分注した。エンドスペシーＥＳ−５０Ｍを０．０５ｍＬ添加し、ウェルリーダーを用いて１分間激しく撹拌した後、３７℃で３０分間加温しながら測定波長４０５ｎｍ及び対照波長４９２ｎｍにおける吸光度の経時変化を測定した。結果を表１１および図１に示す。

図１に示すように、ＡＴIIIを含む試料の希釈倍率に対する測定値および対照試料（エンドトキシン標準液のエンドトキシン試験用水による２倍希釈系列液）のエンドトキシン濃度に対する測定値をそれぞれ両対数プロットし、平行線定量法により平行性検定を行った。平行線定量法の専用ソフトウエア（ＰＬ６０３；生化学工業株式会社）により統計学的に分析した結果、両者は回帰および平行性が成立し、試験に適合した。平行線定量法により算出されたＥｔ濃度（０．２７５ＥＵ／ｍＬ）を対照試料のＥｔ濃度（０．２３２ＥＵ／ｍＬ）で除して算出したＥｔ添加回収率は１１８．５％となった。

＜実施例９＞平行線定量法を用いた試験（２）
５０Ｕｎｉｔ／ｍＬのＡＴIII製剤０．８ｍＬに１ＥＵ／ｍＬのＥｔ標準液０．１ｍＬを加え、試験管ミキサーを用いて１分間激しく撹拌した。その後、水０．０２ｍＬを加え、試験管ミキサーを用いて１分間激しく撹拌した後、５００ｍＭのＭｇＳＯ₄水溶液０．０８ｍＬを加え、さらに試験管ミキサーを用いて１分間激しく撹拌し、溶液をヒートブロックを用いて７０℃で１０分間熱処理した後にただちに氷冷した。溶液の温度を室温に戻した後、０．５ｍＬをＡＴIIIの１．２５倍希釈液として別容器に分注した。残りの０．５ｍＬに４０ｍＭのＭｇＳＯ₄水溶液を０．５ｍＬ加え、試験管ミキサーを用いて１分間激しく撹拌した後、０．５ｍＬをＡＴIIIの２．５倍希釈液として別容器に分注した。この操作を繰り返し、ＡＴIIIの５倍希釈液、１０倍希釈液、２０倍希釈液も調製し、それぞれを別容器に分注した。また、ＡＴIII製剤の代わりにエンドトキシン試験用水を用い、本発明の前処理法を実施せずに調製した同様の希釈系列を対照試料として用意した。各溶液０．０５ｍＬをマイクロプレートに分注し、エンドスペシーＥＳ−５０Ｍを０．０５ｍＬ添加し、ウェルリーダーを用いて１分間激しく撹拌した後、３７℃で３０分間加温しながら測定波長４０５ｎｍ及び対照波長４９２ｎｍにおける吸光度の経時変化を測定した。結果を表１２および図２に示す。

図２に示すように、ＡＴIIIを含む試料の希釈倍率に対する測定値および対照試料（エンドトキシン標準液のエンドトキシン試験用水による２倍希釈系列液）のエンドトキシン濃度に対する測定値をそれぞれ両対数プロットし、平行線定量法により平行性検定を行った。平行線定量法の専用ソフトウェア（ＰＬ６０３；生化学工業株式会社）により統計学的に分析した結果、両者には回帰および平行性が成立し、試験に適合した。平行線定量法により算出されたＥｔ濃度（０．１２２ＥＵ／ｍＬ）を対照試料のＥｔ濃度（０．１２５ＥＵ／ｍＬ）で除して算出したＥｔ添加回収率は９７．６％となった。

＜実施例１０＞平行線定量法を用いた試験（３）
５０Ｕｎｉｔ／ｍＬのＡＴIII製剤４７２．５μＬに２０ＥＵ／ｍＬのＥｔ標準液２．５μＬを加え、試験管ミキサーを用いて１分間激しく撹拌した。次に、水６．２５μＬを加え、試験管ミキサーを用いて１分間激しく撹拌した後、２ＭのＭｇＳＯ₄水溶液１８．７５μＬを加え、さらに試験管ミキサーを用いて１分間激しく撹拌した。その後、ヒートブロックを用いて溶液を７０℃で２０分間熱処理した後にただちに氷冷した。溶液の温度を室温に戻した後、２５０μＬをＡＴIIIの１．０６倍希釈液として別容器に分注した。残りの２５０μＬに水を２５０μＬ加え、試験管ミキサーを用いて１分間激しく撹拌した後、２５０μＬをＡＴIIIの２．１２倍希釈液として別容器に分注した。この操作を繰り返し、ＡＴIIIの４．２３倍希釈液、８．４７倍希釈液、１６．９３倍希釈液も調製し、それぞれを別容器に分注した。また、ＡＴIII製剤の代わりにエンドトキシン試験用水を用い、本発明の前処理法を実施せずに調製した同様の希釈系列を対照試料として用意した。各溶液５０μＬをマイクロプレートに分注し、エンドスペシーＥＳ−５０Ｍを５０μＬ添加し、ウェルリーダーを用いて１分間激しく撹拌した後、３７℃で３０分間加温しながら測定波長４０５ｎｍ及び対照波長４９２ｎｍにおける吸光度の経時変化を測定した。結果を表１３および図３に示す。

図３に示すように、ＡＴIIIを含む試料の希釈倍率に対する測定値および対照試料（エンドトキシン標準液のエンドトキシン試験用水による２倍希釈系列液）のエンドトキシン濃度に対する測定値をそれぞれ両対数プロットし、平行線定量法により平行性検定を行った。平行線定量法の専用ソフトウェア（ＰＬ６０３；生化学工業株式会社）により統計学的に分析した結果、両者には回帰および平行性が成立し、試験に適合した。平行線定量法により算出されたＥｔ濃度（０．１１１ＥＵ／ｍＬ）を対照試料のＥｔ濃度（０．１０６ＥＵ／ｍＬ）で除して算出したＥｔ添加回収率は１０４．７％となった。

よって、＜実施例８＞〜＜実施例１０＞に示したとおり、本発明の前処理法を実施することにより、生物学的製剤基準に記載されている平行線定量法に従って試験した場合においても、ＡＴIIIと共存するＥｔの高精度な測定が可能であることが明らかとなった。

本発明によれば、リムルス試験に付されるＡＴIIIの前処理を行うことにより、ＡＴIIIをリムルス試験に付す際の反応干渉作用を低減でき、よって、ＡＴIIIのリムルス試験を高精度に実施できる。また、本発明によれば、ＡＴIIIのリムルス試験を簡便、迅速、かつ安価に実施できると期待される。

Claims

リムルス試験に付されるアンチトロンビンIII用の前処理剤であって、
二価金属が、マグネシウム、カルシウム、マンガン、及び亜鉛からなる群より選択される１又はそれ以上の金属である、二価金属塩を含有し、
アンチトロンビンIIIをリムルス試験に付す前に、該アンチトロンビンIIIを前記前処理剤と共存させた状態でタンパク質を失活させる処理（但しアルカリ処理を除く）に供するために用いられる、前処理剤。
前記二価金属塩が、二価金属塩化物、二価金属酢酸塩、及び二価金属硫酸塩からなる群より選択される１又はそれ以上の金属塩である、請求項１に記載の前処理剤。
アンチトロンビンIIIを前記前処理剤と共存させた時の、前記二価金属塩に由来する二価金属イオンの濃度が、０．５ｍＭ以上である、請求項１又は２に記載の前処理剤。
前記リムルス試験の測定対象物質が、エンドトキシンである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の前処理剤。
請求項１〜４のいずれか１項に記載の前処理剤を含む、アンチトロンビンIII用のリムルス試薬キット。
アンチトロンビンIIIを二価金属塩と共存させた状態でタンパク質を失活させる処理（但しアルカリ処理を除く）に供することを含み、
前記二価金属塩の二価金属が、マグネシウム、カルシウム、マンガン、及び亜鉛からなる群より選択される１又はそれ以上の金属である、リムルス試験に付されるアンチトロンビンIIIの前処理方法。
前記タンパク質を失活させる処理が、熱処理または酸処理である、請求項６に記載の前処理方法。
前記熱処理が、５０℃超の温度で行われる、請求項７に記載の前処理方法。
前記酸処理に用いられる酸が、塩酸である、請求項７に記載の前処理方法。
前記二価金属塩が、二価金属塩化物、二価金属酢酸塩、及び二価金属硫酸塩からなる群より選択される１又はそれ以上の金属塩である、請求項６〜９のいずれか１項に記載の前処理方法。
アンチトロンビンIIIを前記二価金属塩と共存させた時の、前記二価金属塩に由来する二価金属イオンの濃度が、０．５ｍＭ以上である、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の前処理方法。
前記リムルス試験の測定対象物質が、エンドトキシンである、請求項６〜１１のいずれか１項に記載の前処理方法。
請求項６〜１２のいずれか１項に記載の前処理方法によりアンチトロンビンIIIを前処理すること、および前処理されたアンチトロンビンIIIをリムルス試験に付すことを含む、アンチトロンビンIII中のリムルス試験の測定対象物質を測定する方法。
請求項１３に記載の方法によりアンチトロンビンIII中のリムルス試験の測定対象物質を測定することを含む、アンチトロンビンIIIを製造する方法。