JP4355608B2 - エンドトキシン試験方法及び培養物の処理方法 - Google Patents
エンドトキシン試験方法及び培養物の処理方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4355608B2 JP4355608B2 JP2004126653A JP2004126653A JP4355608B2 JP 4355608 B2 JP4355608 B2 JP 4355608B2 JP 2004126653 A JP2004126653 A JP 2004126653A JP 2004126653 A JP2004126653 A JP 2004126653A JP 4355608 B2 JP4355608 B2 JP 4355608B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- solution
- endotoxin
- sample
- test
- culture
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
一方、非特許文献3は、コラーゲンなどはエンドトキシンが吸着し易く、上述の生理食塩液による抽出方法では十分ではない旨を指摘し、更に、滅菌生理食塩液中で精製コラゲナーゼによりコラーゲンを溶解させ、その溶解液を基にエンドトキシン試験を行うことによって、LPS(リポ多糖、すなわちエンドトキシン)の回収率が飛躍的に改善することができたと報告している。
また医療用移植片などに利用するための培養物においては、使用前に種々の成分について迅速に試験を行うことが切望され、手間の掛かる工程をできるだけ排除する必要がある。
第十四改正日本薬局方、厚生労働省、2001年3月30日、第20頁〜第23頁 「天然由来物質」を利用する創傷保護材の取扱いについて,厚生省薬務局医療機器開発課 事務連絡・審査事務連絡(92−8)、平成4年4月14日 天然医用材料からのエンドトキシン回収法の開発,第24回日本バイオマテリアル学会大会 予稿集、2002年、p223
また本発明は、培養物において、エンドトキシンに限らず種々の成分の試験を簡便に行うために有効な処理方法を提供することを目的とする。
また本発明によれば、酸性溶液で培養物を溶解し、次いで中和して、中和試料液とするので、エンドトキシンに限らず、培養物に吸着しやすい種々の成分の試験を簡便且つ迅速に実施しやすくすることができる。さらに、本発明によれば、酵素などの試薬による溶解よりも早期に試料を溶解することができる。
なお、試料に含有される物質とは、試料全体の一部に物質が存在する場合のみならず、試料全体の大部分を構成する場合も含む。
ここで云う酸性溶液とは、試料を溶解することが可能な酸性溶液であればよく、試料の種類に応じて適宜決定することができる。試料を溶解する時間などを考慮すると、pH0.1〜5.9の範囲の酸、特にpH0.1〜3.5の範囲の強酸である酸性溶液が好ましい。このような酸性溶液は、当業界において強酸性物質として一般に既知である無機酸(例えば、塩酸、硫酸、硝酸)や有機酸(例えば、トリクロロ酢酸、フェノール)を単独で又は組み合わせて使用して、容易に作製することができる。また、弱酸性物質として一般に既知である有機酸(例えば、酢酸、クエン酸、コハク酸、シュウ酸、)を使用し、上記pH0.1〜3.5の範囲に調整した強酸を示す酸性溶液を作製してもよく、弱酸性物質と強酸性物質とを組み合わせて使用してもよい。
このようにして得られた溶解試料液は、酸性のpH、好ましくはpH0.3〜3、特に好ましくはpH1〜3のpH範囲内の試料pHとなって、後続する中和工程に用いられる。pH0.3よりもpHが低いと緩衝液による中和が不十分となって好ましくなく、pH3よりもpHが高いとコラーゲンの溶解が不十分となって好ましくない。
ここで云う緩衝作用を有する溶液とは、酸性溶液で試料を溶解した溶解試料液を中和する作用を有する溶液であればよく、酸性溶液と試料の種類に応じて適宜決定することができる。具体的には、リン酸緩衝液、BSE(N,N−ビス(2−ヒドロキシエチル)−2−アミノエタンスルホン酸)緩衝液、トリス緩衝液などが挙げられる。これらの溶液は、塩が析出するほど緩衝能が高すぎず、また溶解試料液の中和に必要な量が大量になりすぎて試験感度を下げることがないため、好ましい。緩衝能の強さ及びエンドトキシン試験系の検出能を高く維持することができる観点から、リン酸緩衝液であることが特に好ましい。
ここで云う試験とは、中和試料液中のエンドトキシンの量を測定する方法のみならず、単に有無を検出する方法も含む。当業者であれば、当業界で周知の方法から適切な方法を容易に選択し、実行することができる。例えば、リムスル試薬(ライセート試薬)を用いたゲル化法、比濁法及び比色法などが挙げられ、日本薬局方で定められたエンドトキシン試験法などが該当する。なお、エンドトキシン試験法を採用する場合には、既知の反応干渉因子試験などを行って検出能を確認することが好ましい。
なお、試験を行うに際して適当な試料濃度となるように、中和試料溶液を蒸留水などで更に希釈してもよい。
本発明の培養物の処理方法は、培養物を酸性溶液を用いて溶解して、溶解試料液を得る溶解工程と、緩衝作用を有する溶液で、前記溶解試料液を中和して、中和試料液を得る中和工程と、を含む。
この培養物の処理方法における培養物には、上記エンドトキシンの試験方法を適用可能な培養物が含まれる。このような培養物には、培養対象となる細胞を所定の培養培地の存在下で所定期間培養したものが該当し、足場材料(Scaffold:スキャホールド)と共に培養されたものが特に好ましい。ここでいう足場材料には、上記天然由来物質が該当し、特にコラーゲンであることが好ましい。
この方法によれば、得られた中和試料液中に、培養物中に存在するエンドトキシンなどの成分が試験可能な形態で存在するので、本処理方法に続けて当該成分の試験を容易に行うことができる。
このような試験は、培養物に含有する可能性のある成分であって、酸性溶液によって分解・変質しない成分の試験であればよく、用いる酸性溶液及び緩衝作用を有する溶液の種類に応じて、当業者であれば容易に判断することができる。
また処理方法に必要な薬剤をひとつにまとめたキットとして提供してもよく、その際には酸性溶液を入れた容器と、緩衝作用を有する溶液を入れた容器と、これらの薬剤の使用方法を記載した説明書を含むものとすることができる。
[実施例1]
(1)検量線の作成
各実施例で使用する試薬の精度と有効性を保証するために、検量線の信頼性確認試験を、培養軟骨のエンドトキシン試験に先立って行った。
E.coli UKT−B由来の標準エンドトキシン(CSE:1000EU/ml、和光純薬工業社製)をダルベッコリン酸緩衝液(DPBS)で希釈し、0.013、0.025、0.050EU/mlのエンドトキシン標準液を調製した。
これらのエンドトキシン標準液をマイクロプレートに50μlずつ分注し、50μlのライセート試薬(エンドスペシー〔登録商標〕:生化学工業社製)を混合後、37℃で30分間反応させた。反応終了後、ジアゾカップリング試薬(トキシカラー〔登録商標〕:生化学工業社製)を順次加えて吸光度測定を行い、545nmと630nmの吸光度の差を測定した。これらの測定結果を、表1に示す。検量線は対数−対数プロットで作成し、直線回帰分析を行い、相関係数が0.98以上であることを確認した。
次に、塩酸を用いた溶解処理及び中和処理のエンドトキシン試験に対する影響を確認した。
E.coli UKT−B由来の標準エンドトキシン(CSE:1000EU/ml、和光純薬工業社製)を注射用蒸留水で希釈したエンドトキシン標準液(25EU/ml)に、50mMの塩酸(HCl)を標準液の9倍量で加え、室温で5分間放置した。50mMの塩酸は、1Nの塩酸(和光純薬工業社製)を注射用蒸留水で希釈し、0.45μmのフィルタで濾過滅菌したものを使用した。放置後、DPBSで100倍希釈したものを試料溶液とし、上述の検量線の作成と同様の操作を行い、塩酸処理が測定値に与える影響を調べた。
その結果、50mMの塩酸で処理した標準エンドトキシンの測定値は、理論値の130%を示し(図示せず)、標準偏差内に収まったので、塩酸処理によってエンドトキシンが分解される等の影響がないことが確認された。
比色法によるエンドトキシン試験
(1)培養軟骨組織の作製
日本白色家兎の膝、股、肩関節から関節軟骨を採取し、トリプシンEDTA溶液及びコラゲナーゼ溶液で酵素処理を行い、軟骨細胞を分離・回収した。得られた軟骨細胞を洗浄後、10%ウシ胎児血清(FBS)含有DMEM(ダルベッコ改変イーグル培地)を加え、細胞密度が1×107個/mlとなるように細胞懸濁液を調製した。細胞懸濁液と3%アテロコラーゲンインプラント(高研社製)が1:4の割合になるように混合(包埋)し、この混合液100μlを培養皿に略ドーム状となるようにマウント(設置)した。この工程によって細胞密度は希釈されるので、細胞懸濁液を1×107個/mlの濃度で調製した場合、コラーゲンに包埋したときの濃度は2×106個/cm3(2×105個/100μl)となる。
次に、エンドトキシン試験の精度と有効性を保証するため、反応干渉因子試験を行った。なお試験に用いる検量線の信頼性は、実施例1で用いたものを使用するため、既に確認されている。
試験の前処理として、上述の作製方法で作製した培養軟骨の重量を測定し、9倍量の50mMの塩酸を加えて室温で攪拌して培養軟骨を溶解した。培養軟骨の溶解を確認した後、DPBSを用いて100倍希釈を行って試料溶液(希釈倍率:1000倍)とした。また、軟骨細胞を含まないコラーゲンゲルを溶解した試料溶液も用意した。コラーゲンゲルの試料溶液は、100倍希釈(希釈倍率:1000倍)、200倍希釈(希釈倍率:2000倍)、300倍希釈(希釈倍率:3000倍)のものを準備した。
また、上記エンドトキシン比色法試験により、エンドトキシン未添加群における培養軟骨の試験溶液の測定値より算出したエンドトキシン濃度は、検量線の最小濃度(0.013EU/ml)未満であった。試料溶液は培養軟骨より換算して1000倍に希釈されていることから、培養軟骨中のエンドトキシン濃度は、13EU/cm3未満であることが確認できた。
ゲル化法によるエンドトキシン試験
最初に、実施例1で使用したものと同様の標準エンドトキシン(和光純薬工業社製)を、注射用蒸留水で3倍希釈したDPBS(以下、3倍希釈DPBSと云う)で溶解し、1000EU/mlのエンドトキシン標準原液を調製した。この原液を3倍希釈DPBSを用いて希釈し、6.25、0.0625、0.0313、0.0156、0.0078EU/mlのエンドトキシン標準液(C)を作製した。
6.25EU/mlの濃度のエンドトキシン標準液を試料溶液で100倍希釈し、エンドトキシンを添加した試験溶液(0.0625EU/ml)を調製し、さらに試料溶液で2倍希釈を繰り返すことで0.0313EU/ml、0.0156EU/ml、0.0078EU/mlのエンドトキシン添加群の各試験溶液(B)を調製した。
またエンドトキシンに限らず試料中に検出対象が含まれる場合に、種々の試験を実施するための試料を、簡便に調製することができる。さらに、酵素などの試薬による溶解よりも早期に試料を溶解することができる。
Claims (8)
- 試料に対してエンドトキシンの試験を行うエンドトキシン試験方法であって、
ゲル試料を酸性溶液で溶解して、溶解試料液を得る工程と、
緩衝作用を有する溶液で、前記溶解試料液を中和して、中和試料液を得る工程と、
前記中和試料液に対してエンドトキシンの試験を行う工程と、
を含むエンドトキシン試験方法。 - 前記ゲル試料は、天然由来物質を含有することを特徴とする請求項1に記載のエンドトキシン試験方法。
- 前記天然由来物質は、コラーゲンであることを特徴とする請求項2に記載のエンドトキシン試験方法。
- 前記ゲル試料は、コラーゲンゲルに軟骨細胞を包埋した培養軟骨であることを特徴とする請求項1に記載のエンドトキシン試験方法。
- 前記酸性溶液は、無機酸であることを特徴とする請求項1〜請求項4のいずれか1項に記載のエンドトキシン試験方法。
- 前記酸性溶液が塩酸であり、且つ前記緩衝作用を有する溶液がリン酸緩衝液であることを特徴とする請求項1〜請求項5のいずれか1項に記載のエンドトキシン試験方法。
- 培養物の処理方法であって、
培養物を酸性溶液で溶解して、溶解試料液を得る工程と、
緩衝作用を有する溶液で、前記溶解試料液を中和して、中和試料液を得る工程と、
を含む処理方法。 - 前記培養物は、コラーゲンと該コラーゲンに保持された細胞で構成されていることを特徴とする請求項7に記載の培養物の処理方法。
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2004126653A JP4355608B2 (ja) | 2004-04-22 | 2004-04-22 | エンドトキシン試験方法及び培養物の処理方法 |
TW94112425A TW200538737A (en) | 2004-04-22 | 2005-04-19 | A method of testing endotoxin and method for treating a sample containing collagen |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2004126653A JP4355608B2 (ja) | 2004-04-22 | 2004-04-22 | エンドトキシン試験方法及び培養物の処理方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2005308574A JP2005308574A (ja) | 2005-11-04 |
JP4355608B2 true JP4355608B2 (ja) | 2009-11-04 |
Family
ID=35437518
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2004126653A Expired - Fee Related JP4355608B2 (ja) | 2004-04-22 | 2004-04-22 | エンドトキシン試験方法及び培養物の処理方法 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP4355608B2 (ja) |
TW (1) | TW200538737A (ja) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP4938628B2 (ja) * | 2007-10-29 | 2012-05-23 | Hoya株式会社 | リン酸カルシウム系化合物、リン酸カルシウム系化合物/コラーゲン複合体及びリン酸カルシウム系細胞培養担体に付着又は吸着したエンドトキシンの抽出方法及び定量方法 |
WO2012029171A1 (ja) * | 2010-09-03 | 2012-03-08 | 興和株式会社 | 生物由来の生理活性物質の測定方法 |
EP2940468B1 (en) * | 2012-12-28 | 2019-04-17 | Seikagaku Corporation | Pre-treatment agent and pre-treatment method for antithrombin iii to be subjected to limulus test |
CN112462076B (zh) * | 2020-11-12 | 2022-10-18 | 天津华龛生物科技有限公司 | 应用于微载体的内毒素含量的检测方法 |
-
2004
- 2004-04-22 JP JP2004126653A patent/JP4355608B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2005
- 2005-04-19 TW TW94112425A patent/TW200538737A/zh unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
TW200538737A (en) | 2005-12-01 |
JP2005308574A (ja) | 2005-11-04 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Che et al. | A 3D printable and bioactive hydrogel scaffold to treat traumatic brain injury | |
Gallo et al. | Contributions of human tissue analysis to understanding the mechanisms of loosening and osteolysis in total hip replacement | |
Yu et al. | Lipopolysaccharide inhibits or accelerates biomedical titanium corrosion depending on environmental acidity | |
DE602004011105T2 (de) | Verfahren, peptide und biosensoren mit eignung zum nachweis eines breiten spektrums von bakterien | |
Ahmed et al. | Risk factors, diagnosis and management of prosthetic joint infection after total hip arthroplasty | |
Prech et al. | Apoptosis as a mechanism for the elimination of cardiomyocytes after acute myocardial infarction | |
Uhl et al. | Preparation of decellularized lung matrices for cell culture and protein analysis | |
Ma et al. | Osteogenetic property of a biodegradable three-dimensional macroporous hydrogel coating on titanium implants fabricated via EPD | |
CN111671772B (zh) | 一种外泌体在制备修复皮肤损伤的药品或化妆品中的应用 | |
Friedrich et al. | Residual sodium dodecyl sulfate in decellularized muscle matrices leads to fibroblast activation in vitro and foreign body response in vivo | |
Milošev et al. | pH and metal concentration of synovial fluid of osteoarthritic joints and joints with metal replacements | |
JP4355608B2 (ja) | エンドトキシン試験方法及び培養物の処理方法 | |
Cipriano et al. | A comparison study on the degradation and cytocompatibility of Mg-4Zn-x Sr alloys in direct culture | |
Schumacher et al. | Biodegradation of metallic magnesium elicits an inflammatory response in primary nasal epithelial cells | |
Jannasch et al. | An in vitro model mimics the contact of biomaterials to blood components and the reaction of surrounding soft tissue | |
Younis et al. | 3D TECA hydrogel reduces cellular senescence and enhances fibroblasts migration in wound healing | |
Amberg et al. | Effect of physical cues of altered extract media from biodegradable magnesium implants on human gingival fibroblasts | |
JP2016114591A (ja) | 皮膚粘弾性のマーカー及びその利用 | |
JP2007064895A (ja) | 生体適用材料のエンドトキシン測定のための前処理方法及びエンドトキシンの測定方法 | |
DE60035104D1 (de) | Biologische indikatoren zur gültigkeitserklärung eines prionsterilisierungsprozess | |
Alexeev et al. | Mechanical and biological characterization of a composite annulus fibrosus repair strategy in an endplate delamination model | |
Dhandapani et al. | Mechanical, compositional, and microstructural changes caused by human skin maceration | |
US20220145254A1 (en) | Osteoporosis model comprising calcium phosphate hydrogel composition and use thereof | |
Gjaldbaek et al. | Does urine from stone-formers contain macromolecules which promote the crystal growth rate of calcium oxalate crystals in vitro? | |
Meinshausen et al. | The terminal complement pathway is activated in septic but not in aseptic shoulder revision arthroplasties |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20070402 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20090403 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090421 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090615 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20090721 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20090803 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4355608 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120807 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120807 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120807 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20150807 Year of fee payment: 6 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |