JP5564193B2 - リポ多糖又はリピッドａの分析方法 - Google Patents
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Description
本発明は、リポ多糖（Lipopolysaccharide；ＬＰＳ）及び／又はリピッドＡの分析方法に関する。
ＬＰＳ（エンドトキシン）は、多糖部分とリン脂質部分（すなわち、リピッドＡ）とからなり、糖鎖部分が菌種又は菌株によって多様性があるのに対して、リピッドＡ部分は菌種又は菌株でほぼ同一構造を有する。また、リピッドＡ部分は、リポ多糖毒性の中心的役割を果たしている。
公知のＬＰＳ測定方法としては、例えば、ウサギ発熱試験、細胞の産生マーカーによる定量法、ＬＡＬ（limulus amebocyte lysate）法を挙げることができる。ウサギ発熱試験は、コストが高く、生命倫理上の問題がある。細胞の産生マーカーによる定量法は、細胞の準備や同一性などの問題がある。現在、最も広範に用いられているＬＰＳ測定方法は、ＬＡＬ法であるが、被検試料（例えば、アンチトロンビンIII含有試料や、血液、血漿、血清など）によっては正確な値が得られないことが指摘されてきた。
一方、本発明者は、リポ多糖及び／又はリピッドＡに対する高い結合活性を有する新規ペプチドを取得し、更に、ＬＰＳをリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で溶解して調製したＬＰＳ溶液中のエンドトキシン量を、この新規ペプチドを固定化したビーズ担体を用いて吸着回収し、ＬＡＬ法により定量可能であったことを報告している（特許文献１）。前記特許文献１には記載されていないが、この新規ペプチド固定化ビーズとＬＡＬ法との組合せにおいても、被検試料によっては正確な値が得られないことがあることを、本発明者は確認している。
血液等の被検試料をＬＡＬ法により測定する前に実施する前処理方法としては、例えば、単純に希釈する方法、希釈して加熱する方法、界面活性剤や塩を加えて加熱する方法などが挙げられるが、いずれの方法も、全ての被検試料で満足な測定結果が得られるまでの顕著な改善効果は得られていなかった。
本発明の課題は、これまで正確な値が得られないことがあった被検試料であっても、簡便な方法により正確な値を得ることのできるリポ多糖及び／又はリピッドＡの分析方法を提供することにある。
本発明は、
［１］リポ多糖及び／又はリピッドＡ結合性ペプチドを固定化した担体を用いるリポ多糖及び／又はリピッドＡの分析方法であって、
リポ多糖及び／又はリピッドＡを含む可能性のある被検試料と、前記担体とを接触させる工程（以下、接触工程と称する）、
前記担体と未反応成分とを分離し、分離した担体を洗浄液で洗浄する工程（以下、洗浄工程と称する）、及び
前記担体に結合したリポ多糖及び／又はリピッドＡを分析する工程（以下、分析工程と称する）
を含み、
（ａ）前記洗浄液として有機溶媒含有水溶液を使用する、及び／又は
（ｂ）被検試料と担体との前記接触を、界面活性剤、還元剤、又はキレート剤の存在下で実施する
ことを特徴とする、前記分析方法、
［２］前記洗浄液が、界面活性剤、還元剤、又はキレート剤を更に含有する、［１］の分析方法、
［３］前記分析工程を、ＬＡＬ（limulus amebocyte lysate）法、免疫学的分析方法、あるいは、細胞又は組織を用いるエンドトキシン測定法により実施する、［１］又は［２］の分析方法、
［４］前記被検試料が、アンチトロンビンIIIを含有する可能性のある被検試料である、［１］〜［３］の分析方法、
［５］前記被検試料が血液、血漿、血清、あるいは、生体試料若しくは生物材料由来物であり、前記洗浄液として有機溶媒含有水溶液を使用する、［１］〜［４］の分析方法、
［６］前記リポ多糖及び／又はリピッドＡ結合性ペプチドが、
配列番号１又は配列番号２で表されるアミノ酸配列、あるいは、前記アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、リポ多糖及び／又はリピッドＡ結合活性を示すペプチド、又はその誘導体
である、［１］〜［５］の分析方法、
に関する。
［１］リポ多糖及び／又はリピッドＡ結合性ペプチドを固定化した担体を用いるリポ多糖及び／又はリピッドＡの分析方法であって、
リポ多糖及び／又はリピッドＡを含む可能性のある被検試料と、前記担体とを接触させる工程（以下、接触工程と称する）、
前記担体と未反応成分とを分離し、分離した担体を洗浄液で洗浄する工程（以下、洗浄工程と称する）、及び
前記担体に結合したリポ多糖及び／又はリピッドＡを分析する工程（以下、分析工程と称する）
を含み、
（ａ）前記洗浄液として有機溶媒含有水溶液を使用する、及び／又は
（ｂ）被検試料と担体との前記接触を、界面活性剤、還元剤、又はキレート剤の存在下で実施する
ことを特徴とする、前記分析方法、
［２］前記洗浄液が、界面活性剤、還元剤、又はキレート剤を更に含有する、［１］の分析方法、
［３］前記分析工程を、ＬＡＬ（limulus amebocyte lysate）法、免疫学的分析方法、あるいは、細胞又は組織を用いるエンドトキシン測定法により実施する、［１］又は［２］の分析方法、
［４］前記被検試料が、アンチトロンビンIIIを含有する可能性のある被検試料である、［１］〜［３］の分析方法、
［５］前記被検試料が血液、血漿、血清、あるいは、生体試料若しくは生物材料由来物であり、前記洗浄液として有機溶媒含有水溶液を使用する、［１］〜［４］の分析方法、
［６］前記リポ多糖及び／又はリピッドＡ結合性ペプチドが、
配列番号１又は配列番号２で表されるアミノ酸配列、あるいは、前記アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、リポ多糖及び／又はリピッドＡ結合活性を示すペプチド、又はその誘導体
である、［１］〜［５］の分析方法、
に関する。
本発明によれば、これまで正確な値が得られないことがあった被検試料であっても、簡便な方法により、リポ多糖及び／又はリピッドＡの正確な値を得ることができる。
本発明の分析方法は、リポ多糖及び／又はリピッドＡ結合性ペプチドを固定化した担体を使用し、被検試料中のリポ多糖及び／又はリピッドＡを前記担体により吸着回収し、担体に結合したリポ多糖及び／又はリピッドＡを分析することにより、被検試料中のリポ多糖及び／又はリピッドＡ量又は濃度を決定することができる。
本発明の分析方法は、接触工程、洗浄工程、及び分析工程を含み、（ａ）前記洗浄工程で用いる洗浄液として有機溶媒含有水溶液を使用するか、あるいは、（ｂ）前記接触工程における被検試料と担体との接触を、界面活性剤、還元剤、又はキレート剤の存在下で実施する。本発明においては、（ａ）又は（ｂ）のいずれか一方のみを行うこともできるし、その両方［すなわち、（ａ）及び（ｂ）］を行うこともできる。
本発明の分析方法は、接触工程、洗浄工程、及び分析工程を含み、（ａ）前記洗浄工程で用いる洗浄液として有機溶媒含有水溶液を使用するか、あるいは、（ｂ）前記接触工程における被検試料と担体との接触を、界面活性剤、還元剤、又はキレート剤の存在下で実施する。本発明においては、（ａ）又は（ｂ）のいずれか一方のみを行うこともできるし、その両方［すなわち、（ａ）及び（ｂ）］を行うこともできる。
本発明の分析方法で分析することのできる被検試料は、リポ多糖及び／又はリピッドＡを含む可能性のあるものであれば、特に限定されるものではなく、好ましくは、アンチトロンビンIIIを含有する可能性のある試料である。アンチトロンビンIIIを含有する試料は、ＬＡＬ法において正確な値が得られないことが知られており、本発明の分析方法によれば、アンチトロンビンIIIを含有する試料であっても、正確な値を得ることができる。
リポ多糖及び／又はリピッドＡを含む可能性のある試料としては、各種の生体試料（例えば、血液、血漿、血清）、あるいは、生体試料又は生物材料の各種の由来物（例えば、プラスミン製剤、抗生物質、ワクチン）を挙げることができ、アンチトロンビンIIIを含有する可能性のある試料としては、特に、血液、血漿、血清を挙げることができる。
リポ多糖及び／又はリピッドＡを含む可能性のある試料としては、各種の生体試料（例えば、血液、血漿、血清）、あるいは、生体試料又は生物材料の各種の由来物（例えば、プラスミン製剤、抗生物質、ワクチン）を挙げることができ、アンチトロンビンIIIを含有する可能性のある試料としては、特に、血液、血漿、血清を挙げることができる。
本発明の分析方法において、被検試料として、例えば、血液、血漿、血清を用いる場合には、洗浄工程で用いる洗浄液として有機溶媒含有水溶液を用いることが好ましく、それに加えて、接触工程における被検試料と担体との接触を、界面活性剤、還元剤、又はキレート剤の存在下で実施することがより好ましい。
また、被検試料として、血液分画製剤（ヒト免疫グロブリン製剤等）を用いる場合には、接触工程における被検試料と担体との接触を、界面活性剤、還元剤、又はキレート剤の存在下で実施することにより、有機溶媒含有水溶液を洗浄液として使用することなく、正確な測定を実施することができる。なお、このような試料を用いる場合であっても、界面活性剤、還元剤、又はキレート剤の使用の有無にかかわらず、有機溶媒含有水溶液を洗浄液として使用することもできる。
また、被検試料として、血液分画製剤（ヒト免疫グロブリン製剤等）を用いる場合には、接触工程における被検試料と担体との接触を、界面活性剤、還元剤、又はキレート剤の存在下で実施することにより、有機溶媒含有水溶液を洗浄液として使用することなく、正確な測定を実施することができる。なお、このような試料を用いる場合であっても、界面活性剤、還元剤、又はキレート剤の使用の有無にかかわらず、有機溶媒含有水溶液を洗浄液として使用することもできる。
本発明で用いるリポ多糖及び／又はリピッドＡ結合ペプチドとしては、リポ多糖及び／又はリピッドＡに対する結合能を有する限り、特に限定されるものではなく、例えば、ＷＯ２００７／０６０９７９、ＷＯ２００５／４７３１３、Biochim.Biophys.Acta Vol.1611, p.234-242 (2003)、FASEB J. Vol.14, p.1801-1813 (2000)に記載の各種ペプチドを用いることができ、リポ多糖及び／又はリピッドＡに対する極めて優れた結合活性を有する点で、ＷＯ２００７／０６０９７９に記載の各種ペプチドを用いることが好ましい。
なお、本明細書における用語「ペプチド」には、オリゴペプチド及びポリペプチドの両方が含まれ、また、各種修飾を施したペプチド誘導体を包含する意味で使用する。前記修飾としては、例えば、Ｌ体アミノ酸のＤ体化（例えば、Ｎ末端アミノ酸のＤ体化、Ｃ末端アミノ酸のＤ体化、Ｎ末端及びＣ末端以外のアミノ酸のＤ体化）、Ｎ末アミノ基のアセチル化、Ｃ末端カルボキシル基のアミド化、天然型アミノ酸の（性質の類似した）非天然型アミノ酸への置換、又はこれらの組合せを挙げることができる。
ＷＯ２００７／０６０９７９に記載のペプチドとしては、例えば、以下に示す配列番号１（＝ＷＯ２００７／０６０９７９における配列番号４）又は配列番号２（＝ＷＯ２００７／０６０９７９における配列番号１）で表されるアミノ酸配列、あるいは、前記アミノ酸配列において１又は数個（例えば、１〜６個、好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、更に好ましくは１又は２個、特に好ましくは１個）のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、リポ多糖及び／又はリピッドＡ結合活性を示すペプチド、又はその誘導体を挙げることができる。
ＸＹＳＳＳ ＩＳＳＩＸ Ａ（配列番号：１）
［前記アミノ酸配列中、１番目及び１０番目のＸは、それぞれ独立に、Ｋ、Ｒ、又はＨを意味する］
ＸＮＹＳＳ ＳＩＳＳＩ ＸＡ（配列番号：２）
［１番目及び１１番目のＸは、それぞれ独立に、Ｋ、Ｒ、又はＨを意味する］
ＸＹＳＳＳ ＩＳＳＩＸ Ａ（配列番号：１）
［前記アミノ酸配列中、１番目及び１０番目のＸは、それぞれ独立に、Ｋ、Ｒ、又はＨを意味する］
ＸＮＹＳＳ ＳＩＳＳＩ ＸＡ（配列番号：２）
［１番目及び１１番目のＸは、それぞれ独立に、Ｋ、Ｒ、又はＨを意味する］
ここで、ペプチドの機能を維持するために置換されるアミノ酸は、置換前のアミノ酸と似た性質を有するアミノ酸であることが好ましい。例えば、以下に示すような各グループに属するアミノ酸は、そのグループ内で互いに似た性質を有するアミノ酸である。これらのアミノ酸をグループ内の他のアミノ酸に置換しても、タンパク質の本質的な機能は損なわれないことが多い。このようなアミノ酸の置換は、保存的置換と呼ばれ、ポリペプチドの機能を保持しつつアミノ酸配列を変換するための手法として公知である。
非極性アミノ酸：Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe、及びTrp
非荷電性アミノ酸：Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、及びGln
酸性アミノ酸：Asp及びGlu
塩基性アミノ酸：Lys、Arg、及びHis
非極性アミノ酸：Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe、及びTrp
非荷電性アミノ酸：Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、及びGln
酸性アミノ酸：Asp及びGlu
塩基性アミノ酸：Lys、Arg、及びHis
また、或るペプチドがリポ多糖及び／又はリピッドＡ結合活性を有するか否かは、公知方法により容易に判定することができる。例えば、リポ多糖又はリピッドＡ（好ましくはリピッドＡ、又はリポ多糖とリピッドＡとの組合せ）を適当な担体（例えば、ＥＬＩＳＡプレート又はビーズ担体）に固定化し、前記リポ多糖への結合の有無を分析する方法、あるいは、表面プラズモン共鳴（surface plasmon resonance；ＳＰＲ）に基づく方法［例えば、ビアコア（BIACORE）システム（例えば、BIACORE 2000; BIACORE社）を用いる方法］により、或るペプチドがリポ多糖及び／又はリピッドＡ結合活性を有するか否かを容易に判定することができる。
本発明で用いる担体としては、例えば、シリカビーズ、アガロースビーズ、セルロースビーズ、磁気ビーズ、又はガラスファイバー等を用いることができる。リポ多糖及び／又はリピッドＡ結合ペプチドと担体との結合は、例えば、ジスルフィド結合による結合、あるいは、担体のマレイミド基を利用したマレイミド法などにより実施することができる。
本発明の分析方法における接触工程で用いることのできる界面活性剤としては、例えば、非イオン界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、又は両性界面活性剤を用いることができる。
非イオン界面活性剤として、具体的には、例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル［例えば、ポリエチレングリコール モノ−パラ−イソ−オクチルフェニルエステル（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）］、ポリオキシエチレンアルキルアリルエーテル、ポリオキシエチレン誘導体、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル［例えば、ポリオキシエチレンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０）］、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルアミン、又はアルキルアルカノールアミド等を挙げることができる。
陰イオン性界面活性剤として、具体的には、例えば、脂肪酸塩、アルキル硫酸エステル塩、アルキルベンゼンスルフォン酸塩、アルキルナフタレンスルフォン酸塩、又はアルキルスルホコハク酸塩等を挙げることができる。
陽イオン性界面活性剤として、具体的には、例えば、アルキルアミン塩、又は第４級アンモニウム塩等を挙げることができる。
両性界面活性剤として、具体的には、例えば、アルキルベタイン、アミンオキサイド、又はジメチルアンモニオプロパンスルホン酸等を挙げることができる。
陰イオン性界面活性剤として、具体的には、例えば、脂肪酸塩、アルキル硫酸エステル塩、アルキルベンゼンスルフォン酸塩、アルキルナフタレンスルフォン酸塩、又はアルキルスルホコハク酸塩等を挙げることができる。
陽イオン性界面活性剤として、具体的には、例えば、アルキルアミン塩、又は第４級アンモニウム塩等を挙げることができる。
両性界面活性剤として、具体的には、例えば、アルキルベタイン、アミンオキサイド、又はジメチルアンモニオプロパンスルホン酸等を挙げることができる。
接触工程における界面活性剤の濃度は、使用する界面活性剤の種類により適宜決定することができ、例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を用いる場合には、通常、０．０１〜１％で実施することができ、好ましくは０．０２〜１％、より好ましくは０．０５〜０．５％で実施することができる。
本発明の分析方法における接触工程で用いることのできる還元剤としては、例えば、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩［Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP・HCl)］などがある。使用濃度としては、例えば、ＤＴＴを用いる場合には、通常、０．１〜１０００ｍｍｏｌ／Ｌで実施することができ、好ましくは１〜１０００ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは１０〜５００ｍｍｏｌ／Ｌで実施することができる。ＴＣＥＰを用いる場合には、通常、０．０５〜５００ｍｍｏｌ／Ｌで実施することができ、好ましくは０．１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．５〜５０ｍｍｏｌ／Ｌで実施することができる。
本発明の分析方法における接触工程で用いることのできるキレート剤としては、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などがある。使用濃度としては、通常、０．５〜５００ｍｍｏｌ／Ｌで実施することができ、好ましくは１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは１０〜５０ｍｍｏｌ／Ｌで実施することができる。
接触工程では、これらの界面活性剤、還元剤、又はキレート剤のいずれか１つを、あるいは、それらを組み合わせて使用することができる。
本発明の分析方法における洗浄工程で用いる洗浄液に使用する有機溶媒としては、例えば、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジメトキシエタン、アセトニトリル、プロピオニトリル、ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリジノン、ジメチルスルホキシドなどの非プロトン性極性溶媒、又はヘキサン、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、キシレン、クロロベンゼンなどの非プロトン性非極性溶媒、又はメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなどのプロトン性極性溶媒が挙げられる。
使用濃度としては、例えば、アセトニトリルを用いる場合には、通常、０．１〜１００％で実施することができ、好ましくは、１〜８０％、より好ましくは１０〜５０％で実施することができる。
なお、洗浄工程で用いる有機溶媒含有水溶液は、更に、前記の界面活性剤、還元剤、及び／又はキレート剤を含有することができる。
使用濃度としては、例えば、アセトニトリルを用いる場合には、通常、０．１〜１００％で実施することができ、好ましくは、１〜８０％、より好ましくは１０〜５０％で実施することができる。
なお、洗浄工程で用いる有機溶媒含有水溶液は、更に、前記の界面活性剤、還元剤、及び／又はキレート剤を含有することができる。
本発明の分析方法における分析工程では、担体に結合したリポ多糖及び／又はリピッドＡを分析可能な公知のエンドトキシン測定法により分析を行うことができ、例えば、ＬＡＬ法、特異的抗体を用いる免疫学的分析方法、細胞又は組織を用いた分析系（例えば、細胞系を用いるＴＮＦαの誘導量測定（West MA, Koons Aら, Endotoxin tolerance in sepsis: concentration-dependent augmentation or inhibition of LPS-stimulated macrophage TNF secretion by LPS pretreatment., J Trauma. 2008 Oct;65(4):893-898; discussion 898-900.）、末梢血を用いるサイトカインの誘導）、表面プラズモン共鳴法を挙げることができる。本発明では、ＬＡＬ法を用いることが好ましく、例えば、市販のエンドトキシン測定キット（例えば、エンドスペシー ES-50Mセット；生化学工業社）を用いてＬＡＬ法を実施することができる。
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
《実施例１：ＤＴＴを用いたＡＴIII含有試料中のエンドトキシン（ＬＰＳ）測定》
（１）チップカラムの調製
ＬＰＳ及び／又はリピッドＡ結合性ペプチドとしては、ＷＯ２００７／０６０９７９に記載の
ペプチドＬｉ５−０２５：ｋＹＳＳＳＩＳＳＩＲＡｃ
［前記アミノ酸配列において、小文字で示すアミノ酸（ｋ、ｃ）はＤ体アミノ酸であることを示す。すなわち、前記アミノ酸配列は、配列番号３で表される配列において、１番目のＫ（Ｌ体）をＤ体リジンに置換し、１２番目のＣ（Ｌ体）をＤ体システインに置換した配列である］
を使用した。なお、比較用のＬＰＳ結合体としては、市販品であるポリε−リジン固定化ビーズ（ET-Clean；チッソ社）を使用した。
（１）チップカラムの調製
ＬＰＳ及び／又はリピッドＡ結合性ペプチドとしては、ＷＯ２００７／０６０９７９に記載の
ペプチドＬｉ５−０２５：ｋＹＳＳＳＩＳＳＩＲＡｃ
［前記アミノ酸配列において、小文字で示すアミノ酸（ｋ、ｃ）はＤ体アミノ酸であることを示す。すなわち、前記アミノ酸配列は、配列番号３で表される配列において、１番目のＫ（Ｌ体）をＤ体リジンに置換し、１２番目のＣ（Ｌ体）をＤ体システインに置換した配列である］
を使用した。なお、比較用のＬＰＳ結合体としては、市販品であるポリε−リジン固定化ビーズ（ET-Clean；チッソ社）を使用した。
ペプチドＬｉ５−０２５のビーズへの固定化は、ヨード酢酸アミドセルロース粒子（以下、ビーズと称する）にペプチド溶液を加え、Ｃ末端システインのチオール基を利用し、ＣＳ結合にて固定化した。
具体的には、まず、ペプチドを最少量の蒸留水で溶解し、５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ，５ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ・２Ｎａ，ｐＨ８．５のバッファー（以下、カップリングバッファーと称する）を加え、ペプチドの濃度が最終濃度で０．２５〜０．５μｍｏｌ／ｍＬとなるように調整した。一方で、ビーズを蒸留水で洗浄し、カップリングバッファーで平衡化した。
ビーズ１ｍＬ当たりペプチド３０μｍｏｌ（Peptide 30μmol/mL Beads）となるように、洗浄したビーズとペプチド溶液とを混合し、室温で穏やかに攪拌させながら、６時間〜一晩反応させた。ペプチド固定化後の溶液を回収し、ＳＨ基定量試薬（商品名：Ellman’s Reagent, PIERCE社製）にて未結合のペプチドの濃度を測定することにより、ペプチドの固定化量を算出した。
具体的には、まず、ペプチドを最少量の蒸留水で溶解し、５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ，５ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ・２Ｎａ，ｐＨ８．５のバッファー（以下、カップリングバッファーと称する）を加え、ペプチドの濃度が最終濃度で０．２５〜０．５μｍｏｌ／ｍＬとなるように調整した。一方で、ビーズを蒸留水で洗浄し、カップリングバッファーで平衡化した。
ビーズ１ｍＬ当たりペプチド３０μｍｏｌ（Peptide 30μmol/mL Beads）となるように、洗浄したビーズとペプチド溶液とを混合し、室温で穏やかに攪拌させながら、６時間〜一晩反応させた。ペプチド固定化後の溶液を回収し、ＳＨ基定量試薬（商品名：Ellman’s Reagent, PIERCE社製）にて未結合のペプチドの濃度を測定することにより、ペプチドの固定化量を算出した。
ペプチドＬｉ５−０２５固定化後、未反応のペプチドを洗い流すため、蒸留水でビーズを洗浄し、更にカップリングバッファーで平衡化した。一方で、２−メルカプトエタノール（関東化学社製）を１００ｍｍｏｌ／Ｌとなるように、カップリングバッファーで溶解し、ブロッキングバッファーを作製した。それを平衡化したビーズに加え混ぜ、穏やかに攪拌しながら室温で６時間〜一晩放置し、非特異吸着を防ぐためのブロッキングを行った。
ブロッキング後、蒸留水で良く洗浄し、未反応のメルカプトエタノールを取り除いた。最後、蒸留水を綺麗に取り除き、０．２Ｎ ＮａＯＨ（９５％エタノール）溶液を加え、混ぜ、穏やかに攪拌しながら３０分反応させ、その後、ビーズが中性になるまで蒸留水でよく洗浄した。この操作を３回程度繰り返し行い、混在しているエンドトキシンを除去するためのアルカリ洗浄を行った。
その後、２０％エタノール又はリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）等に置換し、使用するまで４℃で保存した。
ブロッキング後、蒸留水で良く洗浄し、未反応のメルカプトエタノールを取り除いた。最後、蒸留水を綺麗に取り除き、０．２Ｎ ＮａＯＨ（９５％エタノール）溶液を加え、混ぜ、穏やかに攪拌しながら３０分反応させ、その後、ビーズが中性になるまで蒸留水でよく洗浄した。この操作を３回程度繰り返し行い、混在しているエンドトキシンを除去するためのアルカリ洗浄を行った。
その後、２０％エタノール又はリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）等に置換し、使用するまで４℃で保存した。
得られたＬｉ５−０２５固定化ビーズ、コントロール用ビーズ（上記のブロッキング処理のみ）、市販のポリε−リジン固定化ビーズを、それぞれ、２００μＬフィルターチップ（深江化成社）に１５μＬずつ充填し、上澄みを除去した後、注射用蒸留水（大塚製薬）で１回洗浄した。
（２）エンドトキシンの測定
測定用試料として、市販のＡＴIII溶液［製品名：ノイアート(Neuart)、生物学的製剤基準 乾燥濃縮ヒト・アンチトロンビンIII、三菱ウェルファーマ社］に、エンドトキシン標準品［E.coli UKT-B、（財）日本公定書協会］を所定濃度（０、０．０２５、０．０５、０．１ＥＵ／ｍＬ）となるように添加し、室温で１時間インキュベートした。
各試料溶液に、終濃度１００ｍｍｏｌ／Ｌとなるように、ＤＴＴを加え、室温で１０分間インキュベートした後、その２００μＬを、先に調製した各チップカラムに通流した。通流後、２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ水溶液２００μＬで、５回洗浄した。
（２）エンドトキシンの測定
測定用試料として、市販のＡＴIII溶液［製品名：ノイアート(Neuart)、生物学的製剤基準 乾燥濃縮ヒト・アンチトロンビンIII、三菱ウェルファーマ社］に、エンドトキシン標準品［E.coli UKT-B、（財）日本公定書協会］を所定濃度（０、０．０２５、０．０５、０．１ＥＵ／ｍＬ）となるように添加し、室温で１時間インキュベートした。
各試料溶液に、終濃度１００ｍｍｏｌ／Ｌとなるように、ＤＴＴを加え、室温で１０分間インキュベートした後、その２００μＬを、先に調製した各チップカラムに通流した。通流後、２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ水溶液２００μＬで、５回洗浄した。
チップカラムのフィルター部分を切断し、エンドトキシンフリーの純水５０μＬにより、チップカラム中のビーズを、それぞれ、９６ウェル エンドトキシンフリープレート（製品名：トキシペット プレート ＬＰ、生化学バイオビジネス製）の各ウェルに押し出した。
各ウェルに、市販のエンドトキシン測定用試薬（エンドスペシー、生化学バイオビジネス製）５０μＬを加え、３７℃で３０分間インキュベートした後、反応停止剤（製品名：トキシカラーＤＩＡ−ＭＰセット、生化学バイオビジネス製）を加え、更にジアゾ化試薬を加えアゾ色素に変換し、吸光度計［５４５ｎｍ（対象波長６３０ｎｍ）］にて測定した。
各ウェルに、市販のエンドトキシン測定用試薬（エンドスペシー、生化学バイオビジネス製）５０μＬを加え、３７℃で３０分間インキュベートした後、反応停止剤（製品名：トキシカラーＤＩＡ−ＭＰセット、生化学バイオビジネス製）を加え、更にジアゾ化試薬を加えアゾ色素に変換し、吸光度計［５４５ｎｍ（対象波長６３０ｎｍ）］にて測定した。
結果を図１に示す。
なお、Ｌｉ５−０２５固定化ビーズに関しては、ＡＴIII及びエンドトキシン含有試料溶液に加え、エンドトキシンを水に溶解した試料溶液（エンドトキシン水溶液）、エンドトキシンをＰＢＳに溶解した試料溶液（エンドトキシン含有ＰＢＳ）についても、同様の操作を実施した。
図１に示すとおり、試料にＡＴIIIが含まれる場合、公知のＬＰＳ結合体であるポリε−リジンは、ＬＰＳ結合能をほとんど消失していた。一方、ペプチドＬｉ５−０２５は、試料にＡＴIIIが含まれる場合であっても、ＡＴIIIが含まれていない場合（エンドトキシン水溶液、エンドトキシン含有ＰＢＳ）と同様のＬＰＳ結合能を保持していた。
なお、Ｌｉ５−０２５固定化ビーズに関しては、ＡＴIII及びエンドトキシン含有試料溶液に加え、エンドトキシンを水に溶解した試料溶液（エンドトキシン水溶液）、エンドトキシンをＰＢＳに溶解した試料溶液（エンドトキシン含有ＰＢＳ）についても、同様の操作を実施した。
図１に示すとおり、試料にＡＴIIIが含まれる場合、公知のＬＰＳ結合体であるポリε−リジンは、ＬＰＳ結合能をほとんど消失していた。一方、ペプチドＬｉ５−０２５は、試料にＡＴIIIが含まれる場合であっても、ＡＴIIIが含まれていない場合（エンドトキシン水溶液、エンドトキシン含有ＰＢＳ）と同様のＬＰＳ結合能を保持していた。
《実施例２：洗浄にアセトニトリルを用いたＡＴIII含有試料中のエンドトキシン測定》
チップカラムとして、実施例１（１）と同じ手順で、Ｌｉ５−０２５固定化ビーズをフィルターチップに充填したチップカラムを用意した。
また、測定用試料として、実施例１（２）と同じ手順で調製した各試料溶液（ＤＴＴ無添加）を用意した。
チップカラムとして、実施例１（１）と同じ手順で、Ｌｉ５−０２５固定化ビーズをフィルターチップに充填したチップカラムを用意した。
また、測定用試料として、実施例１（２）と同じ手順で調製した各試料溶液（ＤＴＴ無添加）を用意した。
各試料溶液（ＤＴＴ無添加）２００μＬをチップカラムに通流し、続いて、２５％アセトニトリル含有の５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）緩衝液で、５回洗浄した。
チップカラムのフィルター部分を切断し、エンドトキシンフリーの純水５０μＬにより、チップカラム中のビーズを、それぞれ、９６ウェル エンドトキシンフリープレート（製品名：トキシペット プレート ＬＰ、生化学バイオビジネス製）の各ウェルに押し出した。
各ウェルに、市販のエンドトキシン測定用試薬（エンドスペシー、生化学バイオビジネス製）５０μＬを加え、３７℃で３０分間インキュベートした後、反応停止剤（製品名：トキシカラーＤＩＡ−ＭＰセット、生化学バイオビジネス製）を加え、更にジアゾ化試薬を加えアゾ色素に変換し、吸光度計［５４５ｎｍ（対象波長６３０ｎｍ）］にて測定した。
チップカラムのフィルター部分を切断し、エンドトキシンフリーの純水５０μＬにより、チップカラム中のビーズを、それぞれ、９６ウェル エンドトキシンフリープレート（製品名：トキシペット プレート ＬＰ、生化学バイオビジネス製）の各ウェルに押し出した。
各ウェルに、市販のエンドトキシン測定用試薬（エンドスペシー、生化学バイオビジネス製）５０μＬを加え、３７℃で３０分間インキュベートした後、反応停止剤（製品名：トキシカラーＤＩＡ−ＭＰセット、生化学バイオビジネス製）を加え、更にジアゾ化試薬を加えアゾ色素に変換し、吸光度計［５４５ｎｍ（対象波長６３０ｎｍ）］にて測定した。
結果を図２に示す。
Ｌｉ５−０２５固定化ビーズは、試料にＡＴIIIが含まれる場合であっても、変わらないＬＰＳ結合能を保持していた。
Ｌｉ５−０２５固定化ビーズは、試料にＡＴIIIが含まれる場合であっても、変わらないＬＰＳ結合能を保持していた。
《実施例３：アセトニトリル含有洗浄液を用いた血漿中のエンドトキシン測定》
フィルターチップとして、実施例１（１）と同じ手順で、Ｌｉ５−０２５固定化ビーズをフィルターチップに充填したチップカラムを用意した。
また、測定用試料として、ヒト血漿にエンドトキシン標準品を０、０．１、０．５、１ＥＵ／ｍＬとなるように加え、氷中で３０分間インキュベートした後、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を最終濃度０．１％となるように更に添加し、ボルテックスにより充分に混合した。
フィルターチップとして、実施例１（１）と同じ手順で、Ｌｉ５−０２５固定化ビーズをフィルターチップに充填したチップカラムを用意した。
また、測定用試料として、ヒト血漿にエンドトキシン標準品を０、０．１、０．５、１ＥＵ／ｍＬとなるように加え、氷中で３０分間インキュベートした後、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を最終濃度０．１％となるように更に添加し、ボルテックスにより充分に混合した。
各試料溶液２０μＬをチップカラムに通流させた。続いて、チップカラムを、２５％アセトニトリル含有の５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）緩衝液２００μＬで３回洗浄した後、蒸留水で１回洗浄した。最後は完全に水気を取り除いた。
なお、比較例として、２５％アセトニトリル含有の５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）緩衝液の代わりに、０．５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ、２０ｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ含有の洗浄液を用いた場合についても、同時に評価した。
なお、比較例として、２５％アセトニトリル含有の５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）緩衝液の代わりに、０．５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ、２０ｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ含有の洗浄液を用いた場合についても、同時に評価した。
チップカラムのフィルター部分を切断し、蒸留水５０μＬにより、ビーズをそれぞれ９６ウェル エンドトキシンフリープレート（製品名：トキシペット プレート ＬＰ、生化学バイオビジネス製）の各ウェルに押し出した。
各ウェルに、市販のエンドトキシン測定用試薬（ＬＡＬ試薬）５０μＬを加え、更にジアゾ化試薬を加えアゾ色素に変換し、吸光度計［５４５ｎｍ（対象波長６３０ｎｍ）］にて測定した。
各ウェルに、市販のエンドトキシン測定用試薬（ＬＡＬ試薬）５０μＬを加え、更にジアゾ化試薬を加えアゾ色素に変換し、吸光度計［５４５ｎｍ（対象波長６３０ｎｍ）］にて測定した。
添加ＬＰＳと実測ＬＰＳの関係を図３に、図３から算出したＬＰＳ回収率の結果を図４に、それぞれ、示す。なお、図３及び図４において、黒菱形は、アセトニトリル含有洗浄液（本発明）の結果を示し、白抜き四角は、ＮａＣｌ含有洗浄液（比較例）の結果を示す。
０．５Ｍ ＮａＣｌ含有溶液で洗浄したときは全く測定することができなかったが、有機溶媒含有溶液で洗浄することにより、ＬＰＳ回収率がほぼ１００％前後であり、低濃度のＬＰＳを効率よく測定できることが示された。
また、血漿にＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を添加することによって、血漿中のＬＰＳ定量を可能にできることが示された。
ビーズに非特異的に結合していた脂質等のＬＡＬの反応阻害物質がアセトニトリルで綺麗に洗浄できたため、測定が可能になったと考えられる。
０．５Ｍ ＮａＣｌ含有溶液で洗浄したときは全く測定することができなかったが、有機溶媒含有溶液で洗浄することにより、ＬＰＳ回収率がほぼ１００％前後であり、低濃度のＬＰＳを効率よく測定できることが示された。
また、血漿にＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を添加することによって、血漿中のＬＰＳ定量を可能にできることが示された。
ビーズに非特異的に結合していた脂質等のＬＡＬの反応阻害物質がアセトニトリルで綺麗に洗浄できたため、測定が可能になったと考えられる。
本発明の分析方法は、エンドトキシン測定の用途に適用することができる。
配列表の配列番号１〜３の配列で表される各アミノ酸配列は、リポ多糖及び／又はリピッドＡ結合ペプチドである。
配列表の配列番号１の配列で表される各アミノ酸配列における１番目及び１０番目の各アミノ酸「Xaa」は、それぞれ独立に、リジン、アルギニン、又はヒスチジンを意味する。
配列表の配列番号２の配列で表される各アミノ酸配列における１番目及び１１番目の各アミノ酸「Xaa」は、それぞれ独立に、リジン、アルギニン、又はヒスチジンを意味する。
配列表の配列番号１の配列で表される各アミノ酸配列における１番目及び１０番目の各アミノ酸「Xaa」は、それぞれ独立に、リジン、アルギニン、又はヒスチジンを意味する。
配列表の配列番号２の配列で表される各アミノ酸配列における１番目及び１１番目の各アミノ酸「Xaa」は、それぞれ独立に、リジン、アルギニン、又はヒスチジンを意味する。
Claims (6)
- リポ多糖及び／又はリピッドＡ結合性ペプチドを固定化した担体を用いるリポ多糖及び／又はリピッドＡの分析方法であって、
リポ多糖及び／又はリピッドＡを含む可能性のある被検試料と、前記担体とを接触させる工程、
前記担体と未反応成分とを分離し、分離した担体を洗浄液で洗浄する工程、及び
前記担体に結合したリポ多糖及び／又はリピッドＡを分析する工程
を含み、
（ａ）前記洗浄液としてアセトニトリル含有水溶液を使用する、及び／又は
（ｂ）被検試料と担体との前記接触を、界面活性剤、還元剤、又はキレート剤の存在下で実施する
ことを特徴とする、前記分析方法。 - 前記洗浄液が、界面活性剤、還元剤、又はキレート剤を更に含有する、請求項１に記載の分析方法。
- 前記分析工程を、ＬＡＬ（limulus amebocyte lysate）法、免疫学的分析方法、あるいは、細胞又は組織を用いるエンドトキシン測定法により実施する、請求項１又は２に記載の分析方法。
- 前記被検試料が、アンチトロンビンIIIを含有する可能性のある被検試料である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の分析方法。
- 前記被検試料が血液、血漿、血清、あるいは、生体試料若しくは生物材料由来物であり、前記洗浄液としてアセトニトリル含有水溶液を使用する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の分析方法。
- 前記リポ多糖及び／又はリピッドＡ結合性ペプチドが、
配列番号１又は配列番号２で表されるアミノ酸配列、あるいは、前記アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、リポ多糖及び／又はリピッドＡ結合活性を示すペプチド、又はその誘導体
である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の分析方法。
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