リポ多糖又はリピッド A結合剤及び新規ペプチド
技術分野
[0001] 本発明は、リポ多糖 (Lipopolysaccharide; LPS)及び Z又はリピッド A結合剤及び新 規ペプチドに関する。
背景技術
[0002] LPSは、例えば、グラム陰性菌の外膜に存在し、グラム陰性菌感染時では、体内に 溶出された LPSによって敗血症が誘発されることが知られている。これは、 LPS力LB P (LPS binding protein)などの血漿中の LPS結合タンパクによって細胞膜上の TLR 4 (Toll Like Receptor
4)にリクルートされ、 NFkB (nuclear factor κ B)経路を中心とした炎症反応を誘発す ることが主な発症メカニズムである。これらは各所での炎症又は発熱を引き起こす他 、毛細血管での血液凝固(disseminated
intravascular coagulation; DIC)を誘発し、多臓器不全等、不可逆的反応によって患 者を死に至らしめる。
[0003] このため、グラム陰性菌由来の敗血症又は敗血症性ショック時に LPSに結合し、そ の毒素を中和する医薬、あるいは、体外循環用 LPS除去カラムが期待されている。 中和医薬としては、グラム陰性菌の強力な抗生物質であるポリミキシン B (polymyxin B ; PMB)が期待されていたが、腎臓毒性及び神経毒性があり、血中への投与が不 可能であった。また、抗 LPS抗体 2件について米国にて臨床試験が行われた力 い ずれも失敗に終わっている。一方、体外循環用 LPS除去カラムとしては、例えば、「ト レミキシン」(東レ社)が公知であるが、毒性を有する PMBを使用するため、製造工程 を厳格に管理する必要があり、高価であるとの欠点があった。
[0004] 一方、本明細書に記載の配列番号 9で表されるアミノ酸配列からなるペプチドは、 例えば、特許文献 1に開示された公知ペプチドである。特許文献 1には、前記べプチ ドが、ネコ由来 IgGの Fcフラグメントに対する結合活性を有することが記載されて!、る
[0005] 特許文献 1 :特開 2004— 189657号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] PMBの前記腎臓毒性及び神経毒性については、例えば、 Danner RLらによる報告
[Purincation, toxicity, and antiendotoxin activity
of polymyxin B nonapeptide., Antimicrob Agents Chemother. 1989
Sep;33(9): 1428-1434 (PMID 2554795)]がある。また、抗 LPS抗体の前記米国臨床試 験については、例えば、 Angus DCらによる報告 [E5
murine monoclonal antiendotoxin antibody in gram-negative sepsis: a randomized controlled trial. E5 Study Investigators., JAMA.2000 Apr 5;283(13): 1723— 1730 (PMID 10755499)]又は Derkx Bらによる報告 [Randomized, placebo-controlled trial of HA-1A,
a human monoclonal antibody to endotoxin, in children with meningococcal septic shock. European Pediatric Meningococcal Septic Shock Trial Study Group., Clin Infect Dis. 1999 Apr;28(4):770-777 (PMID 1082δ037)]がある。
本発明の課題は、これらの ΡΜΒ又は抗 LPS抗体に代わる、例えば、リポ多糖及び Z又はリピッド A中和剤、あるいは、リポ多糖及び Z又はリピッド A除去剤として使用 することのできる、リポ多糖及び/又はリピッド A結合剤を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0007] 前記課題は、本発明による、(1)配列番号 1で表されるアミノ酸配列、あるいは、前 記アミノ酸配列において 1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び Z又は付加された アミノ酸配列を含み、且つ、リポ多糖及び Z又はリピッド A結合活性を示すペプチド、
(2)配列番号 2で表されるアミノ酸配列、あるいは、前記アミノ酸配列において 1又は 数個のアミノ酸が欠失、置換、及び/又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、リポ 多糖及び Z又はリピッド A結合活性を示すペプチド、
(3)配列番号 3で表されるアミノ酸配列を含み、且つ、リポ多糖及び Z又はリピッド A 結合活性を示すペプチド、
(4)配列番号 4で表されるアミノ酸配列、あるいは、前記アミノ酸配列において 1又は
数個のアミノ酸が欠失、置換、及び/又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、リポ 多糖及び Z又はリピッド A結合活性を示すペプチド、
(5)配列番号 5で表されるアミノ酸配列、あるいは、前記アミノ酸配列において 1又は 数個のアミノ酸が欠失、置換、及び/又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、リポ 多糖及び/又はリピッド A結合活性を示すペプチド、又は
(6)配列番号 6で表されるアミノ酸配列を含み、且つ、リポ多糖及び Z又はリピッド A 結合活性を示すペプチド、あるいは、
前記ペプチド(1)〜(6)の誘導体
を有効成分として含む、リポ多糖及び/又はリピッド A結合剤により解決することがで きる。
[0008] 本発明は、前記ペプチド(1)〜(6)又はその誘導体を有効成分として含む、リポ多 糖及び Z又はリピッド A除去剤に関する。
本発明は、前記ペプチド(1)〜(6)若しくはその誘導体、前記ペプチド(1)〜(6)を コードするポリヌクレオチド、又は前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを有効成 分として含む、リポ多糖及び Z又はリピッド A中和剤(例えば、敗血症治療剤)に関す る。
[0009] 本発明は、前記ペプチド(1)〜(6)又はその誘導体と、リポ多糖及び Z又はリピッド Aとを接触させる工程を含む、リポ多糖及び Z又はリピッド Aの結合方法に関する。 本発明は、リポ多糖及び Z又はリピッド Aを含む可能性のある処理対象と、前記べ プチドひ)〜(6)又はその誘導体とを接触させる工程、及びリポ多糖及び Z又はリピ ッド Aと複合体を形成した前記ペプチド又は誘導体と、前記処理対象とを分離するェ 程を含む、リポ多糖及び Z又はリピッド Aの除去方法に関する。
本発明は、前記ペプチド(1)〜(6)若しくはその誘導体、前記ペプチド(1)〜(6)を コードするポリヌクレオチド、又は前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを、リポ多 糖及び Z又はリピッド A中和の必要な対象に、有効量で投与することを含む、リポ多 糖及び Z又はリピッド A中和方法 (例えば、敗血症治療方法)に関する。
[0010] 本発明は、前記ペプチド(1)〜(6)又はその誘導体の、リポ多糖及び Z又はリピッ ド A中和剤を製造するための使用に関する。
本発明は、前記ペプチド(1)〜(6)又はその誘導体の、リポ多糖及び Z又はリピッ ド A除去剤を製造するための使用に関する。
本発明は、前記ペプチド(1)〜(6)若しくはその誘導体、前記ペプチド(1)〜(6)を コードするポリヌクレオチド、又は前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターの、リポ多 糖及び Z又はリピッド A中和剤(例えば、敗血症治療剤)を製造するための使用に関 する。
本発明は、(1)配列番号 1で表されるアミノ酸配列、あるいは、前記アミノ酸配列に おいて 1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び Z又は付加されたアミノ酸配列を含 み、且つ、リポ多糖及び/又はリピッド A結合活性を示すペプチド、
(2)配列番号 2で表されるアミノ酸配列、あるいは、前記アミノ酸配列において 1又は 数個のアミノ酸が欠失、置換、及び/又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、リポ 多糖及び Z又はリピッド A結合活性を示すペプチド、
(3)配列番号 3で表されるアミノ酸配列を含み、且つ、リポ多糖及び Z又はリピッド A 結合活性を示すペプチド、
(4)配列番号 4で表されるアミノ酸配列、あるいは、前記アミノ酸配列において 1又は 数個のアミノ酸が欠失、置換、及び/又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、リポ 多糖及び Z又はリピッド A結合活性を示すペプチド、
(5)配列番号 5で表されるアミノ酸配列、あるいは、前記アミノ酸配列において 1又は 数個のアミノ酸が欠失、置換、及び/又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、リポ 多糖及び Z又はリピッド A結合活性を示すペプチド、並びに
(6)配列番号 6で表されるアミノ酸配列を含み、且つ、リポ多糖及び Z又はリピッド A 結合活性を示すペプチド
からなる群から選んだペプチド (但し、配列番号 9で表されるアミノ酸配列力 なるぺ プチドを除く)又はその誘導体に関する。
本発明は、前記ペプチド(1)〜(6) (但し、配列番号 9で表されるアミノ酸配列から なるペプチドを除く)をコードするポリヌクレオチドに関する。
本発明は、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターに関する。
本発明は、前記ペプチド(1)〜(6) (但し、配列番号 9で表されるアミノ酸配列から
なるペプチドを除く)若しくはその誘導体、前記ペプチドをコードするポリヌクレオチド 、又は前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターと、薬剤学的若しくは獣医学的に許 容することのできる通常の担体又は希釈剤とを含む、医薬組成物に関する。
[0012] 本発明は、前記ペプチド(1)〜(6)又はその誘導体を用いることを特徴とする、リポ 多糖及び Z又はリピッド Aの分析方法に関する。
前記分析方法の好ま 、態様によれば、リポ多糖及び Z又はリピッド Aを含む可能 性のある被検試料と、前記ペプチド(1)〜(6)又はその誘導体とを接触させる工程、 前記ペプチド又は誘導体に結合したリポ多糖及び Z又はリピッド Aを分析する工程を 含む。
[0013] 本発明は、前記ペプチド(1)〜(6)又はその誘導体を用いることを特徴とする、ダラ ム陰性菌の検出方法に関する。
前記検出方法の好まし 、態様によれば、グラム陰性菌を含む可能性のある被検試 料と、前記ペプチド(1)〜(6)又はその誘導体とを接触させる工程、前記ペプチド又 は誘導体に結合したグラム陰性菌を分析する工程を含む。
発明の効果
[0014] 本発明によれば、新規のリポ多糖及び/又はリピッド A結合剤を提供することがで きる。また、本発明のリポ多糖及び/又はリピッド A結合剤は、例えば、リポ多糖及び Z又はリピッド A除去剤又はリポ多糖及び Z又はリピッド A中和剤として使用すること ができる。
発明を実施するための最良の形態
[0015] 本発明のリポ多糖及び Z又はリピッド A結合剤は、有効成分として、
(1)配列番号 1で表されるアミノ酸配列、あるいは、前記アミノ酸配列において 1又は 数個のアミノ酸が欠失、置換、及び/又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、リポ 多糖及び Z又はリピッド A結合活性を示すペプチド、
(2)配列番号 2で表されるアミノ酸配列、あるいは、前記アミノ酸配列において 1又は 数個のアミノ酸が欠失、置換、及び/又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、リポ 多糖及び Z又はリピッド A結合活性を示すペプチド、
(3)配列番号 3で表されるアミノ酸配列を含み、且つ、リポ多糖及び Z又はリピッド A
結合活性を示すペプチド、
(4)配列番号 4で表されるアミノ酸配列、あるいは、前記アミノ酸配列において 1又は 数個のアミノ酸が欠失、置換、及び/又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、リポ 多糖及び Z又はリピッド A結合活性を示すペプチド、
(5)配列番号 5で表されるアミノ酸配列、あるいは、前記アミノ酸配列において 1又は 数個のアミノ酸が欠失、置換、及び/又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、リポ 多糖及び Z又はリピッド A結合活性を示すペプチド、
(6)配列番号 6で表されるアミノ酸配列を含み、且つ、リポ多糖及び Z又はリピッド A 結合活性を示すペプチド、
あるいは、前記ペプチド(1)〜(6)の誘導体
を含む。
[0016] 以下、本発明において有効成分として用いることのできる前記ペプチド(1)〜(6) 及びそれらの誘導体を総称して「リポ多糖及び Z又はリピッド A結合ペプチド」と称す る。なお、本明細書における用語「ペプチド」には、オリゴペプチド及びポリペプチド の両方が含まれる。
[0017] 本明細書において「リポ多糖及び Z又はリピッド A結合活性」とは、リポ多糖 (Lipopo lysaccharide; LPS)又はリピッド Aの少なくとも一方に特異的に結合することのできる 活性を意味し、好ましくは、リポ多糖及びリピッド Aの両方を認識して結合する活性を 意味する。リポ多糖は、多糖部分とリン脂質部分 (すなわち、リピッド A)とからなり、糖 鎖部分が菌種又は菌株によって多様性があるのに対して、リピッド A部分は菌種又は 菌株でほぼ同一構造を有する。また、リピッド A部分は、リポ多糖毒性の中心的役割 を果たしている。
[0018] 或るペプチドがリポ多糖及び Z又はリピッド A結合活性を有する力否かは、公知方 法により容易に判定することができる。例えば、リポ多糖又はリピッド A (好ましくはリピ ッド A、又はリポ多糖とリピッド Aとの組合せ)を適当な担体 (例えば、 ELISAプレート 又はビーズ担体)に固定ィ匕し、前記リポ多糖への結合の有無を分析する方法 (例え ば、後述の実施例 1又は実施例 3参照)、あるいは、表面プラズモン共鳴 (surface pla smon resonance ; SPR)に基づく方法 [例えば、ビアコア(BIACORE)システム(例えば
、 BIACORE
2000; BIACORE社)を用いる方法]により、或るペプチドがリポ多糖及び/又はリピッ ド A結合活性を有するか否かを容易に判定することができる。
[0019] 本発明にお ヽて、前記リポ多糖及び/又はリピッド A結合ペプチドを構成するァミノ 酸残基数は、リポ多糖及び Z又はリピッド A結合活性を示す限り、特に限定されるも のではないが、例えば、 5〜: L00個、好ましくは 5〜61個、より好ましくは 5〜37個、よ り好ましくは 5〜25個、特に好ましくは 5〜13個である。前記アミノ酸配列は、それ単 独でリポ多糖及び Z又はリピッド A結合活性を示すアミノ酸配列(基本配列)のみから なることもできるし、その繰り返し配列力もなることもできる。繰り返し配列からなる場合 には、 1種類の基本配列のみの繰り返し配列であることもできるし、 2種類以上の基本 配列の組合せであることもできる。基本配列を繰り返すことにより、結合力を増大させ ることができる。また、結合力が弱い場合でも、ポリリジンのような反応性の高い側鎖を 高密度且つ近接して持つ支持体を用いて本ペプチドを固定ィ匕し、マルチ化すること で結合力を高める事ができると考えられる。このマルチ化については Fassina, Gらの I gG精製カラムを作成した方法 [Fassina G et al, Protein A mimetic
peptide ligand for affinity purification of antibodies. J. Mol. Recognit 199b,
9(5-6), 564-569]などを参考として挙げることができる。
[0020] 前記リポ多糖及び Z又はリピッド A結合ペプチド(1)、すなわち、「配列番号 1で表 されるアミノ酸配列、あるいは、前記アミノ酸配列において 1又は数個のアミノ酸が欠 失、置換、及び Z又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、リポ多糖及び Z又はリ ピッド A結合活性を示すペプチド」には、例えば、
配列番号 1で表されるアミノ酸配列力 なるペプチド;
配列番号 1で表されるアミノ酸配列の N末端及び Z又は C末端に、適当なアミノ酸配 列が付加されたアミノ酸配列カゝらなり、且つリポ多糖及び/又はリピッド A結合活性を 示すペプチド;又は
配列番号 1で表されるアミノ酸配列において 1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及 び/又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、リポ多糖及び/又はリピッド A結合 活性を示すペプチド
が含まれる。
[0021] 本明細書において、ペプチドの機能を維持するために置換されるアミノ酸は、置換 前のアミノ酸と似た性質を有するアミノ酸であることが好ましい。例えば、以下に示す ような各グループに属するアミノ酸は、そのグループ内で互いに似た性質を有するァ ミノ酸である。これらのアミノ酸をグループ内の他のアミノ酸に置換しても、タンパク質 の本質的な機能は損なわれないことが多い。このようなアミノ酸の置換は、保存的置 換と呼ばれ、ポリペプチドの機能を保持しつつアミノ酸配列を変換するための手法と して公知である。
非極性アミノ酸: Ala、 Val、 Leu、 Ile、 Pro, Met, Phe、及び Trp
非荷電性アミノ酸: Gly、 Ser、 Thr、 Cys、 Tyr、 Asn、及び Gin
酸性アミノ酸: Asp及び Glu
塩基性アミノ酸: Lys、 Arg、及び His
[0022] 配列番号 1で表されるアミノ酸配列には、配列番号 1で表されるアミノ酸配列におけ る 1番目及び 11番目の各アミノ酸 Xが、それぞれ独立して、塩基性アミノ酸 K、 R、又 は Hである配列、すなわち、
KNYSSSISSIKA (配列番号 7)
KNYSSSISSIRA (配列番号 8)
KNYSSSISSIHA (配列番号 9)
RNYSSSISSIKA (配列番号 10)
RNYSSSISSIRA (配列番号 11)
RNYSSSISSIHA (配列番号 12)
HNYSSSISSIKA (配列番号 13)
HNYSSSISSIRA (配列番号 14)
HNYSSSISSIHA (配列番号 15)
が含まれる。
[0023] 配列番号 9で表されるアミノ酸配列からなるペプチドは、例えば、特開 2004-189657 号公報に開示された公知ペプチドであり、後述の実施例に示すように、リポ多糖及び Z又はリピッド A結合活性を示すペプチドである。なお、特開 2004-189657号公報に
は、前記ペプチドが、ネコ由来 IgGの Fcフラグメントに対する結合活性を有することが 記載されて ヽるが、リポ多糖及び Z又はリピッド A結合活性に関する記載はな ヽ。
[0024] 「配列番号 1で表されるアミノ酸配列の N末端及び Z又は C末端 (好ましくは C末端) に、適当なアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列力もなり、且つリポ多糖及び Z又は リピッド A結合活性を示すペプチド」において、 N末端及び/又は C末端に付加する ことができる前記アミノ酸配列としては、例えば、リンカ一配列、マーカー配列、ポリべ プチド配列、又は別のリポ多糖及び Z又はリピッド A結合ペプチド配列を挙げること ができる。
[0025] 前記リンカ一配列としては、例えば、ペプチドを担体に担持させるための配列、例え ば、チオール基を有するアミノ酸 [例えば、システィン (L体システィン又は D体システ イン)又はホモシスティン)又はアミノ基と反応しな 、官能基 (例えば、マレイミド基)を 側鎖に有するアミノ酸 1個からなるリンカ一配列、あるいは、少なくとも一方の末端が、 チオール基を有するアミノ酸又はアミノ基と反応しない官能基を有するアミノ酸である リンカ一配列を挙げることができる。
[0026] 前記マーカー配列としては、例えば、ペプチドの発現の確認、細胞内局在の確認、 あるいは、精製等を容易に行なうための配列を用いることができ、例えば、 FLAGタ グ、へキサーヒスチジン'タグ、へマグルチニン'タグ、又は mycェピトープ、あるいは、 GGLLLLLLL (酉己歹 U番号 125)
力もなるペプチドなどを挙げることができる。配列番号 125からなる前記ペプチドの C 末端カルボキシル基は、そのままでも、あるいは、アミドィ匕することもできる。
[0027] 前記ポリペプチド配列としては、例えば、精製用ポリペプチド [例えば、ダルタチォ ン S—トランスフェラーゼ (GST)の全部又は一部]、検出用ポリペプチド [例えば、へ ムァダルチュン又は j8—ガラクトシダーゼ aペプチド (LacZ a )の全部又は一部]、 又は発現用ポリペプチド (例えば、シグナル配列)などを挙げることができる。
[0028] 「配列番号 1で表されるアミノ酸配列の N末端及び Z又は C末端 (好ましくは C末端) に、適当なアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列力もなり、且つリポ多糖及び Z又は リピッド A結合活性を示すペプチド」としては、例えば、
XNYSSSISSIXAC (配列番号 16)
力もなるペプチドを挙げることができる。
なお、配列番号 16で表されるアミノ酸配列における 1番目のアミノ酸 Xは、塩基性ァ ミノ酸 K、 R、又は H (好ましくは K)であり、 11番目のアミノ酸 Xは、塩基性アミノ酸 K、 R、又は H (好ましくは R又は H、より好ましくは R)である。
[0029] 「配列番号 1で表されるアミノ酸配列において 1又は数個(好ましくは 1〜: LO個、より 好ましくは 1〜8個、更に好ましくは 1〜6個、更に好ましくは 1〜4個、更に好ましくは 1〜3個、更に好ましくは 1又は 2個、特に好ましくは 1個)のアミノ酸が欠失、置換、及 び/又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、リポ多糖及び/又はリピッド A結合 活性を示すペプチド」としては、例えば、以下に詳述する、前記リポ多糖及び Z又は リピッド A結合ペプチド(2)〜(6)を挙げることができる。
[0030] 前記リポ多糖及び Z又はリピッド A結合ペプチド(2)、すなわち、「配列番号 2で表 されるアミノ酸配列、あるいは、前記アミノ酸配列において 1又は数個のアミノ酸が欠 失、置換、及び Z又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、リポ多糖及び Z又はリ ピッド A結合活性を示すペプチド」には、例えば、
配列番号 2で表されるアミノ酸配列力 なるペプチド;
配列番号 2で表されるアミノ酸配列の N末端及び Z又は C末端に、適当なアミノ酸配 列が付加されたアミノ酸配列カゝらなり、且つリポ多糖及び/又はリピッド A結合活性を 示すペプチド;又は
配列番号 2で表されるアミノ酸配列において 1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及 び/又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、リポ多糖及び/又はリピッド A結合 活性を示すペプチド
が含まれる。
[0031] 配列番号 2で表されるアミノ酸配列は、配列番号 1で表されるアミノ酸配列における 1番目〜6番目のアミノ酸力もなる配列である。配列番号 2で表されるアミノ酸配列に は、配列番号 2で表されるアミノ酸配列における 1番目のアミノ酸 X力 塩基性アミノ酸 K、 R、又は Hである配列、すなわち、
KNYSSS (配列番号 17)
RNYSSS (配列番号 18)
HNYSSS (配列番号 19)
が含まれる。
[0032] 「配列番号 2で表されるアミノ酸配列の N末端及び Z又は C末端 (好ましくは C末端) に、適当なアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列力もなり、且つリポ多糖及び Z又は リピッド A結合活性を示すペプチド」において、 N末端及び/又は C末端に付加する ことができる前記アミノ酸配列としては、例えば、リポ多糖及び Z又はリピッド A結合べ プチド(1)において先述した、リンカ一配列、マーカー配列、ポリペプチド配列、又は 別のリポ多糖及び/又はリピッド A結合ペプチド配列を挙げることができる。
[0033] 「配列番号 2で表されるアミノ酸配列の N末端及び Z又は C末端 (好ましくは C末端) に、適当なアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列力もなり、且つリポ多糖及び Z又は リピッド A結合活性を示すペプチド」としては、例えば、
XNYSSSI (配列番号 20)
XNYSSSIS (配列番号 21)
XNYSSSISS (配列番号 22)
XNYSSSISSI (配列番号 23)
XNYSSSISSIX (配列番号 24)
XNYSSSISSIXA (配列番号 1)
からなるペプチド、又は、これらのアミノ酸配列 (若しくは配列番号 2で表されるァミノ 酸配列)の C末端に、更に Cが付加された
XNYSSSC (配列番号 25)
XNYSSSIC (配列番号 26)
XNYSSSISC (配列番号 27)
XNYSSSISSC (配列番号 28)
XNYSSSISSIC (配列番号 29)
XNYSSSISSIXC (配列番号 30)
XNYSSSISSIXAC (配列番号 16)
力もなるペプチドを挙げることができる。
なお、これらのアミノ酸配列における 1番目のアミノ酸 Xは、塩基性アミノ酸 K、 R、又
は H (好ましくは K)であり、 11番目のアミノ酸 Xは、塩基性アミノ酸 K、 R、又は H (好ま しくは R又は H、より好ましくは R)である。
[0034] 「配列番号 2で表されるアミノ酸配列において 1又は数個(好ましくは 1〜: LO個、より 好ましくは 1〜8個、更に好ましくは 1〜6個、更に好ましくは 1〜4個、更に好ましくは 1〜3個、更に好ましくは 1又は 2個、特に好ましくは 1個)のアミノ酸が欠失、置換、及 び/又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、リポ多糖及び/又はリピッド A結合 活性を示すペプチド」としては、例えば、
NYSSS (配列番号 31)
を含み、且つ、リポ多糖及び Z又はリピッド A結合活性を示すペプチド、例えば、
NYSSS (配列番号 31)
NYSSSI (配列番号 32)
NYSSSIS (配列番号 33)
NYSSSISS (配列番号 34)
NYSSSISSI (配列番号 35)
NYSSSISSIX (配列番号 36)
NYSSSISSIXA (配列番号 37)
からなるペプチド、又は、これらのアミノ酸配列の C末端に、更に Cが付加された
NYSSSC (配列番号 38)
NYSSSIC (配列番号 39)
NYSSSISC (配列番号 40)
NYSSSISSC (配列番号 41)
NYSSSISSIC (配列番号 42)
NYSSSISSIXC (配列番号 43)
NYSSSISSIXAC (配列番号 44)
力もなるペプチドを挙げることができる。
なお、これらのアミノ酸配列における 10番目のアミノ酸 Xは、塩基性アミノ酸 K、 R、 又は H (好ましくは R又は H、より好ましくは R)である。
[0035] 前記リポ多糖及び Z又はリピッド A結合ペプチド(3)、すなわち、「配列番号 3で表
されるアミノ酸配列を含み、且つ、リポ多糖及び/又はリピッド A結合活性を示すぺプ チド」には、例えば、
配列番号 3で表されるアミノ酸配列力 なり、且つリポ多糖及び Z又はリピッド A結合 活性を示すペプチド;又は
配列番号 3で表されるアミノ酸配列の N末端及び Z又は C末端に、適当なアミノ酸配 列が付加されたアミノ酸配列カゝらなり、且つリポ多糖及び/又はリピッド A結合活性を 示すペプチド
が含まれる。
[0036] 配列番号 3で表されるアミノ酸配列には、配列番号 3で表されるアミノ酸配列におけ る 1番目及び 11番目の各アミノ酸 Xが、それぞれ独立して、塩基性アミノ酸 K、 R、又 は Hである配列、すなわち、
KXXXXXXXXXK (配列番号 45)
KXXXXXXXXXR (配列番号 46)
KXXXXXXXXXH (配列番号 47)
RXXXXXXXXXK (配列番号 48)
RXXXXXXXXXR (配列番号 49)
RXXXXXXXXXH (配列番号 50)
HXXXXXXXXXK (配列番号 51 )
HXXXXXXXXXR (配列番号 52)
HXXXXXXXXXH (配列番号 53)
が含まれる。
なお、これらのアミノ酸配列における各アミノ酸 X(すなわち、 2番目〜 10番目のアミ ノ酸 X)は、それぞれ独立して、任意のアミノ酸である。
[0037] 「配列番号 3で表されるアミノ酸配列の N末端及び Z又は C末端に、適当なアミノ酸 配列が付加されたアミノ酸配列カゝらなり、且つリポ多糖及び/又はリピッド A結合活性 を示すペプチド」としては、例えば、配列番号 3で表されるアミノ酸配列の C末端に、 更に A、 C、又は ACが付加された
XXXXXXXXXXXA (配列番号 54)
XXXXXXXXXXXC (配列番号 55)
XXXXXXXXXXXAC (配列番号 56)
力もなるペプチドを挙げることができる。
なお、これらのアミノ酸配列における 1番目のアミノ酸 Xは、塩基性アミノ酸 K、 R、又 は H (好ましくは K)であり、 11番目のアミノ酸 Xは、塩基性アミノ酸 K、 R、又は H (好ま しくは R又は H、より好ましくは R)であり、残る各アミノ酸 X(すなわち、 2番目〜 10番 目のアミノ酸 X)は、それぞれ独立して、任意のアミノ酸である。また、 2番目〜: LO番目 のアミノ酸力 なる配列は、好ましくは、
NYSSSISSI (配列番号 57)
である。
[0038] 前記リポ多糖及び Z又はリピッド A結合ペプチド (4)、すなわち、「配列番号 4で表 されるアミノ酸配列、あるいは、前記アミノ酸配列において 1又は数個のアミノ酸が欠 失、置換、及び Z又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、リポ多糖及び Z又はリ ピッド A結合活性を示すペプチド」には、例えば、
配列番号 4で表されるアミノ酸配列力 なるペプチド;
配列番号 4で表されるアミノ酸配列の N末端及び Z又は C末端に、適当なアミノ酸配 列が付加されたアミノ酸配列カゝらなり、且つリポ多糖及び/又はリピッド A結合活性を 示すペプチド;又は
配列番号 4で表されるアミノ酸配列において 1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及 び/又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、リポ多糖及び/又はリピッド A結合 活性を示すペプチド
が含まれる。
[0039] 配列番号 4で表されるアミノ酸配列は、配列番号 1で表されるアミノ酸配列にお!、て 2番目の Nが欠失した配列である。配列番号 4で表されるアミノ酸配列には、配列番 号 4で表されるアミノ酸配列における 1番目及び 10番目の各アミノ酸 Xが、それぞれ 独立して、塩基性アミノ酸 K、 R、又は Hである配列、すなわち、
KYSSSISSIKA (配列番号 58)
KYSSSISSIRA (配列番号 59)
KYSSSISSIHA (配列番号 60)
RYSSSISSIKA (配列番号 61)
RYSSSISSIRA (配列番号 62)
RYSSSISSIHA (配列番号 63)
HYSSSISSIKA (配列番号 64)
HYSSSISSIRA (配列番号 65)
HYSSSISSIHA (配列番号 66)
が含まれる。
[0040] 「配列番号 4で表されるアミノ酸配列の N末端及び Z又は C末端 (好ましくは C末端) に、適当なアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列力もなり、且つリポ多糖及び Z又は リピッド A結合活性を示すペプチド」としては、例えば、
XYSSSISSIXAC (配列番号 67)
力もなるペプチドを挙げることができる。
なお、配列番号 67で表されるアミノ酸配列における 1番目のアミノ酸 Xは、塩基性ァ ミノ酸 K、 R、又は H (好ましくは K)であり、 10番目のアミノ酸 Xは、塩基性アミノ酸 Κ、 R、又は H (好ましくは R又は H、より好ましくは R)である。
[0041] 「配列番号 4で表されるアミノ酸配列において 1又は数個(好ましくは 1〜: LO個、より 好ましくは 1〜8個、更に好ましくは 1〜6個、更に好ましくは 1〜4個、更に好ましくは 1〜3個、更に好ましくは 1又は 2個、特に好ましくは 1個)のアミノ酸が欠失、置換、及 び/又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、リポ多糖及び/又はリピッド A結合 活性を示すペプチド」としては、例えば、前記リポ多糖及び Z又はリピッド A結合ぺプ チド(1)〜(3)、(5)、又は (6)を挙げることができ、特には、以下に詳述するリポ多糖 及び Z又はリピッド A結合ペプチド(5)又は(6)を挙げることができる。
[0042] 前記リポ多糖及び Z又はリピッド A結合ペプチド(5)、すなわち、「配列番号 5で表 されるアミノ酸配列、あるいは、前記アミノ酸配列において 1又は数個のアミノ酸が欠 失、置換、及び Z又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、リポ多糖及び Z又はリ ピッド A結合活性を示すペプチド」には、例えば、
配列番号 5で表されるアミノ酸配列力 なるペプチド;
配列番号 5で表されるアミノ酸配列の N末端及び Z又は C末端に、適当なアミノ酸配 列が付加されたアミノ酸配列カゝらなり、且つリポ多糖及び/又はリピッド A結合活性を 示すペプチド;又は
配列番号 5で表されるアミノ酸配列において 1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及 び/又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、リポ多糖及び/又はリピッド A結合 活性を示すペプチド
が含まれる。
[0043] 配列番号 5で表されるアミノ酸配列は、配列番号 4で表されるアミノ酸配列における 1番目〜5番目のアミノ酸力もなる配列である。配列番号 5で表されるアミノ酸配列に は、配列番号 5で表されるアミノ酸配列における 1番目のアミノ酸 Xが、塩基性アミノ酸 K、 R、又は Hである配列、すなわち、
KYSSS (配列番号 68)
RYSSS (配列番号 69)
HYSSS (配列番号 70)
が含まれる。
[0044] 「配列番号 5で表されるアミノ酸配列の N末端及び Z又は C末端 (好ましくは C末端) に、適当なアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列力もなり、且つリポ多糖及び Z又は リピッド A結合活性を示すペプチド」において、 N末端及び/又は C末端に付加する ことができる前記アミノ酸配列としては、例えば、リポ多糖及び Z又はリピッド A結合べ プチド(1)において先述した、リンカ一配列、マーカー配列、ポリペプチド配列、又は 別のリポ多糖及び/又はリピッド A結合ペプチド配列を挙げることができる。
[0045] 「配列番号 5で表されるアミノ酸配列の N末端及び Z又は C末端 (好ましくは C末端) に、適当なアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列力もなり、且つリポ多糖及び Z又は リピッド A結合活性を示すペプチド」としては、例えば、
XYSSSI (配列番号 71)
XYSSSIS (配列番号 72)
XYSSSISS (配列番号 73)
XYSSSISSI (配列番号 74)
XYSSSISSIX (配列番号 75)
XYSSSISSIXA (配列番号 4)
からなるペプチド、又は、これらのアミノ酸配列 (若しくは配列番号 5で表されるァミノ 酸配列)の C末端に、更に Cが付加された
XYSSSC (配列番号 76)
XYSSSIC (配列番号 77)
XYSSSISC (配列番号 78)
XYSSSISSC (配列番号 79)
XYSSSISSIC (配列番号 80)
XYSSSISSIXC (配列番号 81)
XYSSSISSIXAC (配列番号 82)
力もなるペプチドを挙げることができる。
なお、これらのアミノ酸配列における 1番目のアミノ酸 Xは、塩基性アミノ酸 K、 R、又 は H (好ましくは K)であり、 10番目のアミノ酸 Xは、塩基性アミノ酸 K、 R、又は H (好ま しくは R又は H、より好ましくは R)である。
「配列番号 5で表されるアミノ酸配列において 1又は数個(好ましくは 1〜: LO個、より 好ましくは 1〜8個、更に好ましくは 1〜6個、更に好ましくは 1〜4個、更に好ましくは 1〜3個、更に好ましくは 1又は 2個、特に好ましくは 1個)のアミノ酸が欠失、置換、及 び/又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、リポ多糖及び/又はリピッド A結合 活性を示すペプチド」としては、例えば、
YSSS (配列番号 83)
を含み、且つ、リポ多糖及び Z又はリピッド A結合活性を示すペプチド、例えば、
YSSS (配列番号 83)
YSSSI (配列番号 84)
YSSSIS (配列番号 85)
YSSSISS (配列番号 86)
YSSSISSI (配列番号 87)
YSSSISSIX (配列番号 88)
YSSSISSIXA (配列番号 89)
からなるペプチド、又は、これらのアミノ酸配列の C末端に、更に Cが付加された
YSSSC (配列番号 90)
YSSSIC (配列番号 91)
YSSSISC (配列番号 92)
YSSSISSC (配列番号 93)
YSSSISSIC (配列番号 94)
YSSSISSIXC (配列番号 95)
YSSSISSIXAC (配列番号 96)
力もなるペプチドを挙げることができる。
なお、これらのアミノ酸配列における 9番目のアミノ酸 Xは、塩基性アミノ酸 K、 R、又 は H (好ましくは R又は H、より好ましくは R)である。
[0047] 前記リポ多糖及び Z又はリピッド A結合ペプチド (6)、すなわち、「配列番号 6で表 されるアミノ酸配列を含み、且つ、リポ多糖及び/又はリピッド A結合活性を示すぺプ チド」には、例えば、
配列番号 6で表されるアミノ酸配列力 なり、且つリポ多糖及び Z又はリピッド A結合 活性を示すペプチド;又は
配列番号 6で表されるアミノ酸配列の N末端及び Z又は C末端に、適当なアミノ酸配 列が付加されたアミノ酸配列カゝらなり、且つリポ多糖及び/又はリピッド A結合活性を 示すペプチド
が含まれる。
[0048] 配列番号 6で表されるアミノ酸配列には、配列番号 6で表されるアミノ酸配列におけ る 1番目及び 10番目の各アミノ酸 Xが、それぞれ独立して、塩基性アミノ酸 K、 R、又 は Hである配列、すなわち、
KXXXXXXXXK (配列番号 97)
KXXXXXXXXR (配列番号 98)
KXXXXXXXXH (配列番号 99)
RXXXXXXXXK (配列番号 100)
RXXXXXXXXR (配列番号 9)
RXXXXXXXXH (配列番号 102)
HXXXXXXXXK (配列番号 103)
HXXXXXXXXR (配列番号 104)
HXXXXXXXXH (配列番号 105)
が含まれる。
なお、これらのアミノ酸配列における各アミノ酸 X(すなわち、 2番目〜 9番目のァミノ 酸 X)は、それぞれ独立して、任意のアミノ酸である。
[0049] 「配列番号 6で表されるアミノ酸配列の N末端及び Z又は C末端に、適当なアミノ酸 配列が付加されたアミノ酸配列カゝらなり、且つリポ多糖及び/又はリピッド A結合活性 を示すペプチド」としては、例えば、配列番号 6で表されるアミノ酸配列の C末端に、 更に A、 C、又は ACが付加された
XXXXXXXXXXA (配列番号 106)
XXXXXXXXXXC (配列番号 107)
XXXXXXXXXXAC (配列番号 108)
力もなるペプチドを挙げることができる。
なお、これらのアミノ酸配列における 1番目のアミノ酸 Xは、塩基性アミノ酸 K、 R、又 は H (好ましくは K)であり、 10番目のアミノ酸 Xは、塩基性アミノ酸 K、 R、又は H (好ま しくは R又は H、より好ましくは R)であり、残る各アミノ酸 X(すなわち、 2番目〜 9番目 のアミノ酸 X)は、それぞれ独立して、任意のアミノ酸である。また、 2番目〜9番目の アミノ酸力もなる配列は、好ましくは、
YSSSISSI (配列番号 109)
である。
[0050] 配列番号 6で表されるアミノ酸配列において、 2番目のアミノ酸は好ましくは Yであり 、 3番目のアミン酸は好ましくは S又は Tであり、 4番目のアミン酸は好ましくは S又は T であり、 5番目のアミン酸は好ましくは S、 T、又は Iであり、 6番目のアミン酸は好ましく は I、 F、 S、又は Lであり、 7番目のアミン酸は好ましくは S又は Tであり、 8番目のアミ ン酸は好ましくは S又は Tであり、 9番目のアミン酸は好ましくは I、 F、又は Lである。こ
れらの好適アミノ酸は、任意の組合せで使用可能である。
[0051] 本発明にお 、て有効成分として用いることのできる「ペプチド(1)〜(6)の誘導体」 は、前記ペプチド(1)〜(6)の誘導体であって、且つ、リポ多糖及び Z又はリピッド A 結合活性を示す限り、特に限定されるものではない。「ペプチド(1)〜(6)の誘導体」 としては、例えば、ペプチドの安定性を向上させる各種修飾を施したペプチド誘導体 を挙げることができる。前記修飾としては、例えば、 L体アミノ酸の D体化 (例えば、 N 末端アミノ酸の D体化、 C末端アミノ酸の D体化、 N末端及び C末端以外のアミノ酸の D体化)、 N末ァミノ基のァセチル化、 C末端カルボキシル基のアミド化、天然型ァミノ 酸の(性質の類似した)非天然型アミノ酸への置換、又はこれらの組合せを挙げること ができる。
[0052] N末端アミノ酸 (L体)を D体アミノ酸に置換した誘導体としては、 D体の塩基性ァミノ 酸に置換した誘導体が好ましぐ D体リジン又は D体アルギニンに置換した誘導体が より好まし 、。
[0053] 本発明のリポ多糖及び Z又はリピッド A結合剤は、有効成分として、リポ多糖及び /又はリピッド A結合ペプチドを含む。リポ多糖及び/又はリピッド A結合ペプチドは 、リポ多糖に対する結合活性を有するため、本発明のリポ多糖及び Z又はリピッド A 結合剤は、例えば、リポ多糖及び Z又はリピッド A除去剤(例えば、体外循環用リポ 多糖除去カラム)又はリポ多糖及び Z又はリピッド A中和剤(例えば、敗血症治療剤) として使用することができる。また、本発明のリポ多糖及び Z又はリピッド A結合剤を 用いて、リポ多糖及び Z又はリピッド Aの分析 (例えば、 ELISA法、一分子蛍光測定 法、表面プラズモン共鳴法)を行うことができる。また、本発明のリポ多糖及び Z又は リピッド A結合剤は、グラム陰性菌の外膜に存在するリポ多糖に結合することから、グ ラム陰性菌 (例えば、大腸菌)の染色又は標識などに使用することができ、更には、グ ラム陰性菌の分析 (特には検出)に用いることができる。本発明のリポ多糖及び Z又 はリピッド A結合剤は、有効成分であるリポ多糖及び/又はリピッド A結合ペプチドを 、これらの用途に応じて、任意の形態で含むことができる。
[0054] 本発明のリポ多糖及び Z又はリピッド A結合剤をリポ多糖及び Z又はリピッド A除去 剤として使用する場合には、リポ多糖の除去が必要となる処理対象としては、例えば
、血漿、血清、血液、透析液、輸液、注射剤、又は各種バッファーを挙げることができ る。この場合、本発明における有効成分であるリポ多糖及び/又はリピッド A結合べ プチドは、例えば、ペプチドそれ自体を単独で、好ましくは、適当な担体に結合した 状態で使用することができる。前記担体としては、例えば、シリカビーズ、ァガロース ビーズ、セルロースビーズ、磁気ビーズ、又はガラスファイバ一等を用いることができ る。リポ多糖及び/又はリピッド A結合ペプチドと担体との結合は、例えば、ジスルフ イド結合による結合、あるいは、担体のマレイミド基を利用したマレイミド法などにより 実施することができる。
[0055] 本発明のリポ多糖及び Z又はリピッド A結合剤をリポ多糖及び Z又はリピッド A中和 剤として使用する場合には、例えば、ペプチドそれ自体を単独で、あるいは、所望に より薬剤学的若しくは獣医学的に許容することのできる通常の担体又は希釈剤と共 に、動物、好ましくは哺乳動物(特にはヒト)に投与することができる。また、この場合、 ペプチドに代えて、ペプチドをコードするポリヌクレオチド (好ましくは、前記ポリヌクレ ォチドを含む発現ベクター)を用いることもできる [例えば、 Gene Ther., Development of safe and efticient novel nonviral gene
transfer using ultrasound: enhancement of transfection efficiency of naked plasmid DNA in skeletal muscle., 2002 Mar;9(6):372- 80]。なお、本ペプチドの中和 活性は、例えば、「7.ファージディスプレイ法によるエンドトキシン研究の新戦略 鈴 木政嗣他 エンドトキシン研究 7 医学図書出版 2004、 65-72」に記載されていると おり、リポ多糖とリポ多糖及び Z又はリピッド A結合ペプチドを各濃度及び比にて混 合し、リムルス試験(リポ多糖濃度を測定する一般的方法)で確認することができる。 評価としては実際のリポ多糖濃度と実測値の解離により、本ペプチドの中和活性をィ ンビトロで確認することができる。
[0056] 本発明のリポ多糖及び Z又はリピッド A結合剤を用いてリポ多糖及び Z又はリピッド Aの分析を行う場合には、例えば、リポ多糖及び Z又はリピッド Aを含む可能性のあ る被検試料と、リポ多糖及び Z又はリピッド A結合ペプチド (好ましくは、適当な担体 に固定化したペプチド)とを接触させ、前記ペプチドに結合したリポ多糖及び/又は リピッド Aを分析することにより、被検試料中のリポ多糖及び Z又はリピッド Aの分析を
行うことができる。なお、本明細書における用語「分析」には、分析対象物質の存在の 有無を判定する「検出」と、分析対象物質の量又は活性を定量的又は半定量的に決 定する「測定」とが含まれる。
[0057] 前記担体としては、例えば、ビーズ (例えば、シリカビーズ、ァガロースビーズ、セル ロースビーズ、磁気ビーズ)、プレート(例えば、 ELISA用プレート)を挙げることがで きる。ペプチドに結合したリポ多糖及び/又はリピッド Aの分析は、例えば、市販のェ ンドトキシン測定キット(例えば、エンドスぺシ一 ES-50Mセット;生化学工業社)によ り、あるいは、リポ多糖及び Z又はリピッド Aに特異的な抗体を用いる免疫学的分析 方法により、あるいは、表面プラズモン共鳴法により実施することができる。
[0058] 本発明のリポ多糖及び Z又はリピッド A結合剤をグラム陰性菌の染色又は標識に 用いる場合は、例えば、リポ多糖及び/又はリピッド A結合ペプチドの C末端にシス ティンを付加し、そのチオール基を利用して、例えば、標識ィ匕合物(例えば、色素、 蛍光化合物、発光化合物など)、タンパク質 [例えば、酵素(例えば、ペルォキシダー ゼ)、抗体の Fc部位など]を結合させることができる。例えば、蛍光化合物としてフル ォレセイン— 5—マレイミド(Fluorescein- 5- Maleimide ; PIERCE社製)を用い、結合後 に高速液体クロマトグラフィー法等によって精製し、蛍光染色'標識用のペプチド複 合体を得ることができる。あるいは、酵素や抗体の Fc部位などの有用タンパク質にお ける標識も、スルホ SMCC (Sulfo-SMCC ;PIERCE社製)等を用い、簡便に行うこと ができる。このようにして標識したリポ多糖及び Z又はリピッド A結合ペプチドをグラム 陰性菌と混合することにより、染色'標識等が可能である。
[0059] 本発明のリポ多糖及び Z又はリピッド A結合剤を、グラム陰性菌の分析に用いる場 合には、例えば、グラム陰性菌を含む可能性のある被検試料と、リポ多糖及び Z又 はリピッド A結合ペプチド (好ましくは、適当な担体に固定ィ匕したペプチド)とを接触さ せ、前記ペプチドに結合したグラム陰性菌を分析することにより、被検試料中のダラ ム陰性菌の分析 (特には検出)を行うことができる。ペプチドに結合したグラム陰性菌 の分析は、例えば、グラム陰性菌に特異的な抗体を用いる免疫学的分析方法により 、あるいは、ペプチドに蛍光色素を融合させた蛍光による検出により、あるいは、ぺプ チドにホースラディッシュペルォキシダーゼ(HRP)又はアルカリホスファタ一ゼを融
合した酵素基質反応による検出などにより、実施することができる。
実施例
[0060] 以下、実施例によって本発明を具体的に説明する力 これらは本発明の範囲を限 定するものではない。
[0061] 《実施例 1:ファージディスプレイ法による LPS及び Z又はリピッド A結合ペプチドのス クリーニング》
本実施例では、ファージディスプレイ法により、大腸菌由来リピッド A (Lipid A; E.col i K12, D31m4く Primarily diphosporyl>;フナコシ社)及び大腸菌由来 LPS (E.coli K12 D31 m4 (Re);フナコシ社)の両方に結合性を有するペプチドのスクリーニングを 行った。
[0062] ファージディスプレイ法で用いるライブラリ一として、 Ml 3ファージの表面のマイナ 一タンパク質 pillの N末端にペプチドがランダムに呈示されるライブラリー(呈示される ランダムアミノ酸数が 7個又は 12個のペプチドライブラリー 2種類)を、 Smith,
G. P., Science, 288, 1315- 1317 (1985)、 J. K. Scott and G. P. Smith, Science, 249, 386-390(1990)、及び米国特許第 5,223,409号明細書(Ladnerら)の記載に基づいて 作製した。また、具体的な操作は、特開 2004-189657号公報の記載に準じて実施し た。
[0063] ファージライブラリーのターゲット(リピッド A又は LPS)に対する結合性は、 ELISA ( enzyme-linked immunosorbent assay)により判定した。具体的には、ターゲットの固定 化は、リピッド A又は LPSにリン酸緩衝ィ匕生理食塩水 (pH
7.4 ;以下、 PBSと称する)をカ卩え、 100 /z g/mLとなるように溶解した後、この溶液を 96ゥエルプレート [リピッド Aについては 96WELLポリソーププレート (NUNC社)。 LPS ヽては 96WELLメディソープ
プレート (NUNC社)]に 50 μ Lずつ添カ卩し、 4°Cでー晚インキュベートすることにより実 施した。標識ィ匕抗体としては、ペルォキシダーゼ標識抗 Ml 3抗体 (anti
M13 antibody HRP monoclonal conjugate; Amersham Biosceiencesネエ 使用し、酵 素基質としては 2, 2,一アジノービス(3—ェチルベンゾチアゾリン一 6—スルホン酸) 二アンモニゥム ¾_ |_2,2,— azino— bis(3— ethylbenzothiazoline—り— sulfonic
acid) diammonium salt (ABTS) ;和光純薬社]を使用した。
[0064] リピッド A及び LPSの両方に結合性を有するペプチド提示ファージについて、その ペプチドのアミノ酸配列を決定したところ、配列番号 9で表されるアミノ酸配列: KNYSSSISSIHA (配列番号 9)
が得られた。
[0065] 《実施例 2: LPS及びリピッド Aに対する結合能の確認》
本実施例では、実施例 1で得られた配列番号 9で表されるアミノ酸配列を含むぺプ チド (以下、 Li5と称する)の LPS及びリピッド Aに対する結合能を、ビアコア (BIACOR E)システム(BIACORE 2000; BIACORE社)を用いて確認した。なお、下記に記載し た緩衝液、蒸留水、実験器具等は特に記載しない限り、全てエンドトキシンフリーのも のを用いた。
[0066] 配列番号 9で表されるアミノ酸配列の C末端側にチオール基を導入するために、シ スティンを付加したアミノ酸配列:
KNYSSSISSIHAC (配列番号 110)
からなるペプチド(以下、 Li5 Cと称する)を合成した。
[0067] 合成したペプチド Li5 Cを、センサーチップ(BIACORE Sensor Chip CM5; BIACOR E社)のフローセル(以下、 Fcと称する) 2にチオールカップリングにて固定化した。コ ントロールとして、 Fclにシスティンを固定ィ匕した。比較のために、アミノ基を介して固 定ィ匕するァミンカップリングにて、 Fc4にポリミキシン B (以下、 PMBと称する)を固定 化した。また、 PMBのコントロールとして、 Fc3にエタノールアミンを固定化した。
[0068] 前記センサーチップに、リピッド A溶液及び LPS溶液 [濃度 = 100 μ g/mL, 50 μ g/m L, 25 μ g/mL, 12.5 μ g/mL;緩衝用バッファー HBS (0.01 mol/L HEPES, pH 7.4, 0.15 mol/L NaCl, 3 mmol/L EDTA) ]をアナライトとして、薄い濃度から順に 流して測定した。その結果、濃度の解離定数平均値 (KD)は、リピッド A又は LPSの いずれの場合も、ペプチド Li5
Cで 10_7〜10_9であり、ペプチド Li5 Cがリピッド A及び LPSに強く結合することが確 認された。一方、比較用として測定した PMBの結合能 (KD)は 10一7〜 10_1であり、 ペプチド Li5
Cの結合能は、現在既存の抗生物質である PMBとほぼ同等であることも同時に示さ れた。なお、解離定数の値に幅があるのは、 LPS又はリピッド Aのミセル状態などが 影響して ヽるものと考えられる。
[0069] 《実施例 3 : LPS及び Z又はリピッド A結合ペプチド固定ィ匕ビーズによる LPS除去能 の評価》
(3— 1)ペプチド Li5 Cのビーズ担体への固定ィ匕
本実施例では、酸塩化物が結合しているシリカゲル(Propionyl chloride lunctionaliz ed silica gel 200-400 mesh;シグマ'アルドリッチ社製)(以下、ビーズ担体と称する) に溶媒を加えて反応させ、最終的に C末端のシスティンのチオール基を利用してぺ プチド Li5
Cを固定ィ匕した。なお、下記に記載した緩衝液、蒸留水、実験器具等は特に記載し ない限り、全てエンドトキシンフリーのものを用いた。
[0070] 具体的には、先ず、ビーズ担体 (0.5 g)を量り取り、乾熱滅菌試験管に移し替えた。
そこに 2—ョードエタノール (和光純薬社) (1 mL)をカ卩え、ビーズ担体と結合している 酸塩ィ匕物とョードエタノールの水酸基とを反応させ、共有結合させた。その際に副生 成物として塩化水素(HC1)が発生するので、ョードエタノールが反応し副反応が起こ るのを防ぐため、ピリジン (和光純薬社)(ァミン塩基を含むもの)(100 L)を加え混ぜ た。これをパラフィルムで覆い、よく混ぜた後、穏やかに攪拌しながら、室温で 4時間 反応させた。
[0071] 反応物をェコノカラム (BIO- RAD社)に移し代え、蒸留水でよく洗浄した後、カツプリ ングバッファー(50mmol/L Tris— HC1, 5mmol/L
EDTA-2Na, pH 8.5)で平衡化した。それに、カップリングバッファーに溶解したぺプ チド Li5 C溶液 (5 mg/mL, 1 mL)をカ卩ぇ混ぜ、穏やかに攪拌しながら、室温で 3時間 放置した。ペプチド Li5
C固定ィ匕後、未反応のペプチドを洗い流すため、蒸留水でビーズ担体を洗浄し、更 に、カップリングバッファ一にて平衡化した。続いて、ブロッキングバッファー(2—メル カプトエタノーノレを 100
mmol/Lとなるようにカップリングバッファーに溶解したもの)を、平衡ィ匕したビーズ担
体に加え混ぜ、穏やかに攪拌しながら室温にて 3時間放置し、非特異的吸着を防ぐ ためのブロッキングを行なった。ブロッキング後、蒸留水で良く洗浄し、未反応のメル カプトエタノールを取り除いた。その後、 PBSで平衡ィ匕し、ビーズ担体をカラムからリ ムルス試験管 (スクリューキャップ付き)(第一化学薬品社)に移し変え、使用するまで 4°Cで保存した。
[0072] ペプチド Li5 C固定化ビーズ担体へのペプチド固定化量を、 SH基定量試薬(Ellma n' s Reagent ; PIERCE社)で定量したところ、 4. 9mgが固定化されており、 98%の固 定ィ匕効率であった。また、コントロール用ビーズ担体として、メルカプトエタノールで完 全にブロッキングしたものを調製した。
[0073] (3— 2) LPS吸着能試験
LPS溶液として、大腸菌由来 LPS (E. coli 0111:B4;フナコシ社)を PBSに溶 解(1 mg/mL)し、更に PBSで希釈することにより、 LPS溶液 (最終濃度 = 500 ng/mL )を作成した。前記実施例 3— 1で調製したペプチド Li5
C固定ィ匕ビーズ担体とコントロール用ビーズ担体にっ 、て、その分散溶液 (上清)を 完全に取り除いた。前記 LPS溶液 (2 mL)を各ビーズ担体によく混合させた後、測定 用サンプル (200 L)を回収し、別の新しい乾熱滅菌試験管に移し代えた。回収した サンプルは直ちに、卓上遠心器で数秒間遠心し、ビーズを沈殿させ、上澄みを新し い乾熱滅菌試験管に移し代えた。一方、サンプル回収後のビーズ溶液は、溶液と良 く混ぜ、穏やかに攪拌しながら、室温でインキュベートした。経時的(30分後、 60分 後)に、同様の方法でサンプリングした。
[0074] 回収したサンプル中の LPS量は、市販の測定キット(エンドスぺシ一 ES-50Mセット ;生化学工業社)を用いて測定した。その結果、コントロール (ブロッキングビーズ担体 )では、混合直後の LPS濃度と 60分後の LPS濃度とが、変わらずほぼ一定であった 。一方、ペプチド Li5
C固定ィ匕ビーズ担体では、ペプチド固定ィ匕ビーズ担体と LPS溶液とを混合した直後( 経過時間 =0分)に回収したサンプル中の LPS濃度 (A)は 384.7ng/mLであり、前記 混合から 30分間経過した後に回収したサンプル中の LPS濃度(B)は 85.2ng/mLで あった。 BZA比(0.22)から算出した LPS除去率は 78%であり、高い LPS吸着作用
が認められた。
[0075] (3— 3)ペプチド固定化量に対する LPS除去能の評価
本実施例では、ペプチド固定化量の異なるペプチド Li5 C固定ィヒビーズ担体を調 製し、それらの LPS除去能を比較した。ペプチド Li5 C固定ィ匕ビーズ担体の調製は、 ペプチド Li5 C溶液(5
mg/mL, 1 mL)の代わりに、濃度の異なる 3種類のペプチド Li5 C溶液(5 mg/mL, 0.5 mg/mL, 0.05 mg/mL)を使用すること以外は、前記実施例 3— 2に記載の手順を繰り 返した。結果を表 1に示す。表 1において、欄 Aは、ペプチド固定ィ匕ビーズ担体と LP S溶液とを混合した直後(経過時間 =0分)に回収したサンプル中の LPS濃度(単位 =ng/mL)を示し、欄 Bは、前記混合から 30分間経過した後に回収したサンプル中の LPS濃度 (単位 =ng/mL)を示す。
[0076] [表 1]
[0077] (3-4)各種条件下における LPS除去能の評価
LPS及び/又はリピッド A結合剤を用いて血中の LPSを除去する場合、血中に含 まれる可能性のある各種成分 (例えば、血清アルブミン、 IL—1 18、へパリン)の存在 下であっても、あるいは、各種条件下 (例えば、塩濃度、 LPS濃度)においても、 LPS 除去能を示すことが必要である。本実施例では、ペプチド Li5 C固定ィ匕ビーズ担体が 、種々の条件下でも、高い LPS除去能を示すことを確認した。
[0078] LPS溶液(最終濃度 = 500 ng/mL)に代えて、ゥシ血清アルブミン(BSA)含有 LPS 溶液(1% BSA, 500 ng/mL LPS)を用いること以外は、前記実施例 3— 2に記載の手 順を繰り返した。その結果、 BSAの存在は、ペプチド Li5
C固定ィ匕ビーズ担体の LPS除去能にほとんど影響を与えないことが判明した。
[0079] LPS溶液(最終濃度 = 500 ng/mL)に代えて、ヒト IL— 1 β (Pepro Tech社)含有 LP
S溶液(200 ng/mL IL— 1 β , 500
ng/mL LPS)を用いること以外は、前記実施例 3— 2に記載の手順を繰り返した。その 結果、 IL—Ι βの存在は、ペプチド Li5 C固定ィ匕ビーズ担体の LPS除去能にほとん ど影響を与えないことが判明した。また、 IL- Ι 自体は、 Li5
C固定ィ匕ビーズ担体を使用した場合に最も非特異的な吸着が見られず、 Li5 Cは特 異的に LPSを除去することが示された。
[0080] 血中の LPSを除去する体外循環カラムでは、抗凝固剤(例えば、へパリン、ナファ モスタツトメシレート等)が使用される。 LPS溶液 (最終濃度 = 500 ng/mL)に代えて、 へパリン含有 LPS溶液(1 unit/mLへパリン, 500 ng/mL LPS)を用いること以外は、 前記実施例 3— 2に記載の手順を繰り返した。その結果、へノ リンを含有しない LPS における LPS除去率が 74. 4%であるのに対して、へパリン含有 LPSにおける LPS 除去率は 45. 0%であった。通常使用濃度(1
unit/mL)のへパリンの存在は、ペプチド Li5 C固定化ビーズ担体の LPS除去能を若 干低下させたが、実用上、ほとんど問題ないことが判明した。
[0081] LPS溶液(最終濃度 = 500 ng/mL)に代えて、塩 (NaCl)含有 LPS溶液(0.25, 0.5, 又は 1 mol/L NaCl, 500 ng/mL
LPS)を用いること以外は、前記実施例 3— 2に記載の手順を繰り返した。結果を表 2 に示す。
[0082] [表 2]
大腸菌による有用タンパク質の遺伝子工学的生産において、精製タンパク質溶液 中に含有される高濃度 LPSを除去することは重要である。 LPS溶液 (最終濃度 = 500 ng/mL)に代えて、ファージ溶液 (LPS濃度 = 360 g/mL)を用いること以外は、前記 実施例 3— 2に記載の手順を繰り返した。その結果、初期濃度 360 /z gZmLの高濃
度 LPSを、 30 gZmLまで効率よく除去可能であることが判明した。
[0084] 一方、低濃度 LPS溶液から、発熱限界である lEUZmLまで LPSを除去可能な初 期 LPS濃度を検討した。 LPS溶液 (最終濃度 = 500 ng/mL)に代えて、 LPS (USP Re ference Standard Endotoxin;生化学工業社)濃度が 25、 50、及び lOOEUZmLに なるように PBSで希釈した LPS溶液を用いること以外は、前記実施例 3— 2に記載の 手順を繰り返した。その結果、初期の LPS濃度が 25EUZmLでは 5分後に 1EUZ mL以下にすることができた。なお、単位「EU」は、エンドトキシンユニット(Endotoxin Unit)の略である。
[0085] 《実施例 4:各種 LPS及び Z又はリピッド A結合ペプチドの LPS結合能の評価》
本実施例では、実施例 1で得られた配列番号 9で表されるアミノ酸配列: KNYSSSISSIHA (配列番号 9)
力もなるペプチドに関して、どのアミノ酸力 SLPS結合に関与しているかを検討するた めに、各種ペプチドを合成し、その LPS結合能を評価した。なお、本実施例で合成し たペプチドは、特に断らない限り、 C末端側にチオール基を導入するために、システ インを付加した。なお、下記に記載した緩衝液、蒸留水、実験器具等は特に記載し ない限り、全てエンドトキシンフリーのものを用いた。
[0086] (4 1)各種 LPS及び Z又はリピッド A結合ペプチドの調製
配列番号 1で表されるアミノ酸配列において、 C末端側から 1アミノ酸ずつ欠失させ たペプチドとして、以下のペプチドを合成した:
ペプチド Li5 6C :KNYSSSC (配列番号 111)
ペプチド Li5 7C :KNYSSSIC (配列番号 112)
ペプチド Li5 8C :KNYSSSISC (配列番号 113)
ペプチド Li5 9C :KNYSSSISSC (配列番号 114)
ペプチド Li5 10C :KNYSSSISSIC (配列番号 115)
ペプチド Li5 11C :KNYSSSISSIHC (配列番号 116)
[0087] 配列番号 1で表されるアミノ酸配列において、 N末端アミノ酸を欠失させたペプチド として、
ペプチド Li5 Kldel C :NYSSSISSIHAC (配列番号117)
を合成した。
[0088] 配列番号 1で表されるアミノ酸配列において、塩基性アミノ酸、すなわち、 1番目のリ ジン (K)及び 11番目のヒスチジン (H)の少なくとも一方を別の塩基性アミノ酸 (K、 R 、又は Η)に置換したペプチドとして、以下のペプチドを合成した:
ペプチド Li5 H11K C :KNYSSSISSIKAC (配列番号 118)
ペプチド Li5 !"1111?じ:1^^^3313311^^ (配列番号119)
ペプチド Li5 KIR H11R C :RNYSSSISSIRAC (配列番号 120)
ペプチド Li5 KIR C :RNYSSSISSIHAC (配列番号 121)
ペプチド Li5 K1H C :HNYSSSISSIHAC (配列番号 122)
[0089] 配列番号 1で表されるアミノ酸配列にぉ 、て、 N末端アミノ酸 (L体)を D体アミノ酸に 置換したペプチドとして、以下のペプチドを合成した:
ペプチド Li5 KldK C :配列番号 110で表されるアミノ酸配列において、 1番目の K(L 体)を D体リジンに置換したペプチド
ペプチド Li5 KldR C :配列番号 110で表されるアミノ酸配列において、 1番目の K(L 体)を D体アルギニンに置換したペプチド
ペプチド Li5 KldK H11R C :配列番号 119で表されるアミノ酸配列において、 1番目 の
K (L体)を D体リジンに置換したペプチド
ペプチド Li5 KldR H11R C :配列番号 119で表されるアミノ酸配列において、 1番目 の K(L体)を D体アルギニンに置換したペプチド
[0090] 配列番号 1で表されるアミノ酸配列において、 N末端アミノ酸をァセチルイ匕したぺプ チドとして、
ペプチド Li5 KlactylK C :配列番号 110で表されるアミノ酸配列において、 1番目の K をァセチル化したペプチド
を合成した。
[0091] 配列番号 1で表されるアミノ酸配列において、 2番目のァスパラギン (N)を欠失させ 、 11番目のヒスチジン(H)をアルギニン (R)に置換したペプチドとして、
ペプチド Li5 N2del H10R C :KYSSSISSIRAC (配列番号 123)
を合成し、更に、 1番目の K (L体)を D体リジンに置換したペプチドとして、 ペプチド Li5 KldK N2del H10R C :配列番号 123で表されるアミノ酸配列において、 1番目の K(L体)を D体リジンに置換したペプチド
を合成し、更に、 12番目の C (L体)を D体システィンに置換したペプチドとして、 ペプチド Li5 KldK N2del H10R C12dC :配列番号 123で表されるアミノ酸配列にお いて、 1番目の K(L体)を D体リジンに置換し、 12番目の C (L体)を D体システィンに 置換したペプチド
を合成した。
[0092] 更に、
ペプチド Li5 KldK N2dN HI 1R C :配列番号 119で表されるアミノ酸配列において、 1番目の K(L体)を D体リジンに置換し、 2番目の N (L体)を D体ァスパラギンに置換 したペプチド
ペプチド Li5 -1G KldK HI 1R C :配列番号 119で表されるアミノ酸配列において、 1 番目の K(L体)を D体リジンに置換し、 N末端に Gを付加したペプチド
ペプチド Li5 -lacetylK HI 1R C :配列番号 119で表されるアミノ酸配列において、 N 末端に Kを付加し、更にその N末端アミノ酸をァセチルイ匕したペプチド
ペプチド Li5 KldK H11R C13dC :配列番号 119で表されるアミノ酸配列において、 1
3番目のじ (L体)を D体システィンに置換したペプチド
を合成した。
[0093] (4 2)ビアコアシステムによる LPS結合能の評価
前記実施例 2で合成したペプチド Li5 C、及び前記実施例 4 1で合成した各ぺプ チドについて、ビアコア(BIACORE)システム(BIACORE 2000;
BIACORE社)を用いて LPS結合能を評価した。前記評価は、リピッド A溶液及び LP S溶液 (濃度 z lOO /z g/mL, 50 /z g/mL, 25 μ g/mL,
12.5 /z g/mL)を用いる代わりに、 LPS溶液 (濃度 =50 g/mL, 25 μ g/mL, 12.5 g/ mL, 6.25 g/mL)を用いること以外は、前記実施例 2に記載の手順に従って実施し た。
[0094] (4 3)ペプチド固定ィ匕ビーズ (バッチ法)による LPS吸着能の評価
前記実施例 2で合成したペプチド Li5 C、及び前記実施例 4 2で合成した各ぺプ チドについて、ペプチド固定ィ匕ビーズ (バッチ法)により、 LPS吸着能を評価した。前 記評価(2番目の Nを欠失させたペプチドを除く)は、ビーズ担体へのペプチド固定 ィ匕量を 2 /ζ πιο1、 5mg、又は 2mgとしたこと以外は、前記実施例 3に記載の手順に従 つて実施した。また、 2番目の Nを欠失させたペプチドの評価は、ビーズ担体 0.2 g (実施例 3—1では 0.5 g)、 2 ョードエタノール 0.5 mL (実施例 3—1では 1 mL)、ピ リジン 50 μ L (実施例 3— 1では 100 μ L)、ペプチド溶液 2
mg/mL, 1 mL (実施例 3— 1では 5 mg/mL, 1 mL)、: LPS溶液 0.8 mL (実施例 3— 2で は 2 mL)、測定用サンプル 50 L (実施例 3— 2では 200 L)を用いて、 5分後、 30分 後、 60分後(実施例 3— 2では 30分後、 60分後)にサンプリングしたこと以外は、前 記実施例 3に記載の手順に従って実施した。
[0095] C末端欠失型ペプチドに関する結果を表 3に、塩基アミノ酸置換型ペプチドに関す る結果を表 4に、 2番目の Nを欠失させたペプチドに関する結果を表 5及び表 6に、そ れぞれ示す。表 3〜表 5において、欄 Aは、ペプチド固定ィ匕ビーズ担体と LPS溶液と を混合した直後(経過時間 =0分)に回収したサンプル中の LPS濃度(単位 = ng/mL )を示し、欄 Bは、前記混合から 30分間経過した後に回収したサンプル中の LPS濃 度(単位 = ng/mL)を示す。表 6において、欄 Aは、ペプチド固定ィ匕ビーズ担体と LPS 溶液とを混合した直後(経過時間 =0分)に回収したサンプル中の LPS濃度(単位 = ng/mL)を示し、欄 Bは、前記混合から 5分間経過した後に回収したサンプル中の LP S濃度 (単位 =ng/mL)を示す。
[0096] [表 3]
固定化量 A: B: Ratio LPS除去率 固定化ペプチド
(jtmol) 0 (min) 30 (min) (B/A) (%)
Li5 K1del C 2 277.0 166.8 0.60 39.8
Li511C 2 277.0 -12 0 100.0
Li5 IOC 2 277.0 67.7 0.24 75.6
Li59C 2 277.0 202.8 0.73 26.8
Li58C 2 277.0 230.3 0.83 16.9
Li57C 2 277.0 242.5 0.88 12.5
Li56C 2 277.0 234.1 0.85 15.5
[0098] [表 5]
[0099] [表 6]
固定化量 A: B: Rat io LPS除去率 固定化ぺプチド
(mg) 0 (min) 5 (min) (B/A) (%)
L i5 N2de l H10R C 2 405. 5 136. 4 0. 35 66. 4
Li 5 KldK N2de l H10R C 2 405. 5 36. 7 0. 09 91. 0
Li 5 K1dK N2del H10R C12dC 2 407. 6 114. 7 0. 28 71. 9
[0100] (4 4)結果
前記実施例 4 2及び実施例 4 3の結果を、血中安定性のデータと併せて、表 7 に示す。また、使用したペプチドを表 8にまとめた。
なお、血中安定性は、以下の方法により評価した。先ず、ペプチドを lOmgZmLと なるように蒸留水で溶解した。更にそれを蒸留水で 10倍に希釈し、終濃度 lmgZm Lとなるように調整した。ペプチド溶液 10 Lを 50 Lの血漿(ヒト)にカロえ、 5分後、 3 0%TCA25 Lを添加することにより反応を止めた。良く攪拌後、 12, OOOrpm、 5分 の遠心で変性タンパク質を沈殿させ、上澄みを HPLCにかけた。高速液クロ (HPLC )は以下の条件で行なった:
カラム:トーソー ODS 80TM (4. 6 X 100mm)
溶媒 A: 0. 1%トリフルォロ酢酸 (TFA)
溶媒 B : 90%ァセトニトリル(0. 1%TFA中)
流速 : 0. 8mL/ min
グラディエント: 10〜60%B (55分間)
モニターは 210nm (l. OAUSF)と 280nm(0. 2AUSF)の吸光
各時間ごとに上記操作を行ない(30%TCA25 μ Lをカ卩えて反応を止め、遠心で変 性タンパク質を沈殿させ、上澄みを HPLCで分析し)、ピークの高さを測定した。また 、そのピークのアミノ酸配列をシークェンサ一にて分析することにより、分解産物を確 認し、血漿中の安定性を評価した。
[0101] 表 7において、(a)欄は、結合力(KD)であり、(b)欄は、 LPS (50 g/mL)時の結 合量 (Rmax) [BIACOREソフトウェアによる計算値]であり、(c)欄は、ビアコアシステ ムによる評価 [すなわち、(a)欄及び (b)欄に基づく評価]であり、(d)欄は、バッチ法 による評価であり、(e)欄は、血中安定性に関する評価であり、(f)欄は、総合評価 [
すなわち、(c)欄〜 (e)欄に基づく評価]である。
[0102] 欄 (c)〜欄 (f)における評価は、 4段階評価であり、記号「A」は、極めて優れている ことを示し、記号「B」は、優れていることを示し、記号「C」は、通常使用には耐えること を示し、記号「D」は、単独では劣るが、繰り返し配列からなるマルチマーや、高密度 にペプチドを固定ィ匕する方法などにより使用可能であることを示す。
より具体的には、(c)欄のビアコアシステムによる評価 [ (a)欄及び (b)欄に基づく評 価]では、(a)欄及び (b)欄を総合評価したときに、ペプチド Li5 Cより優れている場合 を評価「A」とし、ペプチド Li5 Cと同程度である場合を「B」と評価し、ペプチド Li5 Cよ りやや劣る場合を「C」と評価し、ペプチド Li5
Cより劣る場合を「D」と評価した。
また、(d)欄におけるバッチ法による評価では、同時に測定したペプチド Li5じよりも LPS吸着能が優れている力、または LPS除去効率が 70%以上の吸着能を示す場 合を評価「A」とし、ペプチド Li5 Cと同等力 または LPS除去効率が 50%〜69%の 吸着能を示す場合を評価「B」とし、ペプチド Li5
Cよりもやや劣る力、または LPS除去効率が 30〜49%の吸着能を示す場合を評価「 C」とし、ペプチド Li5 Cよりも劣る力、または LPS除去効率が 10〜29%の吸着能を示 す場合を評価「D」とした。
また、(e)欄における血中安定性に関する評価では、血漿中で 1時間以上経過して も残存が確認できた場合を評価「A」とし、血漿中において 30分〜 1時間以内で分解 された場合を評価「B」とし、血漿中において 10分〜 30分以内に全て分解された場 合を評価「C」とし、血漿中において 1分〜 10分以内に全て分解された場合を評価「 DJとした。
[0103] これまでの各試験力 導かれる結果として、 N末端に塩基性のアミノ酸 (特に K)が あることが好ま 、。これは N末端の Kを除去すると LPS結合能が低下することから言 える。また、 N末端のアミノ基をァセチルイ匕することで結合力が弱まることから、 N末端 のアミノ基もフリーであることが好ましい。また、 N末端から 11番目又は 10番目のアミ ノ酸が塩基性のアミノ酸 (特に R)であることが好ま 、。これは C末端から削った場合 、この塩基性アミノ酸が削られると LPS結合能が低下することから考えられる。安定性
の面では、 N末端アミノ酸を D体にすることが好ましい。また更に安定ィ匕させる為には C末端となるアミノ酸も D体ィ匕すると相乗的に有効である。また、 2番目の Nを欠失さ せたペプチドに関する結果から、 N末の Kを D体 Kに置換することで、 LPS吸着効率 が更に増すことがわかった。更に、両サイドを D体に変えたペプチドについても LPS 吸着能が確認でき、 N末端を D体、若しくは両サイドを D体に変えても吸着能の劣ら
o
ないことが示された。
[表 7]
o
ぺプチド (a) (b) (C) (d) (e) (f)
Li5 C 10 -10— 8 2590 B B C B
Li5 K1R C 10-8(1 (T9) 1390 B B C B
Li5 K1H C 10— 11(10—10) 76.9 B B 一 B
Li5 H11R C 10 -10 2380 A A ― A
Li5 H11K C 10一7 - 9 2440 A B ― B
Li5 K1R H11R C 10—8 (10—9) 699 B A c A
Li5 KldK C 10'0- 10—'1 886 B A A A
Li5 K1dK H11R C ― ― ― A A A
Li5 K1dR C 10—8 221 C B A B
Li5 K1dR H11R C 10—8(10一12) 195 C B A B
Li5 K1dK圖
H11R C ― ― ― B A A
Li5 -1G K1dK
H11R C ― ― ― B A A
Li5 KlactylK C 10- 9(10-10) 210 B C A B
Li5 -lacetylK
H11R C ― 一 ― A A A
Li5 K1dK H11R
C13dC ― ― ― A A A
Li5 N2del H10R C ― ― ― A B A
Li5 K1dK N2del
H10R 6140 A A A A
Li5 KldK N2del
H10R C12dC ιο-10-ιο-11 4290 A A A A
Li5 K1del C 10—8-10—9 452 B C 一 C
Li5 11C 1240 A A ― B
Li5 10C 一 ― 一 A 一 B
Li59C 10— MO-8 585 C C 一 C
Li58C 一 ― ― D 一 D
Li57C 10- 8 58.4 c D 一 D
Li5 6C ― ― ― D 一 D
[0105] [表 8] ぺプチ ァミノ酸配列
し 5 C KN Y ss s I s s I H A C (配列番号 110) し 5 K1R C RN Y s s s I s s I H A C (配列番号 121) し 5 K1H C H N Y s s s I s s I H AC (配列番号 122) し 5 H11R C KN Y s s s I s s I RAC (配列番号 119) し 5 H11K C KN Y s s s I s s I KAC (配列番号 118) し 5 K1R H11R C RN Y s s s I s s I RAC (配列番号 120) し 5 K1dK C k N Y s s s I s s I H AC
し 5 K1dK H11R C k N Y s s s I s s I RAC
し 5 K1dR C r N Y s s s I s s I H AC
し 5 K1dR H11R C r N Y s s s I s s I RAC
し 5 K1dK N2dN H11R C k n Y s s s I s s I RAC
し 5 -1G K1dK H11R C G k N Y s s s I s s I RAC
し 5 KlactylK C aKN Y s s s I s s I H AC
し 5 -lacetylK H11R C aKKN Y s s s I s s I RAC
し 5 K1dK H11R C13dC k N Y s s s I s s I RA c
し 5 N2del HI OR C K Y s s s I s s I RAC (配列番号 123) し 5 K1dK N2del H10R C k Y s s s I s s I RAC
し 5 K1dK N2del H10R C12dC k Y s s s I s s I RA c
し 5 K1del C N Y s s s I s s I H AC (配列番号 117) し 5 11C KN Y s s s I s s I H C (配列番号 116) し 5 10C KN Y s s s I s s I C (配列番号 115) し 5 9C KN Y s s s I s s C (配列番号 114) し 5 8C KN Y s s s I s C (配列番号 113) し 5 7C KN Y s s s I C (配列番号 112) し 5 6C KN Y s ss c (配列番号 111)
[0106] 表 8において、小文字で示す各アミノ酸 (k、 r、 n、及び c)は、 D体アミノ酸であること を意味し、「ak」は、ペプチドの N末端アミノ基のァセチルイ匕を意味する。
[0107] 《実施例 5:オープンカラム法による LPSの除去》
(5— 1)ペプチド Li5 Cのビーズ担体への固定化とカラム作製
本実施例では、酸塩化物が結合しているシリカゲル(Propionyl chloride lunctionaliz ed silica gel 200-400 mesh;シグマ'アルドリッチ社製)(以下、ビーズ担体と称する) に溶媒を加えて反応させ、最終的に C末端のシスティンのチオール基を利用してぺ プチド Li5
Cを固定ィ匕した。なお、下記に記載した緩衝液、蒸留水、実験器具等は特に記載し ない限り、全てエンドトキシンフリーのものを用いた。
[0108] 具体的には、先ず、ビーズ担体(1.0 g)を量り取り、乾熱滅菌試験管に移し替えた。 そこに 2—ョードエタノール (和光純薬社) (2 mL)をカ卩え、ビーズ担体と結合している 酸塩ィ匕物とョードエタノールの水酸基とを反応させ、共有結合させた。その際に副生 成物として塩化水素(HC1)が発生するので、ョードエタノールが反応し副反応が起こ るのを防ぐため、ピリジン (和光純薬社)(ァミン塩基を含むもの)(200 L)を加え混ぜ た。これをパラフィルムで覆い、よく混ぜた後、穏やかに攪拌しながら、室温で 4時間 反応させた。
[0109] 反応物をェコノカラム(カタログ番号 737-0516、内径 =0.5cm、長さ = 15cm、底面積
= 0.2cm2 ;BIO- RAD社)に移し代え、蒸留水でよく洗浄した後、カップリングバッファ 一 (50mmol/L
Tris-HCl, 5mmol/L EDTA-2Na, pH 8.5)で平衡化した。それに、カップリングバッフ ァ一に溶解したペプチド Li5 C溶液(2.5
mg/mL, 2 mL)をカ卩ぇ混ぜ、穏やかに攪拌しながら、室温で 3時間放置した。ぺプチ ド Li5 C固定ィ匕後、未反応のペプチドを洗い流すため、蒸留水でビーズ担体を洗浄し 、更に、カップリングバッファ一にて平衡化した。続いて、ブロッキングバッファー(2— メルカプトエタノールを 100
mmol/Lとなるようにカップリングバッファーに溶解したもの)を、平衡ィ匕したビーズ担 体に加え混ぜ、穏やかに攪拌しながら室温にて 3時間放置し、非特異的吸着を防ぐ ためのブロッキングを行なった。ブロッキング後、蒸留水で良く洗浄し、未反応のメル カプトエタノールを取り除いた。その後、 PBSで平衡ィ匕し、カラム上部と下部の蓋を閉 め、使用するまで 4°Cで保存した。
[0110] ペプチド Li5 C固定化ビーズ担体へのペプチド固定化量を、 SH基定量試薬(Ellma n' s Reagent ; PIERCE社)で定量したところ、 4. 95mgが固定化されており、 99%の 固定化効率であった。また、コントロール用ビーズ担体として、メルカプトエタノールで 完全にブロッキングしたものを調製した。
[0111] (5— 2) LPS除去試験
LPS溶液として、大腸菌由来 LPS (E. coli 0111:84;フナコシ社)を1¾3に溶解(1 mg/mL)し、更に PBSで希釈することにより、 LPS溶液 (最終濃度 = 500 ng/mL)を作
成した。実施例 5— 1で調製したカラム中の溶液 (PBS)をビーズ担体の表面と同じ高 さまで排除して揃えた。前記 LPS溶液(10
mL)をカラム上部力 流し、通流させ、カラム下部力 0. 5mLずつ溶液を乾熱滅菌 試験管に回収した。回収したサンプル中の LPS量は、実施例 3— 2に記載の方法に より定量した。コントロールでは、カラム添加後、しばらくすると飽和状態に達してしま うのに対して、ペプチド Li5
C固定化カラムでは、 LPS除去率が 91. 1%であり、 LPSを効率よく除去可能である ことが示された。
[0112] 《実施例 6:ペプチド固定ィ匕ビーズ担体を用いた LPSの定量》
本実施例では、前記実施例 4 1で合成したペプチド Li5 KldK N2del H10R C12d
Cの固定ィ匕ビーズ担体を用いて、 LPSと反応させた後、ビーズ担体に結合した LPS 量を測定し、定量ができることを確認した。また、これと同時にメルカプトエタノールで 完全ブロキングしたビーズ担体のみのものをコントロールとして比較した。なお、下記 に記載した緩衝液、蒸留水、実験器具等は特に記載しない限り、全てエンドトキシン フリーのものを用いた。
[0113] (6— 1)ペプチド Li5 KldK N2del H10R C12dCのビーズ担体への固定化
本実施例では、酸塩化物が結合しているシリカゲル(Propionyl chloride lunctionaliz ed silica gel 200-400 mesh;シグマ'アルドリッチ社製)(以下、ビーズ担体と称する) に溶媒を加えて反応させ、最終的に C末端のシスティンのチオール基を利用してぺ プチドを固定ィ匕した。
[0114] 具体的には、先ず、ビーズ担体 [10mg(lサンプル分) ]を量り取り、乾熱滅菌試験 管に移し替えた。そこに 2—ョードエタノール (和光純薬社)(O.lmL)をカ卩え、ビーズ 担体と結合して!/ヽる酸塩化物とョードエタノールの水酸基とを反応させ、共有結合さ せた。その際に副生成物として塩ィ匕水素(HC1)が発生するので、ョードエタノールが 反応し副反応が起こるのを防ぐため、ピリジン (和光純薬社)(ァミン塩基を含むもの) (10 L)を加え混ぜた。これをパラフィルムで覆い、よく混ぜた後、穏やかに攪拌しな がら、室温で 4時間反応させた。
[0115] 反応物をェコノカラム (BIO- RAD社)に移し代え、蒸留水でよく洗浄した後、カツプリ
ングバッファー(50mmol/L Tris— HC1, 5mmol/L
EDTA-2Na, pH 8.5)で平衡化した。それに、カップリングバッファーに溶解したぺプ チド溶液 (20 mg/mL, 0.25 mL)をカ卩ぇ混ぜ、穏やかに攪拌しながら、室温で 3時間放 置した。ペプチド固定化後、未反応のペプチドを洗い流すため、蒸留水でビーズ担 体を洗浄し、更に、カップリングバッファ一にて平衡ィ匕した。続いて、ブロッキングバッ ファー(2—メルカプトエタノールを 100
mmol/Lとなるようにカップリングバッファーに溶解したもの)を、平衡ィ匕したビーズ担 体に加え混ぜ、穏やかに攪拌しながら室温にて 3時間放置し、非特異的吸着を防ぐ ためのブロッキングを行なった。ブロッキング後、蒸留水で良く洗浄し、未反応のメル カプトエタノールを取り除いた。その後、 PBSで平衡ィ匕し、ビーズ担体をカラムから乾 熱滅菌試験管 (生化学工業社)に移し変え、使用するまで 4°Cで保存した。
[0116] ペプチド固定化ビーズ担体へのペプチド固定化量を、 SH基定量試薬(Ellman' s R eagent ;PIERCE社)で定量したところ、 90%以上の固定化効率であった。また、コント ロール用ビーズ担体として、メルカプトエタノールで完全にブロッキングしたものを調 製した。
[0117] (6— 2) LPS吸着能試験
先ず、大腸菌 . coli O113:H10株)由来の米国薬局方エンドトキシン標準品(RSE : Reference Standard
Endotoxin:生化学工業社製)をエンドトキシンフリーの蒸留水(LRW: LAL Reagent W ater;生化学工業社製)で溶解し (2,000EU/mL)、更に PBSで希釈することにより、濃 度の異なる LPS溶液(最終濃度 = 10EU/mL、 5EU/mL、 2.5EU/mL、 OEU/rnL)を作 成した。次に、前記実施例 6—1で調製したペプチド固定ィ匕ビーズ担体とコントロール 用ビーズ担体にっ 、て、その乾熱滅菌試験管中に混入して 、る溶液 (上清)を完全 に取り除いた。各濃度の LPS溶液(1
mL)をそれぞれのビーズ担体に加え混ぜ、パラフィルムで試験管の口を覆い、穏ゃ かに攪拌しながら室温で 30分間反応させた (その際に上澄みを 10 1回収し、添カロ 直後の溶液とした)。その後、直ちに卓上遠心器で数秒間遠心してビーズを沈殿させ てから、上澄みを新しい乾熱滅菌試験管に移し代えた (反応後の上澄みとした)。一
方、沈殿させたビーズに PBS溶液 (0.5mL)を添加し、混合後ビーズを沈殿させてか ら上澄みを取り除くという操作を繰り返し行ない、未結合の LPSを取り除く為、ビーズ を洗浄した。この操作を 6回(計 3mL)繰り返し行なった。この洗浄後の溶液も最終的 に LPS濃度を定量する為、乾熱滅菌試験管にて保管した (洗浄後の溶液とした)。 また、ビーズ担体には PBS溶液(lmL)を加え混ぜた。その後、添加直後や反応後 の上澄み、洗浄後の溶液、ビーズに結合した LPS量についてそれぞれ定量した。 L PS量は、市販の測定キット(エンドスぺシ一 ES-50Mセット;生化学工業社)を用いて 測定した。結果を表 9に示す。
[0118] [表 9]
[0119] その結果、コントロールでビーズに結合した LPS量はほぼ OEUであったのに対し、 ペプチド固定ィ匕ビーズ担体では、濃度依存的にビーズに結合した LPS量の定量が 行なえた。また、 LPS添カ卩直後の上澄みカゝら投入した LPS量も相当量であり、洗浄 後の溶液にも LPSがほとんど含まれていないこと(OEU)、反応後の上澄みにも殆ど LPSが残っていないことなどから、ビーズに結合した LPSの定量が確実であることが 示された。
[0120] 《実施例 7 :オープンカラム法による LPS除去効率の確認》
本実施例では、ペプチド Li5 KldK N2del H10R C12dC固定化担体を充填させた力
ラムと、何も固定ィ匕して 、な 、担体のみを充填させたカラムとの LPS除去効率を比較 した。なお、下記に記載した緩衝液、蒸留水、実験器具等は特に記載しない限り、全 てエンドトキシンフリーのものを用いた。
[0121] (7— 1)ペプチドのビーズ担体への固定ィ匕
本実施例では、チオール基を含む物質をジスルフイド (S— S)結合で固定する担体 (Thiopropyl Sepharose 6B Lab Pack;アマシャム バイオサイエンス社製)(以下、担 体と称する)を用いてペプチドを固定ィ匕した。
具体的には、先ず、担体 [0.5g (容量 1.5mL) ]を遠沈管に量り取り、蒸留水を加え膨 潤させて力もェコノカラム (BIO- RAD社製)(以下、カラムと称する)に移し変えた。カラ ムに蒸留水(lOOmL)を通流させ担体を洗浄した。それにペプチド溶液 [蒸留水 1.35 mL、 0.1mol/L
ギ酸 (pH4.5) 0.15mLにペプチド 5mgを溶解したもの]を添カ卩し、室温でー晚放置し、 ペプチドを固定化した。続いて、ブロッキングバッファー(2—メルカプトエタノールを 1 00
mmol/Lとなるよう〖こ、蒸留水: 0.1mol/Lギ酸 (pH4.5) = 9 : 1の割合の溶液で溶解し たもの)をカラムに添加させ、室温で一晩放置し、非特異的吸着を防ぐ為のブロッキ ングを行なった。ブロッキング後、カラムに蒸留水を通流させ、未反応のメルカプトェ タノールを取り除いた。その後、 PBSで平衡ィ匕し、使用するまで 4°Cで保存した。 また、コントロール用担体として、メルカプトエタノールで完全にブロッキングしたもの を調製した。
[0122] (7— 2) LPS除去効率確認試験
先ず、カラム中に含まれて 、る PBS溶液を捨てて担体の表面と同じ位置に合わせ た。そのカラムに LPS溶液(LPS E.coli 0111:B4 10ng/mLとなるようにヒト血漿に溶解 したもの) 8mLを通流させた。カラム下部力も LPS溶液を lmL又は 0. 5mLずつ回収 した。サンプルは乾熱滅菌試験管にてストックした。
その後、それぞれのサンプル中に含まれる LPS量の定量を行ない、ペプチドによる LPS除去効率を確認した。
LPS量は、市販の測定キット(エンドスぺシ一 ES-50Mセット;生化学工業社)を用い
て測定した。
[0123] その結果、コントロール (担体のみ)では PBS溶液が流れた後、直ぐ飽和状態に達 したのに対し、ペプチド固定ィ匕カラムは 50%程度の LPS除去効率を維持した後、徐 々に飽和していく傾向を示した。また、 LPS溶液 8mLを流した時点での除去効率は まだ完全に飽和状態に達していな力つた。これにより、ペプチド固定ィ匕担体は血漿中 の LPSを除去することが示された。
[0124] 《実施例 8 :ペプチド安定性評価》
本実施例では、ペプチド Li5 KldK N2del H10R C12dCの安定性を、タンパク質とタ ンパク質等の分子間における結合の強さや結合量を測定する機器 [ビアコアシステム
(BIACORE
2000; BIACORE社)]にて測定した。また、ポリミキシン B (PMB)も同時に測定し、比 較した。なお、下記に記載した緩衝液、蒸留水、実験器具等は特に記載しない限り、 全てエンドトキシンフリーのものを用いた。
[0125] 具体的には上記ペプチドを、センサーチップ(BIACORE Sensor Chip CM5 ;BIAC ORE社)のフローセル(以下、 Fcと称する) 2にチオールカップリングにて固定化した。 コントロールとして Fclにシスティンを固定ィ匕した。比較の為に、アミノ基を介して固定 化するァミンカップリングにて Fc4に PMBを固定ィ匕した。なお、それぞれ、等モルとな るように固定ィ匕した。
[0126] そのセンサーチップに、濃度が gZmLの LPS溶液 [緩衝用バッファー HBS- E P (0.01mol/L HEPES、 pH7.4、 0.15mol/L NaCl、 3mmol/L
EDTA) ]をアナライトとして流し、結合量 (RU: Resonance Unit)を測定した後、強アル カリ溶液(15mmol/L NaOH)を流してセンサーチップを洗浄した。このサイクルを 1回 として繰り返し行ない、結合量の変化を調べ、安定性を確認した。
[0127] その結果、 PMBはサイクルを重ねるごとに LPS結合量が低下していくのに対し、ぺ プチド Li5 KldK N2del H10R C12dCの LPS結合量は変わらず一定であった。よって 、強アルカリ洗浄下において、ペプチドは安定であることが示された。
[0128] 《実施例 9 :グラム陰性菌の蛍光染色》
本実施例では、前記実施例 4—1で合成したペプチド Li5 KldK N2del H10R Cを用
V、てグラム陰性菌 (大腸菌及び緑膿菌)及びグラム陽性菌 (乳酸菌)の蛍光染色を実 施した。
[0129] ペプチド Li5 KldK N2del H10R C [0.5mg/mL in PBS (pH7.2) ] lmLを作成し、フル ォレセイン 5 マレイミド (PIERCE社製) 5mgを定法に従ってカ卩え、室温で 2時間反 応させた後、 L—システィン 50mgを添カ卩してブロッキングを行うことにより、フルォレ セイン標識ィ匕ペプチドを調製した。各菌は、充分に増殖させたところ (foil
growth)で遠心して沈殿を回収し、遠心前の培地量の 10倍量の水に再懸濁したもの を使用した。得られた各菌の懸濁液 5 Lを、シラン処理したスライドガラスに滴下し、 乾燥させた。固定のために、 100%エタノール 10 Lを滴下し、乾燥させた。フルォ レセイン標識ィ匕ペプチド溶液(25 μ g/mL) 100 Lを滴下し、そのまま 3時間放置 し、染色を実施した。なお、コントロールとして、フルォレセイン標識ィ匕ペプチド溶液 の代わりに、フルォレセイン標識ィ匕システィン溶液又は水を使用した。
[0130] 蛍光顕微鏡 (BX50WI ;ォリンパス)による観察の結果、グラム陰性菌である大腸菌 又は緑膿菌は、フルォレセイン標識ィ匕ペプチドにより染色されたのに対して、グラム 陽性菌である乳酸菌は染色されな力つた。また、コントロールとして使用したフルォレ セイン標識ィ匕システィンでは、グラム陰性菌及びグラム陽性菌の 、ずれも染色されな かった。
[0131] 《実施例 10 :Li5— 025と各種 LPSとの結合力(親和性)評価 (ビアコアシステムによ る)》
本実施例では、実施例 4—1で合成したペプチド Li5 KldK N2del H10R C (以下、 ペプチド Li5— 025の名称を併用する)について、ビアコア(BIACORE)システム(BIA CORE
2000; BIACORE社)を用いて、種の異なる各種 LPSとの結合力を評価した。
具体的には、合成したペプチド(Li5— 025)をセンサーチップ(BIACORE Sensor
Chip CM5 ; BIACORE社)のフローセル(以下、 Fcと称する) 2にチオールカップリング にて固定ィ匕した。コントロールとして、 Fclにシスティンを固定化した。
画己センサ ~~チップに、各植 [Bordetella pertussis (Bp)、 Viono choierae serotype I naba 569B (Vc)、 Klebsiella
pneumoniae (Kp)、 Pseudomonas aeruginosa Serotype 10 (Pa)、 Escherichia coli 0111:B4 (Ec)]の異なる LPS [濃度 =50 μ g/mL, 25 μ g/mL, 12.5 μ g/mL, 6.25 μ g/mL;緩衝用バッファー HBS— EP (Tween- 20無し)(0.01
mol/L HEPES, pH 7.4, 0.15 mol/L NaCl, 3 mmol/L EDTA) ]をアナライトとして、そ れぞれ薄 ヽ濃度から順に流して測定した。
その結果、 LPSとの結合力 [解離定数平均値 (Kd) ]は、 Bp、 Kp、 Ecでは 10_8で あり、 Vcでは 10—8〜: L0—9であり、 Paでは 10_ 11〜10_12であり、 LPSがいずれの場 合であっても Kd= 10_8オーダと LPSに強く結合することが確認された。
[0132] 《実施例 11 :Li5— 025による各種 LPSとの吸着能評価 (バッチ法による)》
実施例 10で用いたのと同じペプチド (Li5— 025)と各種 LPSを用いて、ペプチド Li 5-025とそれぞれの LPSとの吸着能をバッチ法にて測定すると共に、ポリミキシン B (P MB)とも比較した。なお、下記に記載した緩衝液、蒸留水、実験器具等は特に記載 しない限り、全てエンドトキシンフリーのものを用いた。
[0133] (1)ペプチドの固定化方法
酸塩化物が結合しているシリカゲル(Propionyl chloride lunctionalized silica gel 200 -400 mesh (シグマ'アルドリッチ社製)(以下、ビーズ担体と称する)に溶媒をカ卩えて 反応させ、最終的に C末端のシスティンのチオール基を利用し、共有結合にてぺプ チド Li5— 025を固定化した。
具体的には、先ず、ビーズ担体 (0.2 g)を量り取り、乾熱滅菌試験管に移し替えた。 そこに 2—ョードエタノール (和光純薬社製) (0.4 mL)をカ卩え、ビーズ担体と結合して いる酸塩ィ匕物とョードエタノールの水酸基を反応させ共有結合させた。その際に副 生成物として、塩ィ匕水素(HC1)が発生するので、ョードエタノールが反応し副反応が 起こるのを防ぐため、ピリジン (和光純薬社製)(ァミン塩基を含むもの) (40 μ L)を加え混ぜた。これをパラフィルムで覆い、よく混ぜた後、穏やかに攪拌しながら 、室温で 4時間反応させた。
これをェコノカラム (BIO-RAD社製)に移し代え、蒸留水でよく洗浄した後、カツプリ ングバッファー(50 mmol/L Tris— HC1, 5 mmol/L
EDTA-2Na, pH 8.5)で平衡化した。それに、 Li5-025 (2 mg/mL)となるようにカツ
プリングバッファーに溶解したペプチド溶液(1 mL)を加え混ぜ、穏やかに攪拌しなが ら、室温で 6時間放置した。なお、ペプチド固定化後溶液を用いて、 SH基定量試薬 ( Ellman s
Reagent; PIERCE社製)にてペプチド固定化量を定量した。
U5— 025固定ィ匕後、未反応のペプチドを洗い流すため、蒸留水でビーズ担体を 洗浄し、更に、カップリングバッファ一にて平衡ィ匕した。一方で、 2—メルカプトエタノ ール(関東ィ匕学社製)を lOOmmolZLとなるように、カップリングバッファーで溶解し 、ブロッキングバッファーを作成した。それを、平衡ィ匕したビーズ担体に加え混ぜ、穏 やかに攪拌しながら室温で 3時間以上放置し、非特異的吸着を防ぐためのブロッキ ングを行なった。
ブロッキング後、蒸留水で良く洗浄し、未反応のメルカプトエタノールを取り除いた。 その後、 PBSで平衡ィ匕し、ビーズ担体をカラムからリムルス試験管 (スクリューキャップ 付き)(第一化学薬品社製)に移し変え、使用するまで 4°Cで保存した。
(2)ポリミキシン B (PMB)の固定化方法
酸塩化物が結合しているシリカゲル(Propionyl chloride lunctionalized silica gel 200 -400 mesh ;シグマ'アルドリッチ社製)(以下、ビーズ担体と称する)に溶媒を力卩ぇ反 応させ、最終的にアミノ基を利用して共有結合にて PMBを固定ィヒした。
具体的には、先ず、ビーズ担体 (0.2 g)を量り取り、乾熱滅菌した試験管に移し変え た。そこに蒸留水(H 0)を加え混ぜ、パラフィルムで覆い、室温で穏やかに攪拌しな
2
がら、気泡がなくなるまで放置し、ビーズ担体に結合している酸塩ィ匕物と水とを反応さ せ、共有結合によって、塩素部分を水酸基 (-OH)に置換した。
試験管中の気泡が無くなつたことを確認してから、ェコノカラム (BIO-RAD社製)に 移し代え、蒸留水で洗浄した。その後、 0.1 mol/L NaHCO ノ ッファー(pH
3
8.0)で平衡化した。それに、 EDC [1- Ethy卜 3- (3- dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride]と NHS (N-hydroxysuccinimide)をカ卩え混ぜ、室温で 1時間反応させ た。反応後、カラム内の溶液を排出し、 0.1
mol/L NaHCO バッファーを流した。そこに、 PMB (2 mg/mL)となるように 0.1 mol/L
3
NaHCO
バッファーに溶解した PMB溶液(1 mL)を加え混ぜ、穏やかに攪拌しながら、室温で 6時間放置した。なお、 PMB固定ィ匕後溶液を用いて、アミノ基定量キット (CBQCA Protein Quantitation Kit; Molecular Probes社製)にて PMBの固定化量を定量した。
PMB固定化後、未反応の PMBを洗い流すため、蒸留水でビーズ担体を洗浄した oその後、更に 0.1 mol/L NaHCO バッファ一にて平衡化した。一方で、アミンェタノ
3
ール (和光純薬社製)を 1. OmolZLとなるように、蒸留水で溶解し、塩酸で pH8. 5 に調整し、ブロッキングバッファーを作成した。ブロッキングバッファー(3
mL)をビーズ担体に加え混ぜ、穏やかに攪拌しながら室温で 3時間以上放置し、非 特異的吸着を防ぐためのブロッキングを行なった。
ブロッキング後、蒸留水で良く洗浄し、未反応のエタノールアミンを除去した。その 後、 PBSで平衡ィ匕し、ビーズ担体をカラム力もリムルス試験管 (スクリューキャップ付き ) (第一化学薬品社製)に移し代え、使用するまで 4°Cで保存した。
[0135] (3)コントロール(なにも固定化していないビーズ担体のみのもの)の作製方法
コントロールは、前記項目(1)に記載の Li5— 025固定ィ匕法におけるブロッキング 処理のみを行うことにより、メルカプトエタノールで完全ブロッキングしたものをコント口 ールとした。
[0136] (4) LPS (エンドトキシン)吸着能試験及びサンプル回収方法
LPS溶液を作成し、ペプチド (又は PMB)固定ィ匕ビーズ担体と混合させ、時間を追 つてサンプルを回収し、測定用のサンプルを準備した。
具体的には、先ず、各固定ィ匕又はブロッキングビーズ担体の分散溶液 (上清)を完 全に取り除いた。一方で、それぞれの LPSを PBSで溶解し、 500ngZmLとなるよう に調整し、 LPS溶液を作成した。この LPS溶液 (0.8 mL)をビーズ担体によく混合さ せた後、 200 Lを回収し、別の新しい乾熱滅菌試験管に移し代えた。回収したサン プルは直ちに、卓上遠心器で数秒遠心し、ビーズを沈殿させ、上澄みを新しい乾熱 滅菌試験管に移し代えた。一方、サンプル回収後のビーズ溶液は、溶液と良く混ぜ、 穏やかに攪拌しながら、室温でインキュベートした。経時的に同様の方法でサンプリ ングした。
[0137] (5)エンドトキシン量の定量
回収したサンプル中のエンドトキシン量を、市販の測定キット(エンドスぺシ一 ES- 5編セット;生化学工業社製)にて測定し、 LPS吸着能力を確認した。
具体的には、先に回収したサンプルを蒸留水にて希釈した (この希釈は、エンドス ぺシ一の定量範囲内のレンジに定まるよう希釈した)。これをトキシペット
プレートポリスチレン製 96 well (Et Free) (生化学工業社製)に 50 μ 1/wellずつ入 れた。次に、エンドスぺシ一 ES- 50Mセットを準備した。キット中のライセート試薬(1本 )に、キット添付の緩衝液 1本 (全量)を加え、泡立てないように 5分間手で振って溶解 した。これを、サンプル添カ卩ゥエルに 50 L/wellずつ添カ卩し、よく混合させた。その 後、 37°Cで穏やかに攪拌しながら 30分間インキュベートした。
その後、吸光光度計 (ARVO ;wallac社製)にて、 405nmの吸光度を測定した。また その際に、検量線を作成し、近似直線の方程式から LPS濃度を算出した。
[0138] 結果を表 10に示す。この表 10において、各記号 Bp、 Vc、 Kp、 Ecは、それぞれ、 B ordetella pertussis ^ Viono cholerae serotype Inaba 569B、 Klebsiella
pneumoniae ^ Escherichia coli 0111 :B4を意味する。
コントロールは混ぜて力も直ぐの LPS量と、 60分後の LPSの濃度が変わらずほぼ 一定なのに対し、 Li5— 025固定化ビーズ担体では、それぞれの LPSにおいて LPS 濃度が有意に低下し、 LPS吸着作用が認められた。 PMBと比較しても LPS除去効 率が高いことが示された。
U5-025固定化ビーズ担体を用いた Bp (Bordetella pertussis)吸着試験では、 500 ngZmLの LPSを 95%以上吸着させた。また、 Vc (Vibrio
cholerae serotype Inaba 569B)では 90%以上、 Kp (Klebsiella pneumoniae)では 50 %以上(最大 80%程度)、 Pa (Pseudomonas
aeruginosa Serotype 10)では 95%以上、 Ec (Escherichia coli 0111 :B4)では 95%以 上と、様々な種類の LPSに対して高 、吸着能を持つことが示された。
同時に測定した PMBは、 Bp吸着試験では、 500ngZmLの LPSを 95%以上、 Vc では 60%以上、 Kpや Paでは吸着能が殆ど見られないなど、 LPSの種類によって吸 着能に大きく差のあることが示された。
[0139] [表 10]
LPS除去率 (%)
L P Sの由来
5分後 30分後 60分後
Bp 98. 4 96. 4 97. 1
V c 68. 1 89. 0 92. 1
Kp 3. 3 42. 0 50. 1
E c 6. 2 83. 8 95. 1
[0140] 《実施例 12: Li5— 025固定ィ匕ビーズによる低濃度 LPS吸着能評価 (バッチ法による ))>
実施例 11と同様の方法により作製したペプチド Li5— 025 (又は PMB)固定化ビー ズ担体を用い、これらに lEUZmLと低い濃度の LPS溶液(1 mL)をカ卩ぇ混ぜ、バッ チ法を行うことにより低濃度の LPS吸着能について確認した。 LPSとしては、 Escheri chia coli
O113:H10由来のものを使用した。バッチの測定方法は実施例 10に準じた。
結果を表 11に示す。コントロールの LPS濃度は最後まで低下しな力つたのに対し、 Li5— 025又は PMB固定化ビーズは最終的に lEUZmLの LPSを 70%以上吸着 し、 0.3EUZmL以下にすることが示された。オープンカラム法で測定することにより 、更に低濃度まで除去することができると期待される。
[0141] [表 11]
LPS除去率 (%)
固定化対象
5分後 30分後 60分後
L ί 5-025 55. 6 60. 0 2
PMB 33. 3 60. 0 2
[0142] 《実施例 13: Li5— 025固定ィ匕ビーズによる 1 %BSA溶液中での LPS吸着能評価( ノ ツチ法による)》
実施例 11と同様の方法により作製したペプチド Li5— 025 (又は PMB)固定化ビー ズ担体を用い、これらに 1%BSA溶液 (LPS濃度 = 500 ng/mL) lmLをカ卩ぇ混ぜ、バ ツチ法を行うことにより 1 %BS A溶液中での LPS吸着能につ 、て調べた。 LPSとして は、 Escherichia
coli 0111:B4由来のものを使用した。ノツチ法の基本的な流れは実施例 10に準じた 結果を表 12に示す。 1%BSA共存下において、 500ngZmLの LPSを 60%以上 吸着することが示された。以前に実施済みのペプチド固定化濃度依存試験 (例えば 、実施例 3— 3)の結果から、ペプチドの固定ィ匕量を増やすことによって、 LPS吸着能 を高めることが可能であると考えられる。
[0143] [表 12]
L PS除去率 (%)
固定化対象
5分後 30分後 60分後
L i 5-025 36 8 59. 1 62. 4
PMB 22 1 7. 5
[0144] 《実施例 14:ポリリジン類似ペプチドと Li5— 025を用いた LPS吸着能の比較 (バッチ 法による)》
LPS結合体として既存品であるポリリジンと、 L15-025 (又は PMB)を比較するた め、ポリリジン類似ペプチドとして、
ペプチド K7C: KKKKKKKC (配列番号 124)
をシグマ社にて合成した。実施例 11と同様の方法にて作製したペプチド (又は PMB )固定ィ匕ビーズ担体に lOngZmL濃度の LPS溶液 2mLをカ卩ぇ混ぜ、ノツチ法にて L PS吸着能を確認し、比較した。 LPSとしては、 Escherichia coli 0111:B4由来のもの を使用した。基本的な操作は実施例 11に準じて行なった。
結果を表 13に示す。 Li5— 025は約 90%程度、 PMBは 65%程度、 K7Cは約 20 %程度の LPS吸着能であり、ポリリジンの LPS吸着能は低いことが示された。
[0145] [表 13]
L PS除去率 (%)
固定化対象
5分後 30分後 60分後
L i 5-025 8 1. 2 86. 0 88. 3 K7 C 1 8. 8 2 1. 9 20. 4
PMB 28. 2 57. 9 67. 0
[0146] 《実施例 15 :Li5— 025とその誘導体を用いた LPS吸着能評価(1) (バッチ法による) 本実施例では、表 14に示す Li5— 025とその誘導体を用い、ノ ツチ法にて LPS吸 着能を比較した。
具体的には、基本的な操作は実施例 11と同様に行なった。また、添加 LPS溶液は 、 LPS濃度 500ngZmL(0.8mL)を使用した。 LPSとしては、 Escherichia coli Oil 1:B4由来のものを使用した。
[表 14] ペプチド ァミノ酸配列
し 5 -025 k Y S S S I SS I R A c
し 5 -029 k Y T T T I τ τ I R A c
し 5 -030 k Y T T Tし ττし RA c
し 5 -031 k Υ S S Sし S Sし R A c
し 5 -032 k Υ S S I S S S I RA c
[アミノ酸配列中、小文字で示すアミノ酸 (k、 c)は、 D体アミノ酸であることを示す] [0148] 得られた結果の一部を表 15に示す。 Li5— 025の LPS吸着能は 500ngZmL濃 度の LPSを 95%以上吸着し、 Li5— 032では約 85%程度、 Li5— 029及び Li5— 0
30は約 75%程度の吸着能であり、 Li5— 025が最も高い LPS吸着能を持つことが示 された。
[0149] [表 15]
PS除去率 (%)
固定化対象
5分後 30分後 60分後
5-025 58. 7 93 0 95. 2
5-029 85. 7 59 3 72. 3 し 5-030 0. 0 59 3 74. 0
5-032 80. 1 6. 9 84. 8
[0150] 《実施例 16 :Li5— 025とその誘導体を用いた LPS吸着能評価(2) (バッチ法による) )>
本実施例では、表 16に示す Li5— 025とその誘導体を用い、ノ ツチ法にて LPS吸 着能を比較した。
具体的には、基本的な操作は実施例 11と同様に行なった。また、添加 LPS溶液は 、 LPS濃度 10ngZmL(2. OmL)を使用した。 LPSとしては、 Escherichia coli 0111: B4由来のものを使用した。
[表 16] ペプチド アミノ酸配列
5-025 kYSSS I SS I RAc
5- 1 6 F kYSSS FSS I R A c
5- I 9 F kYSSS I S S F R A c
5 - I 6 F I 9 kYSSS FSS FRAc
[アミノ酸配列中、小文字で示すアミノ酸 (k、 c)は、 D体アミノ酸であることを示す] [0152] 結果を表 17に示す。その結果、 Li5— I6F I9Fは約 75%程度の LPS吸着能であ り、その他の Li5— 025、 Li5— I6F、 Li5— I9Fについては lOngZmL濃度の LPS をほぼ 100%近く吸着し、とても強い LPS吸着作用が認められた。
[0153] [表 17]
LPS除去军 (%)
固定化対象
5分後 30分後 60分後 し 5 -025 93. 1 99. 6 1 00. 0 し 5 - I 6 F 98. 4 1 00. 0 100. 0 し 5 - I 9 F 93. 1 1 00. 0 1 00. 0 し 5 - I 6 F I 9 F 3. 8 45. 6 74. 8
[0154] 《実施例 17: Li5— 025固定ィ匕カラムによる LPS除去効率評価(1) (オープンカラム 法による)》
Li5— 025固定ィ匕カラムを作製し、オープンカラム法により LPS除去効率について 確認した。同時に、 PMB固定ィ匕カラムや何も固定ィ匕していないカラムを作製し、 LPS 除去効率を比較した。
具体的には実施例 11と同様の方法でペプチド (又は PMB)を固定ィ匕したカラムを
作製し、そのカラム上部から lOngZmL濃度の LPS溶液 7mLを通流し、カラム下部 力 溶出された LPSを 0. 4mLずつ回収し、その検体中に含まれる LPS量を定量す ることにより、 LPS除去効率を評価した。カラム条件は以下の通りである。
カラム:ェコノカラム(BIO— RAD社製)
カタログ番号 737— 0516、内径 0. 5cm、
長さ 15cm、底面積 0. 2cm"
カラムビーズ: Si—アシッドクロライドビーズ(Sト Acid Chloride beads)
(0. 8g)
(カラム容量 = 1. 2mL)
リガンド:ペプチド Li5— 025又は PMB (8mg)
エンドトキシン: LPS (E.coli 0111:B4)
エンドトキシン溶液: 10ngZmL (7mL)
保持容量 : 0. 4mL
流速: 0. 5mL/ mm
[0155] その結果、コントロールはすぐ飽和状態に達してしまったのに対し、 Li5— 025固定 化カラムは lOngZmL濃度の LPSを 0. IngZmL以下まで除去することが示された 。その除去効率は、 LPS溶液を流している間、 0. IngZmL以下を保持し続けた。ま た、 PMB固定ィ匕カラムの LPS除去効率は約 50%程度であった。
[0156] 《実施例 18 :Li5— 025固定ィ匕カラムによる低濃度 LPS除去効率評価(2) (オープン カラム法による)》
Li5— 025固定ィ匕カラムを作製し、オープンカラム法により低濃度の LPS除去効率 について確認した。同時に、 PMB固定ィ匕カラムや何も固定ィ匕していないカラムを作 製し、 LPS除去効率を比較した。
具体的には実施例 11と同様の方法でペプチド (又は PMB)を固定ィ匕したカラムを 作製し、そのカラム上部から 2EUZmL濃度の LPS溶液 7mLを通流し、カラム下部 力 溶出された LPSを 0. 4mLずつ回収し、その検体中に含まれる LPS量を定量す ることにより、低濃度の LPS除去効率を評価した。カラム条件は以下の通りである。 《カラム条件》
カラム:ェコノカラム(BIO— RAD社製)
カタログ番号 737— 0516、内径 0. 5cm、
長さ 15cm、底面積 0. 2cm"
カラムビーズ: Si—アシッドクロライドビーズ(Sト Acid Chloride beads)
(0. 8g)
(カラム容量 = 1. 2mL)
リガンド:ペプチド Li5— 025又は PMB (8mg)
エンドトキシン: USP RSE (LPS E.coli O113:H10菌株由;生化学工業社製) エンドトキシン溶液: 2EUZmL (7mL)
保持容量 : 0. 4mL
流速: 0. 5mL/ mm
[0157] その結果、コントロールはすぐ飽和状態に達してしまったのに対し、 Li5— 025固定 化カラムは 2EUZmLの低濃度の LPSを 0. 05EUZmL以下まで吸着除去し、低濃 度の LPSでも更に除去できることが示唆された。また、 PMB固定ィ匕カラムの LPS除 去効率は約 60%程度であった。
[0158] 《実施例 19 :Li5— 025固定ィ匕カラムによる 1%BSA溶液中での LPS除去効率評価
(3) (オープンカラム法による)》
Li5— 025固定化カラムを作製し、オープンカラム法により 1%BSA溶液中の LPS 除去効率について確認した。同時に、 PMB固定ィ匕カラムや何も固定ィ匕していない力 ラムを作製し、 LPS除去効率を比較した。
具体的には実施例 11と同様の方法でペプチド (又は PMB)を固定ィ匕したカラムを 作製し、そのカラム上部から 1%BSA溶液 (LPS濃度 lOngZmL) 7mLを通流し、力 ラム下部力も溶出された LPSを 0. 4mLずつ回収し、その検体中に含まれる LPS量 を定量することにより、 1%BS A溶液中の LPS除去効率を評価した。カラム条件は以 下の通りである。
カラム:ェコノカラム(BIO— RAD社製)
カタログ番号 737— 0516、内径 0. 5cm、
長さ 15cm、底面積 0. 2cm"
カラムビーズ: Si—アシッドクロライドビーズ(Sト Acid Chloride beads) (0. 8g)
(カラム容量 = 1. 2mL)
リガンド:ペプチド Li5— 025又は PMB (8mg)
エンドトキシン: LPS (E.coli 0111:B4)
エンドトキシン溶液: 10ngZmL (7mL)
保持容量 : 0. 4mL
流速: 0. 5mL/ mm
[0159] その結果、コントロールはすぐ飽和状態に達してしまったのに対し、 Li5— 025固定 化カラムは 1%BSA溶液中に混在する lOngZmLの LPSを約 40%程度除去するこ とが示された。また、 PMB固定ィ匕カラムの LPS除去効率はコントロールと同じ範囲内 であり、 LPS除去能が殆ど見られなかった。シリカビーズを用いた PMB固定ィ匕カラム では他のタンパク質共存下条件において、 LPS除去効率が発揮されないと考えられ る。
[0160] 《実施例 20 :Li5— 025固定ィ匕カラムによる 1%BSA溶液中での LPS除去効率評価
(4) (ペプチド固定化濃度依存性評価)(オープンカラム法による)》
ペプチドの固定ィ匕量を増やしたカラムを用いて実施例 19と同様の試験を行ない、 1 %BSA溶液中の LPS除去能を測定することにより、ペプチド固定ィ匕濃度依存性につ いて評価した。ペプチド固定ィ匕量を 8mgから 24mgに変えたこと以外は、実施例 18と 同様の条件で行なった。
その結果、コントロールはすぐ飽和状態に達してしまったのに対し、 Li5— 025固定 化カラムは 1%BSA溶液中に混在する lOngZmLの LPSを約 90%以上除去し、ぺ プチドの固定ィ匕量を増加することにより LPS除去効率が増すことが示唆された。また 、 PMB固定ィ匕カラムは実施例 18と同様、 LPS除去能が殆ど確認されなかった。
[0161] 《実施例 21:ファインチューニングしたペプチドを用いた LPS中和能評価》
Π5-001をファインチューニングした、表 18に示すペプチド 3種をシグマジエノシ スにて合成し、 LPSの中和能について評価した。上記ペプチドと LPSを混ぜ、その 後の LPS量を測定することにより、 LPSの中和能について評価した。 PMBをポジティ
ブコントロールとし、比較した。なお、下記に記載した緩衝液、蒸留水、実験器具等は 、特に記載しない限り、全てエンドトキシンフリーのものを用いた。
[0162] [表 18] ^プチド アミノ酸配列
L i 5-025 kYSSS I SS I RAc
し i 5 K1 dK N2de I H1 OR C kYSSS I SS I RAC
W i n e Op e n e r kYSSS I SS I RGG L L L L L L L
[アミノ酸配列中、小文字で示すアミノ酸 (k、 c)は、 D体アミノ酸であることを示す。ま た、ペプチド Wine Openerの C末端の L (ロイシン)はアミドィ匕されて 、る]
[0163] 具体的には、先ず、それぞれのペプチド (又は PMB)を蒸留水で溶解し、 lmg/m Lの濃度に調製した。それらを蒸留水で 10倍希釈し、 Ing/mLまでの 10希釈系列 を作製した。それらに終濃度 lEUZmLとなるように LPS(USP Reference Standard E ndotoxin, E.coli O113:H10株由来;生化学工業社)をカ卩ぇまぜ、穏やかに攪拌しなが ら室温で 30分インキュベートした。その後、検体中の LPS量を、市販の測定キット(ェ ンドスぺシー ES-50Mセット;生化学工業社)にて測定した。
その結果、どのペプチドも濃度依存的な中和能が確認され、 100/zgZmLで 1EU ZmLの LPSを 70%以上中和することが示された。中でもペプチド Wine Opener は1001¾7!11しで87%以上の中和能を示し、 PMBより 100倍程度強い中和能を持 つことが示された。
[0164] 《実施例 22 :Li5— 025を用いた LPS検出感度(ビアコアシステムによる)》
本実施例では、 Li5— 025による LPS測定感度についてビアコア(BIAOCORE)シ ステム(BIACORE 2000; BIACORE社)を用いて確認し、表面プラズモン共鳴法によ る LPS検出法を検討した。
具体的には、センサーチップ(BIACORE Sensor Chip CM5; BIACORE社)のフロー セル(以下、 Fcと称する) 2に固定化量 271RU、 Fc3に 843RUの Li5— 025をチォ ールカップリングにて固定化した。コントロールとして、 Fclにシスティンを固定化した 前記センサーチップに対し、濃度の異なる LPS (E.coli K12株) [濃度 =10 ng/mL,
100 ng/mL, 1000 ng/mL;緩衝用 HBSバッファー(0.01
mol/L HEPES, pH 7.4, 0.15 mol/L NaCl, 3 mmol/L EDTA) ]をアナライトとして、そ れぞれ薄 ヽ濃度から順に流して測定した。
その結果、 Fc2で検出されたシグナルは、 10ng/mLでは 1. 7RU、 lOOng/mL では 2RU、 lOOOngZmLでは 3. 3RUが測定され、感度として lOngZmL程度であ ることが示された。また、 Fc3においては lOngZmLで 3. 2RUが検出され、 Li5— 0
25のチップ固定ィ匕量依存性も示された。
[0165] 《実施例 23:蛍光標識 Li5— 025によるグラム陰性菌の染色》
Π5— 025にフルォレセインを融合し、グラム陰性菌の染色を試みた。
蛍光標識ペプチドは、 Li5— 025の C末端のシスティンの SH基を利用してフルォレ セインを融合することにより調製した。菌としては、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa) 及び乳酸菌(Lactobacillus
casei)を用いた。それぞれ液体培地にて充分に増殖させた後、純水で 100倍希釈し 混合してスライドガラスに塗布した。乾燥後、 100%エタノールを滴下し、エタノール 固定を行なった。
固定化後、 1 gZmLの Li5— 025フルォレセインを滴下し、 15分間遮光して室温 でインキュベートした。純水で洗浄後、蛍光顕微鏡にて観察した。
グラム陰性菌である緑膿菌が強く蛍光染色され、グラム染色の代替法となることが 示された。
[0166] 《実施例 24 :Li5— 025固定ィ匕カラムを用いた血中エンドトキシン除去》
Li5— 025を固定ィ匕 [0. 8gのビーズ(Si- Acid Chloride)に 8mgのペプチド又は PM Bを固定化)したカラムを用い、全血でのエンドトキシン除去効果をオープンカラムに て比較した。なお、コントロールは何も固定化していない、ブロッキングのみのビーズ を用いた。
方法としては、 LPS濃度 2ngZmLとなるようにヒト全血に溶解し、 5mL流し、溶出さ れた全血を新しい全血 +RPMI培地に加え、 37°Cで 4時間インキュベートした。評価 は LPSによる TNF a誘導量によって行なった。全血は 3名の静脈から採取し、 lOun itsのへノ《リンと混合した。
LPS (エンドトキシン)は TNF aの発現を誘導するため、 TNF aの誘導量によって
、 LPSの吸着能を間接的に評価することができる。
[0167] 誘導された TNF aの値を表 19に示す。コントロールに比べ、 Li5— 025固定化ビ 一ズを通流した血液は、 TNF aの誘導量が低下しており、カラムによって LPSが除 去されたことを示唆する。
[0168] [表 19]
[0169] 《実施例 25 : Li5— 025誘導体による敗血症治療及び予防効果》
Li5— 025誘導体として、実施例 21で合成したペプチド Wine Opener (以下、ぺ プチド WOと称する)を用い、マウスエンドトキシン血症モデルに対する治療 ·予防効 果を評価した。
マウスは C3HZHeNを用いた。投与方法は以下の通りである。また、それぞれのグ ループは 8匹で構成されている。
グループ A:コントロール。マウスに生理食塩水を静脈注射し、 30分後に再度静脈注 射。
グループ B:生理食塩水を静脈注射後、 30分後にペプチド WOを lOmgZkgを静脈 投与。
グループ C: 2mgZkgの LPSを静脈投与後、 30分後に生理食塩水を静脈投与。 グループ E : 2mgZkgの LPSを静脈投与後、 30分後にペプチド WOを lOmgZkgを 静脈投与。
グループ G: 2mgZkgの LPSと lOmgZkgのペプチド WOを混合後に静脈投与。
[0170] 評価は敗血症性ショックによって誘導される体重減少を投与前体重との比で示した 。 3日目、 6日目の体重減少量 (比)を表 20に示す。表 20において、数値は平均減少 量 (投与前との体重比)を示し、括弧内はグループの平均力もの解離の上限と加減を 示した。
[0171] [表 20]
[0172] 表 20に示す通り、 LPSのみ投与群(C)ではコントロール (A)と比較し、 3日目、 6日 目共に有意な体重減少が見られた。また LPS投与後 30分後に WOを投与した群 (E )では、 1日目まではグループ Cと同様の体重減少が見られた力 3日目、 6日目では 有意に回復が見られた。また、 LPSと WOの混合投与群 (G)では有意な体重減少は 見られず、 WOには予防的な効果も見られることが示された。
また、グループ Bのペプチドのみ投与群ではコントロール(グループ A)と比較し、有 意な体重減少は見られず、ペプチド単独の体重に影響する短期毒性は見られなか つた (表には示さず)。
産業上の利用可能性
[0173] 本発明のリポ多糖及び Z又はリピッド A結合剤は、例えば、リポ多糖及び Z又はリピ ッド A除去、あるいは、リポ多糖及び Z又はリピッド A中和の用途に適用することがで きる。
配列表フリーテキスト
[0174] 配列表の配列番号 1〜124の配列で表される各アミノ酸配列は、リポ多糖及び Z又 はリピッド A結合ペプチドである。
配列表の配列番号 125の配列で表されるアミノ酸配列は、マーカー配列である。 配列表の配列番号 1、 16、 24、 30の配列で表される各アミノ酸配列における 1番目 及び 11番目の各アミノ酸「Xaa」は、それぞれ独立に、リジン、アルギニン、又はヒスチ ジンを意味する。
配列表の配列番号 2、 5、 20〜23、 25〜29、 71〜74、 76〜80の配列で表される 各アミノ酸配列における 1番目のアミノ酸「Xaa」は、リジン、アルギニン、又はヒスチジ ンを意味する。
配列表の配列番号 3、 54〜56の配列で表される各アミノ酸配列における 1番目及
び 11番目の各アミノ酸「Xaa」は、それぞれ独立に、リジン、アルギニン、又はヒスチジ ンを意味し、 2番目〜: LO番目の各アミノ酸「Xaa」は、それぞれ独立に、任意のァミノ 酸を意味する。
配列表の配列番号 4、 67、 75、 81、 82の配列で表される各アミノ酸配列における 1 番目及び 10番目の各アミノ酸「Xaa」は、それぞれ独立に、リジン、アルギニン、又はヒ スチジンを意味する。
配列表の配列番号 6、 106〜 108の配列で表される各アミノ酸配列における 1番目 及び 10番目の各アミノ酸「Xaa」は、それぞれ独立に、リジン、アルギニン、又はヒスチ ジンを意味し、 2番目〜9番目の各アミノ酸「Xaa」は、それぞれ独立に、任意のァミノ 酸を意味する。
配列表の配列番号 36、 37、 43、 44の配列で表される各アミノ酸配列における 10 番目のアミノ酸「Xaa」は、リジン、アルギニン、又はヒスチジンを意味する。
配列表の配列番号 45〜53の配列で表される各アミノ酸配列における 2番目〜 10 番目の各アミノ酸「Xaa」は、それぞれ独立に、任意のアミノ酸を意味する。
配列表の配列番号 88、 89、 95、 96の配列で表される各アミノ酸配列における 9番 目のアミノ酸「Xaa」は、リジン、アルギニン、又はヒスチジンを意味する。
配列表の配列番号 97〜 105の配列で表される各アミノ酸配列における 2番目〜9 番目の各アミノ酸「Xaa」は、それぞれ独立に、任意のアミノ酸を意味する。