JP2004189658A - ＩｇＧ精製用吸着剤及びＩｇＧの精製法 - Google Patents
ＩｇＧ精製用吸着剤及びＩｇＧの精製法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2004189658A JP2004189658A JP2002358615A JP2002358615A JP2004189658A JP 2004189658 A JP2004189658 A JP 2004189658A JP 2002358615 A JP2002358615 A JP 2002358615A JP 2002358615 A JP2002358615 A JP 2002358615A JP 2004189658 A JP2004189658 A JP 2004189658A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- amino acid
- igg
- purifying
- acid sequence
- fragment
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Abstract
【課題】ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有する新規なペプチド又はタンパク質を利用したＩｇＧ精製用吸着剤、及びＩｇＧの精製法を提供する。
【解決手段】各種動物由来のＩｇＧのＦｃフラグメントをターゲット物質として用い、ファージディスプレイ法によりスクリーニングを行い、該ターゲット物質に結合性を有するペプチドのアミノ酸配列を同定する。このようにして得られた配列番号１〜１６４で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有するペプチド又はタンパク質をアフィニティリガンドとして担体上に固定化し、これを用いてＩｇＧの精製を行う。
【選択図】 なし
【解決手段】各種動物由来のＩｇＧのＦｃフラグメントをターゲット物質として用い、ファージディスプレイ法によりスクリーニングを行い、該ターゲット物質に結合性を有するペプチドのアミノ酸配列を同定する。このようにして得られた配列番号１〜１６４で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有するペプチド又はタンパク質をアフィニティリガンドとして担体上に固定化し、これを用いてＩｇＧの精製を行う。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、担体上にＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有する新規なペプチド又はタンパク質を固定化したＩｇＧ精製用吸着剤、及びＩｇＧの精製法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
免疫反応の中心的な役割を担うタンパク質である抗体は、従来から医療や臨床診断をはじめとする幅広い分野で利用されており、近年では、抗体を利用した医薬品（抗体医薬品）の開発も盛んに行なわれている。
【０００３】
また、抗体は、微量物質を特異的に検出・測定する手段としても利用されており、酵素免疫測定法や蛍光免疫測定法等に用いられている。これらの測定方法は、検査薬に応用されているほか、医学・薬学・生化学分野等の研究に欠くことのできないものとなっている。
【０００４】
一般的な抗体の作製方法としては、マウス、ウサギ、ヒツジ等の動物に抗原を接種して免疫することによって抗血清を調製し、その抗血清からポリクローナル抗体を精製する方法、ハイブリドーマをマウス等の腹腔にて増殖させ、モノクローナル抗体を含む腹水を調製し、その腹水から抗体を精製する方法、ハイブリドーマを血清培地や無血清培地中で培養してモノクローナル抗体を含む培養液を調製し、その培養液から抗体を精製する方法等がある。
【０００５】
そして、上記のようにして得られた抗血清や腹水、培養液から抗体を精製する方法としては、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等の精製方法が知られている。例えば、アフィニティクロマトグラフィーには、ＩｇＧのＦｃフラグメントに対して結合性を有するプロテインＡやプロテインＧをリガンドとして固定化したゲルが広く用いられている。
【０００６】
一方、非特許文献１には、ヒトＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドとして、配列番号２８３〜２８９で表されるペプチドが報告されており、ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドが、分析や医薬用途の抗体の精製工程におけるアフィニティリガンドとして利用できる可能性があることが記載されている。
【０００７】
【非特許文献１】
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２２１ （１９９８） １５１−１５７
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記のプロテインＡやプロテインＧは、▲１▼抗体を産生する動物の種類によっては、ＩｇＧであってもプロテインＡやプロテインＧに対する結合性を持たないため、プロテインＡやプロテインＧを固定化したゲルの適用範囲が狭い、▲２▼ＩｇＧとプロテインＡ（又はプロテインＧ）との結合が強固で、ＩｇＧの回収に強酸性の溶離液を使用しなければならず、ＩｇＧの変性や失活が起こり易い、▲３▼菌類由来であるプロテインＡやプロテインＧは量産化が困難であり、その調製コストが高い、▲４▼原料の菌体に由来する夾雑物の混入等が懸念されるなどの安全性の面で不安があるため、医薬用途に用いられる抗体の精製には利用しにくい、などの欠点があった。
【０００９】
一方、ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドは、化学合成することができるため、低コストで大量調製が可能であり、更に、夾雑物の混入等の心配がなく、医薬用途の抗体の精製にも利用しやすい等の利点があるが、上記非特許文献１に記載されたペプチド以外にＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドは報告されていない。また、ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドを利用してＩｇＧの精製が行われたという報告もなされていない。
【００１０】
したがって、本発明の目的は、ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有する新規なペプチド又はタンパク質を利用したＩｇＧ精製用吸着剤、及びＩｇＧの精製法を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するため、本発明の第一は、担体上に、配列番号１〜１６４で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又はタンパク質を固定化してなることを特徴とするＩｇＧ精製用吸着剤である。
【００１２】
本発明の第一によれば、ＩｇＧへの特異性が高く、効率よくＩｇＧを精製することができるＩｇＧ精製用吸着剤を提供できる。このＩｇＧ精製用吸着剤は、上記のＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又はタンパク質を担体上に固定化しているので、不純物等の混入を厳密に管理する必要のある医薬品用途の抗体の精製に特に好適に用いることができる。また、ペプチドは化学合成でき、低コストで大量に調製できるので、製造コストの低減を図ることができる。
【００１３】
上記第一の発明の好ましい態様においては、ヒト由来ＩｇＧを精製する際に用いられるＩｇＧ精製用吸着剤であって、担体上に、配列番号１〜８７で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、ヒト由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又はタンパク質を固定化してなるＩｇＧ精製用吸着剤が提供される。これによれば、ヒト由来ＩｇＧへの特異性が高く、効率よくヒト由来ＩｇＧを精製することができるＩｇＧ精製用吸着剤を提供できる。
【００１４】
また、別の好ましい態様においては、ウマ由来ＩｇＧを精製する際に用いられるＩｇＧ精製用吸着剤であって、担体上に、配列番号８８〜９０で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、ウマ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又はタンパク質を固定化してなるＩｇＧ精製用吸着剤が提供される。これによれば、ウマ由来ＩｇＧへの特異性が高く、効率よくウマ由来ＩｇＧを精製することができるＩｇＧ精製用吸着剤を提供できる。
【００１５】
また、更に別の好ましい態様においては、ヒツジ由来ＩｇＧを精製する際に用いられるＩｇＧ精製用吸着剤であって、担体上に、配列番号９１〜９３で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、ヒツジ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又はタンパク質を固定化してなるＩｇＧ精製用吸着剤が提供される。これによれば、ヒツジ由来ＩｇＧへの特異性が高く、効率よくヒツジ由来ＩｇＧを精製することができるＩｇＧ精製用吸着剤を提供できる。
【００１６】
また、更に別の好ましい態様においては、ウサギ由来ＩｇＧを精製する際に用いられるＩｇＧ精製用吸着剤であって、担体上に、配列番号９４〜９７で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、ウサギ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又はタンパク質を固定化してなるＩｇＧ精製用吸着剤が提供される。これによれば、ウサギ由来ＩｇＧへの特異性が高く、効率よくウサギ由来ＩｇＧを精製することができるＩｇＧ精製用吸着剤を提供できる。
【００１７】
また、更に別の好ましい態様においては、モルモット由来ＩｇＧを精製する際に用いられるＩｇＧ精製用吸着剤であって、担体上に、配列番号９８〜１０４で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、モルモット由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又はタンパク質を固定化してなるＩｇＧ精製用吸着剤が提供される。これによれば、モルモット由来ＩｇＧへの特異性が高く、効率よくモルモット由来ＩｇＧを精製することができるＩｇＧ精製用吸着剤を提供できる。
【００１８】
また、更に別の好ましい態様においては、ヤギ由来ＩｇＧを精製する際に用いられるＩｇＧ精製用吸着剤であって、担体上に、配列番号１０５〜１０８で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、ヤギ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又はタンパク質を固定化してなるＩｇＧ精製用吸着剤が提供される。これによれば、ヤギ由来ＩｇＧへの特異性が高く、効率よくヤギ由来ＩｇＧを精製することができるＩｇＧ精製用吸着剤を提供できる。
【００１９】
また、更に別の好ましい態様においては、ネコ由来ＩｇＧを精製する際に用いられるＩｇＧ精製用吸着剤であって、担体上に、配列番号１０９〜１３１で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、ネコ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又はタンパク質を固定化してなるＩｇＧ精製用吸着剤が提供される。これによれば、ネコ由来ＩｇＧへの特異性が高く、効率よくネコ由来ＩｇＧを精製することができるＩｇＧ精製用吸着剤を提供できる。
【００２０】
また、更に別の好ましい態様においては、イヌ由来ＩｇＧを精製する際に用いられるＩｇＧ精製用吸着剤であって、担体上に、配列番号１３２〜１５１で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、イヌ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又はタンパク質を固定化してなるＩｇＧ精製用吸着剤が提供される。これによれば、イヌ由来ＩｇＧへの特異性が高く、効率よくイヌ由来ＩｇＧを精製することができるＩｇＧ精製用吸着剤を提供できる。
【００２１】
また、更に別の好ましい態様においては、ウシ由来ＩｇＧを精製する際に用いられるＩｇＧ精製用吸着剤であって、担体上に、配列番号１５２〜１５６で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、ウシ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又はタンパク質を固定化してなるＩｇＧ精製用吸着剤が提供される。これによれば、ウシ由来ＩｇＧへの特異性が高く、効率よくウシ由来ＩｇＧを精製することができるＩｇＧ精製用吸着剤を提供できる。
【００２２】
また、更に別の好ましい態様においては、ブタ由来ＩｇＧを精製する際に用いられるＩｇＧ精製用吸着剤であって、担体上に、配列番号１５７〜１６２で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、ブタ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又はタンパク質を固定化してなるＩｇＧ精製用吸着剤が提供される。これによれば、ブタ由来ＩｇＧへの特異性が高く、効率よくブタ由来ＩｇＧを精製することができるＩｇＧ精製用吸着剤を提供できる。
【００２３】
また、更に別の好ましい態様においては、マウス由来ＩｇＧを精製する際に用いられるＩｇＧ精製用吸着剤であって、担体上に、配列番号１６３〜１６４で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、マウス由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又はタンパク質を固定化してなるＩｇＧ精製用吸着剤が提供される。これによれば、マウス由来ＩｇＧへの特異性が高く、効率よくマウス由来ＩｇＧを精製することができるＩｇＧ精製用吸着剤を提供できる。
【００２４】
また、本発明の第二は、ＩｇＧを精製する際に、配列番号１〜１６４で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又はタンパク質を、アフィニティリガンドとして用いることを特徴とするＩｇＧの精製法である。
【００２５】
本発明の第二によれば、上記のＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又はタンパク質を、ＩｇＧを精製する際のアフィニティリガンドとして用いることにより、効率よくＩｇＧを精製することができる。また、ペプチドは化学合成でき、低コストで大量に調製できるので、精製コストの低減を図ることができる。本発明の精製法は、不純物等の混入を厳密に管理する必要のある医薬品用途の抗体の精製に特に好適に適用することができる。
【００２６】
上記第二の発明の好ましい態様においては、ヒト由来ＩｇＧを精製する際に、配列番号１〜８７で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、ヒト由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又はタンパク質を、アフィニティリガンドとして用いることが好ましい。これによれば、ヒト由来ＩｇＧを効率よく精製することができる。
【００２７】
また、別の好ましい態様においては、ウマ由来ＩｇＧを精製する際に、配列番号８８〜９０で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、ウマ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又はタンパク質を、アフィニティリガンドとして用いることが好ましい。これによれば、ウマ由来ＩｇＧを効率よく精製することができる。
【００２８】
また、更に別の好ましい態様においては、ヒツジ由来ＩｇＧを精製する際に、配列番号９１〜９３で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、ヒツジ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又はタンパク質を、アフィニティリガンドとして用いることが好ましい。これによれば、ヒツジ由来ＩｇＧを効率よく精製することができる。
【００２９】
また、更に別の好ましい態様によれば、ウサギ由来ＩｇＧを精製する際に、配列番号９４〜９７で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、ウサギ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又はタンパク質を、アフィニティリガンドとして用いることが好ましい。これによれば、ウサギ由来ＩｇＧを効率よく精製することができる。
【００３０】
また、更に別の好ましい態様によれば、モルモット由来ＩｇＧを精製する際に、配列番号９８〜１０４で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、モルモット由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又はタンパク質を、アフィニティリガンドとして用いることが好ましい。これによれば、モルモット由来ＩｇＧを効率よく精製することができる。
【００３１】
また、更に別の好ましい態様によれば、ヤギ由来ＩｇＧを精製する際に、配列番号１０５〜１０８で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、ヤギ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又はタンパク質を、アフィニティリガンドとして用いることが好ましい。これによれば、ヤギ由来ＩｇＧを効率よく精製することができる。
【００３２】
また、更に別の好ましい態様によれば、ネコ由来ＩｇＧを精製する際に、配列番号１０９〜１３１で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、ネコ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又はタンパク質を、アフィニティリガンドとして用いることが好ましい。これによれば、ネコ由来ＩｇＧを効率よく精製することができる。
【００３３】
また、更に別の好ましい態様によれば、イヌ由来ＩｇＧを精製する際に、配列番号１３２〜１５１で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、イヌ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又はタンパク質を、アフィニティリガンドとして用いることが好ましい。これによれば、イヌ由来ＩｇＧを効率よく精製することができる。
【００３４】
また、更に別の好ましい態様によれば、ウシ由来ＩｇＧを精製する際に、配列番号１５２〜１５６で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、ウシ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又はタンパク質を、アフィニティリガンドとして用いることが好ましい。これによれば、ウシ由来ＩｇＧを効率よく精製することができる。
【００３５】
また、更に別の好ましい態様によれば、ブタ由来ＩｇＧを精製する際に、配列番号１５７〜１６２で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、ブタ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又はタンパク質を、アフィニティリガンドとして用いることが好ましい。これによれば、ブタ由来ＩｇＧを効率よく精製することができる。
【００３６】
また、更に別の好ましい態様によれば、マウス由来ＩｇＧを精製する際に、配列番号１６３〜１６４で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、マウス由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又はタンパク質を、アフィニティリガンドとして用いることが好ましい。これによれば、マウス由来ＩｇＧを効率よく精製することができる。
【００３７】
【発明の実施の形態】
本発明において、アフィニティリガンドとして用いられるペプチドは、ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドであり、ペプチド中に配列番号１〜１６４で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有するものである。なお、本発明において、アフィニティリガンドとは、タンパク質に特異的に結合する物質を意味する。
【００３８】
本発明で用いられるペプチドは、上記の部分アミノ酸配列を有するものであれば、そのアミノ酸数は特に制限されないが、通常、アミノ酸数４〜５０個からなることが好ましく、アミノ酸数６〜２０個からなることがより好ましい。また、本発明のペプチドは、ＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾（例えばアセチル化、アシル化、アミド化、カルボキシル化、リン酸化、糖鎖の付加等）、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失があってもよい。なお、本発明で用いられるペプチドは、上記アミノ酸配列を複数個有していてもよい。
【００３９】
また、本発明のタンパク質は、ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するタンパク質であって、タンパク質中に配列番号１〜１６４で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有するものであり、その分子量等は特に制限されないが、上記アミノ酸配列を有する部分が、ＩｇＧのＦｃフラグメントと接触・結合できるように、タンパク分子上に提示されている必要がある。なお、本発明のタンパク質は、上記アミノ酸配列を複数個有していてもよい。
【００４０】
本発明のタンパク質としては、以下のようなものが例示できる。
▲１▼上記ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドを、ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）、ＡＰ（アルカリフォスファターゼ）、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素等の酵素に結合したもの。このようなタンパク質は、例えば「超高感度酵素免疫測定法」（石川栄治著 学会出版センター）等に記載された公知の方法にしたがって、上記ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドと上記酵素とを結合させることにより得ることができる。
【００４１】
▲２▼上記ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドを表面に提示したファージ。
【００４２】
このようなファージは、Ｓｍｉｔｈ， Ｇ． Ｐ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２８８， １３１５−１３１７ （１９８５）、Ｊ．Ｋ． Ｓｃｏｔｔ ａｎｄ Ｇ． Ｐ． Ｓｍｉｔｈ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４９， ３８６−３９０ （１９９０）等に記載されたファージライブラリの作製方法にしたがって得ることができる。すなわち、上記ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドをコードするＤＮＡを化学合成し、このＤＮＡをファージラブラリを作製するときと同様の方法で、ファージＤＮＡの外殻タンパク質をコードする遺伝子に挿入し、このＤＮＡを大腸菌に導入することにより、所望のペプチドを表面に提示したファージを得ることができる。
【００４３】
▲３▼上記ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドを所定の抗原に連結したものと、該抗原に対する抗体とを結合させた抗体。このような抗体は、本出願人による特願２００２−２４１６８８号に記載された方法によって得ることができる。例えば、上記ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドと抗原となるペプチドとを連続した一つのペプチドとして合成し、前記抗原に対する抗体との抗原抗体反応により結合させればよい。
【００４４】
本発明のペプチドは、ＩｇＧのＦｃフラグメントをターゲット物質として、ファージディスプレイ法（Ｓｍｉｔｈ， Ｇ．Ｐ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２８８， １３１５−１３１７ （１９８５））によって得られたものであるが、コンピューターソフト（日立Ｂｉｏ Ｐａｃｋａｇｅ）を用いた解析によっても得ることができる。なお、ファージディスプレイ法は、ファージの外殻タンパク質に、ランダムなアミノ酸配列を有するペプチド（通常、アミノ酸数５〜１２個程度）を融合タンパク質として提示させたファージライブラリを用いて、ターゲット物質に結合するペプチドをスクリーニングする方法である。ファージライブラリは、例えば、Ｓｍｉｔｈ， Ｇ． Ｐ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２８８， １３１５−１３１７ （１９８５）、Ｊ． Ｋ． Ｓｃｏｔｔ ａｎｄ Ｇ． Ｐ． Ｓｍｉｔｈ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４９， ３８６−３９０ （１９９０）等に記載された方法にしたがって、ランダム化したＤＮＡを化学合成し、これをファージＤＮＡの外殻タンパク質をコードする遺伝子に挿入し、このＤＮＡを大腸菌に導入することにより調製することができる。また、ファージライブラリは市販されており、例えば、商品名「Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｋｉｔ」、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ社製）等を用いることもできる。
【００４５】
そして、ファージディスプレイ法等により決定されたアミノ酸配列に基づいて、例えば、固相法、Ｆｍｏｃ法等の公知のペプチド合成法により、目的とするペプチドを簡単に合成することができる。
【００４６】
そして、得られたペプチドやタンパク質を適当な担体に結合・固定化することにより、本発明のＩｇＧ精製用吸着剤を得ることができる。ペプチドやタンパク質を固定化する担体としては、ペプチドやタンパク質を化学的或いは物理的に固定化できるものであれば特に制限なく用いることができるが、カラム用担体又はバッチ処理では磁気ビーズ等が好ましく用いられる。カラム用担体としては、セファロース、シリカ粒子等の材質からなる粒径１〜１００μｍのビーズが好ましく例示できる。このようなカラム用担体は市販されており、例えば、商品名「ＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＨＰ」（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、商品名「トシル基活性化ダイナビーズＭ−２８０」（Ｄｙｎａｌ社製）等を用いることができる。ちなみに、商品名「ＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＨＰ」（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）は、セファロースビーズ上にＮＨＳがあり、タンパク質やペプチド上の第１級アミノ基と共有結合する形で固定化することができる。また、商品名「トシル基活性化ダイナビーズＭ−２８０」（Ｄｙｎａｌ社製）は、疎水性ビーズ表面にトシル基があり、ペプチドやタンパク質上の第１級アミノ基やスルフヒドリル基と共有結合する形で固定化することができる。
【００４７】
本発明においては、ペプチドを担体に固定化する際に、ペプチドの末端に担体との結合に利用できる適当なスペーサーを挿入したペプチドを用いることが好ましい。スペーサーとしては、例えば、アミノ酸、ペプチド、炭素数２〜１８の主鎖（主鎖中にエステル結合やエーテル結合を有していてもよい。）を有し、好ましくは水酸基等の親水性の官能基を有するもの（例えば、両末端に活性基を有するポリビニルアルコール、好ましくはビニルアルコール分子が２〜１０程度重合したもの）、２〜１０糖からなる糖鎖等が例示できる。上記アミノ酸は、担体との結合に利用可能な官能基を有するアミノ酸が好ましく、例えば、アルギニン、リシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸等が例示できる。また、上記ペプチドとしては、グリシンやセリンが数個（通常２〜１０個）ペプチド結合したペプチド等のフレキシブルリンカー等が好ましく挙げられる。例えば、スペーサーがアミノ酸やペプチドである場合は、スペーサーを挿入したペプチドを連続した一つのペプチドとして合成することができるので好ましい。
【００４８】
スペーサーを挿入することにより、担体への固定化を行いやすくなると共に、スペーサーの長さを調整することにより、上記ペプチドとターゲット物質（ＩｇＧのＦｃフラグメント）との立体的な結合阻害を回避して、上記ペプチドとターゲット物質（ＩｇＧのＦｃフラグメント）との接触をより容易にすることができるので、カラム性能の向上を図ることが可能となる。
【００４９】
次に、本発明で用いられるペプチドについて詳しく説明する。
配列番号１〜８７で表されるアミノ酸配列は、ヒト由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドの共通配列である。これらの共通配列は、上記のようなファージライブラリを、ヒト由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに接触させて選択操作（バイオパニング）を行い、ヒト由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合するペプチドを発現したファージ群のみを選択し、このファージのＤＮＡを解析することにより、ファージ表面に提示されたペプチドのアミノ酸配列を同定して得られたペプチドのアミノ酸配列を比較することにより決定したものである（実施例１の表２参照）。
【００５０】
したがって、配列番号１〜８７で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有するペプチド又はタンパク質は、ヒト由来ＩｇＧ精製用吸着剤のアフィニティリガンドとして用いることができる。本発明においては、配列番号１〜８７で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有する１種又は２種以上のペプチド又はタンパク質を担体に固定化してもよい。
【００５１】
配列番号８８〜９０で表されるアミノ酸配列は、ウマ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドの共通配列である。これらの共通配列は、ターゲット物質としてウマ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントを用い、上記と同様にしてファージディスプレイ法を行うことによって得られたペプチドのアミノ酸配列を比較することにより決定したものである（実施例６の表４参照）。
【００５２】
したがって、配列番号８８〜９０で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有するペプチド又はタンパク質は、ウマ由来ＩｇＧ精製用吸着剤のアフィニティリガンドとして用いることができる。本発明においては、配列番号８８〜９０で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有する１種又は２種以上のペプチド又はタンパク質を担体に固定化してもよい。
【００５３】
配列番号９１〜９３で表されるアミノ酸配列は、ヒツジ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドの共通配列である。これらの共通配列は、ターゲット物質としてヒツジ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントを用い、上記と同様にしてファージディスプレイ法を行うことによって得られたペプチドのアミノ酸配列を比較することにより決定したものである（実施例７の表６参照）。
【００５４】
したがって、配列番号９１〜９３で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有するペプチド又はタンパク質は、ヒツジ由来ＩｇＧ精製用吸着剤のアフィニティリガンドとして用いることができる。本発明においては、配列番号９１〜９３で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有する１種又は２種以上のペプチド又はタンパク質を担体に固定化してもよい。
【００５５】
配列番号９４〜９７で表されるアミノ酸配列は、ウサギ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドであり、ターゲット物質としてウサギ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントを用い、上記と同様にしてファージディスプレイ法を行うことにより、アミノ酸配列を同定したものである（実施例８の表８参照）。
【００５６】
したがって、配列番号９４〜９７で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有するペプチド又はタンパク質は、ウサギ由来ＩｇＧ精製用吸着剤のアフィニティリガンドとして用いることができる。本発明においては、配列番号９４〜９７で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有する１種又は２種以上のペプチド又はタンパク質を担体に固定化してもよい。
【００５７】
配列番号９８〜１０４で表されるアミノ酸配列は、モルモット由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドの共通配列である。これらの共通配列は、ターゲット物質としてモルモット由来ＩｇＧのＦｃフラグメントを用い、上記と同様にしてファージディスプレイ法を行うことによって得られたペプチドのアミノ酸配列を比較することにより決定したものである（実施例９の表１０参照）。
【００５８】
したがって、配列番号９８〜１０４で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有するペプチド又はタンパク質は、モルモット由来ＩｇＧ精製用吸着剤のアフィニティリガンドとして用いることができる。本発明においては、配列番号９８〜１０４で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有する１種又は２種以上のペプチド又はタンパク質を担体に固定化してもよい。
【００５９】
配列番号１０５〜１０８で表されるアミノ酸配列は、ヤギ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドの共通配列である。これらの共通配列は、ターゲット物質としてヤギ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントを用い、上記と同様にしてファージディスプレイ法を行うことによって得られたペプチドのアミノ酸配列を比較することにより決定したものである（実施例１０の表１２参照）。
【００６０】
したがって、配列番号１０５〜１０８で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有するペプチド又はタンパク質は、ヤギ由来ＩｇＧ精製用吸着剤のアフィニティリガンドとして用いることができる。本発明においては、配列番号１０５〜１０８で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有する１種又は２種以上のペプチド又はタンパク質を担体に固定化してもよい。
【００６１】
配列番号１０９〜１３１で表されるアミノ酸配列は、ネコ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドの共通配列である。これらの共通配列は、ターゲット物質としてネコ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントを用い、上記と同様にしてファージディスプレイ法を行うことによって得られたペプチドのアミノ酸配列を比較することにより決定したものである（実施例１１の表１４参照）。
【００６２】
したがって、配列番号１０９〜１３１で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有するペプチド又はタンパク質は、ネコ由来ＩｇＧ精製用吸着剤のアフィニティリガンドとして用いることができる。本発明においては、配列番号１０９〜１３１で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有する１種又は２種以上のペプチド又はタンパク質を担体に固定化してもよい。
【００６３】
配列番号１３２〜１５１で表されるアミノ酸配列は、イヌ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドの共通配列である。これらの共通配列は、ターゲット物質としてイヌ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントを用い、上記と同様にしてファージディスプレイ法を行うことによって得られたペプチドのアミノ酸配列を比較することにより決定したものである（実施例１２の表１６参照）。
【００６４】
したがって、配列番号１３２〜１５１で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有するペプチド又はタンパク質は、イヌ由来ＩｇＧ精製用吸着剤のアフィニティリガンドとして用いることができる。本発明においては、配列番号１３２〜１５１で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有する１種又は２種以上のペプチド又はタンパク質を担体に固定化してもよい。
【００６５】
配列番号１５２〜１５６で表されるアミノ酸配列は、ウシ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドの共通配列である。これらの共通配列は、ターゲット物質としてウシ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントを用い、上記と同様にしてファージディスプレイ法を行うことによって得られたペプチドのアミノ酸配列を比較することにより決定したものである（実施例１３の表１８参照）。
【００６６】
したがって、配列番号１５２〜１５６で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有するペプチド又はタンパク質は、ウシ由来ＩｇＧ精製用吸着剤のアフィニティリガンドとして用いることができる。本発明においては、配列番号１５２〜１５６で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有する１種又は２種以上のペプチド又はタンパク質を担体に固定化してもよい。
【００６７】
配列番号１５７〜１６２で表されるアミノ酸配列は、ブタ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドの共通配列である。これらの共通配列は、ターゲット物質としてブタ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントを用い、上記と同様にしてファージディスプレイ法を行うことによって得られたペプチドのアミノ酸配列を比較することにより決定したものである（実施例１４の表２０参照）。
【００６８】
したがって、配列番号１５７〜１６２で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有するペプチド又はタンパク質は、ウシ由来ＩｇＧ精製用吸着剤のアフィニティリガンドとして用いることができる。本発明においては、配列番号１５７〜１６２で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有する１種又は２種以上のペプチド又はタンパク質を担体に固定化してもよい。
【００６９】
配列番号１６３〜１６４で表されるアミノ酸配列は、マウス由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドの共通配列である。これらの共通配列は、ターゲット物質としてマウス由来ＩｇＧのＦｃフラグメントを用い、上記と同様にしてファージディスプレイ法を行うことによって得られたペプチドのアミノ酸配列を比較することにより決定したものである（実施例１５の表２２参照）。
【００７０】
したがって、配列番号１６３〜１６４で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有するペプチド又はタンパク質は、マウス由来ＩｇＧ精製用吸着剤のアフィニティリガンドとして用いることができる。本発明においては、配列番号１６３〜１６４で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有する１種又は２種以上のペプチド又はタンパク質を担体に固定化してもよい。
【００７１】
本発明のＩｇＧの精製法は、上記の各種ペプチド又はタンパク質を固定化した担体（ＩｇＧ精製用吸着剤）を用いて、通常のプロテインＡやプロテインＧを利用したアフィニティカラムによるＩｇＧの精製法と同様にして行うことができる。すなわち、上記ＩｇＧ精製用吸着剤を充填したカラムをＰＢＳ等の緩衝液で平衡化した後、ＩｇＧを含む試料を負荷し、ＰＢＳ等の緩衝液でカラムを洗浄する。そして、カラムに溶離液を流して、ｐＨ低下、塩濃度を高めるなどすることにより、吸着されたＩｇＧを溶出すればよい。なお、後述する実施例に示されるように、ＩｇＧのＦｃフラグメントに対する親和性の弱いペプチドをアフィニティリガンドとして固定化した担体を用いた場合は、リテンションタイムの違いによるＩｇＧの精製も可能であり、ＩｇＧを精製する際に問題となるＩｇＧの失活や変性を防止できる。
【００７２】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。
【００７３】
実施例１
（１）ヒト由来ＩｇＧのＦｃフラグメント（以下、ｈｕｍａｎ Ｆｃと略記する。）に結合性を有するペプチドのスクリーニング
ターゲット物質として、ｈｕｍａｎ Ｆｃを用い、ファージディスプレイ法により、ｈｕｍａｎ Ｆｃに結合性を有するペプチドのスクリーニングを以下のようにして行った。なお、ファージディスプレイ法では、Ｍ１３ファージの表面のマイナータンパクｐＩＩＩにペプチドがランダムに提示されるライブラリ（提示されるランダムアミノ酸数が７個、１０個、１２個のペプチドライブラリ）を、Ｓｍｉｔｈ， Ｇ．Ｐ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２８８， １３１５−１３１７ （１９８５）、Ｊ．Ｋ． Ｓｃｏｔｔ ａｎｄ Ｇ．Ｐ． Ｓｍｉｔｈ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４９， ３８６−３９０ （１９９０）等の記載に基づいて作成し、この３種類のライブラリを用いた。
【００７４】
ターゲットとなるｈｕｍａｎ Ｆｃ（ＩＣＮ／ＣＡＰＰＥＬ社製、ＰＵＲＩＦＩＥＤ ＨＵＭＡＮ ＩＧＧ ＦＣ）は、商品名「ｓｕｌｆｏＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ」（ピアース社製）を用いてビオチン標識し、ストレプトアビジンでコートされた磁気ビーズ（商品名「Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ２８０ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ」、Ｄｙａｎａｌ社製）に、ビオチン−ストレプトアビジン結合活性を利用して固定化した。この磁気ビーズは非特異的な結合を最低限にするため、２％（ｗ／ｖ）スキムミルク溶液（１０ｍＭリン酸バッファ、ｐＨ７．４）に懸濁してブロッキングを行った。
【００７５】
この磁気ビーズを用いて、常法にしたがってファージディスプレイ法（選択操作３回）を行い、配列番号１６５〜２０７で表されるｈｕｍａｎ Ｆｃに結合性を有するペプチドのアミノ酸配列を同定した。
【００７６】
（２）得られたペプチドのｈｕｍａｎ Ｆｃに対する結合性の確認
ターゲットとなるｈｕｍａｎ Ｆｃを、コーニング社製ＥＬＩＳＡプレート（高結合タイプ）に以下のようにして固定化した。ｈｕｍａｎ Ｆｃ（ＩＣＮ／ＣＡＰＰＥＬ社製、ＰＵＲＩＦＩＥＤ ＨＵＭＡＮＩＧＧ ＦＣ）を１００μｇ／ｍｌとなるように炭酸バッファ（１００ｍＭ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．０）に溶解した溶液を調製し、この溶液を１００μｌずつプレートのウェルに入れて４℃で一晩放置して、ｈｕｍａｎ Ｆｃフラグメントの固定化を行った。また、上記と同様にして、特異性の対照として、ニワトリ、ウサギ、ウマ、ヤギ由来の各種ＩｇＧのＦｃフラグメント（いずれもＲＯＣＫＬＡＮＤ社製）を、コーニング社製ＥＬＩＳＡプレート（高結合タイプ）に固定化した。
【００７７】
なお、ウェルは２４列用い、１列は抗ｈｕｍａｎ Ｆｃ抗体用（ポジティブコントロール）に、１列はｈｕｍａｎ Ｆｃに結合性を有さないペプチドを呈示するファージ用（ネガティブコントロール）とし、残りの２２列は、配列番号１６５〜１６７、１６９、１７０、１７２、１７３、１７５〜１８９で表される各ｈｕｍａｎ Ｆｃに結合性を有するペプチドを呈示したファージ用とした。
【００７８】
一晩放置した後、各ウェル中の溶液を捨て、３００μｌのブロッキングバッファ（２％（ｗ／ｖ）スキムミルク ＰＢＳ溶液）を、上記Ｆｃフラグメント固定化ウェル、及びターゲット無しの空ウェル（コントロール用、２４個）に加えて、２時間室温で放置した。
【００７９】
一方、各ファージ（上記２２種のｈｕｍａｎ Ｆｃに結合性を有するペプチドを呈示した各ファージと、ｈｕｍａｎ Ｆｃに結合性を有さないペプチドを呈示したファージ）溶液（１０１１ｐｆｕ／μｌ）５０μｌをブロッキングバッファ６５０μｌに加えて３０分放置し、非特異的結合の低減前処理を行った。また、抗ｈｕｍａｎ Ｆｃ抗体（ＣＡＰＰＥＬ社製、ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ ａｎｔｉｓｅｒｕｍ）３０μｌを６５０μｌのブロッキングバッファに溶解し、同様に非特異的吸着低減処理を行った。
【００８０】
各ウェルのブロッキングバッファを捨て、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．１％Ｔｗｅｅｎ ｉｎ ＰＢＳ）で５回洗浄した後、上記の各ファージ溶液と抗ｈｕｍａｎ Ｆｃ抗体溶液を、ｈｕｍａｎ Ｆｃ固定化ウェル、各動物種Ｆｃフラグメント固定化ウェル、コントロール用ウェルに１００μｌずつ加え、１時間軽く撹拌（２０ｒｐｍ／ｍｉｎ程度）しながら室温で放置した。
【００８１】
そして、各ウェル中の溶液を捨て、２００μｌのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで６回洗浄した後、各ウェルに、下記の発色用の抗体を含む溶液を１００μｌずつ加え、穏やかに撹拌しながら１時間放置した。
【００８２】
・ペプチド呈示ファージを加えたウェル：商品名「ａｎｔｉ Ｍ１３ ａｎｔｉｂｏｄｙ ＨＲＰ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌｃｏｎｊｕｇａｔｅ」（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｅｉｅｎｃｅｓ社製）を４μｌ／２０ｍｌとなるようにブロッキングバッファに溶解した溶液。
【００８３】
・抗ｈｕｍａｎ Ｆｃ抗体を加えたウェル：商品名「ＨＲＰ−ａｎｔｉ ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｇｏａｔ）」（ＣＡＰＰＥＬ社製）を０．２μｌ／ｍｌとなるように２ｍｌのブロッキングバッファに溶解した溶液。
【００８４】
そして、各ウェル中の溶液を捨て、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで６回洗浄した後、ＡＢＴＳ発色溶液（ＡＢＴＳ（和光純薬製）を０．２２ｍｇ／ｍｌとなるようにクエン酸バッファ（５０ｍＭ、ｐＨ４．０）に溶解して作製し、使用直前に１．８μｌ／ｍｌとなるように３０％過酸化水素水（和光純薬製）を加えたもの）を２００μｌずつ、各ウェルに加えて発色させて、吸光度（４０５ｎｍ）をプレートリーダー（「ＡＲＶＯ．ＳＸ」、ワラック社製）で測定した。その結果を図１に示す。なお、図１において、Ｙ軸は各Ｆｃフラグメント固定化ウェルの吸光度をコントロールのウェルの吸光度で割ったものである。
【００８５】
図１から、配列番号１６５〜１６７、１６９、１７０、１７２、１７３、１７５〜１８９で表されるペプチドは、ｈｕｍａｎ Ｆｃに対する特異性が高いことが分かる。一方、ポジティブコントロールの抗体はｈｕｍａｎ Ｆｃ以外にも結合しており、ポリクローナルの未吸収血清では特異性が低いことが分かる。
【００８６】
（３）得られた全てのペプチド（配列番号１６５〜２０７）について、上記（２）と同様の方法（ＥＬＩＳＡ法）で、ｈｕｍａｎ Ｆｃに対する結合性を調べた。その結果を表１に示す。なお、表１中の「発色値」は、ｈｕｍａｎ Ｆｃ（ターゲット物質）固定化ウェルの吸光度（４０５ｎｍ）／コントロール（空）ウェルの吸光度（４０５ｎｍ）を表し、「発色値」が大きいほど、ｈｕｍａｎ Ｆｃに対する親和性が強いことを示す。
【００８７】
【表１】
【００８８】
表１から、配列番号１６５〜２０７で表されるペプチドは、ｈｕｍａｎ Ｆｃに対する親和性が異なるものの、いずれもｈｕｍａｎ Ｆｃに対して結合力を有していることが分かる。
【００８９】
（４）得られたペプチドの共通配列の検索
配列番号１６５〜２０７で表されるペプチドのアミノ酸配列から、表２のような組み合わせで共通配列の検索を行い、配列番号１〜８７で表される共通配列を決定した。
【００９０】
【表２】
【００９１】
実施例２
実施例１のｈｕｍａｎ Ｆｃの代わりに、ヒト由来ＩｇＧ（ＣＡＰＰＥＬ社製）そのものを用い、対照としてブタ、ウシ、マウス、ヤギ、ウサギ由来の各種ＩｇＧ（ＲＯＣＫＬＡＮＤ社製）を用いた以外は、実施例１の（２）と同様の方法で実験を行い、配列番号１６５〜１６７、１６９、１７０、１７２、１７３、１７５〜１８９で表されるペプチドのヒト由来ＩｇＧに対する特異性を検討した。その結果を図２に示す。
【００９２】
図２から分かるように、実施例１の場合とほぼ同様の結果が得られ、配列番号１６５〜１６７、１６９、１７０、１７２、１７３、１７５〜１８９で表されるペプチドは、ヒト由来ＩｇＧそのものに対しても特異性が高いことが確認された。
【００９３】
実施例３
配列番号１６６で表されるペプチドのＣ末端側にグリシンとアルギニンを付加した配列番号２８１で表されるペプチドを用いて、ｈｕｍａｎ Ｆｃが精製できるかどうかを確認した。なお、Ｃ末端に付加したグリシンはスペーサーとして、アルギニンはアミノ基を利用したカラムへの固定化に利用するためのアミノ基追加用である。
【００９４】
配列番号２８１で表されるペプチドは、株式会社シグマジェノシスに合成を依頼（８０％純度保証）した。
【００９５】
＜カラムへの固定化＞
ｈｕｍａｎ Ｆｃを精製するために、配列番号２８１で表されるペプチドを固定化したカラムを、商品名「ＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＨＰ（カラムボリューム１ｍｌ）」（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、以下、単にカラムという）を用いて、以下のようにして作製した。
【００９６】
まず、カラムのキャップを外し、シリンジを用いて氷冷した６ｍｌの１ｍＭ ＨＣｌでカラムを洗浄した後、配列番号２８１で表されるペプチドを含む溶液（１ｍｇ／ｍｌ溶液、バッファ：炭酸バッファ０．２Ｍ ＮａＨＣＯ３、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．３）１．５ｍｌを上記カラムにシリンジで注入し、これを室温で２時間放置してペプチドをカラムに固定化した。ペプチド固定化後、未反応のカラム官能基をブロックして活性を無くすため、エタノールアミン溶液（０．５Ｍエタノールアミン、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．３）６ｍｌと酢酸バッファ（０．１Ｍ酢酸、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ４．０）６ｍｌを交互に４回ずつ通した。なお、途中、２回目のエタノールアミン溶液注入後は３０分室温で放置した。この操作終了後、ＰＢＳ（１０ｍＭリン酸、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）５ｍｌでカラムを平衡化した。
【００９７】
＜Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ＞
上記のようにして作成したカラムを用い、以下のようにしてｈｕｍａｎ Ｆｃを精製した。なお、精製にはＨＰＬＣシステム「ＡＫＴＡ ｐｕｒｉｆｉｅｒ」（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いた。
【００９８】
まず、１００μｇ／ｍｌとなるようにｈｕｍａｎ Ｆｃ（ＩＣＮ／ＣＡＰＰＥＬ社製、ＰＵＲＩＦＩＥＤ ＨＵＭＡＮ ＩＧＧ ＦＣ）をＮａＨＣＯ３溶液（１００ｍＭ、ｐＨ８．０）に溶解してｈｕｍａｎ Ｆｃ溶液を調製した。対照として、ヒトに近いと言われるブタ由来ＩｇＧ Ｆｃフラグメント（ＲＯＣＫＬＡＮＤ社製、ＳＷＩＮＥ ＩｇＧ Ｆｃ ｆｒａｇｍｅｎｔ）をした溶液も同様に調製した。そして、カラムをＨＰＬＣシステムに繋げ、１ｍｌ／ｍｉｎの流速でＰＢＳで平衡化した（実験を通して流速はこのままである。）。これに、上記ｈｕｍａｎ Ｆｃ溶液１００μｌを注入してカラムに吸着させた。そして、カラム容量の５倍のボリューム（５ｍｌ）のＰＢＳで洗浄した後、連続して溶離液（ＰＢＳ ｐＨ３．０）をグラディエント投入した。グラディエントは、溶離液１００％になるまでカラム容量の２０倍のボリューム（２０ｍｌ）と設定した。また、ブタ由来ＩｇＧ Ｆｃフラグメント溶液も上記と同様にしてカラムに供した。それらの溶出結果を図３に示す。
【００９９】
実施例４
カラムに固定化するペプチドとして、配列番号１７３で表されるペプチドのＣ末端側にグリシンとアルギニンを付加した配列番号２８２で表されるペプチドを用いて、実施例３と同様の方法でカラムを作製し、ｈｕｍａｎ Ｆｃの精製を行った。その結果を図３に示す。なお、配列番号１７３で表されるペプチドは、実施例３で用いた配列番号１６６で表されるペプチドに比べて、ｈｕｍａｎ Ｆｃに対する親和性が弱いことが、ＥＬＩＳＡ発色により確認されている（表１参照）。
【０１００】
実施例５
カラムに固定化するペプチドとして、配列番号２８１で表されるペプチドと、配列番号２８２で表されるペプチドの２種類を用いて、実施例３と同様の方法でカラムを作製し、ｈｕｍａｎ Ｆｃの精製を行った。なお、これらのペプチドをカラムに固定化する際には、それぞれ０．５ｍｇ／ｍｌ（あわせて１ｍｇ／ｍｌ）となるように炭酸バッファに溶解して固定化した。その結果を図３に示す。
【０１０１】
図３中、（Ａ）はサンプルを負荷していないカラム（コントロール）の溶出結果、（Ｂ）は配列番号２８１で表されるペプチドを固定したカラムにｈｕｍａｎ Ｆｃを負荷した場合の溶出結果（実施例３）、（Ｃ）は配列番号２８１で表されるペプチドを固定したカラムにブタ由来ＩｇＧ Ｆｃフラグメントを負荷した場合の溶出結果（実施例３）、（Ｄ）は配列番号２８２で表されるペプチドを固定したカラムにｈｕｍａｎ Ｆｃを負荷した場合の溶出結果（実施例４）、（Ｅ）は、配列番号２８１で表されるペプチド及び配列番号２８２で表されるペプチドを固定したカラムにｈｕｍａｎ Ｆｃを負荷した場合の溶出結果（実施例５）を表し、▲１▼〜▲７▼は検出されたピークを示す。
【０１０２】
図３の（Ｂ）、（Ｃ）の結果から、配列番号２８１で表されるペプチドを固定したカラムにはｈｕｍａｎ Ｆｃは吸着されているが、ブタ由来ＩｇＧ Ｆｃフラグメントは吸着されていないことが分かる。したがって、ｈｕｍａｎ Ｆｃに結合性を有するペプチドを用いることにより、ｈｕｍａｎ Ｆｃを特異的に精製できることが分かる。なお、（Ｂ）において、複数ピーク（▲１▼〜▲３▼）が見られるのは、ＩｇＧのサブクラスＩｇＧ１〜ＩｇＧ４による結合親和性の違いから来るものと考えられ、サブクラスを分けるカラムも作成可能であることが示唆される。
【０１０３】
一方、図３の（Ｄ）の結果から、配列番号２８２で表されるペプチドを固定したカラムを用いた場合、実施例３の場合のように、溶離液を用いなくてもｈｕｍａｎ Ｆｃが溶出されていることが分かる（ピーク▲４▼）。したがって、ｈｕｍａｎ Ｆｃに対する親和性の弱いペプチドを用いることにより、リテンションタイムの違いによってＩｇＧの精製が可能であることが示され、ＩｇＧを精製する際に問題となるＩｇＧの失活や変性を防止できる可能性が示唆される。
【０１０４】
また、図３の（Ｅ）の結果から、配列番号２８１で表されるペプチド及び配列番号２８２で表されるペプチドを固定したカラムを用いてもｈｕｍａｎ Ｆｃを十分に精製できることが分かる。なお、ピーク（▲６▼、▲７▼）の状態が上記２つのペプチドをそれぞれ単独で用いた場合（実施例３、４の場合）と異なることから、ペプチドを適当に組み合わせることにより、目的に合ったカラムが作製できる可能性も示唆される。
【０１０５】
実施例６
ターゲット物質として、ウマ由来ＩｇＧのＦｃフラグメント（以下、ｈｏｒｓｅ Ｆｃと略記する。）を用いた以外は、実施例１の（１）と同様にしてファージディスプレイ法（選択操作４回）を行い、ｈｏｒｓｅ Ｆｃに対して結合性を有するペプチドのスクリーニングを行い、配列番号２０８〜２１２で表されるペプチドのアミノ酸配列を同定した。
【０１０６】
得られた全てのペプチド（配列番号２０８〜２１２）について、実施例１（２）と同様の方法（ＥＬＩＳＡ法）で、ｈｏｒｓｅ Ｆｃに対する結合性を調べた。その結果を表３に示す。なお、表３中の「発色値」は、ｈｏｒｓｅ Ｆｃ（ターゲット物質）固定化ウェルの吸光度（４０５ｎｍ）／コントロール（空）ウェルの吸光度（４０５ｎｍ）を表し、「発色値」が大きいほど、ｈｏｒｓｅ Ｆｃに対する親和性が強いことを示す。
【０１０７】
【表３】
【０１０８】
表３から、配列番号２０８〜２１２で表されるペプチドは、ｈｏｒｓｅ Ｆｃに対する親和性が異なるものの、いずれもｈｏｒｓｅ Ｆｃに対して結合力を有していることが分かる。
【０１０９】
また、配列番号２０８〜２１２で表されるペプチドのアミノ酸配列から、表４のような組み合わせで共通配列の検索を行い、配列番号８８〜９０で表される共通配列を決定した。
【０１１０】
【表４】
【０１１１】
実施例７
ターゲット物質として、ヒツジ由来ＩｇＧのＦｃフラグメント（以下、ｓｈｅｅｐ Ｆｃと略記する。）を用いた以外は、実施例１の（１）と同様にしてファージディスプレイ法（選択操作４回）を行い、ｓｈｅｅｐ Ｆｃに対して結合性を有するペプチドのスクリーニングを行い、配列番号２１３〜２１６で表されるペプチドのアミノ酸配列を同定した。
【０１１２】
得られた全てのペプチド（配列番号２１３〜２１６）について、実施例１（２）と同様の方法（ＥＬＩＳＡ法）で、ｓｈｅｅｐ Ｆｃに対する結合性を調べた。その結果を表５に示す。なお、表５中の「発色値」は、ｓｈｅｅｐ Ｆｃ（ターゲット物質）固定化ウェルの吸光度（４０５ｎｍ）／コントロール（空）ウェルの吸光度（４０５ｎｍ）を表し、「発色値」が大きいほど、ｓｈｅｅｐ Ｆｃに対する親和性が強いことを示す。
【０１１３】
【表５】
【０１１４】
表５から、配列番号２１３〜２１６で表されるペプチドは、ｓｈｅｅｐ Ｆｃに対する親和性が異なるものの、いずれもｓｈｅｅｐ Ｆｃに対して結合力を有していることが分かる。
【０１１５】
また、配列番号２１３〜２１６で表されるペプチドのアミノ酸配列から、表６のような組み合わせで共通配列の検索を行い、配列番号９１〜９３で表される共通配列を決定した。
【０１１６】
【表６】
【０１１７】
実施例８
ターゲット物質として、ウサギ由来ＩｇＧのＦｃフラグメント（以下、ｒａｂｂｉｔ Ｆｃと略記する。）を用いた以外は、実施例１の（１）と同様にしてファージディスプレイ法（選択操作４回）を行い、ｒａｂｂｉｔ Ｆｃに対して結合性を有するペプチドのスクリーニングを行い、配列番号２１７〜２２０で表されるペプチドのアミノ酸配列を同定した。
【０１１８】
得られた全てのペプチド（配列番号２１７〜２２０）について、実施例１（２）と同様の方法（ＥＬＩＳＡ法）で、ｒａｂｂｉｔ Ｆｃに対する結合性を調べた。その結果を表７に示す。なお、表７中の「発色値」は、ｒａｂｂｉｔ Ｆｃ（ターゲット物質）固定化ウェルの吸光度（４０５ｎｍ）／コントロール（空）ウェルの吸光度（４０５ｎｍ）を表し、「発色値」が大きいほど、ｒａｂｂｉｔ Ｆｃに対する親和性が強いことを示す。
【０１１９】
【表７】
【０１２０】
表７から、配列番号２１７〜２２０で表されるペプチドは、ｒａｂｂｉｔ Ｆｃに対する親和性が異なるものの、いずれもｒａｂｂｉｔ Ｆｃに対して結合力を有していることが分かる。
【０１２１】
また、配列番号２１７〜２２０で表されるペプチドのアミノ酸配列から、表８のような組み合わせで共通配列の検索を行い、配列番号９４〜９７で表される共通配列を決定した。
【０１２２】
【表８】
【０１２３】
実施例９
ターゲット物質として、モルモット由来ＩｇＧのＦｃフラグメント（以下、ｇｕｉｎｅａ ｐｉｇ Ｆｃと略記する。）を用いた以外は、実施例１の（１）と同様にしてファージディスプレイ法（選択操作４回）を行い、ｇｕｉｎｅａ ｐｉｇ Ｆｃに対して結合性を有するペプチドのスクリーニングを行い、配列番号２２１〜２２７で表されるペプチドのアミノ酸配列を同定した。
【０１２４】
得られた全てのペプチド（配列番号２２１〜２２７）について、実施例１（２）と同様の方法（ＥＬＩＳＡ法）で、ｇｕｉｎｅａ ｐｉｇ Ｆｃに対する結合性を調べた。その結果を表９に示す。なお、表９中の「発色値」は、ｇｕｉｎｅａ ｐｉｇ Ｆｃ（ターゲット物質）固定化ウェルの吸光度（４０５ｎｍ）／コントロール（空）ウェルの吸光度（４０５ｎｍ）を表し、「発色値」が大きいほど、ｇｕｉｎｅａ ｐｉｇ Ｆｃに対する親和性が強いことを示す。
【０１２５】
【表９】
【０１２６】
表９から、配列番号２２１〜２２７で表されるペプチドは、ｇｕｉｎｅａ ｐｉｇ Ｆｃに対する親和性が異なるものの、いずれもｇｕｉｎｅａ ｐｉｇ Ｆｃに対して結合力を有していることが分かる。
【０１２７】
また、配列番号２２１〜２２７で表されるペプチドのアミノ酸配列から、表１０のような組み合わせで共通配列の検索を行い、配列番号９８〜１０４で表される共通配列を決定した。
【０１２８】
【表１０】
【０１２９】
実施例１０
ターゲット物質として、ヤギ由来ＩｇＧのＦｃフラグメント（以下、ｇｏａｔ Ｆｃと略記する。）を用いた以外は、実施例１の（１）と同様にしてファージディスプレイ法（選択操作４回）を行い、ｇｏａｔ Ｆｃに対して結合性を有するペプチドのスクリーニングを行い、配列番号２２８〜２３２で表されるアミノ酸配列を同定した。
【０１３０】
得られた全てのペプチド（配列番号２２８〜２３２）について、実施例１（２）と同様の方法（ＥＬＩＳＡ法）で、ｇｏａｔ Ｆｃに対する結合性を調べた。その結果を表１１に示す。なお、表１１中の「発色値」は、ｇｏａｔ Ｆｃ（ターゲット物質）固定化ウェルの吸光度（４０５ｎｍ）／コントロール（空）ウェルの吸光度（４０５ｎｍ）を表し、「発色値」が大きいほど、ｇｏａｔ Ｆｃに対する親和性が強いことを示す。
【０１３１】
【表１１】
【０１３２】
表１１から、配列番号２２８〜２３２で表されるペプチドは、ｇｏａｔ Ｆｃに対する親和性が異なるものの、いずれもｇｏａｔ Ｆｃに対して結合力を有していることが分かる。
【０１３３】
また、配列番号２２８〜２３２で表されるペプチドのアミノ酸配列から、表１２のような組み合わせで共通配列の検索を行い、配列番号１０５〜１０８で表される共通配列を決定した。
【０１３４】
【表１２】
【０１３５】
実施例１１
ターゲット物質として、ネコ由来ＩｇＧのＦｃフラグメント（以下、ｃａｔ Ｆｃと略記する。）を用いた以外は、実施例１の（１）と同様にしてファージディスプレイ法（選択操作４回）を行い、ｃａｔ Ｆｃに対して結合性を有するペプチドのスクリーニングを行い、配列番号２３３〜２４８で表されるペプチドのアミノ酸配列を同定した。
【０１３６】
得られた全てのペプチド（配列番号２３３〜２４８）について、実施例１（２）と同様の方法（ＥＬＩＳＡ法）で、ｃａｔ Ｆｃに対する結合性を調べた。その結果を表１３に示す。なお、表１３中の「発色値」は、ｃａｔ Ｆｃ（ターゲット物質）固定化ウェルの吸光度（４０５ｎｍ）／コントロール（空）ウェルの吸光度（４０５ｎｍ）を表し、「発色値」が大きいほど、ｃａｔ Ｆｃに対する親和性が強いことを示す。
【０１３７】
【表１３】
【０１３８】
表１３から、配列番号２３３〜２４８で表されるペプチドは、ｃａｔ Ｆｃに対する親和性が異なるものの、いずれもｃａｔ Ｆｃに対して結合力を有していることが分かる。
【０１３９】
また、配列番号２３３〜２４８で表されるペプチドのアミノ酸配列から、表１４のような組み合わせで共通配列の検索を行い、配列番号１０９〜１３１で表される共通配列を決定した。
【０１４０】
【表１４】
【０１４１】
実施例１２
ターゲット物質として、イヌ由来ＩｇＧのＦｃフラグメント（以下、ｄｏｇ Ｆｃと略記する。）を用いた以外は、実施例１の（１）と同様にしてファージディスプレイ法（選択操作４回）を行い、ｄｏｇ Ｆｃに対して結合性を有するペプチドのスクリーニングを行い、配列番号２４９〜２６１で表されるペプチドのアミノ酸配列を同定した。
【０１４２】
得られた全てのペプチド（配列番号２４９〜２６１）について、実施例１（２）と同様の方法（ＥＬＩＳＡ法）で、ｄｏｇ Ｆｃに対する結合性を調べた。その結果を表１５に示す。なお、表１５中の「発色値」は、ｄｏｇ Ｆｃ（ターゲット物質）固定化ウェルの吸光度（４０５ｎｍ）／コントロール（空）ウェルの吸光度（４０５ｎｍ）を表し、「発色値」が大きいほど、ｄｏｇ Ｆｃに対する親和性が強いことを示す。
【０１４３】
【表１５】
【０１４４】
表１５から、配列番号２４９〜２６１で表されるペプチドは、ｄｏｇ Ｆｃに対する親和性が異なるものの、いずれもｄｏｇ Ｆｃに対して結合力を有していることが分かる。
【０１４５】
また、配列番号２４９〜２６１で表されるペプチドのアミノ酸配列から、表１６のような組み合わせで共通配列の検索を行い、配列番号１３２〜１５１で表される共通配列を決定した。
【０１４６】
【表１６】
【０１４７】
実施例１３
ターゲット物質として、ウシ由来ＩｇＧのＦｃフラグメント（以下、ｂｏｖｉｎｅ Ｆｃと略記する。）を用いた以外は、実施例１の（１）と同様にしてファージディスプレイ法（選択操作４回）を行い、ｂｏｖｉｎｅ Ｆｃに対して結合性を有するペプチドのスクリーニングを行い、配列番号２６２〜２６７で表されるペプチドのアミノ酸配列を同定した。
【０１４８】
得られた全てのペプチド（配列番号２６２〜２６７）について、実施例１（２）と同様の方法（ＥＬＩＳＡ法）で、ｂｏｖｉｎｅ Ｆｃに対する結合性を調べた。その結果を表１７に示す。なお、表１７中の「発色値」は、ｂｏｖｉｎｅ Ｆｃ（ターゲット物質）固定化ウェルの吸光度（４０５ｎｍ）／コントロール（空）ウェルの吸光度（４０５ｎｍ）を表し、「発色値」が大きいほど、ｂｏｖｉｎｅ Ｆｃに対する親和性が強いことを示す。
【０１４９】
【表１７】
【０１５０】
表１７から、配列番号２６２〜２６７で表されるペプチドは、ｂｏｖｉｎｅ Ｆｃに対する親和性が異なるものの、いずれもｂｏｖｉｎｅ Ｆｃに対して結合力を有していることが分かる。
【０１５１】
また、配列番号２６２〜２６７で表されるペプチドのアミノ酸配列から、表１８のような組み合わせで共通配列の検索を行い、配列番号１５２〜１５６で表される共通配列を決定した。
【０１５２】
【表１８】
【０１５３】
実施例１４
ターゲット物質として、ブタ由来ＩｇＧのＦｃフラグメント（以下、ｓｗｉｎｅ Ｆｃと略記する。）を用いた以外は、実施例１の（１）と同様にしてファージディスプレイ法（選択操作４回）を行い、ｓｗｉｎｅ Ｆｃに対して結合性を有するペプチドのスクリーニングを行い、配列番号２６８〜２７７で表されるペプチドのアミノ酸配列を同定した。
【０１５４】
得られた全てのペプチド（配列番号２６８〜２７７）について、実施例１（２）と同様の方法（ＥＬＩＳＡ法）で、ｓｗｉｎｅ Ｆｃに対する結合性を調べた。その結果を表１９に示す。なお、表１９中の「発色値」は、ｓｗｉｎｅ Ｆｃ（ターゲット物質）固定化ウェルの吸光度（４０５ｎｍ）／コントロール（空）ウェルの吸光度（４０５ｎｍ）を表し、「発色値」が大きいほど、ｓｗｉｎｅ Ｆｃに対する親和性が強いことを示す。
【０１５５】
【表１９】
【０１５６】
表１９から、配列番号２６８〜２７７で表されるペプチドは、ｓｗｉｎｅ Ｆｃに対する親和性が異なるものの、いずれもｓｗｉｎｅ Ｆｃに対して結合力を有していることが分かる。
【０１５７】
また、配列番号２６８〜２７７で表されるペプチドのアミノ酸配列から、表２０のような組み合わせで共通配列の検索を行い、配列番号１５７〜１６２で表される共通配列を決定した。
【０１５８】
【表２０】
【０１５９】
実施例１５
ターゲット物質として、マウス由来ＩｇＧのＦｃフラグメント（以下、ｍｏｕｓｅ Ｆｃと略記する。）を用いた以外は、実施例１の（１）と同様にしてファージディスプレイ法（選択操作４回）を行い、ｍｏｕｓｅ Ｆｃに対して結合性を有するペプチドのスクリーニングを行い、配列番号２７８〜２８０で表されるペプチドのアミノ酸配列を同定した。
【０１６０】
得られた全てのペプチド（配列番号２７８〜２８０）について、実施例１（２）と同様の方法（ＥＬＩＳＡ法）で、ｍｏｕｓｅ Ｆｃに対する結合性を調べた。その結果を表２１に示す。なお、表２１中の「発色値」は、ｍｏｕｓｅ Ｆｃ（ターゲット物質）固定化ウェルの吸光度（４０５ｎｍ）／コントロール（空）ウェルの吸光度（４０５ｎｍ）を表し、「発色値」が大きいほど、ｍｏｕｓｅ Ｆｃに対する親和性が強いことを示す。
【０１６１】
【表２１】
【０１６２】
表２１から、配列番号２７８〜２８０で表されるペプチドは、ｍｏｕｓｅ Ｆｃに対する親和性が異なるものの、いずれもｍｏｕｓｅ Ｆｃに対して結合力を有していることが分かる。
【０１６３】
また、配列番号２７８〜２８０で表されるペプチドのアミノ酸配列から、表２２のような組み合わせで共通配列の検索を行い、配列番号１６３〜１６４で表される共通配列を決定した。
【０１６４】
【表２２】
【０１６５】
「配列表フリーテキスト」
配列番号１〜８７：ファージディスプレイ法で得られたヒト由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドから決定された共通配列である。
配列番号８８〜９０：ファージディスプレイ法で得られたウマ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドから決定された共通配列である。
配列番号９１〜９３：ファージディスプレイ法で得られたヒツジ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドから決定された共通配列である。
配列番号９４〜９７：ファージディスプレイ法で得られたウサギ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドから決定されたアミノ酸配列である。
配列番号９８〜１０４：ファージディスプレイ法で得られたモルモット由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドから決定された共通配列である。
配列番号１０５〜１０８：ファージディスプレイ法で得られたヤギ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドから決定された共通配列である。
配列番号１０９〜１３１：ファージディスプレイ法で得られたネコ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドから決定された共通配列である。
配列番号１３２〜１５１：ファージディスプレイ法で得られたイヌ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドから決定された共通配列である。
配列番号１５２〜１５６：ファージディスプレイ法で得られたウシ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドから決定された共通配列である。
配列番号１５７〜１６２：ファージディスプレイ法で得られたブタ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドから決定された共通配列である。
配列番号１６３〜１６４：ファージディスプレイ法で得られたマウス由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドから決定された共通配列である。
配列番号１６５〜２０７：ファージディスプレイ法によって得られた、ヒト由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドである。
配列番号２０８〜２１２：ファージディスプレイ法によって得られた、ウマ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドである。
配列番号２１３〜２１６：ファージディスプレイ法によって得られた、ヒツジ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドである。
配列番号２１７〜２２０：ファージディスプレイ法によって得られた、ウサギ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドである。
配列番号２２１〜２２７：ファージディスプレイ法によって得られた、モルモット由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドである。
配列番号２２８〜２３２：ファージディスプレイ法によって得られた、ヤギ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドである。
配列番号２３３〜２４８：ファージディスプレイ法によって得られた、ネコ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドである。
配列番号２４９〜２６１：ファージディスプレイ法によって得られた、イヌ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドである。
配列番号２６２〜２６７：ファージディスプレイ法によって得られた、ウシ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドである。
配列番号２６８〜２７７：ファージディスプレイ法によって得られた、ブタ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドである。
配列番号２７８〜２８０：ファージディスプレイ法によって得られた、マウス由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドである。
配列番号２８１：配列番号１６６で表されるペプチドのＣ末端側にグリシンとアルギニンを付加したペプチドであって、ヒト由来ＩｇＧのＦｃフラグメントを精製する際のアフィニティリガンドとして用いたペプチドである。
配列番号２８２：配列番号１７３で表されるペプチドのＣ末端側にグリシンとアルギニンを付加したペプチドであって、ヒト由来ＩｇＧのＦｃフラグメントを精製する際のアフィニティリガンドとして用いたペプチドである。
配列番号２８３〜２８９：非特許文献１に記載されたヒト由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドである。
【０１６６】
【発明の効果】
以上説明したように本発明のＩｇＧ精製用吸着剤は、担体上に上記のＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又はタンパク質を固定化しているので、ＩｇＧへの特異性が高く、効率よくＩｇＧを精製することができる。また、ペプチドは化学合成によって低コストで大量に調製できるので、ＩｇＧ精製用吸着剤の製造コストを下げることが可能となり、結果的に精製コストの低減を図ることができる。また、従来のアフィニティカラムに用いられているプロテインＡやプロテインＧに比べて夾雑物の混入等の心配がないので、医薬用途の抗体の精製にも適用しやすいという利点もある。さらに、ＩｇＧのＦｃフラグメントに対する親和性の異なるペプチドを用いることにより、例えば、ＩｇＧのサブクラスを分けることができるカラムや、リテンションタイムの違いでＩｇＧの精製が可能なカラムを作製できる可能性があり、精製工程の簡略化や、精製工程におけるＩｇＧの失活や変性を防止できる可能性がある。
【０１６７】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】配列番号１６５〜１６７、１６９、１７０、１７２、１７３、１７５〜１８９で表されるペプチドのｈｕｍａｎ Ｆｃに対する結合性の確認試験の結果を表す図である。
【図２】配列番号１６５〜１６７、１６９、１７０、１７２、１７３、１７５〜１８９で表されるペプチドのヒト由来ＩｇＧに対する特異性を検討した結果を示す図である。
【図３】配列番号２８１、２８２で表されるペプチドを固定化したカラムを用いてｈｕｍａｎ Ｆｃを精製した際の溶出結果を示す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、担体上にＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有する新規なペプチド又はタンパク質を固定化したＩｇＧ精製用吸着剤、及びＩｇＧの精製法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
免疫反応の中心的な役割を担うタンパク質である抗体は、従来から医療や臨床診断をはじめとする幅広い分野で利用されており、近年では、抗体を利用した医薬品（抗体医薬品）の開発も盛んに行なわれている。
【０００３】
また、抗体は、微量物質を特異的に検出・測定する手段としても利用されており、酵素免疫測定法や蛍光免疫測定法等に用いられている。これらの測定方法は、検査薬に応用されているほか、医学・薬学・生化学分野等の研究に欠くことのできないものとなっている。
【０００４】
一般的な抗体の作製方法としては、マウス、ウサギ、ヒツジ等の動物に抗原を接種して免疫することによって抗血清を調製し、その抗血清からポリクローナル抗体を精製する方法、ハイブリドーマをマウス等の腹腔にて増殖させ、モノクローナル抗体を含む腹水を調製し、その腹水から抗体を精製する方法、ハイブリドーマを血清培地や無血清培地中で培養してモノクローナル抗体を含む培養液を調製し、その培養液から抗体を精製する方法等がある。
【０００５】
そして、上記のようにして得られた抗血清や腹水、培養液から抗体を精製する方法としては、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等の精製方法が知られている。例えば、アフィニティクロマトグラフィーには、ＩｇＧのＦｃフラグメントに対して結合性を有するプロテインＡやプロテインＧをリガンドとして固定化したゲルが広く用いられている。
【０００６】
一方、非特許文献１には、ヒトＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドとして、配列番号２８３〜２８９で表されるペプチドが報告されており、ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドが、分析や医薬用途の抗体の精製工程におけるアフィニティリガンドとして利用できる可能性があることが記載されている。
【０００７】
【非特許文献１】
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２２１ （１９９８） １５１−１５７
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記のプロテインＡやプロテインＧは、▲１▼抗体を産生する動物の種類によっては、ＩｇＧであってもプロテインＡやプロテインＧに対する結合性を持たないため、プロテインＡやプロテインＧを固定化したゲルの適用範囲が狭い、▲２▼ＩｇＧとプロテインＡ（又はプロテインＧ）との結合が強固で、ＩｇＧの回収に強酸性の溶離液を使用しなければならず、ＩｇＧの変性や失活が起こり易い、▲３▼菌類由来であるプロテインＡやプロテインＧは量産化が困難であり、その調製コストが高い、▲４▼原料の菌体に由来する夾雑物の混入等が懸念されるなどの安全性の面で不安があるため、医薬用途に用いられる抗体の精製には利用しにくい、などの欠点があった。
【０００９】
一方、ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドは、化学合成することができるため、低コストで大量調製が可能であり、更に、夾雑物の混入等の心配がなく、医薬用途の抗体の精製にも利用しやすい等の利点があるが、上記非特許文献１に記載されたペプチド以外にＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドは報告されていない。また、ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドを利用してＩｇＧの精製が行われたという報告もなされていない。
【００１０】
したがって、本発明の目的は、ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有する新規なペプチド又はタンパク質を利用したＩｇＧ精製用吸着剤、及びＩｇＧの精製法を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するため、本発明の第一は、担体上に、配列番号１〜１６４で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又はタンパク質を固定化してなることを特徴とするＩｇＧ精製用吸着剤である。
【００１２】
本発明の第一によれば、ＩｇＧへの特異性が高く、効率よくＩｇＧを精製することができるＩｇＧ精製用吸着剤を提供できる。このＩｇＧ精製用吸着剤は、上記のＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又はタンパク質を担体上に固定化しているので、不純物等の混入を厳密に管理する必要のある医薬品用途の抗体の精製に特に好適に用いることができる。また、ペプチドは化学合成でき、低コストで大量に調製できるので、製造コストの低減を図ることができる。
【００１３】
上記第一の発明の好ましい態様においては、ヒト由来ＩｇＧを精製する際に用いられるＩｇＧ精製用吸着剤であって、担体上に、配列番号１〜８７で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、ヒト由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又はタンパク質を固定化してなるＩｇＧ精製用吸着剤が提供される。これによれば、ヒト由来ＩｇＧへの特異性が高く、効率よくヒト由来ＩｇＧを精製することができるＩｇＧ精製用吸着剤を提供できる。
【００１４】
また、別の好ましい態様においては、ウマ由来ＩｇＧを精製する際に用いられるＩｇＧ精製用吸着剤であって、担体上に、配列番号８８〜９０で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、ウマ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又はタンパク質を固定化してなるＩｇＧ精製用吸着剤が提供される。これによれば、ウマ由来ＩｇＧへの特異性が高く、効率よくウマ由来ＩｇＧを精製することができるＩｇＧ精製用吸着剤を提供できる。
【００１５】
また、更に別の好ましい態様においては、ヒツジ由来ＩｇＧを精製する際に用いられるＩｇＧ精製用吸着剤であって、担体上に、配列番号９１〜９３で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、ヒツジ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又はタンパク質を固定化してなるＩｇＧ精製用吸着剤が提供される。これによれば、ヒツジ由来ＩｇＧへの特異性が高く、効率よくヒツジ由来ＩｇＧを精製することができるＩｇＧ精製用吸着剤を提供できる。
【００１６】
また、更に別の好ましい態様においては、ウサギ由来ＩｇＧを精製する際に用いられるＩｇＧ精製用吸着剤であって、担体上に、配列番号９４〜９７で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、ウサギ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又はタンパク質を固定化してなるＩｇＧ精製用吸着剤が提供される。これによれば、ウサギ由来ＩｇＧへの特異性が高く、効率よくウサギ由来ＩｇＧを精製することができるＩｇＧ精製用吸着剤を提供できる。
【００１７】
また、更に別の好ましい態様においては、モルモット由来ＩｇＧを精製する際に用いられるＩｇＧ精製用吸着剤であって、担体上に、配列番号９８〜１０４で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、モルモット由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又はタンパク質を固定化してなるＩｇＧ精製用吸着剤が提供される。これによれば、モルモット由来ＩｇＧへの特異性が高く、効率よくモルモット由来ＩｇＧを精製することができるＩｇＧ精製用吸着剤を提供できる。
【００１８】
また、更に別の好ましい態様においては、ヤギ由来ＩｇＧを精製する際に用いられるＩｇＧ精製用吸着剤であって、担体上に、配列番号１０５〜１０８で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、ヤギ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又はタンパク質を固定化してなるＩｇＧ精製用吸着剤が提供される。これによれば、ヤギ由来ＩｇＧへの特異性が高く、効率よくヤギ由来ＩｇＧを精製することができるＩｇＧ精製用吸着剤を提供できる。
【００１９】
また、更に別の好ましい態様においては、ネコ由来ＩｇＧを精製する際に用いられるＩｇＧ精製用吸着剤であって、担体上に、配列番号１０９〜１３１で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、ネコ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又はタンパク質を固定化してなるＩｇＧ精製用吸着剤が提供される。これによれば、ネコ由来ＩｇＧへの特異性が高く、効率よくネコ由来ＩｇＧを精製することができるＩｇＧ精製用吸着剤を提供できる。
【００２０】
また、更に別の好ましい態様においては、イヌ由来ＩｇＧを精製する際に用いられるＩｇＧ精製用吸着剤であって、担体上に、配列番号１３２〜１５１で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、イヌ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又はタンパク質を固定化してなるＩｇＧ精製用吸着剤が提供される。これによれば、イヌ由来ＩｇＧへの特異性が高く、効率よくイヌ由来ＩｇＧを精製することができるＩｇＧ精製用吸着剤を提供できる。
【００２１】
また、更に別の好ましい態様においては、ウシ由来ＩｇＧを精製する際に用いられるＩｇＧ精製用吸着剤であって、担体上に、配列番号１５２〜１５６で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、ウシ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又はタンパク質を固定化してなるＩｇＧ精製用吸着剤が提供される。これによれば、ウシ由来ＩｇＧへの特異性が高く、効率よくウシ由来ＩｇＧを精製することができるＩｇＧ精製用吸着剤を提供できる。
【００２２】
また、更に別の好ましい態様においては、ブタ由来ＩｇＧを精製する際に用いられるＩｇＧ精製用吸着剤であって、担体上に、配列番号１５７〜１６２で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、ブタ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又はタンパク質を固定化してなるＩｇＧ精製用吸着剤が提供される。これによれば、ブタ由来ＩｇＧへの特異性が高く、効率よくブタ由来ＩｇＧを精製することができるＩｇＧ精製用吸着剤を提供できる。
【００２３】
また、更に別の好ましい態様においては、マウス由来ＩｇＧを精製する際に用いられるＩｇＧ精製用吸着剤であって、担体上に、配列番号１６３〜１６４で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、マウス由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又はタンパク質を固定化してなるＩｇＧ精製用吸着剤が提供される。これによれば、マウス由来ＩｇＧへの特異性が高く、効率よくマウス由来ＩｇＧを精製することができるＩｇＧ精製用吸着剤を提供できる。
【００２４】
また、本発明の第二は、ＩｇＧを精製する際に、配列番号１〜１６４で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又はタンパク質を、アフィニティリガンドとして用いることを特徴とするＩｇＧの精製法である。
【００２５】
本発明の第二によれば、上記のＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又はタンパク質を、ＩｇＧを精製する際のアフィニティリガンドとして用いることにより、効率よくＩｇＧを精製することができる。また、ペプチドは化学合成でき、低コストで大量に調製できるので、精製コストの低減を図ることができる。本発明の精製法は、不純物等の混入を厳密に管理する必要のある医薬品用途の抗体の精製に特に好適に適用することができる。
【００２６】
上記第二の発明の好ましい態様においては、ヒト由来ＩｇＧを精製する際に、配列番号１〜８７で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、ヒト由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又はタンパク質を、アフィニティリガンドとして用いることが好ましい。これによれば、ヒト由来ＩｇＧを効率よく精製することができる。
【００２７】
また、別の好ましい態様においては、ウマ由来ＩｇＧを精製する際に、配列番号８８〜９０で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、ウマ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又はタンパク質を、アフィニティリガンドとして用いることが好ましい。これによれば、ウマ由来ＩｇＧを効率よく精製することができる。
【００２８】
また、更に別の好ましい態様においては、ヒツジ由来ＩｇＧを精製する際に、配列番号９１〜９３で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、ヒツジ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又はタンパク質を、アフィニティリガンドとして用いることが好ましい。これによれば、ヒツジ由来ＩｇＧを効率よく精製することができる。
【００２９】
また、更に別の好ましい態様によれば、ウサギ由来ＩｇＧを精製する際に、配列番号９４〜９７で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、ウサギ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又はタンパク質を、アフィニティリガンドとして用いることが好ましい。これによれば、ウサギ由来ＩｇＧを効率よく精製することができる。
【００３０】
また、更に別の好ましい態様によれば、モルモット由来ＩｇＧを精製する際に、配列番号９８〜１０４で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、モルモット由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又はタンパク質を、アフィニティリガンドとして用いることが好ましい。これによれば、モルモット由来ＩｇＧを効率よく精製することができる。
【００３１】
また、更に別の好ましい態様によれば、ヤギ由来ＩｇＧを精製する際に、配列番号１０５〜１０８で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、ヤギ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又はタンパク質を、アフィニティリガンドとして用いることが好ましい。これによれば、ヤギ由来ＩｇＧを効率よく精製することができる。
【００３２】
また、更に別の好ましい態様によれば、ネコ由来ＩｇＧを精製する際に、配列番号１０９〜１３１で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、ネコ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又はタンパク質を、アフィニティリガンドとして用いることが好ましい。これによれば、ネコ由来ＩｇＧを効率よく精製することができる。
【００３３】
また、更に別の好ましい態様によれば、イヌ由来ＩｇＧを精製する際に、配列番号１３２〜１５１で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、イヌ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又はタンパク質を、アフィニティリガンドとして用いることが好ましい。これによれば、イヌ由来ＩｇＧを効率よく精製することができる。
【００３４】
また、更に別の好ましい態様によれば、ウシ由来ＩｇＧを精製する際に、配列番号１５２〜１５６で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、ウシ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又はタンパク質を、アフィニティリガンドとして用いることが好ましい。これによれば、ウシ由来ＩｇＧを効率よく精製することができる。
【００３５】
また、更に別の好ましい態様によれば、ブタ由来ＩｇＧを精製する際に、配列番号１５７〜１６２で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、ブタ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又はタンパク質を、アフィニティリガンドとして用いることが好ましい。これによれば、ブタ由来ＩｇＧを効率よく精製することができる。
【００３６】
また、更に別の好ましい態様によれば、マウス由来ＩｇＧを精製する際に、配列番号１６３〜１６４で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、マウス由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又はタンパク質を、アフィニティリガンドとして用いることが好ましい。これによれば、マウス由来ＩｇＧを効率よく精製することができる。
【００３７】
【発明の実施の形態】
本発明において、アフィニティリガンドとして用いられるペプチドは、ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドであり、ペプチド中に配列番号１〜１６４で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有するものである。なお、本発明において、アフィニティリガンドとは、タンパク質に特異的に結合する物質を意味する。
【００３８】
本発明で用いられるペプチドは、上記の部分アミノ酸配列を有するものであれば、そのアミノ酸数は特に制限されないが、通常、アミノ酸数４〜５０個からなることが好ましく、アミノ酸数６〜２０個からなることがより好ましい。また、本発明のペプチドは、ＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾（例えばアセチル化、アシル化、アミド化、カルボキシル化、リン酸化、糖鎖の付加等）、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失があってもよい。なお、本発明で用いられるペプチドは、上記アミノ酸配列を複数個有していてもよい。
【００３９】
また、本発明のタンパク質は、ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するタンパク質であって、タンパク質中に配列番号１〜１６４で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有するものであり、その分子量等は特に制限されないが、上記アミノ酸配列を有する部分が、ＩｇＧのＦｃフラグメントと接触・結合できるように、タンパク分子上に提示されている必要がある。なお、本発明のタンパク質は、上記アミノ酸配列を複数個有していてもよい。
【００４０】
本発明のタンパク質としては、以下のようなものが例示できる。
▲１▼上記ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドを、ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）、ＡＰ（アルカリフォスファターゼ）、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素等の酵素に結合したもの。このようなタンパク質は、例えば「超高感度酵素免疫測定法」（石川栄治著 学会出版センター）等に記載された公知の方法にしたがって、上記ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドと上記酵素とを結合させることにより得ることができる。
【００４１】
▲２▼上記ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドを表面に提示したファージ。
【００４２】
このようなファージは、Ｓｍｉｔｈ， Ｇ． Ｐ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２８８， １３１５−１３１７ （１９８５）、Ｊ．Ｋ． Ｓｃｏｔｔ ａｎｄ Ｇ． Ｐ． Ｓｍｉｔｈ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４９， ３８６−３９０ （１９９０）等に記載されたファージライブラリの作製方法にしたがって得ることができる。すなわち、上記ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドをコードするＤＮＡを化学合成し、このＤＮＡをファージラブラリを作製するときと同様の方法で、ファージＤＮＡの外殻タンパク質をコードする遺伝子に挿入し、このＤＮＡを大腸菌に導入することにより、所望のペプチドを表面に提示したファージを得ることができる。
【００４３】
▲３▼上記ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドを所定の抗原に連結したものと、該抗原に対する抗体とを結合させた抗体。このような抗体は、本出願人による特願２００２−２４１６８８号に記載された方法によって得ることができる。例えば、上記ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドと抗原となるペプチドとを連続した一つのペプチドとして合成し、前記抗原に対する抗体との抗原抗体反応により結合させればよい。
【００４４】
本発明のペプチドは、ＩｇＧのＦｃフラグメントをターゲット物質として、ファージディスプレイ法（Ｓｍｉｔｈ， Ｇ．Ｐ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２８８， １３１５−１３１７ （１９８５））によって得られたものであるが、コンピューターソフト（日立Ｂｉｏ Ｐａｃｋａｇｅ）を用いた解析によっても得ることができる。なお、ファージディスプレイ法は、ファージの外殻タンパク質に、ランダムなアミノ酸配列を有するペプチド（通常、アミノ酸数５〜１２個程度）を融合タンパク質として提示させたファージライブラリを用いて、ターゲット物質に結合するペプチドをスクリーニングする方法である。ファージライブラリは、例えば、Ｓｍｉｔｈ， Ｇ． Ｐ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２８８， １３１５−１３１７ （１９８５）、Ｊ． Ｋ． Ｓｃｏｔｔ ａｎｄ Ｇ． Ｐ． Ｓｍｉｔｈ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４９， ３８６−３９０ （１９９０）等に記載された方法にしたがって、ランダム化したＤＮＡを化学合成し、これをファージＤＮＡの外殻タンパク質をコードする遺伝子に挿入し、このＤＮＡを大腸菌に導入することにより調製することができる。また、ファージライブラリは市販されており、例えば、商品名「Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｋｉｔ」、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ社製）等を用いることもできる。
【００４５】
そして、ファージディスプレイ法等により決定されたアミノ酸配列に基づいて、例えば、固相法、Ｆｍｏｃ法等の公知のペプチド合成法により、目的とするペプチドを簡単に合成することができる。
【００４６】
そして、得られたペプチドやタンパク質を適当な担体に結合・固定化することにより、本発明のＩｇＧ精製用吸着剤を得ることができる。ペプチドやタンパク質を固定化する担体としては、ペプチドやタンパク質を化学的或いは物理的に固定化できるものであれば特に制限なく用いることができるが、カラム用担体又はバッチ処理では磁気ビーズ等が好ましく用いられる。カラム用担体としては、セファロース、シリカ粒子等の材質からなる粒径１〜１００μｍのビーズが好ましく例示できる。このようなカラム用担体は市販されており、例えば、商品名「ＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＨＰ」（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、商品名「トシル基活性化ダイナビーズＭ−２８０」（Ｄｙｎａｌ社製）等を用いることができる。ちなみに、商品名「ＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＨＰ」（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）は、セファロースビーズ上にＮＨＳがあり、タンパク質やペプチド上の第１級アミノ基と共有結合する形で固定化することができる。また、商品名「トシル基活性化ダイナビーズＭ−２８０」（Ｄｙｎａｌ社製）は、疎水性ビーズ表面にトシル基があり、ペプチドやタンパク質上の第１級アミノ基やスルフヒドリル基と共有結合する形で固定化することができる。
【００４７】
本発明においては、ペプチドを担体に固定化する際に、ペプチドの末端に担体との結合に利用できる適当なスペーサーを挿入したペプチドを用いることが好ましい。スペーサーとしては、例えば、アミノ酸、ペプチド、炭素数２〜１８の主鎖（主鎖中にエステル結合やエーテル結合を有していてもよい。）を有し、好ましくは水酸基等の親水性の官能基を有するもの（例えば、両末端に活性基を有するポリビニルアルコール、好ましくはビニルアルコール分子が２〜１０程度重合したもの）、２〜１０糖からなる糖鎖等が例示できる。上記アミノ酸は、担体との結合に利用可能な官能基を有するアミノ酸が好ましく、例えば、アルギニン、リシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸等が例示できる。また、上記ペプチドとしては、グリシンやセリンが数個（通常２〜１０個）ペプチド結合したペプチド等のフレキシブルリンカー等が好ましく挙げられる。例えば、スペーサーがアミノ酸やペプチドである場合は、スペーサーを挿入したペプチドを連続した一つのペプチドとして合成することができるので好ましい。
【００４８】
スペーサーを挿入することにより、担体への固定化を行いやすくなると共に、スペーサーの長さを調整することにより、上記ペプチドとターゲット物質（ＩｇＧのＦｃフラグメント）との立体的な結合阻害を回避して、上記ペプチドとターゲット物質（ＩｇＧのＦｃフラグメント）との接触をより容易にすることができるので、カラム性能の向上を図ることが可能となる。
【００４９】
次に、本発明で用いられるペプチドについて詳しく説明する。
配列番号１〜８７で表されるアミノ酸配列は、ヒト由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドの共通配列である。これらの共通配列は、上記のようなファージライブラリを、ヒト由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに接触させて選択操作（バイオパニング）を行い、ヒト由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合するペプチドを発現したファージ群のみを選択し、このファージのＤＮＡを解析することにより、ファージ表面に提示されたペプチドのアミノ酸配列を同定して得られたペプチドのアミノ酸配列を比較することにより決定したものである（実施例１の表２参照）。
【００５０】
したがって、配列番号１〜８７で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有するペプチド又はタンパク質は、ヒト由来ＩｇＧ精製用吸着剤のアフィニティリガンドとして用いることができる。本発明においては、配列番号１〜８７で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有する１種又は２種以上のペプチド又はタンパク質を担体に固定化してもよい。
【００５１】
配列番号８８〜９０で表されるアミノ酸配列は、ウマ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドの共通配列である。これらの共通配列は、ターゲット物質としてウマ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントを用い、上記と同様にしてファージディスプレイ法を行うことによって得られたペプチドのアミノ酸配列を比較することにより決定したものである（実施例６の表４参照）。
【００５２】
したがって、配列番号８８〜９０で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有するペプチド又はタンパク質は、ウマ由来ＩｇＧ精製用吸着剤のアフィニティリガンドとして用いることができる。本発明においては、配列番号８８〜９０で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有する１種又は２種以上のペプチド又はタンパク質を担体に固定化してもよい。
【００５３】
配列番号９１〜９３で表されるアミノ酸配列は、ヒツジ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドの共通配列である。これらの共通配列は、ターゲット物質としてヒツジ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントを用い、上記と同様にしてファージディスプレイ法を行うことによって得られたペプチドのアミノ酸配列を比較することにより決定したものである（実施例７の表６参照）。
【００５４】
したがって、配列番号９１〜９３で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有するペプチド又はタンパク質は、ヒツジ由来ＩｇＧ精製用吸着剤のアフィニティリガンドとして用いることができる。本発明においては、配列番号９１〜９３で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有する１種又は２種以上のペプチド又はタンパク質を担体に固定化してもよい。
【００５５】
配列番号９４〜９７で表されるアミノ酸配列は、ウサギ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドであり、ターゲット物質としてウサギ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントを用い、上記と同様にしてファージディスプレイ法を行うことにより、アミノ酸配列を同定したものである（実施例８の表８参照）。
【００５６】
したがって、配列番号９４〜９７で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有するペプチド又はタンパク質は、ウサギ由来ＩｇＧ精製用吸着剤のアフィニティリガンドとして用いることができる。本発明においては、配列番号９４〜９７で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有する１種又は２種以上のペプチド又はタンパク質を担体に固定化してもよい。
【００５７】
配列番号９８〜１０４で表されるアミノ酸配列は、モルモット由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドの共通配列である。これらの共通配列は、ターゲット物質としてモルモット由来ＩｇＧのＦｃフラグメントを用い、上記と同様にしてファージディスプレイ法を行うことによって得られたペプチドのアミノ酸配列を比較することにより決定したものである（実施例９の表１０参照）。
【００５８】
したがって、配列番号９８〜１０４で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有するペプチド又はタンパク質は、モルモット由来ＩｇＧ精製用吸着剤のアフィニティリガンドとして用いることができる。本発明においては、配列番号９８〜１０４で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有する１種又は２種以上のペプチド又はタンパク質を担体に固定化してもよい。
【００５９】
配列番号１０５〜１０８で表されるアミノ酸配列は、ヤギ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドの共通配列である。これらの共通配列は、ターゲット物質としてヤギ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントを用い、上記と同様にしてファージディスプレイ法を行うことによって得られたペプチドのアミノ酸配列を比較することにより決定したものである（実施例１０の表１２参照）。
【００６０】
したがって、配列番号１０５〜１０８で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有するペプチド又はタンパク質は、ヤギ由来ＩｇＧ精製用吸着剤のアフィニティリガンドとして用いることができる。本発明においては、配列番号１０５〜１０８で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有する１種又は２種以上のペプチド又はタンパク質を担体に固定化してもよい。
【００６１】
配列番号１０９〜１３１で表されるアミノ酸配列は、ネコ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドの共通配列である。これらの共通配列は、ターゲット物質としてネコ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントを用い、上記と同様にしてファージディスプレイ法を行うことによって得られたペプチドのアミノ酸配列を比較することにより決定したものである（実施例１１の表１４参照）。
【００６２】
したがって、配列番号１０９〜１３１で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有するペプチド又はタンパク質は、ネコ由来ＩｇＧ精製用吸着剤のアフィニティリガンドとして用いることができる。本発明においては、配列番号１０９〜１３１で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有する１種又は２種以上のペプチド又はタンパク質を担体に固定化してもよい。
【００６３】
配列番号１３２〜１５１で表されるアミノ酸配列は、イヌ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドの共通配列である。これらの共通配列は、ターゲット物質としてイヌ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントを用い、上記と同様にしてファージディスプレイ法を行うことによって得られたペプチドのアミノ酸配列を比較することにより決定したものである（実施例１２の表１６参照）。
【００６４】
したがって、配列番号１３２〜１５１で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有するペプチド又はタンパク質は、イヌ由来ＩｇＧ精製用吸着剤のアフィニティリガンドとして用いることができる。本発明においては、配列番号１３２〜１５１で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有する１種又は２種以上のペプチド又はタンパク質を担体に固定化してもよい。
【００６５】
配列番号１５２〜１５６で表されるアミノ酸配列は、ウシ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドの共通配列である。これらの共通配列は、ターゲット物質としてウシ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントを用い、上記と同様にしてファージディスプレイ法を行うことによって得られたペプチドのアミノ酸配列を比較することにより決定したものである（実施例１３の表１８参照）。
【００６６】
したがって、配列番号１５２〜１５６で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有するペプチド又はタンパク質は、ウシ由来ＩｇＧ精製用吸着剤のアフィニティリガンドとして用いることができる。本発明においては、配列番号１５２〜１５６で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有する１種又は２種以上のペプチド又はタンパク質を担体に固定化してもよい。
【００６７】
配列番号１５７〜１６２で表されるアミノ酸配列は、ブタ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドの共通配列である。これらの共通配列は、ターゲット物質としてブタ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントを用い、上記と同様にしてファージディスプレイ法を行うことによって得られたペプチドのアミノ酸配列を比較することにより決定したものである（実施例１４の表２０参照）。
【００６８】
したがって、配列番号１５７〜１６２で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有するペプチド又はタンパク質は、ウシ由来ＩｇＧ精製用吸着剤のアフィニティリガンドとして用いることができる。本発明においては、配列番号１５７〜１６２で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有する１種又は２種以上のペプチド又はタンパク質を担体に固定化してもよい。
【００６９】
配列番号１６３〜１６４で表されるアミノ酸配列は、マウス由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドの共通配列である。これらの共通配列は、ターゲット物質としてマウス由来ＩｇＧのＦｃフラグメントを用い、上記と同様にしてファージディスプレイ法を行うことによって得られたペプチドのアミノ酸配列を比較することにより決定したものである（実施例１５の表２２参照）。
【００７０】
したがって、配列番号１６３〜１６４で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有するペプチド又はタンパク質は、マウス由来ＩｇＧ精製用吸着剤のアフィニティリガンドとして用いることができる。本発明においては、配列番号１６３〜１６４で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有する１種又は２種以上のペプチド又はタンパク質を担体に固定化してもよい。
【００７１】
本発明のＩｇＧの精製法は、上記の各種ペプチド又はタンパク質を固定化した担体（ＩｇＧ精製用吸着剤）を用いて、通常のプロテインＡやプロテインＧを利用したアフィニティカラムによるＩｇＧの精製法と同様にして行うことができる。すなわち、上記ＩｇＧ精製用吸着剤を充填したカラムをＰＢＳ等の緩衝液で平衡化した後、ＩｇＧを含む試料を負荷し、ＰＢＳ等の緩衝液でカラムを洗浄する。そして、カラムに溶離液を流して、ｐＨ低下、塩濃度を高めるなどすることにより、吸着されたＩｇＧを溶出すればよい。なお、後述する実施例に示されるように、ＩｇＧのＦｃフラグメントに対する親和性の弱いペプチドをアフィニティリガンドとして固定化した担体を用いた場合は、リテンションタイムの違いによるＩｇＧの精製も可能であり、ＩｇＧを精製する際に問題となるＩｇＧの失活や変性を防止できる。
【００７２】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。
【００７３】
実施例１
（１）ヒト由来ＩｇＧのＦｃフラグメント（以下、ｈｕｍａｎ Ｆｃと略記する。）に結合性を有するペプチドのスクリーニング
ターゲット物質として、ｈｕｍａｎ Ｆｃを用い、ファージディスプレイ法により、ｈｕｍａｎ Ｆｃに結合性を有するペプチドのスクリーニングを以下のようにして行った。なお、ファージディスプレイ法では、Ｍ１３ファージの表面のマイナータンパクｐＩＩＩにペプチドがランダムに提示されるライブラリ（提示されるランダムアミノ酸数が７個、１０個、１２個のペプチドライブラリ）を、Ｓｍｉｔｈ， Ｇ．Ｐ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２８８， １３１５−１３１７ （１９８５）、Ｊ．Ｋ． Ｓｃｏｔｔ ａｎｄ Ｇ．Ｐ． Ｓｍｉｔｈ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４９， ３８６−３９０ （１９９０）等の記載に基づいて作成し、この３種類のライブラリを用いた。
【００７４】
ターゲットとなるｈｕｍａｎ Ｆｃ（ＩＣＮ／ＣＡＰＰＥＬ社製、ＰＵＲＩＦＩＥＤ ＨＵＭＡＮ ＩＧＧ ＦＣ）は、商品名「ｓｕｌｆｏＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ」（ピアース社製）を用いてビオチン標識し、ストレプトアビジンでコートされた磁気ビーズ（商品名「Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ２８０ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ」、Ｄｙａｎａｌ社製）に、ビオチン−ストレプトアビジン結合活性を利用して固定化した。この磁気ビーズは非特異的な結合を最低限にするため、２％（ｗ／ｖ）スキムミルク溶液（１０ｍＭリン酸バッファ、ｐＨ７．４）に懸濁してブロッキングを行った。
【００７５】
この磁気ビーズを用いて、常法にしたがってファージディスプレイ法（選択操作３回）を行い、配列番号１６５〜２０７で表されるｈｕｍａｎ Ｆｃに結合性を有するペプチドのアミノ酸配列を同定した。
【００７６】
（２）得られたペプチドのｈｕｍａｎ Ｆｃに対する結合性の確認
ターゲットとなるｈｕｍａｎ Ｆｃを、コーニング社製ＥＬＩＳＡプレート（高結合タイプ）に以下のようにして固定化した。ｈｕｍａｎ Ｆｃ（ＩＣＮ／ＣＡＰＰＥＬ社製、ＰＵＲＩＦＩＥＤ ＨＵＭＡＮＩＧＧ ＦＣ）を１００μｇ／ｍｌとなるように炭酸バッファ（１００ｍＭ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．０）に溶解した溶液を調製し、この溶液を１００μｌずつプレートのウェルに入れて４℃で一晩放置して、ｈｕｍａｎ Ｆｃフラグメントの固定化を行った。また、上記と同様にして、特異性の対照として、ニワトリ、ウサギ、ウマ、ヤギ由来の各種ＩｇＧのＦｃフラグメント（いずれもＲＯＣＫＬＡＮＤ社製）を、コーニング社製ＥＬＩＳＡプレート（高結合タイプ）に固定化した。
【００７７】
なお、ウェルは２４列用い、１列は抗ｈｕｍａｎ Ｆｃ抗体用（ポジティブコントロール）に、１列はｈｕｍａｎ Ｆｃに結合性を有さないペプチドを呈示するファージ用（ネガティブコントロール）とし、残りの２２列は、配列番号１６５〜１６７、１６９、１７０、１７２、１７３、１７５〜１８９で表される各ｈｕｍａｎ Ｆｃに結合性を有するペプチドを呈示したファージ用とした。
【００７８】
一晩放置した後、各ウェル中の溶液を捨て、３００μｌのブロッキングバッファ（２％（ｗ／ｖ）スキムミルク ＰＢＳ溶液）を、上記Ｆｃフラグメント固定化ウェル、及びターゲット無しの空ウェル（コントロール用、２４個）に加えて、２時間室温で放置した。
【００７９】
一方、各ファージ（上記２２種のｈｕｍａｎ Ｆｃに結合性を有するペプチドを呈示した各ファージと、ｈｕｍａｎ Ｆｃに結合性を有さないペプチドを呈示したファージ）溶液（１０１１ｐｆｕ／μｌ）５０μｌをブロッキングバッファ６５０μｌに加えて３０分放置し、非特異的結合の低減前処理を行った。また、抗ｈｕｍａｎ Ｆｃ抗体（ＣＡＰＰＥＬ社製、ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ ａｎｔｉｓｅｒｕｍ）３０μｌを６５０μｌのブロッキングバッファに溶解し、同様に非特異的吸着低減処理を行った。
【００８０】
各ウェルのブロッキングバッファを捨て、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．１％Ｔｗｅｅｎ ｉｎ ＰＢＳ）で５回洗浄した後、上記の各ファージ溶液と抗ｈｕｍａｎ Ｆｃ抗体溶液を、ｈｕｍａｎ Ｆｃ固定化ウェル、各動物種Ｆｃフラグメント固定化ウェル、コントロール用ウェルに１００μｌずつ加え、１時間軽く撹拌（２０ｒｐｍ／ｍｉｎ程度）しながら室温で放置した。
【００８１】
そして、各ウェル中の溶液を捨て、２００μｌのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで６回洗浄した後、各ウェルに、下記の発色用の抗体を含む溶液を１００μｌずつ加え、穏やかに撹拌しながら１時間放置した。
【００８２】
・ペプチド呈示ファージを加えたウェル：商品名「ａｎｔｉ Ｍ１３ ａｎｔｉｂｏｄｙ ＨＲＰ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌｃｏｎｊｕｇａｔｅ」（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｅｉｅｎｃｅｓ社製）を４μｌ／２０ｍｌとなるようにブロッキングバッファに溶解した溶液。
【００８３】
・抗ｈｕｍａｎ Ｆｃ抗体を加えたウェル：商品名「ＨＲＰ−ａｎｔｉ ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｇｏａｔ）」（ＣＡＰＰＥＬ社製）を０．２μｌ／ｍｌとなるように２ｍｌのブロッキングバッファに溶解した溶液。
【００８４】
そして、各ウェル中の溶液を捨て、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで６回洗浄した後、ＡＢＴＳ発色溶液（ＡＢＴＳ（和光純薬製）を０．２２ｍｇ／ｍｌとなるようにクエン酸バッファ（５０ｍＭ、ｐＨ４．０）に溶解して作製し、使用直前に１．８μｌ／ｍｌとなるように３０％過酸化水素水（和光純薬製）を加えたもの）を２００μｌずつ、各ウェルに加えて発色させて、吸光度（４０５ｎｍ）をプレートリーダー（「ＡＲＶＯ．ＳＸ」、ワラック社製）で測定した。その結果を図１に示す。なお、図１において、Ｙ軸は各Ｆｃフラグメント固定化ウェルの吸光度をコントロールのウェルの吸光度で割ったものである。
【００８５】
図１から、配列番号１６５〜１６７、１６９、１７０、１７２、１７３、１７５〜１８９で表されるペプチドは、ｈｕｍａｎ Ｆｃに対する特異性が高いことが分かる。一方、ポジティブコントロールの抗体はｈｕｍａｎ Ｆｃ以外にも結合しており、ポリクローナルの未吸収血清では特異性が低いことが分かる。
【００８６】
（３）得られた全てのペプチド（配列番号１６５〜２０７）について、上記（２）と同様の方法（ＥＬＩＳＡ法）で、ｈｕｍａｎ Ｆｃに対する結合性を調べた。その結果を表１に示す。なお、表１中の「発色値」は、ｈｕｍａｎ Ｆｃ（ターゲット物質）固定化ウェルの吸光度（４０５ｎｍ）／コントロール（空）ウェルの吸光度（４０５ｎｍ）を表し、「発色値」が大きいほど、ｈｕｍａｎ Ｆｃに対する親和性が強いことを示す。
【００８７】
【表１】
表１から、配列番号１６５〜２０７で表されるペプチドは、ｈｕｍａｎ Ｆｃに対する親和性が異なるものの、いずれもｈｕｍａｎ Ｆｃに対して結合力を有していることが分かる。
【００８９】
（４）得られたペプチドの共通配列の検索
配列番号１６５〜２０７で表されるペプチドのアミノ酸配列から、表２のような組み合わせで共通配列の検索を行い、配列番号１〜８７で表される共通配列を決定した。
【００９０】
【表２】
実施例２
実施例１のｈｕｍａｎ Ｆｃの代わりに、ヒト由来ＩｇＧ（ＣＡＰＰＥＬ社製）そのものを用い、対照としてブタ、ウシ、マウス、ヤギ、ウサギ由来の各種ＩｇＧ（ＲＯＣＫＬＡＮＤ社製）を用いた以外は、実施例１の（２）と同様の方法で実験を行い、配列番号１６５〜１６７、１６９、１７０、１７２、１７３、１７５〜１８９で表されるペプチドのヒト由来ＩｇＧに対する特異性を検討した。その結果を図２に示す。
【００９２】
図２から分かるように、実施例１の場合とほぼ同様の結果が得られ、配列番号１６５〜１６７、１６９、１７０、１７２、１７３、１７５〜１８９で表されるペプチドは、ヒト由来ＩｇＧそのものに対しても特異性が高いことが確認された。
【００９３】
実施例３
配列番号１６６で表されるペプチドのＣ末端側にグリシンとアルギニンを付加した配列番号２８１で表されるペプチドを用いて、ｈｕｍａｎ Ｆｃが精製できるかどうかを確認した。なお、Ｃ末端に付加したグリシンはスペーサーとして、アルギニンはアミノ基を利用したカラムへの固定化に利用するためのアミノ基追加用である。
【００９４】
配列番号２８１で表されるペプチドは、株式会社シグマジェノシスに合成を依頼（８０％純度保証）した。
【００９５】
＜カラムへの固定化＞
ｈｕｍａｎ Ｆｃを精製するために、配列番号２８１で表されるペプチドを固定化したカラムを、商品名「ＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＨＰ（カラムボリューム１ｍｌ）」（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、以下、単にカラムという）を用いて、以下のようにして作製した。
【００９６】
まず、カラムのキャップを外し、シリンジを用いて氷冷した６ｍｌの１ｍＭ ＨＣｌでカラムを洗浄した後、配列番号２８１で表されるペプチドを含む溶液（１ｍｇ／ｍｌ溶液、バッファ：炭酸バッファ０．２Ｍ ＮａＨＣＯ３、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．３）１．５ｍｌを上記カラムにシリンジで注入し、これを室温で２時間放置してペプチドをカラムに固定化した。ペプチド固定化後、未反応のカラム官能基をブロックして活性を無くすため、エタノールアミン溶液（０．５Ｍエタノールアミン、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．３）６ｍｌと酢酸バッファ（０．１Ｍ酢酸、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ４．０）６ｍｌを交互に４回ずつ通した。なお、途中、２回目のエタノールアミン溶液注入後は３０分室温で放置した。この操作終了後、ＰＢＳ（１０ｍＭリン酸、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）５ｍｌでカラムを平衡化した。
【００９７】
＜Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ＞
上記のようにして作成したカラムを用い、以下のようにしてｈｕｍａｎ Ｆｃを精製した。なお、精製にはＨＰＬＣシステム「ＡＫＴＡ ｐｕｒｉｆｉｅｒ」（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いた。
【００９８】
まず、１００μｇ／ｍｌとなるようにｈｕｍａｎ Ｆｃ（ＩＣＮ／ＣＡＰＰＥＬ社製、ＰＵＲＩＦＩＥＤ ＨＵＭＡＮ ＩＧＧ ＦＣ）をＮａＨＣＯ３溶液（１００ｍＭ、ｐＨ８．０）に溶解してｈｕｍａｎ Ｆｃ溶液を調製した。対照として、ヒトに近いと言われるブタ由来ＩｇＧ Ｆｃフラグメント（ＲＯＣＫＬＡＮＤ社製、ＳＷＩＮＥ ＩｇＧ Ｆｃ ｆｒａｇｍｅｎｔ）をした溶液も同様に調製した。そして、カラムをＨＰＬＣシステムに繋げ、１ｍｌ／ｍｉｎの流速でＰＢＳで平衡化した（実験を通して流速はこのままである。）。これに、上記ｈｕｍａｎ Ｆｃ溶液１００μｌを注入してカラムに吸着させた。そして、カラム容量の５倍のボリューム（５ｍｌ）のＰＢＳで洗浄した後、連続して溶離液（ＰＢＳ ｐＨ３．０）をグラディエント投入した。グラディエントは、溶離液１００％になるまでカラム容量の２０倍のボリューム（２０ｍｌ）と設定した。また、ブタ由来ＩｇＧ Ｆｃフラグメント溶液も上記と同様にしてカラムに供した。それらの溶出結果を図３に示す。
【００９９】
実施例４
カラムに固定化するペプチドとして、配列番号１７３で表されるペプチドのＣ末端側にグリシンとアルギニンを付加した配列番号２８２で表されるペプチドを用いて、実施例３と同様の方法でカラムを作製し、ｈｕｍａｎ Ｆｃの精製を行った。その結果を図３に示す。なお、配列番号１７３で表されるペプチドは、実施例３で用いた配列番号１６６で表されるペプチドに比べて、ｈｕｍａｎ Ｆｃに対する親和性が弱いことが、ＥＬＩＳＡ発色により確認されている（表１参照）。
【０１００】
実施例５
カラムに固定化するペプチドとして、配列番号２８１で表されるペプチドと、配列番号２８２で表されるペプチドの２種類を用いて、実施例３と同様の方法でカラムを作製し、ｈｕｍａｎ Ｆｃの精製を行った。なお、これらのペプチドをカラムに固定化する際には、それぞれ０．５ｍｇ／ｍｌ（あわせて１ｍｇ／ｍｌ）となるように炭酸バッファに溶解して固定化した。その結果を図３に示す。
【０１０１】
図３中、（Ａ）はサンプルを負荷していないカラム（コントロール）の溶出結果、（Ｂ）は配列番号２８１で表されるペプチドを固定したカラムにｈｕｍａｎ Ｆｃを負荷した場合の溶出結果（実施例３）、（Ｃ）は配列番号２８１で表されるペプチドを固定したカラムにブタ由来ＩｇＧ Ｆｃフラグメントを負荷した場合の溶出結果（実施例３）、（Ｄ）は配列番号２８２で表されるペプチドを固定したカラムにｈｕｍａｎ Ｆｃを負荷した場合の溶出結果（実施例４）、（Ｅ）は、配列番号２８１で表されるペプチド及び配列番号２８２で表されるペプチドを固定したカラムにｈｕｍａｎ Ｆｃを負荷した場合の溶出結果（実施例５）を表し、▲１▼〜▲７▼は検出されたピークを示す。
【０１０２】
図３の（Ｂ）、（Ｃ）の結果から、配列番号２８１で表されるペプチドを固定したカラムにはｈｕｍａｎ Ｆｃは吸着されているが、ブタ由来ＩｇＧ Ｆｃフラグメントは吸着されていないことが分かる。したがって、ｈｕｍａｎ Ｆｃに結合性を有するペプチドを用いることにより、ｈｕｍａｎ Ｆｃを特異的に精製できることが分かる。なお、（Ｂ）において、複数ピーク（▲１▼〜▲３▼）が見られるのは、ＩｇＧのサブクラスＩｇＧ１〜ＩｇＧ４による結合親和性の違いから来るものと考えられ、サブクラスを分けるカラムも作成可能であることが示唆される。
【０１０３】
一方、図３の（Ｄ）の結果から、配列番号２８２で表されるペプチドを固定したカラムを用いた場合、実施例３の場合のように、溶離液を用いなくてもｈｕｍａｎ Ｆｃが溶出されていることが分かる（ピーク▲４▼）。したがって、ｈｕｍａｎ Ｆｃに対する親和性の弱いペプチドを用いることにより、リテンションタイムの違いによってＩｇＧの精製が可能であることが示され、ＩｇＧを精製する際に問題となるＩｇＧの失活や変性を防止できる可能性が示唆される。
【０１０４】
また、図３の（Ｅ）の結果から、配列番号２８１で表されるペプチド及び配列番号２８２で表されるペプチドを固定したカラムを用いてもｈｕｍａｎ Ｆｃを十分に精製できることが分かる。なお、ピーク（▲６▼、▲７▼）の状態が上記２つのペプチドをそれぞれ単独で用いた場合（実施例３、４の場合）と異なることから、ペプチドを適当に組み合わせることにより、目的に合ったカラムが作製できる可能性も示唆される。
【０１０５】
実施例６
ターゲット物質として、ウマ由来ＩｇＧのＦｃフラグメント（以下、ｈｏｒｓｅ Ｆｃと略記する。）を用いた以外は、実施例１の（１）と同様にしてファージディスプレイ法（選択操作４回）を行い、ｈｏｒｓｅ Ｆｃに対して結合性を有するペプチドのスクリーニングを行い、配列番号２０８〜２１２で表されるペプチドのアミノ酸配列を同定した。
【０１０６】
得られた全てのペプチド（配列番号２０８〜２１２）について、実施例１（２）と同様の方法（ＥＬＩＳＡ法）で、ｈｏｒｓｅ Ｆｃに対する結合性を調べた。その結果を表３に示す。なお、表３中の「発色値」は、ｈｏｒｓｅ Ｆｃ（ターゲット物質）固定化ウェルの吸光度（４０５ｎｍ）／コントロール（空）ウェルの吸光度（４０５ｎｍ）を表し、「発色値」が大きいほど、ｈｏｒｓｅ Ｆｃに対する親和性が強いことを示す。
【０１０７】
【表３】
表３から、配列番号２０８〜２１２で表されるペプチドは、ｈｏｒｓｅ Ｆｃに対する親和性が異なるものの、いずれもｈｏｒｓｅ Ｆｃに対して結合力を有していることが分かる。
【０１０９】
また、配列番号２０８〜２１２で表されるペプチドのアミノ酸配列から、表４のような組み合わせで共通配列の検索を行い、配列番号８８〜９０で表される共通配列を決定した。
【０１１０】
【表４】
実施例７
ターゲット物質として、ヒツジ由来ＩｇＧのＦｃフラグメント（以下、ｓｈｅｅｐ Ｆｃと略記する。）を用いた以外は、実施例１の（１）と同様にしてファージディスプレイ法（選択操作４回）を行い、ｓｈｅｅｐ Ｆｃに対して結合性を有するペプチドのスクリーニングを行い、配列番号２１３〜２１６で表されるペプチドのアミノ酸配列を同定した。
【０１１２】
得られた全てのペプチド（配列番号２１３〜２１６）について、実施例１（２）と同様の方法（ＥＬＩＳＡ法）で、ｓｈｅｅｐ Ｆｃに対する結合性を調べた。その結果を表５に示す。なお、表５中の「発色値」は、ｓｈｅｅｐ Ｆｃ（ターゲット物質）固定化ウェルの吸光度（４０５ｎｍ）／コントロール（空）ウェルの吸光度（４０５ｎｍ）を表し、「発色値」が大きいほど、ｓｈｅｅｐ Ｆｃに対する親和性が強いことを示す。
【０１１３】
【表５】
表５から、配列番号２１３〜２１６で表されるペプチドは、ｓｈｅｅｐ Ｆｃに対する親和性が異なるものの、いずれもｓｈｅｅｐ Ｆｃに対して結合力を有していることが分かる。
【０１１５】
また、配列番号２１３〜２１６で表されるペプチドのアミノ酸配列から、表６のような組み合わせで共通配列の検索を行い、配列番号９１〜９３で表される共通配列を決定した。
【０１１６】
【表６】
実施例８
ターゲット物質として、ウサギ由来ＩｇＧのＦｃフラグメント（以下、ｒａｂｂｉｔ Ｆｃと略記する。）を用いた以外は、実施例１の（１）と同様にしてファージディスプレイ法（選択操作４回）を行い、ｒａｂｂｉｔ Ｆｃに対して結合性を有するペプチドのスクリーニングを行い、配列番号２１７〜２２０で表されるペプチドのアミノ酸配列を同定した。
【０１１８】
得られた全てのペプチド（配列番号２１７〜２２０）について、実施例１（２）と同様の方法（ＥＬＩＳＡ法）で、ｒａｂｂｉｔ Ｆｃに対する結合性を調べた。その結果を表７に示す。なお、表７中の「発色値」は、ｒａｂｂｉｔ Ｆｃ（ターゲット物質）固定化ウェルの吸光度（４０５ｎｍ）／コントロール（空）ウェルの吸光度（４０５ｎｍ）を表し、「発色値」が大きいほど、ｒａｂｂｉｔ Ｆｃに対する親和性が強いことを示す。
【０１１９】
【表７】
表７から、配列番号２１７〜２２０で表されるペプチドは、ｒａｂｂｉｔ Ｆｃに対する親和性が異なるものの、いずれもｒａｂｂｉｔ Ｆｃに対して結合力を有していることが分かる。
【０１２１】
また、配列番号２１７〜２２０で表されるペプチドのアミノ酸配列から、表８のような組み合わせで共通配列の検索を行い、配列番号９４〜９７で表される共通配列を決定した。
【０１２２】
【表８】
実施例９
ターゲット物質として、モルモット由来ＩｇＧのＦｃフラグメント（以下、ｇｕｉｎｅａ ｐｉｇ Ｆｃと略記する。）を用いた以外は、実施例１の（１）と同様にしてファージディスプレイ法（選択操作４回）を行い、ｇｕｉｎｅａ ｐｉｇ Ｆｃに対して結合性を有するペプチドのスクリーニングを行い、配列番号２２１〜２２７で表されるペプチドのアミノ酸配列を同定した。
【０１２４】
得られた全てのペプチド（配列番号２２１〜２２７）について、実施例１（２）と同様の方法（ＥＬＩＳＡ法）で、ｇｕｉｎｅａ ｐｉｇ Ｆｃに対する結合性を調べた。その結果を表９に示す。なお、表９中の「発色値」は、ｇｕｉｎｅａ ｐｉｇ Ｆｃ（ターゲット物質）固定化ウェルの吸光度（４０５ｎｍ）／コントロール（空）ウェルの吸光度（４０５ｎｍ）を表し、「発色値」が大きいほど、ｇｕｉｎｅａ ｐｉｇ Ｆｃに対する親和性が強いことを示す。
【０１２５】
【表９】
表９から、配列番号２２１〜２２７で表されるペプチドは、ｇｕｉｎｅａ ｐｉｇ Ｆｃに対する親和性が異なるものの、いずれもｇｕｉｎｅａ ｐｉｇ Ｆｃに対して結合力を有していることが分かる。
【０１２７】
また、配列番号２２１〜２２７で表されるペプチドのアミノ酸配列から、表１０のような組み合わせで共通配列の検索を行い、配列番号９８〜１０４で表される共通配列を決定した。
【０１２８】
【表１０】
実施例１０
ターゲット物質として、ヤギ由来ＩｇＧのＦｃフラグメント（以下、ｇｏａｔ Ｆｃと略記する。）を用いた以外は、実施例１の（１）と同様にしてファージディスプレイ法（選択操作４回）を行い、ｇｏａｔ Ｆｃに対して結合性を有するペプチドのスクリーニングを行い、配列番号２２８〜２３２で表されるアミノ酸配列を同定した。
【０１３０】
得られた全てのペプチド（配列番号２２８〜２３２）について、実施例１（２）と同様の方法（ＥＬＩＳＡ法）で、ｇｏａｔ Ｆｃに対する結合性を調べた。その結果を表１１に示す。なお、表１１中の「発色値」は、ｇｏａｔ Ｆｃ（ターゲット物質）固定化ウェルの吸光度（４０５ｎｍ）／コントロール（空）ウェルの吸光度（４０５ｎｍ）を表し、「発色値」が大きいほど、ｇｏａｔ Ｆｃに対する親和性が強いことを示す。
【０１３１】
【表１１】
表１１から、配列番号２２８〜２３２で表されるペプチドは、ｇｏａｔ Ｆｃに対する親和性が異なるものの、いずれもｇｏａｔ Ｆｃに対して結合力を有していることが分かる。
【０１３３】
また、配列番号２２８〜２３２で表されるペプチドのアミノ酸配列から、表１２のような組み合わせで共通配列の検索を行い、配列番号１０５〜１０８で表される共通配列を決定した。
【０１３４】
【表１２】
実施例１１
ターゲット物質として、ネコ由来ＩｇＧのＦｃフラグメント（以下、ｃａｔ Ｆｃと略記する。）を用いた以外は、実施例１の（１）と同様にしてファージディスプレイ法（選択操作４回）を行い、ｃａｔ Ｆｃに対して結合性を有するペプチドのスクリーニングを行い、配列番号２３３〜２４８で表されるペプチドのアミノ酸配列を同定した。
【０１３６】
得られた全てのペプチド（配列番号２３３〜２４８）について、実施例１（２）と同様の方法（ＥＬＩＳＡ法）で、ｃａｔ Ｆｃに対する結合性を調べた。その結果を表１３に示す。なお、表１３中の「発色値」は、ｃａｔ Ｆｃ（ターゲット物質）固定化ウェルの吸光度（４０５ｎｍ）／コントロール（空）ウェルの吸光度（４０５ｎｍ）を表し、「発色値」が大きいほど、ｃａｔ Ｆｃに対する親和性が強いことを示す。
【０１３７】
【表１３】
表１３から、配列番号２３３〜２４８で表されるペプチドは、ｃａｔ Ｆｃに対する親和性が異なるものの、いずれもｃａｔ Ｆｃに対して結合力を有していることが分かる。
【０１３９】
また、配列番号２３３〜２４８で表されるペプチドのアミノ酸配列から、表１４のような組み合わせで共通配列の検索を行い、配列番号１０９〜１３１で表される共通配列を決定した。
【０１４０】
【表１４】
実施例１２
ターゲット物質として、イヌ由来ＩｇＧのＦｃフラグメント（以下、ｄｏｇ Ｆｃと略記する。）を用いた以外は、実施例１の（１）と同様にしてファージディスプレイ法（選択操作４回）を行い、ｄｏｇ Ｆｃに対して結合性を有するペプチドのスクリーニングを行い、配列番号２４９〜２６１で表されるペプチドのアミノ酸配列を同定した。
【０１４２】
得られた全てのペプチド（配列番号２４９〜２６１）について、実施例１（２）と同様の方法（ＥＬＩＳＡ法）で、ｄｏｇ Ｆｃに対する結合性を調べた。その結果を表１５に示す。なお、表１５中の「発色値」は、ｄｏｇ Ｆｃ（ターゲット物質）固定化ウェルの吸光度（４０５ｎｍ）／コントロール（空）ウェルの吸光度（４０５ｎｍ）を表し、「発色値」が大きいほど、ｄｏｇ Ｆｃに対する親和性が強いことを示す。
【０１４３】
【表１５】
表１５から、配列番号２４９〜２６１で表されるペプチドは、ｄｏｇ Ｆｃに対する親和性が異なるものの、いずれもｄｏｇ Ｆｃに対して結合力を有していることが分かる。
【０１４５】
また、配列番号２４９〜２６１で表されるペプチドのアミノ酸配列から、表１６のような組み合わせで共通配列の検索を行い、配列番号１３２〜１５１で表される共通配列を決定した。
【０１４６】
【表１６】
実施例１３
ターゲット物質として、ウシ由来ＩｇＧのＦｃフラグメント（以下、ｂｏｖｉｎｅ Ｆｃと略記する。）を用いた以外は、実施例１の（１）と同様にしてファージディスプレイ法（選択操作４回）を行い、ｂｏｖｉｎｅ Ｆｃに対して結合性を有するペプチドのスクリーニングを行い、配列番号２６２〜２６７で表されるペプチドのアミノ酸配列を同定した。
【０１４８】
得られた全てのペプチド（配列番号２６２〜２６７）について、実施例１（２）と同様の方法（ＥＬＩＳＡ法）で、ｂｏｖｉｎｅ Ｆｃに対する結合性を調べた。その結果を表１７に示す。なお、表１７中の「発色値」は、ｂｏｖｉｎｅ Ｆｃ（ターゲット物質）固定化ウェルの吸光度（４０５ｎｍ）／コントロール（空）ウェルの吸光度（４０５ｎｍ）を表し、「発色値」が大きいほど、ｂｏｖｉｎｅ Ｆｃに対する親和性が強いことを示す。
【０１４９】
【表１７】
表１７から、配列番号２６２〜２６７で表されるペプチドは、ｂｏｖｉｎｅ Ｆｃに対する親和性が異なるものの、いずれもｂｏｖｉｎｅ Ｆｃに対して結合力を有していることが分かる。
【０１５１】
また、配列番号２６２〜２６７で表されるペプチドのアミノ酸配列から、表１８のような組み合わせで共通配列の検索を行い、配列番号１５２〜１５６で表される共通配列を決定した。
【０１５２】
【表１８】
実施例１４
ターゲット物質として、ブタ由来ＩｇＧのＦｃフラグメント（以下、ｓｗｉｎｅ Ｆｃと略記する。）を用いた以外は、実施例１の（１）と同様にしてファージディスプレイ法（選択操作４回）を行い、ｓｗｉｎｅ Ｆｃに対して結合性を有するペプチドのスクリーニングを行い、配列番号２６８〜２７７で表されるペプチドのアミノ酸配列を同定した。
【０１５４】
得られた全てのペプチド（配列番号２６８〜２７７）について、実施例１（２）と同様の方法（ＥＬＩＳＡ法）で、ｓｗｉｎｅ Ｆｃに対する結合性を調べた。その結果を表１９に示す。なお、表１９中の「発色値」は、ｓｗｉｎｅ Ｆｃ（ターゲット物質）固定化ウェルの吸光度（４０５ｎｍ）／コントロール（空）ウェルの吸光度（４０５ｎｍ）を表し、「発色値」が大きいほど、ｓｗｉｎｅ Ｆｃに対する親和性が強いことを示す。
【０１５５】
【表１９】
表１９から、配列番号２６８〜２７７で表されるペプチドは、ｓｗｉｎｅ Ｆｃに対する親和性が異なるものの、いずれもｓｗｉｎｅ Ｆｃに対して結合力を有していることが分かる。
【０１５７】
また、配列番号２６８〜２７７で表されるペプチドのアミノ酸配列から、表２０のような組み合わせで共通配列の検索を行い、配列番号１５７〜１６２で表される共通配列を決定した。
【０１５８】
【表２０】
実施例１５
ターゲット物質として、マウス由来ＩｇＧのＦｃフラグメント（以下、ｍｏｕｓｅ Ｆｃと略記する。）を用いた以外は、実施例１の（１）と同様にしてファージディスプレイ法（選択操作４回）を行い、ｍｏｕｓｅ Ｆｃに対して結合性を有するペプチドのスクリーニングを行い、配列番号２７８〜２８０で表されるペプチドのアミノ酸配列を同定した。
【０１６０】
得られた全てのペプチド（配列番号２７８〜２８０）について、実施例１（２）と同様の方法（ＥＬＩＳＡ法）で、ｍｏｕｓｅ Ｆｃに対する結合性を調べた。その結果を表２１に示す。なお、表２１中の「発色値」は、ｍｏｕｓｅ Ｆｃ（ターゲット物質）固定化ウェルの吸光度（４０５ｎｍ）／コントロール（空）ウェルの吸光度（４０５ｎｍ）を表し、「発色値」が大きいほど、ｍｏｕｓｅ Ｆｃに対する親和性が強いことを示す。
【０１６１】
【表２１】
表２１から、配列番号２７８〜２８０で表されるペプチドは、ｍｏｕｓｅ Ｆｃに対する親和性が異なるものの、いずれもｍｏｕｓｅ Ｆｃに対して結合力を有していることが分かる。
【０１６３】
また、配列番号２７８〜２８０で表されるペプチドのアミノ酸配列から、表２２のような組み合わせで共通配列の検索を行い、配列番号１６３〜１６４で表される共通配列を決定した。
【０１６４】
【表２２】
「配列表フリーテキスト」
配列番号１〜８７：ファージディスプレイ法で得られたヒト由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドから決定された共通配列である。
配列番号８８〜９０：ファージディスプレイ法で得られたウマ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドから決定された共通配列である。
配列番号９１〜９３：ファージディスプレイ法で得られたヒツジ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドから決定された共通配列である。
配列番号９４〜９７：ファージディスプレイ法で得られたウサギ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドから決定されたアミノ酸配列である。
配列番号９８〜１０４：ファージディスプレイ法で得られたモルモット由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドから決定された共通配列である。
配列番号１０５〜１０８：ファージディスプレイ法で得られたヤギ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドから決定された共通配列である。
配列番号１０９〜１３１：ファージディスプレイ法で得られたネコ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドから決定された共通配列である。
配列番号１３２〜１５１：ファージディスプレイ法で得られたイヌ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドから決定された共通配列である。
配列番号１５２〜１５６：ファージディスプレイ法で得られたウシ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドから決定された共通配列である。
配列番号１５７〜１６２：ファージディスプレイ法で得られたブタ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドから決定された共通配列である。
配列番号１６３〜１６４：ファージディスプレイ法で得られたマウス由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドから決定された共通配列である。
配列番号１６５〜２０７：ファージディスプレイ法によって得られた、ヒト由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドである。
配列番号２０８〜２１２：ファージディスプレイ法によって得られた、ウマ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドである。
配列番号２１３〜２１６：ファージディスプレイ法によって得られた、ヒツジ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドである。
配列番号２１７〜２２０：ファージディスプレイ法によって得られた、ウサギ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドである。
配列番号２２１〜２２７：ファージディスプレイ法によって得られた、モルモット由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドである。
配列番号２２８〜２３２：ファージディスプレイ法によって得られた、ヤギ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドである。
配列番号２３３〜２４８：ファージディスプレイ法によって得られた、ネコ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドである。
配列番号２４９〜２６１：ファージディスプレイ法によって得られた、イヌ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドである。
配列番号２６２〜２６７：ファージディスプレイ法によって得られた、ウシ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドである。
配列番号２６８〜２７７：ファージディスプレイ法によって得られた、ブタ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドである。
配列番号２７８〜２８０：ファージディスプレイ法によって得られた、マウス由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドである。
配列番号２８１：配列番号１６６で表されるペプチドのＣ末端側にグリシンとアルギニンを付加したペプチドであって、ヒト由来ＩｇＧのＦｃフラグメントを精製する際のアフィニティリガンドとして用いたペプチドである。
配列番号２８２：配列番号１７３で表されるペプチドのＣ末端側にグリシンとアルギニンを付加したペプチドであって、ヒト由来ＩｇＧのＦｃフラグメントを精製する際のアフィニティリガンドとして用いたペプチドである。
配列番号２８３〜２８９：非特許文献１に記載されたヒト由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドである。
【０１６６】
【発明の効果】
以上説明したように本発明のＩｇＧ精製用吸着剤は、担体上に上記のＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又はタンパク質を固定化しているので、ＩｇＧへの特異性が高く、効率よくＩｇＧを精製することができる。また、ペプチドは化学合成によって低コストで大量に調製できるので、ＩｇＧ精製用吸着剤の製造コストを下げることが可能となり、結果的に精製コストの低減を図ることができる。また、従来のアフィニティカラムに用いられているプロテインＡやプロテインＧに比べて夾雑物の混入等の心配がないので、医薬用途の抗体の精製にも適用しやすいという利点もある。さらに、ＩｇＧのＦｃフラグメントに対する親和性の異なるペプチドを用いることにより、例えば、ＩｇＧのサブクラスを分けることができるカラムや、リテンションタイムの違いでＩｇＧの精製が可能なカラムを作製できる可能性があり、精製工程の簡略化や、精製工程におけるＩｇＧの失活や変性を防止できる可能性がある。
【０１６７】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】配列番号１６５〜１６７、１６９、１７０、１７２、１７３、１７５〜１８９で表されるペプチドのｈｕｍａｎ Ｆｃに対する結合性の確認試験の結果を表す図である。
【図２】配列番号１６５〜１６７、１６９、１７０、１７２、１７３、１７５〜１８９で表されるペプチドのヒト由来ＩｇＧに対する特異性を検討した結果を示す図である。
【図３】配列番号２８１、２８２で表されるペプチドを固定化したカラムを用いてｈｕｍａｎ Ｆｃを精製した際の溶出結果を示す図である。
Claims (24)
- 担体上に、配列番号１〜１６４で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又はタンパク質を固定化してなることを特徴とするＩｇＧ精製用吸着剤。
- ヒト由来ＩｇＧを精製する際に用いられるＩｇＧ精製用吸着剤であって、担体上に、配列番号１〜８７で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、ヒト由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又はタンパク質を固定化してなる、請求項１に記載のＩｇＧ精製用吸着剤。
- ウマ由来ＩｇＧを精製する際に用いられるＩｇＧ精製用吸着剤であって、担体上に、配列番号８８〜９０で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、ウマ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又はタンパク質を固定化してなる、請求項１に記載のＩｇＧ精製用吸着剤。
- ヒツジ由来ＩｇＧを精製する際に用いられるＩｇＧ精製用吸着剤であって、担体上に、配列番号９１〜９３で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、ヒツジ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又はタンパク質を固定化してなる、請求項１に記載のＩｇＧ精製用吸着剤。
- ウサギ由来ＩｇＧを精製する際に用いられるＩｇＧ精製用吸着剤であって、担体上に、配列番号９４〜９７で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、ウサギ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又はタンパク質を固定化してなる、請求項１に記載のＩｇＧ精製用吸着剤。
- モルモット由来ＩｇＧを精製する際に用いられるＩｇＧ精製用吸着剤であって、担体上に、配列番号９８〜１０４で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、モルモット由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又はタンパク質を固定化してなる、請求項１に記載のＩｇＧ精製用吸着剤。
- ヤギ由来ＩｇＧを精製する際に用いられるＩｇＧ精製用吸着剤であって、担体上に、配列番号１０５〜１０８で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、ヤギ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又はタンパク質を固定化してなる、請求項１に記載のＩｇＧ精製用吸着剤。
- ネコ由来ＩｇＧを精製する際に用いられるＩｇＧ精製用吸着剤であって、担体上に、配列番号１０９〜１３１で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、ネコ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又はタンパク質を固定化してなる、請求項１に記載のＩｇＧ精製用吸着剤。
- イヌ由来ＩｇＧを精製する際に用いられるＩｇＧ精製用吸着剤であって、担体上に、配列番号１３２〜１５１で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、イヌ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又はタンパク質を固定化してなる、請求項１に記載のＩｇＧ精製用吸着剤。
- ウシ由来ＩｇＧを精製する際に用いられるＩｇＧ精製用吸着剤であって、担体上に、配列番号１５２〜１５６で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、ウシ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又はタンパク質を固定化してなる、請求項１に記載のＩｇＧ精製用吸着剤。
- ブタ由来ＩｇＧを精製する際に用いられるＩｇＧ精製用吸着剤であって、担体上に、配列番号１５７〜１６２で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、ブタ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又はタンパク質を固定化してなる、請求項１に記載のＩｇＧ精製用吸着剤。
- マウス由来ＩｇＧを精製する際に用いられるＩｇＧ精製用吸着剤であって、担体上に、配列番号１６３〜１６４で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、マウス由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又はタンパク質を固定化してなる、請求項１に記載のＩｇＧ精製用吸着剤。
- ＩｇＧを精製する際に、配列番号１〜１６４で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又はタンパク質を、アフィニティリガンドとして用いることを特徴とするＩｇＧの精製法。
- ヒト由来ＩｇＧを精製する際に、配列番号１〜８７で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、ヒト由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又はタンパク質を、アフィニティリガンドとして用いる、請求項１３に記載のＩｇＧの精製法。
- ウマ由来ＩｇＧを精製する際に、配列番号８８〜９０で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、ウマ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又はタンパク質を、アフィニティリガンドとして用いる、請求項１３に記載のＩｇＧの精製法。
- ヒツジ由来ＩｇＧを精製する際に、配列番号９１〜９３で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、ヒツジ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又はタンパク質を、アフィニティリガンドとして用いる、請求項１３に記載のＩｇＧの精製法。
- ウサギ由来ＩｇＧを精製する際に、配列番号９４〜９７で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、ウサギ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又はタンパク質を、アフィニティリガンドとして用いる、請求項１３に記載のＩｇＧの精製法。
- モルモット由来ＩｇＧを精製する際に、配列番号９８〜１０４で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、モルモット由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又はタンパク質を、アフィニティリガンドとして用いる、請求項１３に記載のＩｇＧの精製法。
- ヤギ由来ＩｇＧを精製する際に、配列番号１０５〜１０８で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、ヤギ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又はタンパク質を、アフィニティリガンドとして用いる、請求項１３に記載のＩｇＧの精製法。
- ネコ由来ＩｇＧを精製する際に、配列番号１０９〜１３１で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、ネコ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又はタンパク質を、アフィニティリガンドとして用いる、請求項１３に記載のＩｇＧの精製法。
- イヌ由来ＩｇＧを精製する際に、配列番号１３２〜１５１で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、イヌ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又はタンパク質を、アフィニティリガンドとして用いる、請求項１３に記載のＩｇＧの精製法。
- ウシ由来ＩｇＧを精製する際に、配列番号１５２〜１５６で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、ウシ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又はタンパク質を、アフィニティリガンドとして用いる、請求項１３に記載のＩｇＧの精製法。
- ブタ由来ＩｇＧを精製する際に、配列番号１５７〜１６２で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、ブタ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又はタンパク質を、アフィニティリガンドとして用いる、請求項１３に記載のＩｇＧの精製法。
- マウス由来ＩｇＧを精製する際に、配列番号１６３〜１６４で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、マウス由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又はタンパク質を、アフィニティリガンドとして用いる、請求項１３に記載のＩｇＧの精製法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002358615A JP2004189658A (ja) | 2002-12-10 | 2002-12-10 | ＩｇＧ精製用吸着剤及びＩｇＧの精製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002358615A JP2004189658A (ja) | 2002-12-10 | 2002-12-10 | ＩｇＧ精製用吸着剤及びＩｇＧの精製法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2004189658A true JP2004189658A (ja) | 2004-07-08 |
Family
ID=32758286
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002358615A Pending JP2004189658A (ja) | 2002-12-10 | 2002-12-10 | ＩｇＧ精製用吸着剤及びＩｇＧの精製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2004189658A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007060979A1 (ja) * | 2005-11-24 | 2007-05-31 | Peptide Door Co., Ltd. | リポ多糖又はリピッドａ結合剤及び新規ペプチド |
| WO2007060769A1 (ja) * | 2005-11-24 | 2007-05-31 | Peptide Door Co., Ltd. | リポ多糖又はリピッドａ結合剤及び新規ペプチド |
| JP2007244285A (ja) * | 2006-03-16 | 2007-09-27 | Kaneka Corp | 抗体結合性ペプチド |
| EP2995621A1 (en) * | 2014-09-10 | 2016-03-16 | Previpharma AG | Ligands and methods for isolating or removing proteins |
| JP2020500149A (ja) * | 2016-09-19 | 2020-01-09 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ | 補体因子に基づくアフィニティークロマトグラフィー |
-
2002
- 2002-12-10 JP JP2002358615A patent/JP2004189658A/ja active Pending
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007060979A1 (ja) * | 2005-11-24 | 2007-05-31 | Peptide Door Co., Ltd. | リポ多糖又はリピッドａ結合剤及び新規ペプチド |
| WO2007060769A1 (ja) * | 2005-11-24 | 2007-05-31 | Peptide Door Co., Ltd. | リポ多糖又はリピッドａ結合剤及び新規ペプチド |
| JP2007244285A (ja) * | 2006-03-16 | 2007-09-27 | Kaneka Corp | 抗体結合性ペプチド |
| JP4481260B2 (ja) * | 2006-03-16 | 2010-06-16 | 株式会社カネカ | 抗体結合性ペプチド |
| EP2995621A1 (en) * | 2014-09-10 | 2016-03-16 | Previpharma AG | Ligands and methods for isolating or removing proteins |
| JP2020500149A (ja) * | 2016-09-19 | 2020-01-09 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ | 補体因子に基づくアフィニティークロマトグラフィー |
| US11440942B2 (en) | 2016-09-19 | 2022-09-13 | Hoffmann-La Roche Inc. | Complement factor based affinity chromatography |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7217507B2 (en) | Method for detecting ligands and targets in a mixture | |
| JP2001512560A (ja) | 標的に対し特異的な親和性を有するペプチドおよびタンパク質の選択のための方法および手段 | |
| WO2013027796A1 (ja) | IgG結合性ペプチド及びそれによるIgGの検出および精製方法 | |
| US20050214852A1 (en) | Peptides for the treatment and diagnosis of systemic lupus erythematosus | |
| JP2005503344A (ja) | Ｆｃ領域ポリペプチドの結合分子 | |
| US20140170727A1 (en) | Affinity medium using fixed whole cells | |
| EP2949750A1 (en) | Antibody-binding peptide | |
| JP3811524B2 (ja) | リガンドとして有用なペプチド | |
| JP4101298B2 (ja) | タンパク質の製造のための磁気活性化細胞の分類 | |
| JP2004189658A (ja) | ＩｇＧ精製用吸着剤及びＩｇＧの精製法 | |
| JPS62166897A (ja) | 核内非ヒストン蛋白質に対するモノクロ−ナル抗体 | |
| WO2010024271A1 (ja) | 修飾抗ヘパリン／pf4複合体抗体及びhit抗体標準品 | |
| WO1998016541A9 (en) | Magnetically activated cell sorting for production of proteins | |
| JP2004187563A (ja) | ＩｇＧに結合性を有するペプチド又は該ペプチドを表面に呈示したファージを用いたＩｇＧの検出方法 | |
| JP6818305B2 (ja) | 非天然型立体構造を形成した抗体に親和性を示すポリペプチド | |
| JP2004189657A (ja) | ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又はタンパク質 | |
| Lathrop et al. | The Bead blot: A method for identifying ligand–protein and protein–protein interactions using combinatorial libraries of peptide ligands | |
| KR101257491B1 (ko) | 항체에 결합하는 펩티드, 그의 제조방법 및 용도 | |
| US20230194511A1 (en) | Compound Fixing Method, Detection Method, Screening Method, Substrate Used in Same, Compound Fixing Agent, and Fixing Kit | |
| US20030049694A1 (en) | Production of fusion proteins and use for identifying binding molecules | |
| JPH0459797A (ja) | 抗体の精製法 | |
| JP2004250352A (ja) | リガンドとして有用なペプチド | |
| JP2004217573A (ja) | 免疫グロブリン結合性ペプチド | |
| RU2478646C1 (ru) | Способ получения высокоаффинных поликлональных антител | |
| Camperi et al. | Protein purification by affinity chromatography with peptide ligands selected from the screening of combinatorial libraries |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20051207 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20081028 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20090310 |