JP2004250352A

JP2004250352A - リガンドとして有用なペプチド

Info

Publication number: JP2004250352A
Application number: JP2003040514A
Authority: JP
Inventors: Teruhiko Ide; 輝彦井出
Original assignee: Marine Biotechnology Institute Co Ltd; Tosoh Corp
Current assignee: Marine Biotechnology Institute Co Ltd; Tosoh Corp
Priority date: 2003-02-19
Filing date: 2003-02-19
Publication date: 2004-09-09

Abstract

【課題】温和な条件の下、吸脱着が可能であり、免疫グロブリンに対する結合特異性が高く、かつ、滅菌処理時または保存中における結合特性の低下が極めて少ない、安定性、安全性の高い結合物質を提供する。
【解決手段】金属イオン存在下でのみ免疫グロブリンに特異的に結合するペプチド、及びそのようなペプチドの取得手段。
【選択図】なし

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は精製用リガンドとして有用な、免疫グロブリンに対して特異的に結合性を有するペプチドおよびそのようなペプチドを提示するファージの単離方法に関する。さらに詳述すると、本発明は金属イオン存在下において免疫グロブリンの一定部分にそれ自体を非共有結合的に結合しうるペプチドに関するものであり、免疫グロブリンの精製リガンド等に利用することができる。
【０００２】
【従来の技術】
抗体としても知られる免疫グロブリン（Ｉｇ）は脊椎動物の血漿、リンパ液中に存在する免疫を担う糖タンパク質である。現在まで、免疫グロブリンの五つの主要なクラスがヒトにおいて同定（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ）されている。近年、これらの免疫グロブリンは診断及び治療分野で極めて重要な地位を占め、事実、有機低分子化合物、環境汚染物質、生体由来物質の同定、定量化試薬として広く使用され、また、治療上有用な各種生体分子に結合し、その結果生じる生理的変動から、臨床的な効果も確認されている。さらには、免疫グロブリン及び免疫グロブリン複合体が慢性間接リウマチなどの各種自己免疫疾患の原因、進行に密接に関与することが明らかになりつつある。
【０００３】
免疫グロブリンは、動物の血清等からの分離あるいは適当な細胞系の培養後、夾雑物を除く大まかな前処理工程、クロマトグラフィーによる精製操作等を経てその製造が行われている。精製工程においてはその特異的吸着による利便性から、免疫グロブリン結合性タンパク質であるプロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＨ、プロテインＬ、リウマチ因子（土屋尚之、臨床免疫、２３巻、８９６−９０３（１９９１年））などを吸着リガンドとするアフィニティークロマトグラフィーが用いられることがある。なかでも、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）由来のプロテインＡはその吸着特性から免疫グロブリンＩｇＧの分離・精製に広く採用され、臨床応用も可能な精製ＩｇＧを提供している。プロテインＡは分子量約４２ＫＤａのタンパク質で、免疫グロブリンＩｇＧの不変領域（定常領域とも称される）である重鎖のＣＨ２、ＣＨ３ドメインに結合することが知られている（ＦｏｒｓｇｅｒｅｎＡ．，ＳｊｏｅｑｕｉｓｔＪ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：８２２−８２７（１９６６））。
【０００４】
しかしながら、異種タンパク質である上記タンパク質等を吸着リガンドとするクロマトグラフィー工程を採る場合、それらの溶出による製造物への混入が危惧され（ＢｅｎｓｉｎｇｅｒＷＩ．ｅｔａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．ＲｅｓｐｏｎｓｅＭｏｄ．，３：３４７−３５１（１９８４），ＭｅｓｓｅｒｓｃｈｍｉｄｔＧＬ．ｅｔａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．ＲｅｓｐｏｎｓｅＭｏｄ．，３：３２５−３２９（１９８４））、溶出リガンドを除去する工程が求められる。また、溶出の際用いられる極端な低ｐＨ溶液（あるいは高ｐＨ）による目的タンパク質である免疫グロブリンの変性、タンパク質リガンドの変性などに起因する低回収性の問題点なども報告されている（Ｆｌｕｇｌｓｔａｌｌｅｒ，Ｐ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，９０：１７１−１７７（１９８９），Ｇｏｄｆｒｅｙ，Ｍ．Ａ．，ｅｔａｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１６０：９７−１０５（１９９３））。さらには、タンパク質リガンドの場合、医療品製造には不可欠である滅菌処理時の安定性に問題があり滅菌方法が限定されること、固定化後の保存安定性に欠ける事などが指摘されている。
【０００５】
このように従来から知られているタンパク質性の免疫グロブリン吸着剤は、安全性、安定性などの観点から、診断・治療に用いる免疫グロブリンの精製リガンドとしては必ずしも適切とはいえない。
【０００６】
【非特許文献１】
Ｇ．Ｋ．Ｅｈｒｌｉｃｈ，ａｎｄＰ．Ｂａｉｌｏｎ，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｍｏｄｅｌｐｅｐｔｉｄｅｓａｓａｆｆｉｎｉｔｙｌｉｇａｎｄｓｆｏｒｔｈｅｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｉｚｅｄｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｂｙｍｅａｎｓｏｆｐｈａｇｅｄｉｓｐｌａｙ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．，４９：４４３−４５４（２００１）．
【０００７】
【非特許文献２】
ＭａｒｇａｒｅｔａＫｒｏｏｋ，ＫｌａｕｓＭｏｓｂａｃｈ，ａｎｄＯｌｏｆＲａｍｓｔｒｏｎ，ＮｏｖｅｌｐｅｐｔｉｄｅｓｂｉｎｄｉｎｇｔｏｔｈｅＦｃ−ｐｏｒｔｉｏｎｏｆｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓｏｂｔａｉｎｅｄｆｒｏｍａｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌｐｈａｇｅｄｉｓｐｌａｙｐｅｐｔｉｄｅｌｉｂｒａｒｙ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２２１：１５１−１５７（１９９８）．
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、温和な条件の下、吸脱着が可能であり、免疫グロブリンに対する結合特異性が高く、かつ、滅菌処理時または保存中における結合特性の低下が極めて少ない、安定性、安全性の高い結合物質を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、アミノ酸残基数１０個程度のペプチドであれば天然高分子タンパク質に比べて生体に対する抗原性が極めて低いこと、及びこのような短いペプチドが熱安定性に代表される高い安定性、特に滅菌処理に対する高い安定性および保存安定性を有していることなどの利点を考慮し、各種免疫グロブリン結合性ペプチドの同定を種々検討した。
【００１０】
その結果、ペプチドをファージ表面に提示させたファージディスプレイライブラリー（ＳｍｉｔｈＧ．Ｐ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２８：１３１５−１３１７（１９８５））を金属イオン存在下で抗原に接触させることにより、金属イオン存在下の時のみ免疫グロブリン結合能を有するペプチド提示ファージクローンを多数単離し、そのアミノ酸配列を決定することに成功し本発明を完成するに至った。
【００１１】
即ち、本発明は、（１）任意のペプチドをその表面に提示するファージからなるファージライブラリーを作製し、（２）抗原を固相に固定し、ブロッキング剤で処理し、金属イオンを含む緩衝液下でファ−ジディスプレイライブラリーと接触させ、洗浄し、（３）ファージを固相から解離させた後、増殖させ、（４）増殖させたファージの中から抗原と特異的に結合するペプチドを提示するファージを選択する工程を含む金属イオン存在下でのみ抗原に特異的に結合するペプチドを提示するファージの単離方法である。
【００１２】
また、本発明は、配列番号１乃至５２記載のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン結合性ペプチド、又は前記ペプチドと実質的に同一の免疫グロブリン結合性ペプチドである。
【００１３】
更に、本発明は、下記のアミノ酸配列（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）：
Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（Ｉ）
Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｘ１−Ｘ２−Ａｒｇ（ＩＩ）
（配列中、Ｘ１はＡｓｐ又はＧｌｎを表し、Ｘ２はＶａｌ又はＳｅｒを表す）
Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ（ＩＩＩ）
を含む免疫グロブリン結合性ペプチド、又は前記ペプチドと実質的に同一の免疫グロブリン結合性ペプチドである。
【００１４】
更に、本発明は、上記のの免疫グロブリン結合性ペプチドを担体に固定してなる免疫グロブリン精製用担体である。
【００１５】
更に、本発明は、金属イオン存在下で、上記の免疫グロブリン精製用担体と免疫グロブリンを含む試料とを接触させ前記担体と免疫グロブリンを結合させ、その後、前記担体から免疫グロブリンを解離させることを特徴とする免疫グロブリンの精製方法である。
【００１６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１７】
本発明のファージの単離方法は、以下に詳述する（１）から（４）の工程によって、金属イオン存在下でのみ抗原に特異的に結合するペプチドを提示するファージを単離するものである。
【００１８】
（１）の工程
この工程では、任意のペプチドをその表面に提示するファージからなるファージディスプレイライブラリーを作製する。提示されるアミノ酸配列数は特に限定されないが、７から１５程度が好ましい。ペプチドをファージ表面に提示するには、そのペプチドがファージの表面タンパク質と融合タンパク質となるように、そのペプチドをコードするＤＮＡを導入すればよい。ファージとしては、ファージディスプレイ法に通常使用されるものでよく、Ｍ１３ファージなどを例示することができる。
【００１９】
以上のような方法で、ファージディスプレイライブラリーを作製することができるが、市販のファージディスプレイライブラリーを使用してもよい。ライブラリーとしては、ＰｈａｇｅＤｉｓｐｌａｙＰｅｐｔｉｄｅＬｉｂｒａｒｙＫｉｔ（ニューイングランドバイオラボ社製）などを例示することができる。
【００２０】
（２）の工程
この工程では、抗原を固相に固定し、ブロッキング剤で処理し、ファージディスプレイライブラリーと接触させた後、洗浄する。抗原としては、免疫グロブリンを使用できるが、他のものを使ってもよい。また、抗原とする免疫グロブリンは、免疫グロブリンを直接用いてもよいが、免疫グロブリンの一部である不変領域を用いてもよい。免疫グロブリンの不変領域を固相に固定化することにより、得られるファージの結合性クローンは、免疫グロブリンの種類に依らず結合性を有するからである。免疫グロブリン不変領域は、適当な細胞系の培養生産物から精製後、プロテアゼー等で消化したものを使用することができる。さらには、適当な発現系から調製した組換え免疫グロブリン不変領域タンパク質を用いてもよい。
【００２１】
一般にファージディスプレイ法の選択的濃縮の際には、ブロッキング剤として低分子タンパク質消化物などが用いられるが、本発明においては牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いることができる。
【００２２】
固相となる不溶性担体としては、マイクロタイタープレート、イムノチューブ、ビーズ、メンブランフィルターなどを例示することができる。金属イオンを含む緩衝液下でファージディスプレイライブラリーを固相に固定された抗原と接触させることにより、金属イオン存在下でのみ抗原と特異的に結合するファージを選択的に濃縮することができる。用いられる金属イオンの種類としては、遷移金属、例えば銅、ニッケル、亜鉛、鉄の二価イオン、あるいは鉄、アルミニウムの三価イオン等が例示される。好ましくは銅、ニッケルの二価イオンである。また、接触の際、不溶性担体または抗原と非特異的に結合するファージとも結合することがある。そこで、この抗原を界面活性剤を含む緩衝液等で洗浄することにより、非特異的に結合したファージを除去する。
【００２３】
（３）の工程
この工程では、ファージを固相から解離させた後、増殖させる。標的抗原からのファージの解離は、一般のファージディスプレイ法と同様に接触反応液のｐＨを変化させることにより行ってもよいが、金属キレート剤を含む緩衝液を用いてファージを解離させてもよい。
【００２４】
（４）の工程
この工程では、増殖させたファージの中から免疫グロブリン不変領域と特異的に結合するペプチドを提示するファージを選択する。上記（１）から（３）の工程を１サイクルとして、同様のサイクルを数サイクル程度連続して行い、数サイクル後に得られたファージ溶出液から、ファージをクローニングし、その中から、免疫グロブリン不変領域に特異的に結合するファージを選択する。ファージを選択する方法は特に限定されないが、ＥＬＩＳＡ法によって選択するのが好ましい。
【００２５】
以上のようにして得られた、抗原と特異的に結合しうるペプチドを提示したファージから、適当な方法でＤＮＡを抽出・調製する。このＤＮＡに対して、提示ペプチド部分をコードする塩基配列を解析することで、抗原に特異的に結合するペプチドのアミノ酸配列を同定することができる。
【００２６】
かかる方法によって選択され、同定された金属イオン存在下でのみ免疫グロブリンに特異的に結合するペプチドの第一は、配列番号１乃至４３記載のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン結合性ペプチド及び配列番号４４乃至５２記載のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン結合性ペプチド、又は前記ペプチドと実質的に同一の免疫グロブリン結合性ペプチドに関するものである。ここで、「配列番号１乃至４３記載のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン結合性ペプチド」は、ニッケルイオン存在下でのみ免疫グロブリンに特異的に結合することが確認されているペプチドであり、「配列番号４４乃至５２記載のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン結合性ペプチド」は、銅イオン存在下でのみ免疫グロブリンに特異的に結合することが確認されているペプチドである。また、「前記ペプチドと実質的に同一の免疫グロブリン結合性ペプチド」とは、配列番号１乃至５２記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列で表され、かつ免疫グロブリンと結合し得るペプチドをいう。アミノ酸の欠失、置換若しくは付加の程度及びそれらの位置などは、改変されたペプチド若しくはポリペプチドが、配列番号１乃至５２記載のアミノ酸配列で表されるペプチドと同様に金属イオン存在下でのみ免疫グロブリンに特異的に結合するペプチドであれば特に制限されない。但し、欠失等させるアミノ酸の個数は、通常５個以内であり、好ましくは３個以内であり、最も好ましくは１個である。アミノ酸の改変は、例えば突然変異や翻訳後修飾などに生じることもあるが、人為的に改変することもできる。本発明は、このような改変、変異の原因および手段を問わず、上記特性を有するすべての改変ペプチドを包含する。
【００２７】
上述したペプチドの中、好適なペプチドは、配列番号５、８、１１から１３、１６、１８から２１、２４、２９、３０、３２、３９から４２、４５、４６、５０記載のアミノ酸配列で表されるペプチドであり、より好適なペプチドは、配列番号１１から１３、２９、３２、４１、４２、４６記載のアミノ酸配列で表されるペプチドである。
【００２８】
本発明のペプチドの第二は、上記のアミノ酸配列（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）を含む免疫グロブリン結合性ペプチド、又は前記ペプチドと実質的に同一の免疫グロブリン結合性ペプチドに関する。ここで、「前記ペプチドと実質的に同一の免疫グロブリン結合性ペプチド」とは、アミノ酸配列（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ免疫グロブリンと結合し得るペプチドをいう。アミノ酸の欠失、置換若しくは付加の程度及びそれらの位置などは、改変されたペプチド若しくはポリペプチドが、アミノ酸配列（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）を含むペプチドと同様に免疫グロブリンに対して結合性を有するペプチドであれば特に制限されない。但し、欠失等させるアミノ酸の個数は、好ましくは１個である。アミノ酸の改変は、例えば突然変異や翻訳後修飾などに生じることもあるが、人為的に改変することもできる。本発明は、このような改変、変異の原因および手段を問わず、上記特性を有するすべての改変ペプチドを包含する。また、「アミノ酸配列（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）を含むペプチド」とは、前記したアミノ酸配列だけからなるペプチドのほか、このようなペプチドのＮ末端又はＣ末端側に複数のアミノ酸が付加したものも含む。付加するアミノ酸の個数は、免疫グロブリンに対する結合性を失わせない範囲であれば特に限定されないが、通常は１０個以内であり、好ましくは３個以内である。
【００２９】
一般式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）で表されるアミノ酸配列は、配列番号１乃至５２記載のアミノ酸配列で表されるペプチドを解析した結果見出されたコンセンサス配列である。コンセンサス配列とは、ある特定のペプチドにおけるアミノ酸配列間に、明らかに関連性が認められる配列部分をいう。コンセンサス配列は、同定されたアミノ酸配列においてその結合に必要不可欠な配列と推測することができる。アミノ酸配列（Ｉ）は、配列番号６、２６のアミノ酸配列から見出されたコンセンサス配列であり、アミノ酸配列（ＩＩ）は、配列番号２０、４４のアミノ酸配列から見出されたコンセンサス配列であり、アミノ酸配列（ＩＩＩ）は、配列番号１６、３５のアミノ酸配列から見出されたコンセンサス配列である。
【００３０】
本発明の免疫グロブリン結合性ペプチドは、そのアミノ酸配列に従って、一般的な化学合成法またはペプチドをコードするＤＮＡを用いて遺伝子操作によって製造することができる。
【００３１】
化学合成方法においては、液相及び固相法によるペプチド合成法が包含される。かかるペプチド合成法は、より詳しくは、アミノ酸配列情報に基づいて、各アミノ酸を１個ずつ逐次結合させペプチドを延長させるステップワイズ法、アミノ酸数個からなるフラグメントをあらかじめ合成し、次いで各フラグメントをカップリング反応させる方法を含む。
【００３２】
遺伝子組換え法によって生産する場合には、目的とするペプチドのアミノ酸配列をもとにこれをコードするＤＮＡを合成し、ファージあるいはプラスミドベクターに導入する。これを適当な微生物（例えば大腸菌）に組み込んで形質転換体を選抜、取得し、公知の方法によって培養する。また、適切なプラスミドベクターを選びさえすれば、酵母、放線菌、枯草菌なども宿主として容易に利用することができる。
【００３３】
かくして得られる本発明の免疫グロブリンに結合するペプチドは、通常の方法に従って、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、ゲルパーミネーションクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、向流分配等のペプチド科学の分野で汎用されている方法に従って、精製を行うことができる。
【００３４】
本発明の方法によって、選別され同定されるペプチドは、免疫グロブリンを特異的に認識して結合するアミノ酸配列を有するものであり、適当な担体に結合することで免疫グロブリン精製用担体として用いることができる。担体としては、ガラスビーズ、シリカゲルなどの無機担体、セルロース、キトサン、セファロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、エチレン・酢酸ビニル共重合体、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸メチル、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレン、架橋セルロース、架橋アガロース、架橋デキストランなどの有機担体、さらにはこれらの組み合わせによって得られる複合担体などが挙げられる。さらに担体表面には、リガンドの固定化反応に用い得る官能基が存在することが好都合である。これらの官能基の代表例としては、水酸基、アミノ基、アルデヒド基、カルボキシル基、チオール基、シラノール基、エポキシ基、アミド基、ハロゲン基、サクシニルイミド基、酸無水物基がどが挙げられる。
【００３５】
上記担体へのペプチドの固定化においては、ペプチドの立体障害を小さくすることにより吸着効率を向上させ、さらに非特異的吸着を抑えるために、親水性スペーサーを介して固定化することが好ましい。親水性スペーサーとしては、例えば、両末端をカルボキシル基、アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基などで置換した適当な有機分子であればよい。また、これらペプチドおよびスペーサーとして用いられる有機分子は比較的安定で低分子の物質であり、例えば、酵素、抗体のようなタンパク質を固定化する場合と比較して、その固定化反応条件には制約が少ない。従って、固定化方法は特に限定されるものではない。
【００３６】
本願発明のペプチドは金属イオン存在下でのみ免疫グロブリンに結合する。すなわち、該ペプチドを上述した適当な不溶性担体に固定化し、公知である金属キレートカラムクロマトグラフィーで行われる操作を行うことで、免疫グロブリンを含む原料から精製免疫グロブリンを調製することができる。従来公知の方法としては、免疫グロブリン含有画分を不溶性担体に固定化したペプチドリガンドに接触させることにより、該画分中の夾雑タンパク質が効率良く分離除去される。用いられる金属イオンの種類としては、遷移金属、例えば銅、ニッケル、亜鉛、鉄の二価イオン、あるいは鉄、アルミニウムの三価イオン等が例示される。好ましくは銅、ニッケルの二価イオンである。ペプチドリガンドは、金属イオン含有液、例えばＣｕ^２＋塩含有液（例えばＣｕＳＯ_４）を該リガンドを付着したマトリックスと接触させ、該リガンドに結合させることにより調製される。
【００３７】
免疫グロブリンを吸着画分に回収する場合は、先ず、塩濃度０．０１Ｍ〜１Ｍ程度、ｐＨ５〜８程度の緩衝液、具体的には１Ｍ以下の塩化ナトリウムを含有する１０〜１００ｍＭ酢酸、リン酸又はＴｒｉｓ塩酸緩衝液（ｐＨ５〜９）等を用いて、ペプチドリガンド平衡化、洗浄した後、平衡化したｐＨに調製した免疫グロブリン含有画分を該ペプチドリガンドを固定化した吸着体に接触させ、ついで吸着画分を塩濃度０．０１Ｍ〜１Ｍ、ｐＨ３〜５程度の上記緩衝液を用いて溶出する。
【００３８】
一方、免疫グロブリンを非吸着画分に回収する場合、先ず、塩濃度０．０１Ｍ〜１Ｍ程度、ｐＨ３〜５程度の緩衝液、具体的には１Ｍ以下の塩化ナトリウムを含有する１０〜１００ｍＭ酢酸、リン酸又はＴｒｉｓ塩酸緩衝液（ｐＨ３〜５）等を用いて、ペプチドリガンドを平衡化、洗浄した後、平衡化したｐＨに調製した免疫ブロブリン画分を該ペプチドリガンドに接触させ非吸着画分に回収する。
【００３９】
【実施例】
以下、本発明をさらに詳細に説明するために実施例を示すが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４０】
〔実施例１〕ニッケルイオン存在下で免疫グロブリン不変領域に結合するファージの選択的濃縮
ヒト免疫グロブリン不変領域（ＩＣＮファルマシューティカル社製、カタログ番号５５９１１）をＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）（和光純薬社製）に１０ μｇ／ｍｌの濃度になるよう溶解させ、この溶液を市販のイムノチューブ（ヌンク社製）に２．０ｍｌ加え、一晩放置しヒト免疫グロブリン不変領域を固定化した。翌日、チューブの溶液を除去した後、５％ＢＳＡ（大日本製薬社製）を含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）を３．０ｍｌ加え、室温で２時間放置し、ブロッキングした。ブロッキング後、イムノチューブに１０ｍＭ硫酸ニッケルＮｉＳＯ_４を含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）を２．０ｍｌ加え、さらに、４×１０^１０個相当分のファージ（ニューイングランドバイオラボ社製、Ｐｈａｇｅ−ＤｉｓｐｌａｙＰｅｐｔｉｄｅＬｉｂｒａｒｙｋｉｇ：Ｐｈ．Ｄ−１２）を添加し、室温で２時間放置した。溶液を除去後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、１０ｍＭＮｉＳＯ_４を含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）で３回洗浄することにより結合し得なかったファージを除去した。次に、該チューブに３．０ｍｌの０．１Ｍトリエチルアミンを加え、１５分間、室温で放置することにより結合性ファージを固定化抗原から解離させた。このファージ溶液に２．２５ｍｌの１．０ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）緩衝液を添加し、ファージ溶液のｐＨを調製した。これを常法により大腸菌に感染させ、ファージを増殖させ、次のラウンドのスクリーニング用ファージディスプレイライブラリーとした。
【００４１】
前記の操作を１ラウンドとして、４ラウンド繰り返しニッケルイオン存在下でヒト免疫グロブリン結合性ファージを選択的に濃縮した。
【００４２】
〔実施例２〕銅イオン存在下で免疫グロブリン不変領域に結合するファージの選択的濃縮
ヒト免疫グロブリン不変領域（ＩＣＮファルマシューティカル社製、カタログ番号５５９１１）をＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）（和光純薬社製）に１０ μｇ／ｍｌの濃度になるよう溶解させ、この溶液を市販のイムノチューブ（ヌンク社製）に２．０ｍｌ加え、一晩放置しヒト免疫グロブリン不変領域を固定化した。翌日、チューブの溶液を除去した後、５％ＢＳＡ（大日本製薬社製）を含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）を３．０ｍｌ加え、室温で２時間放置し、ブロッキングした。ブロッキング後、イムノチューブに１０ｍＭ塩化銅ＣｕＣｌ_２を含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）を２．０ｍｌ加え、さらに、４×１０^１０個相当分のファージ（ニューイングランドバイオラボ社製、Ｐｈａｇｅ−ＤｉｓｐｌａｙＰｅｐｔｉｄｅＬｉｂｒａｒｙｋｉｇ：Ｐｈ．Ｄ−１２）を添加し、室温で２時間放置した。溶液を除去後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、１０ｍＭＣｕＣｌ_２を含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）で３回洗浄することにより結合し得なかったファージを除去した。次に、該チューブに３．０ｍｌの０．１Ｍトリエチルアミンを加え、１５分間、室温で放置することにより結合性ファージを固定化抗原から解離させた。このファージ溶液に２．２５ｍｌの１．０ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）緩衝液を添加し、ファージ溶液のｐＨを調製した。これを常法により大腸菌に感染させ、ファージを増殖させ、次のラウンドのスクリーニング用ファージディスプレイライブラリーとした。
【００４３】
前記の操作を１ラウンドとして、４ラウンド繰り返しヒト免疫グロブリン結合性ファージを選択的に濃縮した。
【００４４】
〔実施例３〕免疫グロブリン不変領域に結合するファージのスクリーニング
実施例１、又は実施例２の４ラウンド目で溶出されたファージをそれぞれシングルクローンに調製し、免疫グロブリン不変領域に対する結合性を評価した。シングルクローンの調製は、溶出されたファージを適当に希釈し、対数増殖期の大腸菌ＥＲ２７３８（ニューイングランドバイオラボ社製）を含む、溶解後のソフトアガー（１％トリプトン、０．５％イーストイクストラクト、０．５％ＮａＣｌ、０．１％ＭｇＣｌ_２／６Ｈ_２Ｏ、０．７％アガロース）に添加し、これをＸ−Ｇａｌ（５−Ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ、和光純薬社製）、ＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ、和光純薬社製）を含むＬＢ（１％トリプトン、０．５％イーストイクストラクト、０．５％ＮａＣｌ）プレートにまき、３７℃で一晩培養することで行った。次いで、プレート上のシングルファージクローン（合計１９２個）をピックアップし、対数増殖期の大腸菌ＥＲ２７３８を含む５００μｌのＬＢ液体培地に接種し３７℃で４．５時間、激しく攪拌しながら培養した。得られた培養液を遠心分離（１０，０００ｇ×２０ｍｉｎ）し、培養上清中に含まれるファージを結合活性評価に供した。
【００４５】
結合活性は、市販の９６穴マイクロタイタープレートに免疫グロブリン不変領域（１０μｇ／ｍｌ）を固定化した試験区、緩衝液のみを添加した対照区を設けて評価した。すなわち、５％ＢＳＡを含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）でブロッキング後（２．０時間、３７℃）、ニッケルイオン存在下で濃縮したファージクローン（実施例１）においては、先に得られたファージ溶液５０ μｌ及び２０ｍＭ硫酸ニッケルＮｉＳＯ_４を含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）５０μｌを添加し反応させた（１．５時間、３７℃）。なお、硫酸ニッケルの結合性への効果を評価するため、硫酸ニッケルを含まないＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液の試験区も設定した。反応後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）で３回洗浄し、その後、ＨＲＰで標識された抗Ｍ１３抗体を加えた（アマシャムファルマシアバイオテク社製）。３７℃で１．５時間反応後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）で３回洗浄し、２０００倍希釈のＨＲＰ用の発色試薬ＡＢＴＳ（フナコシ社製）を加え吸光度（４０５ｎｍ）を求めた。また、銅イオン存在下で濃縮したファージクローン（実施例２）においては、上述の硫酸ニッケルに代えて塩化銅ＣｕＣｌ_２を用いた。
【００４６】
それぞれのファージクローンの結合性は免疫グロブリン不変領域固定化ウェルの吸光度と対照ウェルの吸光度の差を以って評価した。ニッケルイオン存在下で選択的に濃縮されたファージクローンのスクリーニング結果の一部を図１、銅イオンのそれを図２に示した。
【００４７】
〔実施例４〕免疫グロブリン結合性ファージが提示しているペプチドのアミノ酸配列の決定
実施例３において金属イオン存在下の試験区と対照区との吸光度差が０．３以上のファージを選び、常法に従い、これらのファージからＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡの塩基配列を決定することにより、ファージが呈示しているポリペプチドのアミノ酸配列を決定した。塩基配列は、配列表配列番号５３のプライマー（５’−ＣＣＣＴＣＡＴＡＧＴＴＡＧＣＧＴＡＡＣＧ−３’）を使用し、チェーンターミネーター法に基づくＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＦＳＲｅａｄｙＲｅａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＰＥアプライドバイオシステム社製）を用いてサイクルシークエンス反応に供し、全自動ＤＮＡシークエンサーＡＢＩＰｒｉｓｍ３７００ＤＮＡＡｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥアプライドバイオシステム社製）にて解析することにより決定した。なお、ファージクローンの提示ペプチド解析の結果、同一のアミノ酸配列を示したクローンがあった。重複する配列を除いたペプチドのアミノ酸配列５２種類を配列表配列番号１から５２に示す。このうち、配列番号１乃至４３で示されたペプチドはニッケルイオン存在下で濃縮されたファージクローンから抽出されたものであり、配列番号４４乃至５２で示されたペプチドは銅イオン存在下で濃縮されたファージクローンから抽出されたものである。
【００４８】
〔実施例５〕ニッケルイオン存在下で免疫グロブリン不変領域に結合するファージの反応性
免疫グロブリン不変領域タンパク質を濃度５０μｇ／ｍｌから連続的に希釈し、それぞれの濃度の免疫グロブリン不変領域溶液１００μｌを９６穴マイクロタイタープレートのウェルに添加し、免疫グロブリン不変領域タンパク質をプレートに固定した（４℃、１６時間）。次に、５％ＢＳＡ含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）でブロッキング後（３７℃、２時間）、各ウェルを０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）で３回洗浄した。洗浄後のプレートに、硫酸ニッケルＮｉＳＯ_４を１０ｍＭ、５ｍＭの濃度で含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）区を作製し、ファージ粒子濃度を１．０×１０^１２個／ｍｌ（ファージタイターの算出は製造者マニュアルに従って行った）に調製したファージ溶液１００μｌを添加、反応させた（３７℃、１．５時間）。評価対象のファージは、実施例３の結果から、高結合性の７個のファージを選別した（配列番号１１から１３、２９，３２，４１，４２のペプチドを提示するファージ）。反応終了後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）で３回洗浄し、２０００倍希釈のＨＲＰ標識抗Ｍ１３抗体を１００μｌ添加し反応させた（３７℃、１．５時間）。次いで、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）で３回洗浄し、ＨＲＰ用の発色試薬ＡＢＴＳで発色させ吸光度を測定した。結果を図３〜図９に示す。
【００４９】
〔実施例６〕銅イオン存在下で免疫グロブリン不変領域に結合するファージの反応性
免疫グロブリン不変領域タンパク質を濃度５０μｇ／ｍｌから連続的に希釈し、それぞれの濃度の免疫グロブリン不変領域溶液を１００μｌを９６穴マイクロタイタープレートのウェルに添加し、免疫グロブリン不変領域タンパク質をプレートに固定した（４℃、１６時間）。次に、５％ＢＳＡ含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）でブロッキング後（３７℃、２時間）、各ウェルを０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）で３回洗浄した。洗浄後のプレートに、塩化銅ＣｕＣｌ_２を１０ｍＭ、５ｍＭの濃度で含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）区を作製し、ファージ粒子濃度を１．０×１０^１２個／ｍｌ（ファージタイターの算出は製造者マニュアルに従って行った）に調製したファージ溶液１００μｌを添加、反応させた（３７℃、１．５時間）。評価対象のファージは、実施例３の結果から、高結合性のファージを選別した（配列番号４６のペプチドを提示するファージ）。反応終了後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）で３回洗浄し、２０００倍希釈のＨＲＰ標識抗Ｍ１３抗体を１００μｌ添加し反応させた（３７℃、１．５時間）。次いで、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）で３回洗浄し、ＨＲＰ用の発色試薬ＡＢＴＳで発色させ吸光度を測定した。結果を図１０に示す。
【００５０】
【発明の効果】
本発明のペプチドは、金属イオン存在下で免疫グロブリンに対する結合特異性が高く、かつ、滅菌処理時または保存中における結合特性の極めて少ないため、免疫グロブリン用の精製リガンド等として有用である。
【００５１】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】ニッケルイオン存在下で免疫グロブリン不変領域に結合するファージのスクリーニング結果を示す図である。
【図２】銅イオン存在下で免疫グロブリン不変領域に結合するファージのスクリーニング結果を示す図である。
【図３】配列番号１１で表されるペプチドを提示するファージの免疫グロブリン不変領域に対する結合性を示す図である。
【図４】配列番号１２で表されるペプチドを提示するファージの免疫グロブリン不変領域に対する結合性を示す図である。
【図５】配列番号１３で表されるペプチドを提示するファージの免疫グロブリン不変領域に対する結合性を示す図である。
【図６】配列番号２９で表されるペプチドを提示するファージの免疫グロブリン不変領域に対する結合性を示す図である。
【図７】配列番号３２で表されるペプチドを提示するファージの免疫グロブリン不変領域に対する結合性を示す図である。
【図８】配列番号４１で表されるペプチドを提示するファージの免疫グロブリン不変領域に対する結合性を示す図である。
【図９】配列番号４２で表されるペプチドを提示するファージの免疫グロブリン不変領域に対する結合性を示す図である。
【図１０】配列番号４６で表されるペプチドを提示するファージの免疫グロブリン不変領域に対する結合性を示す図である。

Claims

（１）任意のペプチドをその表面に提示するファージからなるファージライブラリーを作製し、（２）抗原を固相に固定し、ブロッキング剤で処理し、金属イオンを含む緩衝液下でファ−ジディスプレイライブラリーと接触させ、洗浄し、（３）ファージを固相から解離させた後、増殖させ、（４）増殖させたファージの中から抗原と特異的に結合するペプチドを提示するファージを選択する工程を含む金属イオン存在下でのみ抗原に特異的に結合するペプチドを提示するファージの単離方法。
金属イオンがニッケル又は銅であることを特徴とする請求項１記載のファージの単離方法。
配列番号１乃至５２記載のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン結合性ペプチド、又は前記ペプチドと実質的に同一の免疫グロブリン結合性ペプチド。
下記のアミノ酸配列（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）：
Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（Ｉ）
Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｘ１−Ｘ２−Ａｒｇ（ＩＩ）
（配列中、Ｘ１はＡｓｐ又はＧｌｎを表し、Ｘ２はＶａｌ又はＳｅｒを表す）
Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ（ＩＩＩ）
を含む免疫グロブリン結合性ペプチド、又は前記ペプチドと実質的に同一の免疫グロブリン結合性ペプチド。
請求項３又は４記載の免疫グロブリン結合性ペプチドを担体に固定してなる免疫グロブリン精製用担体。
金属イオン存在下で、請求項５記載の免疫グロブリン精製用担体と免疫グロブリンを含む試料とを接触させ前記担体と免疫グロブリンを結合させ、その後、前記担体から免疫グロブリンを解離させることを特徴とする免疫グロブリンの精製方法。
金属イオンがニッケルイオンであり、免疫グロブリン精製用担体が配列番号１乃至４３記載のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン結合性ペプチド、又は前記ペプチドと実質的に同一の免疫グロブリン結合性ペプチドを担体に固定してなる免疫グロブリン精製用担体であることを特徴とする請求項６記載の免疫グロブリンの精製方法。
金属イオンが銅イオンであり、免疫グロブリン精製用担体が配列番号４４乃至５２記載のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン結合性ペプチド、又は前記ペプチドと実質的に同一の免疫グロブリン結合性ペプチドを担体に固定してなる免疫グロブリン精製用担体であることを特徴とする請求項６記載の免疫グロブリンの精製方法。