KR101257491B1 - 항체에 결합하는 펩티드, 그의 제조방법 및 용도 - Google Patents

항체에 결합하는 펩티드, 그의 제조방법 및 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항체에 결합하는 펩티드, 그의 제조방법 및 용도에 관한 것이다.
본 발명에서 발견된 펩티드를 면역분석법이나 항체 정제 과정 등에 이용할 경우 기존의 이차 항체, protein A, protein G 등을 이용하는 것보다 조작이 쉽고 비용을 절감하는 효과를 얻을 수 있다.

Description

항체에 결합하는 펩티드, 그의 제조방법 및 용도{Antibody-binding peptides, their preparation method and use}
본 발명은 항체에 결합하는 펩티드, 그의 제조방법 및 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 면역분석법에서 이차 항체 (secondary antibody) 대신 이용하거나 항체를 정제하는 친화성 크로마토그래피에 이용할 수 있는 펩티드, 그의 제조방법 및 용도에 관한 것이다.
항체 (antibody)는 백혈구인 B 세포에 의해 면역 글로불린 (immunoglobulin) 단백질로서 침입한 항원 (antigen)과 결합하여 이들의 작용을 중화시키거나 다른 면역 체계가 항원에 대해 면역반응을 일으키도록 유도한다. 항체 단백질들 가운데 가장 큰 비중을 차지하는 면역 글로불린 G (immunoglobulin G, IgG)는 4 개의 폴리펩티드 사슬, 즉 무거운 사슬 (heavy chain) 두 개와 가벼운 사슬 (light chain) 두 개로 이루어져 있다 (도 1). IgG의 전체적인 구조는 Y 자 형태이며 크게 불변영역 (constant region)으로 알려진 Fc (crystallizable fragment)와 가변영역 (variable region)으로 알려진 Fab (antigen-binding fragment)의 두 부분으로 나눠진다. 각 생물체에는 다양한 항원과 반응하기 위해 매우 다양한 IgG가 존재하는데 각 IgG의 Fab는 항원과 선택적 반응을 하기 위해 아미노산 서열과 구조가 다르지만 Fc 부분은 모두 동일하다.
항원과 항체 사이의 선택적 결합력을 이용하여 항원 또는 항체를 검출하는 radioimmunoassay (RIA), enzyme immunoassay (EIA), 그리고 western blotting과 같은 면역분석법 (immunoassay)은 질병진단 및 생명과학 분야에서 중요한 분석 방법으로 이용되고 있다. 그 가운데 가장 널리 사용되고 있는 EIA 는 도 2의 왼쪽에서 보는 것처럼 먼저 면역 플레이트 우물 (microplate well)에 항원을 흡착시키고 이 항원에 대한 항체인 일차 항체를 더하여 결합시킨다. 다음으로 이 항체와 결합할 수 있는 이차 항체에 효소를 연결시켜 넣어준다. 만약 일차 항체가 토끼에서 생성된 것이라면 토끼 IgG를 염소와 같은 다른 동물에 주입하여 만들어진 항체가 이차 항체가 된다. 마지막으로 효소에 의해 색깔을 띠거나, 형광을 발생하거나, 빛을 낼 수 있는 기질을 넣어줌으로써 처음 흡착된 항원의 양을 민감하게 측정할 수 있다.
또는, 이차 항체 대신 항체들과 결합할 수 있는 Staphylococcal protein A나 Streptococcal protein G에 효소를 연결시켜 사용할 수도 있다. protein A나 protein G와 같은 단백질들은 크로마토그래피 매질에 고정시켜 항체를 정제하는 affinity chromatography에 활용되기도 한다. 그러나 이차 항체, protein A, protein G와 같은 단백질들은 가격이 비싸고 안정성이 낮은 단점을 가지고 있다.
이러한 문제를 해결하기 위한 시도로 Fassina 등은 protein A를 모방하는 펩티드를 개발하였다 (Fassina, G. et al., J. Mol. Recognit. 1996, 9, 564). 그들은 펩티드 문고에서 protein A와 IgG의 결합을 방해하는 펩티드를 검색한 결과 아미노산 서열이 YTR (Tyr-Thr-Arg)인 펩티드를 발견하였고, 이 펩티드 네 개를 연결하여 친화도를 증가시킨 항체-결합 펩티드 리간드를 개발하였다. 또한 Ehrlich 등은 파지-펩티드 문고로부터 사람의 IgG Fc 조각에 결합하는 펩티드를 검색한 결과 EPIHRSTLTALL 서열의 펩티드를 발견하여 항체 정제용 크로마토그래피에 활용하였다 (Ehrlich GK and Bailon P. J. Mol. Recognit. 1998, 11, 121). 그러나 Fassina 등이 개발한 tetramer 펩티드는 합성이 어렵다는 단점을 가지고 있으며, EPIHRSTLTALL 펩티드는 잔기의 수가 12개로 역시 합성에 많은 비용이 소요된다. 또한 펩티드 리간드는 일반적으로 단백질 A 나 G 에 비해 친화도가 낮다는 문제점도 발견되었다.
대한민국 공개특허 제2010-56492호는 ‘인간 C-FMS 항원 결합 단백질’에 대하여 기재하고 있으며, 대한민국 공개특허 제2010-1091호는 ‘항체를 세포내로 도입하는 융합 펩타이드, 및 이를 이용한 세포이미징 및 약물 전달’에 관한 것으로, 항체 Fc 부위 결합 펩타이드에 대하여 기재하고 있다.
그러나, 종래의 어떠한 기술도 본 발명에 따르는 항체 결합 펩티드에 대하여 기재하고 있지 않으며, 본 발명에 기재된 바와 같은 항체 결합 방법에 대하여도 기재하고 있지 않다.
본 발명의 목적은 항체에 결합하는 펩티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 항체에 결합하는 펩티드를 확인하는 방법을 제공한다.
본 발명의 목적은 면역 분석법 또는 항체 정제에 사용할 수 있는 펩티드를 제공하는 것이다.
본 발명에 따르면, 항체에 결합하는 KHRFNKD (GL-01), PIISRAT (GL-02), SKPLHKM (GL-03), AAPSPRN (GC-01) 또는 PLSPSQE (GC-02) 서열의 펩티드를 제공한다.
본 발명에 따르면, 무작위 아미노산이 7개인 파지-펩티드 문고를 검색하는 단계, 항체가 결합되어 있는 배양 접시에 파지-펩티드 문고를 더하여 바이오패닝 (biopanning) 과정을 반복하는 단계, 바이오패닝에서 회수된 펩티드 중 발생 빈도가 높은 펩티드의 염기 서열을 확인하는 단계를 포함하는 방법에 있어서, 항체 Fab 부분이 아래로 위치하여 배양 접시에 결합되어 있고 Fc 부분이 위로 노출되어 파지 결합 부위를 제공하는 것을 특징으로 하는 항체 결합 펩티드의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 면역 분석법 또는 항체 정제 과정에 사용하기 위한 KHRFNKD, PIISRAT, SKPLHKM, AAPSPRN 또는 PLSPSQE 서열의 펩티드를 제공한다.
본 발명에서 발견된 펩티드를 면역분석법이나 항체 정제 과정 등에 이용할 경우 기존의 이차 항체, protein A, protein G 등을 이용하는 것보다 조작이 쉽고 비용을 절감하는 효과를 얻을 수 있다.
도 1은 항체의 구조를 나타낸다.
도 2는 효소면역분석법의 원리를 나타낸다.
도 3은 섬유상 박테리오파지의 구조를 나타낸다.
도 4는 바이오패닝의 원리를 나타낸다.
도 5는 Ph.D-7 파지-펩티드 문고에서 무작위 아미노산 서열의 구조를 나타낸다.
도 6은 본원 발명에 사용된 바이오패닝 방법을 나타낸다.
도 7은 효소면역분석법을 이용한 펩티드들의 친화도 측정 결과를 나타낸다.
도 8은 Quartz crystal microbalance (QCM) 바이오센서를 이용한 펩티드들의 친화도 측정 결과를 나타낸다.
도 9는 효소면역분석법을 이용한 GL-01 펩티드의 해리상수 측정 결과를 나타낸다.
도 10은 GL-01 펩티드를 이차 항체 대신 사용할 수 있는 지 확인한 실험 결과를 나타낸다.
본 발명에 따르면, 무작위 아미노산이 7개인 파지-펩티드 문고를 검색하는 단계, 항체가 결합되어 있는 배양 접시에 파지-펩티드 문고를 더하여 바이오패닝 (biopanning) 과정을 반복하는 단계, 바이오패닝에서 회수된 펩티드 중 발생 빈도가 높은 펩티드의 염기 서열을 확인하는 단계를 포함하는 방법에 있어서, 항체 Fab 부분이 아래로 위치하여 배양 접시에 결합되어 있고 Fc 부분이 위로 노출되어 파지 결합 부위를 제공하는 것을 특징으로 하는 항체 결합 펩티드의 제조방법을 제공한다(도 1 내지 도 2).
본 발명에 따르면, 바이오패닝 과정 중 면역글로불린을 고정시킨 배양 접시에 파지-펩티드 문고를 더하여 결합시킬 때에 면역글로불린의 도 1에 도시한 바와 같이 Fab 부분이 면역플레이트 쪽으로 위치하고 Fc 부분이 위로 노출되어 파지 결합 부위를 제공하게 된다.
파지-펩티드 문고 기술은 M13이나 fd와 같은 섬유상 박테리오파지 (filamentous bacteriophage)의 껍질 단백질 (coat protein)에 무작위 아미노산 서열의 펩티드를 나타낸 박테리오파지들로 이루어진 집단으로부터 특정 목표 분자에 결합하는 리간드를 검색하는 기술이다. 도 3은 섬유상 박테리오파지의 구조를 보여주는데 coat protein 가운데 protein 3의 N-말단 부분에 무작위 아미노산 서열의 펩티드를 나타낸 구조를 볼 수 있다.
본 발명에 따르면, 길이가 짧으면서 항체에 높은 친화도로 결합할 수 있는 펩티드 리간드를 찾기 위해 무작위 아미노산이 7개인 두 종류의 파지-펩티드 문고, 즉, Ph.D-7과 Ph.D-C7C로부터 토끼 IgG에 결합하는 펩티드 리간드를 검색하였다. Ph.D-7은 7개의 잔기로 이루어진 펩티드가 일직선으로 나열된 것이고 Ph.D-C7C는 7개의 잔기로 이루어진 펩티드가 시스테인의 이황화결합에 의해 고리 구조를 가지고 있다. Ph.D-7의 무작위 아미노산 서열 부분은 도 5에 나타나 있으며 X로 표시된 부분이 무작위 서열이다.
바이오패닝은 특정 목표 분자에 결합하는 파지를 찾는 방법이다. 바이오 패닝의 원리는 이하에 기재된 바와 같다 (도 4). 목표 분자가 부착되어 있는 고체 표면에 파지-펩티드 문고를 넣어 결합시킨 후 씻어내면 결합성이 있는 파지들만 남게 된다. 결합한 파지들을 다시 회수하여 숙주 박테리아에 감염시키면 같은 성질을 갖는 파지들이 증폭되고, 증폭된 파지를 이용하여 앞의 과정을 반복하게 되면 특이적으로 결합하는 파지의 비율이 높아져서 마침내는 원하는 펩티드만을 분리할 수 있게 된다. 바이오패닝을 통해 목표 분자에 결합하는 파지를 찾으면 그 파지에 표현된 펩티드의 아미노산 서열은 protein 3의 유전자인 gene 3 앞에 삽입된 DNA의 염기서열로부터 추정할 수 있다.
본 발명에 따르면, 토끼 IgG의 Fc 부분에 결합하는 펩티드를 찾기 위해 도 6에 나타낸 것처럼 먼저 플라스틱 배양 접시 표면에 염소 IgG를 흡착시키고 그 위에 염소 IgG에 대한 토끼의 항체 (rabbit anti-goat IgG antibody)를 결합시켰다. 이 과정에서 토끼의 항체는 도 1 및 도 6에 나타난 것처럼 Fab 부분을 아래로 행하고 결합하기 때문에 Fc 부분이 위로 노출되어 파지들에 결합 부위를 제공하게 된다. 또한 결합한 파지를 회수하는 과정에서 토끼 항체를 더하여 토끼 항체에 결합한 파지만 선택적으로 떨어져 나오도록 하였다.
바이오패닝을 4회 까지 반복한 후 3회와 4회 바이오패닝에서 얻은 파지들 가운데 10개 정도를 무작위로 선별하여 펩티드에 대한 암호를 가지고 있는 염기서열을 결정하였다. 그 결과 발생 빈도가 높은 펩티드로 Ph.D-7에서는 KHRFNKD (GL-01), PIISRAT (GL-02), SKPLHKM (GL-03) 서열이 확인되었고, Ph.D-C7C에서는 AAPSPRN (GC-01)과 PLSPSQE (GC-02) 서열이 확인되었다. 이와 같이 반복된 바이오패닝 과정을 통해 발생 빈도가 높아진 아미노산 서열은 항체에 결합하는 특성이 우수하다는 것을 의미한다.
상기로부터 수득된 본 발명에 따른 펩티드는 항체, 예컨대 토끼의 면역글로불린 G 단백질에 결합할 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위를 이에 한정하는 것은 아니다.
제조예 1: 펩티드의 제조
35 mm 배양접시에 염소의 면역글로불린 G (goat IgG) 단백질 0.15 mg을 넣고 흡착시켰다. 배양접시를 TBST (Tris-buffered saline + Tween-20, 50mM Tris-Cl, pH 7.5, 150mM NaCl, 0.1% Tween-20)로 3회 씻고 BSA (bovine serum albumin)를 1 mg/ml 농도로 포함하고 있는 TBST로 blocking 시켰다. 배양접시를 TBST로 씻고 토끼에서 만든 goat IgG에 대한 항체 (rabbit anti-goat IgG Ab) 15 μg을 넣고 결합시켰다. 이 항체는 토끼에서 얻어진 항체 단백질 (IgG)이기 때문에 최종적으로는 배양접시 표면에 토끼의 IgG를 고정시킨 셈이 되었다. 배양접시를 TBST로 씻고 New England Biolab에서 구입한 Ph.D-7과 Ph.D-C7C 파지 펩티드 문고 10 μl (두 가지 문고 모두 2×1013 pfu/ml, 2×109 independent sequences)를 더하여 실온에서 1시간 동안 흔들어주며 결합시켰다. 배양접시를 TBST로 씻고 rabbit anti-goat IgG Ab를 150 μg 더하여 경쟁적인 반응에 의해 배양접시에 고정되어 있는 rabbit anti-goat IgG Ab에 결합한 파지들이 떨어져 나오게 하였다.
회수한 파지를 액체 배지에서 배양한 Escherichia coli (E. coli) XL1-blue 30 ml에 더하고 5시간 동안 배양하여 파지가 증폭되도록 하였다. 증폭한 후 원심분리 하여 침전에 있는 세포는 제거하고 상층액에 있는 파지를 다음 바이오패닝에 사용하였다.
이와 동일한 방법으로 바이오패닝을 4회 까지 반복한 후 3회와 4회 바이오패닝에서 얻어진 플라크들 가운데 10개를 임의로 선택하여 파지를 배양하였다. 배양된 파지로부터 DNA를 분리하고 각 DNA의 gene 3 앞에 삽입된 무작위 염기서열을 결정하여 아미노산 서열로 전환하였다. 그 결과 Ph.D-7에서는 KHRFNKD (GL-01), PIISRAT (GL-02), SKPLHKM (GL-03) 서열이, Ph.D-C7C에서는 AAPSPRN (GC-01)과 PLSPSQE (GC-02) 서열이 2개 이상의 플라크에서 관찰되었다. 처음 사용한 Ph.D-7 문고에는 2×109 종류의 파지가 있으며 파지의 수는 2×1012 개이기 때문에 한 종류 파지의 수는 약 1,000개가 된다. 이 가운데서 10개의 파지를 임의로 선택했을 때 동일한 파지가 두 번 선택될 확률은 2.5×10-17 으로 극히 낮다. 따라서 3-4회의 바이오패닝 이후에 이들 아미노산 서열이 2회 이상 나타났다는 것은 그 서열을 갖는 파지들이 다른 파지들에 비해 훨씬 강하게 증폭되었다는 것을 의미한다. 그리고 이 파지들이 토끼 IgG에 결합하는 성질을 기준으로 바이오패닝을 했을 때 강하게 증폭되었다는 사실은 이 파지들이 토끼의 IgG에 잘 결합하는 특성을 가지고 있음을 보여준다.
실시예 1: 항체에 대한 펩티드 친화도 평가
EIA 방법을 사용하여 토끼 항체에 대한 각 펩티드의 친화도를 측정하였다. 여기에서는 5 종류의 펩티드, 즉, KHRFNKD (GL-01), PIISRAT (GL-02), SKPLHKM (GL-03), AAPSPRN (GC-01) 또는 PLSPSQE (GC-02)의 C-말단 쪽에 두 개의 글리신 잔기와 한 개의 리신 잔기 그리고 비오틴을 연결시켜 합성한 펩티드를 사용하였다. 예를 들어 GL-01의 경우 KHRFNKDGGK-biotin의 구조를 갖게 된다. 먼저 면역 플레이트에 아비딘 단백질 1 μg을 흡착법에 의해 고정시키고 남은 자리를 BSA (bovine serum albumin)를 1 mg/ml 농도로 포함하고 있는 TBST로 blocking 시켰다. 다섯 가지 펩티드를 1 μg씩 넣어 아비딘-비오틴 결합에 의해 펩티드가 고정되도록 하였다. 그리고 alkaline phosphatase가 연결되어 있는 토끼 항체를 1 μg씩 넣어 결합시켰다. 마지막으로 alkaline phosphatase 효소의 기질인 p-nitrophenyl phosphate를 넣고 반응시킨 후 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과 도 7에서 보는 것처럼 GL-01의 흡광도 값이 가장 높게 나타났다. 토끼 항체에 대한 펩티드의 친화도가 높으면 토끼 항체가 더 많이 결합하게 되고 항체에 연결된 alkaline phosphatase도 더 많이 결합하기 때문에 흡광도가 높은 것은 친화도가 높은 것을 의미한다.
실시예 2: 항체에 대한 친화도 평가
Quartz Crystal Microbalance (QCM) 바이오센서를 이용하여 다섯 가지 펩티드의 토끼 항체에 대한 친화도를 측정하였다. 먼저 토끼 항체를 고정시킨 QCM 센서 칩을 만들고 비오틴 기를 포함하도록 합성된 다섯 가지 펩티드는 아비딘 단백질과 결합시켜 복합체를 형성하도록 하였다. 다음으로 센서 칩에 다섯 가지 펩티드-아비딘 복합체를 10 μg씩 흘려보내며 주파수 변화를 측정한 결과 GL-01이 가장 주파수 변화가 컸고 GC-01과 GL-03도 비교적 높은 변화를 보여주었다 (도 8). QCM 바이오센서에서는 주파수 변화 값이 질량 변화에 비례하기 때문에 주파수 변화가 크다는 것은 펩티드-아비딘 복합체가 많이 결합한 것을 의미하고 이는 다시 펩티드의 친화도가 높은 것을 의미한다.
앞에서 사용한 EIA 방법과 바이오센서 실험에서 친화도가 서로 다르게 나타나는 이유 중 하나는 실험에 사용한 항체의 차이에 있다. 바이오센서 실험에서는 토끼 항체를 그대로 사용한 반면 EIA 실험에서는 alkaline phosphatase가 연결된 것을 사용하였다. 즉 EIA 실험에서 GC-01이나 GL-03의 친화도가 낮아진 것은 그들의 결합자리가 alkaline phosphatase에 의해 가려졌기 때문으로 보인다.
다른 이유는 실험방법의 변화이다. 바이오센서 실험에서는 항체가 고정된 상태에서 펩티드의 친화도를 측정하였고 EIA 실험에서는 펩티드가 고정된 상태에서 항체의 친화도를 측정하였다. 면역 플레이트의 평평한 표면에 분자량이 작은 펩티드가 조밀하게 고정되어 있을 때에는 항체의 접근성이 낮아지기 때문에 각 펩티드가 항체의 어느 부위에 결합하는가에 따라 친화도가 영향을 받게 된다. 예를 들어 GC-01이나 GL-03의 결합 부위가 항체 단백질의 표면에서 우묵하게 들어간 부분이라면 EIA 실험에서는 친화도가 낮게 나올 수 있을 것이다.
서로 다른 두 방법에서 GL-01 펩티드의 친화도가 현저하게 높게 평가되었기 때문에 GL-01을 선택하여 토끼 항체의 농도를 변화시키며 실시예 1과 동일한 EIA 방법으로 결합을 측정함으로써 해리상수 (dissociation constant)를 평가하였다. 그 결과 Kd 값이 약 1.7×10-8 M로 친화도가 매우 높게 평가되었다 (도 9). 이와 같이 높은 친화도가 나타난 이유는 면역 플레이트 표면에 펩티드가 조밀하게 분포하고 있고 한 개의 항체는 두 개의 동일한 무거운 사슬과 가벼운 사슬을 포함하고 있기 때문에 한 개의 항체에 두 개의 펩티드가 결합하는 다중 결합 때문으로 보인다.
실시예 3: 이차 항체로서의 용도
GL-01을 이차 항체 용도로 사용할 수 있는지 확인하기 위해 비오틴기를 포함하도록 합성된 GL-01 펩티드를 아비딘-peroxidase 복합체와 결합시켜 펩티드-아비딘-peroxidase (APP) 복합체를 만들었다. 그리고 이 APP 복합체 10 μg에 여시니아 (Yersinia enterocolitica) 박테리아에 대한 토끼 항체 (rabbit anti-Yersinia antibody) 5 μg과 여시니아 박테리아 약 105개를 섞고 0.5 ㎛의 구멍을 갖는 필터로 걸러 주었다. 그리고 루미놀과 과산화수소를 넣고 반응시킨 결과 peroxidase의 활성에 의해 빛이 발생하였다 (도 10). APP 복합체의 크기는 필터의 구멍에 비해 훨씬 작기 때문에 이와 같은 결과는 APP 복합체가 여시니아에 결합했다는 것을 의미한다. 반면에 항체가 없는 대조 시료에서는 빛이 발생하지 않았는데 이는 APP 복합체가 여시니아에 직접 결합하는 것이 아니라 여시니아에 결합한 항체에 결합했다는 것을 의미한다. 또한 여시니아가 없이 APP 복합체와 항체만 있는 경우에도 빛이 발생하지 않았는데 이는 APP 복합체가 필터에 흡착된 것이 아니라 여시니아에 결합했기 때문에 필터에 남았다는 것을 의미한다. 이와 같은 결과로부터 GL-01 펩티드가 면역분석법에서 이차 항체의 역할을 할 수 있다는 사실을 확인할 수 있다.
본 발명은 면역 분석법이나 항체 정제를 위한 친화성 크로마토그래피 등에 적용된다.
<110> KANGNUNG-WONJU NATIONAL UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMY COOPERATION GROUP <120> Antibody-binding peptides, their preparation method and use <130> 10000 <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> derived from phage-peptide library <400> 1 Lys His Arg Phe Asn Lys Asp 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> derived from phage-peptide library <400> 2 Pro Ile Ile Ser Arg Ala Thr 1 5 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> derived from phage-peptide library <400> 3 Ser Lys Pro Leu His Lys Met 1 5 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> derived from phage-peptide library <400> 4 Ala Ala Pro Ser Pro Arg Asn 1 5 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> derived from phage-peptide library <400> 5 Pro Leu Ser Pro Ser Gln Glu 1 5

Claims (3)

  1. KHRFNKD, PIISRAT, SKPLHKM, AAPSPRN 또는 PLSPSQE 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 항체 결합용 펩티드.
  2. 삭제
  3. 삭제
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