JP5247539B2 - リポ多糖又はリピッドａ結合剤及び新規ペプチド - Google Patents

Description

本発明は、リポ多糖（Lipopolysaccharide；ＬＰＳ）及び／又はリピッドＡ結合剤及び新規ペプチドに関する。

ＬＰＳは、例えば、グラム陰性菌の外膜に存在し、グラム陰性菌感染時では、体内に溶出されたＬＰＳによって敗血症が誘発されることが知られている。これは、ＬＰＳがＬＢＰ（LPS binding protein）などの血漿中のＬＰＳ結合タンパクによって細胞膜上のＴＬＲ４（Toll Like Receptor 4）にリクルートされ、ＮＦｋＢ（nuclear factor κB）経路を中心とした炎症反応を誘発することが主な発症メカニズムである。これらは各所での炎症又は発熱を引き起こす他、毛細血管での血液凝固（disseminated intravascular coagulation；ＤＩＣ）を誘発し、多臓器不全等、不可逆的反応によって患者を死に至らしめる。

このため、グラム陰性菌由来の敗血症又は敗血症性ショック時にＬＰＳに結合し、その毒素を中和する医薬、あるいは、体外循環用ＬＰＳ除去カラムが期待されている。中和医薬としては、グラム陰性菌の強力な抗生物質であるポリミキシンＢ（polymyxin B；ＰＭＢ）が期待されていたが、腎臓毒性及び神経毒性があり、血中への投与が不可能であった。また、抗ＬＰＳ抗体２件について米国にて臨床試験が行われたが、いずれも失敗に終わっている。一方、体外循環用ＬＰＳ除去カラムとしては、例えば、「トレミキシン」（東レ社）が公知であるが、毒性を有するＰＭＢを使用するため、製造工程を厳格に管理する必要があり、高価であるとの欠点があった。

一方、本明細書に記載の配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるペプチドは、例えば、特許文献１に開示された公知ペプチドである。特許文献１には、前記ペプチドが、ネコ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合活性を有することが記載されている。

特開２００４−１８９６５７号公報

ＰＭＢの前記腎臓毒性及び神経毒性については、例えば、Danner RLらによる報告［Purification, toxicity, and antiendotoxin activity of polymyxin B nonapeptide., Antimicrob Agents Chemother. 1989 Sep;33(9):1428-1434 (PMID 2554795)］がある。また、抗ＬＰＳ抗体の前記米国臨床試験については、例えば、Angus DCらによる報告［E5 murine monoclonal antiendotoxin antibody in gram-negative sepsis: a randomized controlled trial. E5 Study Investigators., JAMA.2000 Apr 5;283(13):1723-1730 (PMID 10755499)］又はDerkx Bらによる報告［Randomized, placebo-controlled trial of HA-1A, a human monoclonal antibody to endotoxin, in children with meningococcal septic shock. European Pediatric Meningococcal Septic Shock Trial Study Group., Clin Infect Dis. 1999 Apr;28(4):770-777 (PMID 10825037)］がある。
本発明の課題は、これらのＰＭＢ又は抗ＬＰＳ抗体に代わる、例えば、リポ多糖及び／又はリピッドＡ中和剤、あるいは、リポ多糖及び／又はリピッドＡ除去剤として使用することのできる、リポ多糖及び／又はリピッドＡ結合剤を提供することにある。

前記課題は、本発明による、（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列、あるいは、前記アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、リポ多糖及び／又はリピッドＡ結合活性を示すペプチド、
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列、あるいは、前記アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、リポ多糖及び／又はリピッドＡ結合活性を示すペプチド、
（３）配列番号３で表されるアミノ酸配列を含み、且つ、リポ多糖及び／又はリピッドＡ結合活性を示すペプチド、
（４）配列番号４で表されるアミノ酸配列、あるいは、前記アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、リポ多糖及び／又はリピッドＡ結合活性を示すペプチド、
（５）配列番号５で表されるアミノ酸配列、あるいは、前記アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、リポ多糖及び／又はリピッドＡ結合活性を示すペプチド、又は
（６）配列番号６で表されるアミノ酸配列を含み、且つ、リポ多糖及び／又はリピッドＡ結合活性を示すペプチド、あるいは、
前記ペプチド（１）〜（６）の誘導体
を有効成分として含む、リポ多糖及び／又はリピッドＡ結合剤により解決することができる。

本発明は、前記ペプチド（１）〜（６）又はその誘導体を有効成分として含む、リポ多糖及び／又はリピッドＡ除去剤に関する。
本発明は、前記ペプチド（１）〜（６）若しくはその誘導体、前記ペプチド（１）〜（６）をコードするポリヌクレオチド、又は前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを有効成分として含む、リポ多糖及び／又はリピッドＡ中和剤（例えば、敗血症治療剤）に関する。

本発明は、前記ペプチド（１）〜（６）又はその誘導体と、リポ多糖及び／又はリピッドＡとを接触させる工程を含む、リポ多糖及び／又はリピッドＡの結合方法に関する。
本発明は、リポ多糖及び／又はリピッドＡを含む可能性のある処理対象と、前記ペプチド（１）〜（６）又はその誘導体とを接触させる工程、及びリポ多糖及び／又はリピッドＡと複合体を形成した前記ペプチド又は誘導体と、前記処理対象とを分離する工程を含む、リポ多糖及び／又はリピッドＡの除去方法に関する。
本発明は、前記ペプチド（１）〜（６）若しくはその誘導体、前記ペプチド（１）〜（６）をコードするポリヌクレオチド、又は前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを、リポ多糖及び／又はリピッドＡ中和の必要な対象に、有効量で投与することを含む、リポ多糖及び／又はリピッドＡ中和方法（例えば、敗血症治療方法）に関する。

本発明は、前記ペプチド（１）〜（６）又はその誘導体の、リポ多糖及び／又はリピッドＡ結合剤を製造するための使用に関する。
本発明は、前記ペプチド（１）〜（６）又はその誘導体の、リポ多糖及び／又はリピッドＡ除去剤を製造するための使用に関する。
本発明は、前記ペプチド（１）〜（６）若しくはその誘導体、前記ペプチド（１）〜（６）をコードするポリヌクレオチド、又は前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターの、リポ多糖及び／又はリピッドＡ中和剤（例えば、敗血症治療剤）を製造するための使用に関する。

本発明は、（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列、あるいは、前記アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、リポ多糖及び／又はリピッドＡ結合活性を示すペプチド、
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列、あるいは、前記アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、リポ多糖及び／又はリピッドＡ結合活性を示すペプチド、
（３）配列番号３で表されるアミノ酸配列を含み、且つ、リポ多糖及び／又はリピッドＡ結合活性を示すペプチド、
（４）配列番号４で表されるアミノ酸配列、あるいは、前記アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、リポ多糖及び／又はリピッドＡ結合活性を示すペプチド、
（５）配列番号５で表されるアミノ酸配列、あるいは、前記アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、リポ多糖及び／又はリピッドＡ結合活性を示すペプチド、並びに
（６）配列番号６で表されるアミノ酸配列を含み、且つ、リポ多糖及び／又はリピッドＡ結合活性を示すペプチド
からなる群から選んだペプチド（但し、配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを除く）又はその誘導体に関する。
本発明は、前記ペプチド（１）〜（６）（但し、配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを除く）をコードするポリヌクレオチドに関する。
本発明は、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターに関する。
本発明は、前記ペプチド（１）〜（６）（但し、配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを除く）若しくはその誘導体、前記ペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターと、薬剤学的若しくは獣医学的に許容することのできる通常の担体又は希釈剤とを含む、医薬組成物に関する。

本発明は、前記ペプチド（１）〜（６）又はその誘導体を用いることを特徴とする、リポ多糖及び／又はリピッドＡの分析方法に関する。
前記分析方法の好ましい態様によれば、リポ多糖及び／又はリピッドＡを含む可能性のある被検試料と、前記ペプチド（１）〜（６）又はその誘導体とを接触させる工程、前記ペプチド又は誘導体に結合したリポ多糖及び／又はリピッドＡを分析する工程を含む。

本発明は、前記ペプチド（１）〜（６）又はその誘導体を用いることを特徴とする、グラム陰性菌の検出方法に関する。
前記検出方法の好ましい態様によれば、グラム陰性菌を含む可能性のある被検試料と、前記ペプチド（１）〜（６）又はその誘導体とを接触させる工程、前記ペプチド又は誘導体に結合したグラム陰性菌を分析する工程を含む。

本発明によれば、新規のリポ多糖及び／又はリピッドＡ結合剤を提供することができる。また、本発明のリポ多糖及び／又はリピッドＡ結合剤は、例えば、リポ多糖及び／又はリピッドＡ除去剤又はリポ多糖及び／又はリピッドＡ中和剤として使用することができる。

本発明のリポ多糖及び／又はリピッドＡ結合剤は、有効成分として、
（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列、あるいは、前記アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、リポ多糖及び／又はリピッドＡ結合活性を示すペプチド、
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列、あるいは、前記アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、リポ多糖及び／又はリピッドＡ結合活性を示すペプチド、
（３）配列番号３で表されるアミノ酸配列を含み、且つ、リポ多糖及び／又はリピッドＡ結合活性を示すペプチド、
（４）配列番号４で表されるアミノ酸配列、あるいは、前記アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、リポ多糖及び／又はリピッドＡ結合活性を示すペプチド、
（５）配列番号５で表されるアミノ酸配列、あるいは、前記アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、リポ多糖及び／又はリピッドＡ結合活性を示すペプチド、
（６）配列番号６で表されるアミノ酸配列を含み、且つ、リポ多糖及び／又はリピッドＡ結合活性を示すペプチド、
あるいは、前記ペプチド（１）〜（６）の誘導体
を含む。

以下、本発明において有効成分として用いることのできる前記ペプチド（１）〜（６）及びそれらの誘導体を総称して「リポ多糖及び／又はリピッドＡ結合ペプチド」と称する。なお、本明細書における用語「ペプチド」には、オリゴペプチド及びポリペプチドの両方が含まれる。

本明細書において「リポ多糖及び／又はリピッドＡ結合活性」とは、リポ多糖（Lipopolysaccharide；ＬＰＳ）又はリピッドＡの少なくとも一方に特異的に結合することのできる活性を意味し、好ましくは、リポ多糖及びリピッドＡの両方を認識して結合する活性を意味する。リポ多糖は、多糖部分とリン脂質部分（すなわち、リピッドＡ）とからなり、糖鎖部分が菌種又は菌株によって多様性があるのに対して、リピッドＡ部分は菌種又は菌株でほぼ同一構造を有する。また、リピッドＡ部分は、リポ多糖毒性の中心的役割を果たしている。

或るペプチドがリポ多糖及び／又はリピッドＡ結合活性を有するか否かは、公知方法により容易に判定することができる。例えば、リポ多糖又はリピッドＡ（好ましくはリピッドＡ、又はリポ多糖とリピッドＡとの組合せ）を適当な担体（例えば、ＥＬＩＳＡプレート又はビーズ担体）に固定化し、前記リポ多糖への結合の有無を分析する方法（例えば、後述の実施例１又は実施例３参照）、あるいは、表面プラズモン共鳴（surface plasmon resonance；ＳＰＲ）に基づく方法［例えば、ビアコア（BIACORE）システム（例えば、BIACORE 2000; BIACORE社）を用いる方法］により、或るペプチドがリポ多糖及び／又はリピッドＡ結合活性を有するか否かを容易に判定することができる。

本発明において、前記リポ多糖及び／又はリピッドＡ結合ペプチドを構成するアミノ酸残基数は、リポ多糖及び／又はリピッドＡ結合活性を示す限り、特に限定されるものではないが、例えば、５〜１００個、好ましくは５〜６１個、より好ましくは５〜３７個、より好ましくは５〜２５個、特に好ましくは５〜１３個である。前記アミノ酸配列は、それ単独でリポ多糖及び／又はリピッドＡ結合活性を示すアミノ酸配列（基本配列）のみからなることもできるし、その繰り返し配列からなることもできる。繰り返し配列からなる場合には、１種類の基本配列のみの繰り返し配列であることもできるし、２種類以上の基本配列の組合せであることもできる。基本配列を繰り返すことにより、結合力を増大させることができる。また、結合力が弱い場合でも、ポリリジンのような反応性の高い側鎖を高密度且つ近接して持つ支持体を用いて本ペプチドを固定化し、マルチ化することで結合力を高める事ができると考えられる。このマルチ化についてはFassina, GらのＩｇＧ精製カラムを作成した方法［Fassina G et al, Protein A mimetic peptide ligand for affinity purification of antibodies. J. Mol. Recognit 1996, 9(5-6), 564-569］などを参考として挙げることができる。

前記リポ多糖及び／又はリピッドＡ結合ペプチド（１）、すなわち、「配列番号１で表されるアミノ酸配列、あるいは、前記アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、リポ多糖及び／又はリピッドＡ結合活性を示すペプチド」には、例えば、
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド；
配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に、適当なアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列からなり、且つリポ多糖及び／又はリピッドＡ結合活性を示すペプチド；又は
配列番号１で表されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、リポ多糖及び／又はリピッドＡ結合活性を示すペプチド
が含まれる。

本明細書において、ペプチドの機能を維持するために置換されるアミノ酸は、置換前のアミノ酸と似た性質を有するアミノ酸であることが好ましい。例えば、以下に示すような各グループに属するアミノ酸は、そのグループ内で互いに似た性質を有するアミノ酸である。これらのアミノ酸をグループ内の他のアミノ酸に置換しても、タンパク質の本質的な機能は損なわれないことが多い。このようなアミノ酸の置換は、保存的置換と呼ばれ、ポリペプチドの機能を保持しつつアミノ酸配列を変換するための手法として公知である。
非極性アミノ酸：Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe、及びTrp
非荷電性アミノ酸：Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、及びGln
酸性アミノ酸：Asp及びGlu
塩基性アミノ酸：Lys、Arg、及びHis

配列番号１で表されるアミノ酸配列には、配列番号１で表されるアミノ酸配列における１番目及び１１番目の各アミノ酸Ｘが、それぞれ独立して、塩基性アミノ酸Ｋ、Ｒ、又はＨである配列、すなわち、
ＫＮＹＳＳＳＩＳＳＩＫＡ（配列番号７）
ＫＮＹＳＳＳＩＳＳＩＲＡ（配列番号８）
ＫＮＹＳＳＳＩＳＳＩＨＡ（配列番号９）
ＲＮＹＳＳＳＩＳＳＩＫＡ（配列番号１０）
ＲＮＹＳＳＳＩＳＳＩＲＡ（配列番号１１）
ＲＮＹＳＳＳＩＳＳＩＨＡ（配列番号１２）
ＨＮＹＳＳＳＩＳＳＩＫＡ（配列番号１３）
ＨＮＹＳＳＳＩＳＳＩＲＡ（配列番号１４）
ＨＮＹＳＳＳＩＳＳＩＨＡ（配列番号１５）
が含まれる。

配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるペプチドは、例えば、特開2004-189657号公報に開示された公知ペプチドであり、後述の実施例に示すように、リポ多糖及び／又はリピッドＡ結合活性を示すペプチドである。なお、特開2004-189657号公報には、前記ペプチドが、ネコ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合活性を有することが記載されているが、リポ多糖及び／又はリピッドＡ結合活性に関する記載はない。

「配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端（好ましくはＣ末端）に、適当なアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列からなり、且つリポ多糖及び／又はリピッドＡ結合活性を示すペプチド」において、Ｎ末端及び／又はＣ末端に付加することができる前記アミノ酸配列としては、例えば、リンカー配列、マーカー配列、ポリペプチド配列、又は別のリポ多糖及び／又はリピッドＡ結合ペプチド配列を挙げることができる。

前記リンカー配列としては、例えば、ペプチドを担体に担持させるための配列、例えば、チオール基を有するアミノ酸［例えば、システイン（Ｌ体システイン又はＤ体システイン）又はホモシステイン）又はアミノ基と反応しない官能基（例えば、マレイミド基）を側鎖に有するアミノ酸１個からなるリンカー配列、あるいは、少なくとも一方の末端が、チオール基を有するアミノ酸又はアミノ基と反応しない官能基を有するアミノ酸であるリンカー配列を挙げることができる。

前記マーカー配列としては、例えば、ペプチドの発現の確認、細胞内局在の確認、あるいは、精製等を容易に行なうための配列を用いることができ、例えば、ＦＬＡＧタグ、ヘキサ−ヒスチジン・タグ、ヘマグルチニン・タグ、又はｍｙｃエピトープ、あるいは、
ＧＧＬＬＬＬＬＬＬ（配列番号１２５）
からなるペプチドなどを挙げることができる。配列番号１２５からなる前記ペプチドのＣ末端カルボキシル基は、そのままでも、あるいは、アミド化することもできる。

前記ポリペプチド配列としては、例えば、精製用ポリペプチド［例えば、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）の全部又は一部］、検出用ポリペプチド［例えば、ヘムアグルチニン又はβ−ガラクトシダーゼαペプチド（ＬａｃＺ α）の全部又は一部］、又は発現用ポリペプチド（例えば、シグナル配列）などを挙げることができる。

「配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端（好ましくはＣ末端）に、適当なアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列からなり、且つリポ多糖及び／又はリピッドＡ結合活性を示すペプチド」としては、例えば、
ＸＮＹＳＳＳＩＳＳＩＸＡＣ（配列番号１６）
からなるペプチドを挙げることができる。
なお、配列番号１６で表されるアミノ酸配列における１番目のアミノ酸Ｘは、塩基性アミノ酸Ｋ、Ｒ、又はＨ（好ましくはＫ）であり、１１番目のアミノ酸Ｘは、塩基性アミノ酸Ｋ、Ｒ、又はＨ（好ましくはＲ又はＨ、より好ましくはＲ）である。

「配列番号１で表されるアミノ酸配列において１又は数個（好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜８個、更に好ましくは１〜６個、更に好ましくは１〜４個、更に好ましくは１〜３個、更に好ましくは１又は２個、特に好ましくは１個）のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、リポ多糖及び／又はリピッドＡ結合活性を示すペプチド」としては、例えば、以下に詳述する、前記リポ多糖及び／又はリピッドＡ結合ペプチド（２）〜（６）を挙げることができる。

前記リポ多糖及び／又はリピッドＡ結合ペプチド（２）、すなわち、「配列番号２で表されるアミノ酸配列、あるいは、前記アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、リポ多糖及び／又はリピッドＡ結合活性を示すペプチド」には、例えば、
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド；
配列番号２で表されるアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に、適当なアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列からなり、且つリポ多糖及び／又はリピッドＡ結合活性を示すペプチド；又は
配列番号２で表されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、リポ多糖及び／又はリピッドＡ結合活性を示すペプチド
が含まれる。

配列番号２で表されるアミノ酸配列は、配列番号１で表されるアミノ酸配列における１番目〜６番目のアミノ酸からなる配列である。配列番号２で表されるアミノ酸配列には、配列番号２で表されるアミノ酸配列における１番目のアミノ酸Ｘが、塩基性アミノ酸Ｋ、Ｒ、又はＨである配列、すなわち、
ＫＮＹＳＳＳ（配列番号１７）
ＲＮＹＳＳＳ（配列番号１８）
ＨＮＹＳＳＳ（配列番号１９）
が含まれる。

「配列番号２で表されるアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端（好ましくはＣ末端）に、適当なアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列からなり、且つリポ多糖及び／又はリピッドＡ結合活性を示すペプチド」において、Ｎ末端及び／又はＣ末端に付加することができる前記アミノ酸配列としては、例えば、リポ多糖及び／又はリピッドＡ結合ペプチド（１）において先述した、リンカー配列、マーカー配列、ポリペプチド配列、又は別のリポ多糖及び／又はリピッドＡ結合ペプチド配列を挙げることができる。

「配列番号２で表されるアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端（好ましくはＣ末端）に、適当なアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列からなり、且つリポ多糖及び／又はリピッドＡ結合活性を示すペプチド」としては、例えば、
ＸＮＹＳＳＳＩ（配列番号２０）
ＸＮＹＳＳＳＩＳ（配列番号２１）
ＸＮＹＳＳＳＩＳＳ（配列番号２２）
ＸＮＹＳＳＳＩＳＳＩ（配列番号２３）
ＸＮＹＳＳＳＩＳＳＩＸ（配列番号２４）
ＸＮＹＳＳＳＩＳＳＩＸＡ（配列番号１）
からなるペプチド、又は、これらのアミノ酸配列（若しくは配列番号２で表されるアミノ酸配列）のＣ末端に、更にＣが付加された
ＸＮＹＳＳＳＣ（配列番号２５）
ＸＮＹＳＳＳＩＣ（配列番号２６）
ＸＮＹＳＳＳＩＳＣ（配列番号２７）
ＸＮＹＳＳＳＩＳＳＣ（配列番号２８）
ＸＮＹＳＳＳＩＳＳＩＣ（配列番号２９）
ＸＮＹＳＳＳＩＳＳＩＸＣ（配列番号３０）
ＸＮＹＳＳＳＩＳＳＩＸＡＣ（配列番号１６）
からなるペプチドを挙げることができる。
なお、これらのアミノ酸配列における１番目のアミノ酸Ｘは、塩基性アミノ酸Ｋ、Ｒ、又はＨ（好ましくはＫ）であり、１１番目のアミノ酸Ｘは、塩基性アミノ酸Ｋ、Ｒ、又はＨ（好ましくはＲ又はＨ、より好ましくはＲ）である。

「配列番号２で表されるアミノ酸配列において１又は数個（好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜８個、更に好ましくは１〜６個、更に好ましくは１〜４個、更に好ましくは１〜３個、更に好ましくは１又は２個、特に好ましくは１個）のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、リポ多糖及び／又はリピッドＡ結合活性を示すペプチド」としては、例えば、
ＮＹＳＳＳ（配列番号３１）
を含み、且つ、リポ多糖及び／又はリピッドＡ結合活性を示すペプチド、例えば、
ＮＹＳＳＳ（配列番号３１）
ＮＹＳＳＳＩ（配列番号３２）
ＮＹＳＳＳＩＳ（配列番号３３）
ＮＹＳＳＳＩＳＳ（配列番号３４）
ＮＹＳＳＳＩＳＳＩ（配列番号３５）
ＮＹＳＳＳＩＳＳＩＸ（配列番号３６）
ＮＹＳＳＳＩＳＳＩＸＡ（配列番号３７）
からなるペプチド、又は、これらのアミノ酸配列のＣ末端に、更にＣが付加された
ＮＹＳＳＳＣ（配列番号３８）
ＮＹＳＳＳＩＣ（配列番号３９）
ＮＹＳＳＳＩＳＣ（配列番号４０）
ＮＹＳＳＳＩＳＳＣ（配列番号４１）
ＮＹＳＳＳＩＳＳＩＣ（配列番号４２）
ＮＹＳＳＳＩＳＳＩＸＣ（配列番号４３）
ＮＹＳＳＳＩＳＳＩＸＡＣ（配列番号４４）
からなるペプチドを挙げることができる。
なお、これらのアミノ酸配列における１０番目のアミノ酸Ｘは、塩基性アミノ酸Ｋ、Ｒ、又はＨ（好ましくはＲ又はＨ、より好ましくはＲ）である。

前記リポ多糖及び／又はリピッドＡ結合ペプチド（３）、すなわち、「配列番号３で表されるアミノ酸配列を含み、且つ、リポ多糖及び／又はリピッドＡ結合活性を示すペプチド」には、例えば、
配列番号３で表されるアミノ酸配列からなり、且つリポ多糖及び／又はリピッドＡ結合活性を示すペプチド；又は
配列番号３で表されるアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に、適当なアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列からなり、且つリポ多糖及び／又はリピッドＡ結合活性を示すペプチド
が含まれる。

配列番号３で表されるアミノ酸配列には、配列番号３で表されるアミノ酸配列における１番目及び１１番目の各アミノ酸Ｘが、それぞれ独立して、塩基性アミノ酸Ｋ、Ｒ、又はＨである配列、すなわち、
ＫＸＸＸＸＸＸＸＸＸＫ（配列番号４５）
ＫＸＸＸＸＸＸＸＸＸＲ（配列番号４６）
ＫＸＸＸＸＸＸＸＸＸＨ（配列番号４７）
ＲＸＸＸＸＸＸＸＸＸＫ（配列番号４８）
ＲＸＸＸＸＸＸＸＸＸＲ（配列番号４９）
ＲＸＸＸＸＸＸＸＸＸＨ（配列番号５０）
ＨＸＸＸＸＸＸＸＸＸＫ（配列番号５１）
ＨＸＸＸＸＸＸＸＸＸＲ（配列番号５２）
ＨＸＸＸＸＸＸＸＸＸＨ（配列番号５３）
が含まれる。
なお、これらのアミノ酸配列における各アミノ酸Ｘ（すなわち、２番目〜１０番目のアミノ酸Ｘ）は、それぞれ独立して、任意のアミノ酸である。

「配列番号３で表されるアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に、適当なアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列からなり、且つリポ多糖及び／又はリピッドＡ結合活性を示すペプチド」としては、例えば、配列番号３で表されるアミノ酸配列のＣ末端に、更にＡ、Ｃ、又はＡＣが付加された
ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＡ（配列番号５４）
ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＣ（配列番号５５）
ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＡＣ（配列番号５６）
からなるペプチドを挙げることができる。
なお、これらのアミノ酸配列における１番目のアミノ酸Ｘは、塩基性アミノ酸Ｋ、Ｒ、又はＨ（好ましくはＫ）であり、１１番目のアミノ酸Ｘは、塩基性アミノ酸Ｋ、Ｒ、又はＨ（好ましくはＲ又はＨ、より好ましくはＲ）であり、残る各アミノ酸Ｘ（すなわち、２番目〜１０番目のアミノ酸Ｘ）は、それぞれ独立して、任意のアミノ酸である。また、２番目〜１０番目のアミノ酸からなる配列は、好ましくは、
ＮＹＳＳＳＩＳＳＩ（配列番号５７）
である。

前記リポ多糖及び／又はリピッドＡ結合ペプチド（４）、すなわち、「配列番号４で表されるアミノ酸配列、あるいは、前記アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、リポ多糖及び／又はリピッドＡ結合活性を示すペプチド」には、例えば、
配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるペプチド；
配列番号４で表されるアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に、適当なアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列からなり、且つリポ多糖及び／又はリピッドＡ結合活性を示すペプチド；又は
配列番号４で表されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、リポ多糖及び／又はリピッドＡ結合活性を示すペプチド
が含まれる。

配列番号４で表されるアミノ酸配列は、配列番号１で表されるアミノ酸配列において２番目のＮが欠失した配列である。配列番号４で表されるアミノ酸配列には、配列番号４で表されるアミノ酸配列における１番目及び１０番目の各アミノ酸Ｘが、それぞれ独立して、塩基性アミノ酸Ｋ、Ｒ、又はＨである配列、すなわち、
ＫＹＳＳＳＩＳＳＩＫＡ（配列番号５８）
ＫＹＳＳＳＩＳＳＩＲＡ（配列番号５９）
ＫＹＳＳＳＩＳＳＩＨＡ（配列番号６０）
ＲＹＳＳＳＩＳＳＩＫＡ（配列番号６１）
ＲＹＳＳＳＩＳＳＩＲＡ（配列番号６２）
ＲＹＳＳＳＩＳＳＩＨＡ（配列番号６３）
ＨＹＳＳＳＩＳＳＩＫＡ（配列番号６４）
ＨＹＳＳＳＩＳＳＩＲＡ（配列番号６５）
ＨＹＳＳＳＩＳＳＩＨＡ（配列番号６６）
が含まれる。

「配列番号４で表されるアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端（好ましくはＣ末端）に、適当なアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列からなり、且つリポ多糖及び／又はリピッドＡ結合活性を示すペプチド」としては、例えば、
ＸＹＳＳＳＩＳＳＩＸＡＣ（配列番号６７）
からなるペプチドを挙げることができる。
なお、配列番号６７で表されるアミノ酸配列における１番目のアミノ酸Ｘは、塩基性アミノ酸Ｋ、Ｒ、又はＨ（好ましくはＫ）であり、１０番目のアミノ酸Ｘは、塩基性アミノ酸Ｋ、Ｒ、又はＨ（好ましくはＲ又はＨ、より好ましくはＲ）である。

「配列番号４で表されるアミノ酸配列において１又は数個（好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜８個、更に好ましくは１〜６個、更に好ましくは１〜４個、更に好ましくは１〜３個、更に好ましくは１又は２個、特に好ましくは１個）のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、リポ多糖及び／又はリピッドＡ結合活性を示すペプチド」としては、例えば、前記リポ多糖及び／又はリピッドＡ結合ペプチド（１）〜（３）、（５）、又は（６）を挙げることができ、特には、以下に詳述するリポ多糖及び／又はリピッドＡ結合ペプチド（５）又は（６）を挙げることができる。

前記リポ多糖及び／又はリピッドＡ結合ペプチド（５）、すなわち、「配列番号５で表されるアミノ酸配列、あるいは、前記アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、リポ多糖及び／又はリピッドＡ結合活性を示すペプチド」には、例えば、
配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるペプチド；
配列番号５で表されるアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に、適当なアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列からなり、且つリポ多糖及び／又はリピッドＡ結合活性を示すペプチド；又は
配列番号５で表されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、リポ多糖及び／又はリピッドＡ結合活性を示すペプチド
が含まれる。

配列番号５で表されるアミノ酸配列は、配列番号４で表されるアミノ酸配列における１番目〜５番目のアミノ酸からなる配列である。配列番号５で表されるアミノ酸配列には、配列番号５で表されるアミノ酸配列における１番目のアミノ酸Ｘが、塩基性アミノ酸Ｋ、Ｒ、又はＨである配列、すなわち、
ＫＹＳＳＳ（配列番号６８）
ＲＹＳＳＳ（配列番号６９）
ＨＹＳＳＳ（配列番号７０）
が含まれる。

「配列番号５で表されるアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端（好ましくはＣ末端）に、適当なアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列からなり、且つリポ多糖及び／又はリピッドＡ結合活性を示すペプチド」において、Ｎ末端及び／又はＣ末端に付加することができる前記アミノ酸配列としては、例えば、リポ多糖及び／又はリピッドＡ結合ペプチド（１）において先述した、リンカー配列、マーカー配列、ポリペプチド配列、又は別のリポ多糖及び／又はリピッドＡ結合ペプチド配列を挙げることができる。

「配列番号５で表されるアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端（好ましくはＣ末端）に、適当なアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列からなり、且つリポ多糖及び／又はリピッドＡ結合活性を示すペプチド」としては、例えば、
ＸＹＳＳＳＩ（配列番号７１）
ＸＹＳＳＳＩＳ（配列番号７２）
ＸＹＳＳＳＩＳＳ（配列番号７３）
ＸＹＳＳＳＩＳＳＩ（配列番号７４）
ＸＹＳＳＳＩＳＳＩＸ（配列番号７５）
ＸＹＳＳＳＩＳＳＩＸＡ（配列番号４）
からなるペプチド、又は、これらのアミノ酸配列（若しくは配列番号５で表されるアミノ酸配列）のＣ末端に、更にＣが付加された
ＸＹＳＳＳＣ（配列番号７６）
ＸＹＳＳＳＩＣ（配列番号７７）
ＸＹＳＳＳＩＳＣ（配列番号７８）
ＸＹＳＳＳＩＳＳＣ（配列番号７９）
ＸＹＳＳＳＩＳＳＩＣ（配列番号８０）
ＸＹＳＳＳＩＳＳＩＸＣ（配列番号８１）
ＸＹＳＳＳＩＳＳＩＸＡＣ（配列番号８２）
からなるペプチドを挙げることができる。
なお、これらのアミノ酸配列における１番目のアミノ酸Ｘは、塩基性アミノ酸Ｋ、Ｒ、又はＨ（好ましくはＫ）であり、１０番目のアミノ酸Ｘは、塩基性アミノ酸Ｋ、Ｒ、又はＨ（好ましくはＲ又はＨ、より好ましくはＲ）である。

「配列番号５で表されるアミノ酸配列において１又は数個（好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜８個、更に好ましくは１〜６個、更に好ましくは１〜４個、更に好ましくは１〜３個、更に好ましくは１又は２個、特に好ましくは１個）のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、リポ多糖及び／又はリピッドＡ結合活性を示すペプチド」としては、例えば、
ＹＳＳＳ（配列番号８３）
を含み、且つ、リポ多糖及び／又はリピッドＡ結合活性を示すペプチド、例えば、
ＹＳＳＳ（配列番号８３）
ＹＳＳＳＩ（配列番号８４）
ＹＳＳＳＩＳ（配列番号８５）
ＹＳＳＳＩＳＳ（配列番号８６）
ＹＳＳＳＩＳＳＩ（配列番号８７）
ＹＳＳＳＩＳＳＩＸ（配列番号８８）
ＹＳＳＳＩＳＳＩＸＡ（配列番号８９）
からなるペプチド、又は、これらのアミノ酸配列のＣ末端に、更にＣが付加された
ＹＳＳＳＣ（配列番号９０）
ＹＳＳＳＩＣ（配列番号９１）
ＹＳＳＳＩＳＣ（配列番号９２）
ＹＳＳＳＩＳＳＣ（配列番号９３）
ＹＳＳＳＩＳＳＩＣ（配列番号９４）
ＹＳＳＳＩＳＳＩＸＣ（配列番号９５）
ＹＳＳＳＩＳＳＩＸＡＣ（配列番号９６）
からなるペプチドを挙げることができる。
なお、これらのアミノ酸配列における９番目のアミノ酸Ｘは、塩基性アミノ酸Ｋ、Ｒ、又はＨ（好ましくはＲ又はＨ、より好ましくはＲ）である。

前記リポ多糖及び／又はリピッドＡ結合ペプチド（６）、すなわち、「配列番号６で表されるアミノ酸配列を含み、且つ、リポ多糖及び／又はリピッドＡ結合活性を示すペプチド」には、例えば、
配列番号６で表されるアミノ酸配列からなり、且つリポ多糖及び／又はリピッドＡ結合活性を示すペプチド；又は
配列番号６で表されるアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に、適当なアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列からなり、且つリポ多糖及び／又はリピッドＡ結合活性を示すペプチド
が含まれる。

配列番号６で表されるアミノ酸配列には、配列番号６で表されるアミノ酸配列における１番目及び１０番目の各アミノ酸Ｘが、それぞれ独立して、塩基性アミノ酸Ｋ、Ｒ、又はＨである配列、すなわち、
ＫＸＸＸＸＸＸＸＸＫ（配列番号９７）
ＫＸＸＸＸＸＸＸＸＲ（配列番号９８）
ＫＸＸＸＸＸＸＸＸＨ（配列番号９９）
ＲＸＸＸＸＸＸＸＸＫ（配列番号１００）
ＲＸＸＸＸＸＸＸＸＲ（配列番号９）
ＲＸＸＸＸＸＸＸＸＨ（配列番号１０２）
ＨＸＸＸＸＸＸＸＸＫ（配列番号１０３）
ＨＸＸＸＸＸＸＸＸＲ（配列番号１０４）
ＨＸＸＸＸＸＸＸＸＨ（配列番号１０５）
が含まれる。
なお、これらのアミノ酸配列における各アミノ酸Ｘ（すなわち、２番目〜９番目のアミノ酸Ｘ）は、それぞれ独立して、任意のアミノ酸である。

「配列番号６で表されるアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に、適当なアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列からなり、且つリポ多糖及び／又はリピッドＡ結合活性を示すペプチド」としては、例えば、配列番号６で表されるアミノ酸配列のＣ末端に、更にＡ、Ｃ、又はＡＣが付加された
ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＡ（配列番号１０６）
ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＣ（配列番号１０７）
ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＡＣ（配列番号１０８）
からなるペプチドを挙げることができる。
なお、これらのアミノ酸配列における１番目のアミノ酸Ｘは、塩基性アミノ酸Ｋ、Ｒ、又はＨ（好ましくはＫ）であり、１０番目のアミノ酸Ｘは、塩基性アミノ酸Ｋ、Ｒ、又はＨ（好ましくはＲ又はＨ、より好ましくはＲ）であり、残る各アミノ酸Ｘ（すなわち、２番目〜９番目のアミノ酸Ｘ）は、それぞれ独立して、任意のアミノ酸である。また、２番目〜９番目のアミノ酸からなる配列は、好ましくは、
ＹＳＳＳＩＳＳＩ（配列番号１０９）
である。

配列番号６で表されるアミノ酸配列において、２番目のアミノ酸は好ましくはＹであり、３番目のアミン酸は好ましくはＳ又はＴであり、４番目のアミン酸は好ましくはＳ又はＴであり、５番目のアミン酸は好ましくはＳ、Ｔ、又はＩであり、６番目のアミン酸は好ましくはＩ、Ｆ、Ｓ、又はＬであり、７番目のアミン酸は好ましくはＳ又はＴであり、８番目のアミン酸は好ましくはＳ又はＴであり、９番目のアミン酸は好ましくはＩ、Ｆ、又はＬである。これらの好適アミノ酸は、任意の組合せで使用可能である。

本発明において有効成分として用いることのできる「ペプチド（１）〜（６）の誘導体」は、前記ペプチド（１）〜（６）の誘導体であって、且つ、リポ多糖及び／又はリピッドＡ結合活性を示す限り、特に限定されるものではない。「ペプチド（１）〜（６）の誘導体」としては、例えば、ペプチドの安定性を向上させる各種修飾を施したペプチド誘導体を挙げることができる。前記修飾としては、例えば、Ｌ体アミノ酸のＤ体化（例えば、Ｎ末端アミノ酸のＤ体化、Ｃ末端アミノ酸のＤ体化、Ｎ末端及びＣ末端以外のアミノ酸のＤ体化）、Ｎ末アミノ基のアセチル化、Ｃ末端カルボキシル基のアミド化、天然型アミノ酸の（性質の類似した）非天然型アミノ酸への置換、又はこれらの組合せを挙げることができる。

Ｎ末端アミノ酸（Ｌ体）をＤ体アミノ酸に置換した誘導体としては、Ｄ体の塩基性アミノ酸に置換した誘導体が好ましく、Ｄ体リジン又はＤ体アルギニンに置換した誘導体がより好ましい。

本発明のリポ多糖及び／又はリピッドＡ結合剤は、有効成分として、リポ多糖及び／又はリピッドＡ結合ペプチドを含む。リポ多糖及び／又はリピッドＡ結合ペプチドは、リポ多糖に対する結合活性を有するため、本発明のリポ多糖及び／又はリピッドＡ結合剤は、例えば、リポ多糖及び／又はリピッドＡ除去剤（例えば、体外循環用リポ多糖除去カラム）又はリポ多糖及び／又はリピッドＡ中和剤（例えば、敗血症治療剤）として使用することができる。また、本発明のリポ多糖及び／又はリピッドＡ結合剤を用いて、リポ多糖及び／又はリピッドＡの分析（例えば、ＥＬＩＳＡ法、一分子蛍光測定法、表面プラズモン共鳴法）を行うことができる。また、本発明のリポ多糖及び／又はリピッドＡ結合剤は、グラム陰性菌の外膜に存在するリポ多糖に結合することから、グラム陰性菌（例えば、大腸菌）の染色又は標識などに使用することができ、更には、グラム陰性菌の分析（特には検出）に用いることができる。本発明のリポ多糖及び／又はリピッドＡ結合剤は、有効成分であるリポ多糖及び／又はリピッドＡ結合ペプチドを、これらの用途に応じて、任意の形態で含むことができる。

本発明のリポ多糖及び／又はリピッドＡ結合剤をリポ多糖及び／又はリピッドＡ除去剤として使用する場合には、リポ多糖の除去が必要となる処理対象としては、例えば、血漿、血清、血液、透析液、輸液、注射剤、又は各種バッファーを挙げることができる。この場合、本発明における有効成分であるリポ多糖及び／又はリピッドＡ結合ペプチドは、例えば、ペプチドそれ自体を単独で、好ましくは、適当な担体に結合した状態で使用することができる。前記担体としては、例えば、シリカビーズ、アガロースビーズ、セルロースビーズ、磁気ビーズ、又はガラスファイバー等を用いることができる。リポ多糖及び／又はリピッドＡ結合ペプチドと担体との結合は、例えば、ジスルフィド結合による結合、あるいは、担体のマレイミド基を利用したマレイミド法などにより実施することができる。

本発明のリポ多糖及び／又はリピッドＡ結合剤をリポ多糖及び／又はリピッドＡ中和剤として使用する場合には、例えば、ペプチドそれ自体を単独で、あるいは、所望により薬剤学的若しくは獣医学的に許容することのできる通常の担体又は希釈剤と共に、動物、好ましくは哺乳動物（特にはヒト）に投与することができる。また、この場合、ペプチドに代えて、ペプチドをコードするポリヌクレオチド（好ましくは、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター）を用いることもできる［例えば、Gene Ther., Development of safe and efficient novel nonviral gene transfer using ultrasound: enhancement of transfection efficiency of naked plasmid DNA in skeletal muscle., 2002 Mar;9(6):372-80］。なお、本ペプチドの中和活性は、例えば、「７．ファージディスプレイ法によるエンドトキシン研究の新戦略 鈴木政嗣他 エンドトキシン研究７ 医学図書出版 2004、65-72」に記載されているとおり、リポ多糖とリポ多糖及び／又はリピッドＡ結合ペプチドを各濃度及び比にて混合し、リムルス試験（リポ多糖濃度を測定する一般的方法）で確認することができる。評価としては実際のリポ多糖濃度と実測値の解離により、本ペプチドの中和活性をインビトロで確認することができる。

本発明のリポ多糖及び／又はリピッドＡ結合剤を用いてリポ多糖及び／又はリピッドＡの分析を行う場合には、例えば、リポ多糖及び／又はリピッドＡを含む可能性のある被検試料と、リポ多糖及び／又はリピッドＡ結合ペプチド（好ましくは、適当な担体に固定化したペプチド）とを接触させ、前記ペプチドに結合したリポ多糖及び／又はリピッドＡを分析することにより、被検試料中のリポ多糖及び／又はリピッドＡの分析を行うことができる。なお、本明細書における用語「分析」には、分析対象物質の存在の有無を判定する「検出」と、分析対象物質の量又は活性を定量的又は半定量的に決定する「測定」とが含まれる。

前記担体としては、例えば、ビーズ（例えば、シリカビーズ、アガロースビーズ、セルロースビーズ、磁気ビーズ）、プレート（例えば、ＥＬＩＳＡ用プレート）を挙げることができる。ペプチドに結合したリポ多糖及び／又はリピッドＡの分析は、例えば、市販のエンドトキシン測定キット（例えば、エンドスペシー ES-50Mセット；生化学工業社）により、あるいは、リポ多糖及び／又はリピッドＡに特異的な抗体を用いる免疫学的分析方法により、あるいは、表面プラズモン共鳴法により実施することができる。

本発明のリポ多糖及び／又はリピッドＡ結合剤をグラム陰性菌の染色又は標識に用いる場合は、例えば、リポ多糖及び／又はリピッドＡ結合ペプチドのＣ末端にシステインを付加し、そのチオール基を利用して、例えば、標識化合物（例えば、色素、蛍光化合物、発光化合物など）、タンパク質［例えば、酵素（例えば、ペルオキシダーゼ）、抗体のＦｃ部位など］を結合させることができる。例えば、蛍光化合物としてフルオレセイン−５−マレイミド（Fluorescein-5-Maleimide；PIERCE社製）を用い、結合後に高速液体クロマトグラフィー法等によって精製し、蛍光染色・標識用のペプチド複合体を得ることができる。あるいは、酵素や抗体のＦｃ部位などの有用タンパク質における標識も、スルホ−ＳＭＣＣ（Sulfo-SMCC；PIERCE社製）等を用い、簡便に行うことができる。このようにして標識したリポ多糖及び／又はリピッドＡ結合ペプチドをグラム陰性菌と混合することにより、染色・標識等が可能である。

本発明のリポ多糖及び／又はリピッドＡ結合剤を、グラム陰性菌の分析に用いる場合には、例えば、グラム陰性菌を含む可能性のある被検試料と、リポ多糖及び／又はリピッドＡ結合ペプチド（好ましくは、適当な担体に固定化したペプチド）とを接触させ、前記ペプチドに結合したグラム陰性菌を分析することにより、被検試料中のグラム陰性菌の分析（特には検出）を行うことができる。ペプチドに結合したグラム陰性菌の分析は、例えば、グラム陰性菌に特異的な抗体を用いる免疫学的分析方法により、あるいは、ペプチドに蛍光色素を融合させた蛍光による検出により、あるいは、ペプチドにホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）又はアルカリホスファターゼを融合した酵素基質反応による検出などにより、実施することができる。

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。

《実施例１：ファージディスプレイ法によるＬＰＳ及び／又はリピッドＡ結合ペプチドのスクリーニング》
本実施例では、ファージディスプレイ法により、大腸菌由来リピッドＡ（Lipid A; E.coli K12, D31m4 <Primarily diphosporyl>; フナコシ社）及び大腸菌由来ＬＰＳ（E.coli K12 D31 m4 (Re); フナコシ社）の両方に結合性を有するペプチドのスクリーニングを行った。

ファージディスプレイ法で用いるライブラリーとして、Ｍ１３ファージの表面のマイナータンパク質ｐIIIのＮ末端にペプチドがランダムに呈示されるライブラリー（呈示されるランダムアミノ酸数が７個又は１２個のペプチドライブラリー２種類）を、Smith, G. P., Science, 288, 1315-1317（1985）、J. K. Scott and G. P. Smith, Science, 249, 386-390(1990)、及び米国特許第5,223,409号明細書（Ladnerら）の記載に基づいて作製した。また、具体的な操作は、特開2004-189657号公報の記載に準じて実施した。

ファージライブラリーのターゲット（リピッドＡ又はＬＰＳ）に対する結合性は、ＥＬＩＳＡ（enzyme-linked immunosorbent assay）により判定した。具体的には、ターゲットの固定化は、リピッドＡ又はＬＰＳにリン酸緩衝化生理食塩水（pH 7.4；以下、ＰＢＳと称する）を加え、１００μｇ／ｍＬとなるように溶解した後、この溶液を９６ウェルプレート［リピッドＡについては96WELLポリソープ プレート(NUNC社)。ＬＰＳについては96WELLメディソープ プレート(NUNC社)］に５０μＬずつ添加し、４℃で一晩インキュベートすることにより実施した。標識化抗体としては、ペルオキシダーゼ標識抗Ｍ１３抗体（anti M13 antibody HRP monoclonal conjugate; Amersham Biosceiences社)を使用し、酵素基質としては２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）二アンモニウム塩［2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS)；和光純薬社］を使用した。

リピッドＡ及びＬＰＳの両方に結合性を有するペプチド提示ファージについて、そのペプチドのアミノ酸配列を決定したところ、配列番号９で表されるアミノ酸配列：
ＫＮＹＳＳＳＩＳＳＩＨＡ（配列番号９）
が得られた。

《実施例２：ＬＰＳ及びリピッドＡに対する結合能の確認》
本実施例では、実施例１で得られた配列番号９で表されるアミノ酸配列を含むペプチド（以下、Li5と称する）のＬＰＳ及びリピッドＡに対する結合能を、ビアコア（BIACORE）システム（BIACORE 2000; BIACORE社）を用いて確認した。なお、下記に記載した緩衝液、蒸留水、実験器具等は特に記載しない限り、全てエンドトキシンフリーのものを用いた。

配列番号９で表されるアミノ酸配列のＣ末端側にチオール基を導入するために、システインを付加したアミノ酸配列：
ＫＮＹＳＳＳＩＳＳＩＨＡＣ（配列番号１１０）
からなるペプチド（以下、Li5 Cと称する）を合成した。

合成したペプチドLi5 Cを、センサーチップ（BIACORE Sensor Chip CM5；BIACORE社）のフローセル（以下、Ｆｃと称する）２にチオールカップリングにて固定化した。コントロールとして、Ｆｃ１にシステインを固定化した。比較のために、アミノ基を介して固定化するアミンカップリングにて、Ｆｃ４にポリミキシンＢ（以下、ＰＭＢと称する）を固定化した。また、ＰＭＢのコントロールとして、Ｆｃ３にエタノールアミンを固定化した。

前記センサーチップに、リピッドＡ溶液及びＬＰＳ溶液［濃度＝100μg/mL, 50μg/mL, 25μg/mL, 12.5μg/mL；緩衝用バッファーＨＢＳ（0.01 mol/L HEPES, pH 7.4, 0.15 mol/L NaCl, 3 mmol/L EDTA）］をアナライトとして、薄い濃度から順に流して測定した。その結果、濃度の解離定数平均値（ＫＤ）は、リピッドＡ又はＬＰＳのいずれの場合も、ペプチドLi5 Cで１０^−７〜１０^−９であり、ペプチドLi5 CがリピッドＡ及びＬＰＳに強く結合することが確認された。一方、比較用として測定したＰＭＢの結合能（ＫＤ）は１０^−７〜１０^−１０であり、ペプチドLi5 Cの結合能は、現在既存の抗生物質であるＰＭＢとほぼ同等であることも同時に示された。なお、解離定数の値に幅があるのは、ＬＰＳ又はリピッドＡのミセル状態などが影響しているものと考えられる。

《実施例３：ＬＰＳ及び／又はリピッドＡ結合ペプチド固定化ビーズによるＬＰＳ除去能の評価》
（３−１）ペプチドLi5 Cのビーズ担体への固定化
本実施例では、酸塩化物が結合しているシリカゲル（Propionyl chloride functionalized silica gel 200-400 mesh；シグマ・アルドリッチ社製）（以下、ビーズ担体と称する）に溶媒を加えて反応させ、最終的にＣ末端のシステインのチオール基を利用してペプチドLi5 Cを固定化した。なお、下記に記載した緩衝液、蒸留水、実験器具等は特に記載しない限り、全てエンドトキシンフリーのものを用いた。

具体的には、先ず、ビーズ担体（0.5 g）を量り取り、乾熱滅菌試験管に移し替えた。そこに２−ヨードエタノール（和光純薬社）（1 mL）を加え、ビーズ担体と結合している酸塩化物とヨードエタノールの水酸基とを反応させ、共有結合させた。その際に副生成物として塩化水素（HCl）が発生するので、ヨードエタノールが反応し副反応が起こるのを防ぐため、ピリジン（和光純薬社）（アミン塩基を含むもの）（100μL）を加え混ぜた。これをパラフィルムで覆い、よく混ぜた後、穏やかに攪拌しながら、室温で４時間反応させた。

反応物をエコノカラム（BIO-RAD社）に移し代え、蒸留水でよく洗浄した後、カップリングバッファー（50mmol/L Tris-HCl, 5mmol/L EDTA・2Na, pH 8.5）で平衡化した。それに、カップリングバッファーに溶解したペプチドLi5 C溶液（5 mg/mL, 1 mL）を加え混ぜ、穏やかに攪拌しながら、室温で３時間放置した。ペプチドLi5 C固定化後、未反応のペプチドを洗い流すため、蒸留水でビーズ担体を洗浄し、更に、カップリングバッファーにて平衡化した。続いて、ブロッキングバッファー（２−メルカプトエタノールを100 mmol/Lとなるようにカップリングバッファーに溶解したもの）を、平衡化したビーズ担体に加え混ぜ、穏やかに攪拌しながら室温にて３時間放置し、非特異的吸着を防ぐためのブロッキングを行なった。ブロッキング後、蒸留水で良く洗浄し、未反応のメルカプトエタノールを取り除いた。その後、ＰＢＳで平衡化し、ビーズ担体をカラムからリムルス試験管（スクリューキャップ付き）（第一化学薬品社）に移し変え、使用するまで４℃で保存した。

ペプチドLi5 C固定化ビーズ担体へのペプチド固定化量を、ＳＨ基定量試薬（Ellman’s Reagent；PIERCE社）で定量したところ、４．９ｍｇが固定化されており、９８％の固定化効率であった。また、コントロール用ビーズ担体として、メルカプトエタノールで完全にブロッキングしたものを調製した。

（３−２）ＬＰＳ吸着能試験
ＬＰＳ溶液として、大腸菌由来ＬＰＳ（E. coli O111:B4；フナコシ社）をＰＢＳに溶
解（1 mg/mL）し、更にＰＢＳで希釈することにより、ＬＰＳ溶液（最終濃度＝500 ng/mL）を作成した。前記実施例３−１で調製したペプチドLi5 C固定化ビーズ担体とコントロール用ビーズ担体について、その分散溶液（上清）を完全に取り除いた。前記ＬＰＳ溶液（2 mL）を各ビーズ担体によく混合させた後、測定用サンプル（200μL）を回収し、別の新しい乾熱滅菌試験管に移し代えた。回収したサンプルは直ちに、卓上遠心器で数秒間遠心し、ビーズを沈殿させ、上澄みを新しい乾熱滅菌試験管に移し代えた。一方、サンプル回収後のビーズ溶液は、溶液と良く混ぜ、穏やかに攪拌しながら、室温でインキュベートした。経時的（３０分後、６０分後）に、同様の方法でサンプリングした。

回収したサンプル中のＬＰＳ量は、市販の測定キット（エンドスペシー ES-50Mセット；生化学工業社）を用いて測定した。その結果、コントロール（ブロッキングビーズ担体）では、混合直後のＬＰＳ濃度と６０分後のＬＰＳ濃度とが、変わらずほぼ一定であった。一方、ペプチドLi5 C固定化ビーズ担体では、ペプチド固定化ビーズ担体とＬＰＳ溶液とを混合した直後（経過時間＝０分）に回収したサンプル中のＬＰＳ濃度（Ａ）は384.7ng/mLであり、前記混合から３０分間経過した後に回収したサンプル中のＬＰＳ濃度（Ｂ）は85.2ng/mLであった。Ｂ／Ａ比（0.22）から算出したＬＰＳ除去率は７８％であり、高いＬＰＳ吸着作用が認められた。

（３−３）ペプチド固定化量に対するＬＰＳ除去能の評価
本実施例では、ペプチド固定化量の異なるペプチドLi5 C固定化ビーズ担体を調製し、それらのＬＰＳ除去能を比較した。ペプチドLi5 C固定化ビーズ担体の調製は、ペプチドLi5 C溶液（5 mg/mL, 1 mL）の代わりに、濃度の異なる３種類のペプチドLi5 C溶液（5 mg/mL, 0.5 mg/mL, 0.05 mg/mL）を使用すること以外は、前記実施例３−１に記載の手順を繰り返した。結果を表１に示す。表１において、欄Ａは、ペプチド固定化ビーズ担体とＬＰＳ溶液とを混合した直後（経過時間＝０分）に回収したサンプル中のＬＰＳ濃度（単位＝ng/mL）を示し、欄Ｂは、前記混合から３０分間経過した後に回収したサンプル中のＬＰＳ濃度（単位＝ng/mL）を示す。

（３−４）各種条件下におけるＬＰＳ除去能の評価
ＬＰＳ及び／又はリピッドＡ結合剤を用いて血中のＬＰＳを除去する場合、血中に含まれる可能性のある各種成分（例えば、血清アルブミン、ＩＬ−１β、ヘパリン）の存在下であっても、あるいは、各種条件下（例えば、塩濃度、ＬＰＳ濃度）においても、ＬＰＳ除去能を示すことが必要である。本実施例では、ペプチドLi5 C固定化ビーズ担体が、種々の条件下でも、高いＬＰＳ除去能を示すことを確認した。

ＬＰＳ溶液（最終濃度＝500 ng/mL）に代えて、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有ＬＰＳ溶液（1% BSA, 500 ng/mL LPS）を用いること以外は、前記実施例３−２に記載の手順を繰り返した。その結果、ＢＳＡの存在は、ペプチドLi5 C固定化ビーズ担体のＬＰＳ除去能にほとんど影響を与えないことが判明した。

ＬＰＳ溶液（最終濃度＝500 ng/mL）に代えて、ヒトＩＬ−１β（Pepro Tech社）含有ＬＰＳ溶液（200 ng/mL IL-1β, 500 ng/mL LPS）を用いること以外は、前記実施例３−２に記載の手順を繰り返した。その結果、ＩＬ−１βの存在は、ペプチドLi5 C固定化ビーズ担体のＬＰＳ除去能にほとんど影響を与えないことが判明した。また、ＩＬ−１β自体は、Li5 C固定化ビーズ担体を使用した場合に最も非特異的な吸着が見られず、Li5 Cは特異的にＬＰＳを除去することが示された。

血中のＬＰＳを除去する体外循環カラムでは、抗凝固剤（例えば、ヘパリン、ナファモスタットメシレート等）が使用される。ＬＰＳ溶液（最終濃度＝500 ng/mL）に代えて、ヘパリン含有ＬＰＳ溶液（1 unit/mL ヘパリン, 500 ng/mL LPS）を用いること以外は、前記実施例３−２に記載の手順を繰り返した。その結果、ヘパリンを含有しないＬＰＳにおけるＬＰＳ除去率が７４．４％であるのに対して、ヘパリン含有ＬＰＳにおけるＬＰＳ除去率は４５．０％であった。通常使用濃度（1 unit/mL）のヘパリンの存在は、ペプチドLi5 C固定化ビーズ担体のＬＰＳ除去能を若干低下させたが、実用上、ほとんど問題ないことが判明した。

ＬＰＳ溶液（最終濃度＝500 ng/mL）に代えて、塩（NaCl）含有ＬＰＳ溶液（0.25, 0.5, 又は1 mol/L NaCl, 500 ng/mL LPS）を用いること以外は、前記実施例３−２に記載の手順を繰り返した。結果を表２に示す。

大腸菌による有用タンパク質の遺伝子工学的生産において、精製タンパク質溶液中に含有される高濃度ＬＰＳを除去することは重要である。ＬＰＳ溶液（最終濃度＝500 ng/mL）に代えて、ファージ溶液（LPS濃度＝360μg/mL）を用いること以外は、前記実施例３−２に記載の手順を繰り返した。その結果、初期濃度３６０μｇ／ｍＬの高濃度ＬＰＳを、３０μｇ／ｍＬまで効率よく除去可能であることが判明した。

一方、低濃度ＬＰＳ溶液から、発熱限界である１ＥＵ／ｍＬまでＬＰＳを除去可能な初期ＬＰＳ濃度を検討した。ＬＰＳ溶液（最終濃度＝500 ng/mL）に代えて、ＬＰＳ（USP Reference Standard Endotoxin；生化学工業社）濃度が２５、５０、及び１００ＥＵ／ｍＬになるようにＰＢＳで希釈したＬＰＳ溶液を用いること以外は、前記実施例３−２に記載の手順を繰り返した。その結果、初期のＬＰＳ濃度が２５ＥＵ／ｍＬでは５分後に１ＥＵ／mL以下にすることができた。なお、単位「ＥＵ」は、エンドトキシンユニット（Endotoxin Unit）の略である。

《実施例４：各種ＬＰＳ及び／又はリピッドＡ結合ペプチドのＬＰＳ結合能の評価》
本実施例では、実施例１で得られた配列番号９で表されるアミノ酸配列：
ＫＮＹＳＳＳＩＳＳＩＨＡ（配列番号９）
からなるペプチドに関して、どのアミノ酸がＬＰＳ結合に関与しているかを検討するために、各種ペプチドを合成し、そのＬＰＳ結合能を評価した。なお、本実施例で合成したペプチドは、特に断らない限り、Ｃ末端側にチオール基を導入するために、システインを付加した。なお、下記に記載した緩衝液、蒸留水、実験器具等は特に記載しない限り、全てエンドトキシンフリーのものを用いた。

（４−１）各種ＬＰＳ及び／又はリピッドＡ結合ペプチドの調製
配列番号１で表されるアミノ酸配列において、Ｃ末端側から１アミノ酸ずつ欠失させたペプチドとして、以下のペプチドを合成した：
ペプチドLi5 6C：ＫＮＹＳＳＳＣ（配列番号１１１）
ペプチドLi5 7C：ＫＮＹＳＳＳＩＣ（配列番号１１２）
ペプチドLi5 8C：ＫＮＹＳＳＳＩＳＣ（配列番号１１３）
ペプチドLi5 9C：ＫＮＹＳＳＳＩＳＳＣ（配列番号１１４）
ペプチドLi5 10C：ＫＮＹＳＳＳＩＳＳＩＣ（配列番号１１５）
ペプチドLi5 11C：ＫＮＹＳＳＳＩＳＳＩＨＣ（配列番号１１６）

配列番号１で表されるアミノ酸配列において、Ｎ末端アミノ酸を欠失させたペプチドとして、
ペプチドLi5 K1del C：ＮＹＳＳＳＩＳＳＩＨＡＣ（配列番号１１７）
を合成した。

配列番号１で表されるアミノ酸配列において、塩基性アミノ酸、すなわち、１番目のリジン（Ｋ）及び１１番目のヒスチジン（Ｈ）の少なくとも一方を別の塩基性アミノ酸（Ｋ、Ｒ、又はＨ）に置換したペプチドとして、以下のペプチドを合成した：
ペプチドLi5 H11K C：ＫＮＹＳＳＳＩＳＳＩＫＡＣ（配列番号１１８）
ペプチドLi5 H11R C：ＫＮＹＳＳＳＩＳＳＩＲＡＣ（配列番号１１９）
ペプチドLi5 K1R H11R C：ＲＮＹＳＳＳＩＳＳＩＲＡＣ（配列番号１２０）
ペプチドLi5 K1R C：ＲＮＹＳＳＳＩＳＳＩＨＡＣ（配列番号１２１）
ペプチドLi5 K1H C：ＨＮＹＳＳＳＩＳＳＩＨＡＣ（配列番号１２２）

配列番号１で表されるアミノ酸配列において、Ｎ末端アミノ酸（Ｌ体）をＤ体アミノ酸に置換したペプチドとして、以下のペプチドを合成した：
ペプチドLi5 K1dK C：配列番号１１０で表されるアミノ酸配列において、１番目のＫ（Ｌ体）をＤ体リジンに置換したペプチド
ペプチドLi5 K1dR C：配列番号１１０で表されるアミノ酸配列において、１番目のＫ（Ｌ体）をＤ体アルギニンに置換したペプチド
ペプチドLi5 K1dK H11R C：配列番号１１９で表されるアミノ酸配列において、１番目の
Ｋ（Ｌ体）をＤ体リジンに置換したペプチド
ペプチドLi5 K1dR H11R C：配列番号１１９で表されるアミノ酸配列において、１番目のＫ（Ｌ体）をＤ体アルギニンに置換したペプチド

配列番号１で表されるアミノ酸配列において、Ｎ末端アミノ酸をアセチル化したペプチドとして、
ペプチドLi5 K1actylK C：配列番号１１０で表されるアミノ酸配列において、１番目のＫをアセチル化したペプチド
を合成した。

配列番号１で表されるアミノ酸配列において、２番目のアスパラギン（Ｎ）を欠失させ、１１番目のヒスチジン（Ｈ）をアルギニン（Ｒ）に置換したペプチドとして、
ペプチドLi5 N2del H10R C：ＫＹＳＳＳＩＳＳＩＲＡＣ（配列番号１２３）
を合成し、更に、１番目のＫ（Ｌ体）をＤ体リジンに置換したペプチドとして、
ペプチドLi5 K1dK N2del H10R C：配列番号１２３で表されるアミノ酸配列において、１番目のＫ（Ｌ体）をＤ体リジンに置換したペプチド
を合成し、更に、１２番目のＣ（Ｌ体）をＤ体システインに置換したペプチドとして、
ペプチドLi5 K1dK N2del H10R C12dC：配列番号１２３で表されるアミノ酸配列において、１番目のＫ（Ｌ体）をＤ体リジンに置換し、１２番目のＣ（Ｌ体）をＤ体システインに置換したペプチド
を合成した。

更に、
ペプチドLi5 K1dK N2dN H11R C：配列番号１１９で表されるアミノ酸配列において、１番目のＫ（Ｌ体）をＤ体リジンに置換し、２番目のＮ（Ｌ体）をＤ体アスパラギンに置換したペプチド
ペプチドLi5 -1G K1dK H11R C：配列番号１１９で表されるアミノ酸配列において、１番目のＫ（Ｌ体）をＤ体リジンに置換し、Ｎ末端にＧを付加したペプチド
ペプチドLi5 -1acetylK H11R C：配列番号１１９で表されるアミノ酸配列において、Ｎ末端にＫを付加し、更にそのＮ末端アミノ酸をアセチル化したペプチド
ペプチドLi5 K1dK H11R C13dC：配列番号１１９で表されるアミノ酸配列において、１３番目のＣ（Ｌ体）をＤ体システインに置換したペプチド
を合成した。

（４−２）ビアコアシステムによるＬＰＳ結合能の評価
前記実施例２で合成したペプチドLi5 C、及び前記実施例４−１で合成した各ペプチドについて、ビアコア（BIACORE）システム（BIACORE 2000; BIACORE社）を用いてＬＰＳ結合能を評価した。前記評価は、リピッドＡ溶液及びＬＰＳ溶液（濃度＝100μg/mL, 50μg/mL, 25μg/mL, 12.5μg/mL）を用いる代わりに、ＬＰＳ溶液（濃度＝50μg/mL, 25μg/mL, 12.5μg/mL, 6.25μg/mL）を用いること以外は、前記実施例２に記載の手順に従って実施した。

（４−３）ペプチド固定化ビーズ（バッチ法）によるＬＰＳ吸着能の評価
前記実施例２で合成したペプチドLi5 C、及び前記実施例４−１で合成した各ペプチドについて、ペプチド固定化ビーズ（バッチ法）により、ＬＰＳ吸着能を評価した。前記評価（２番目のＮを欠失させたペプチドを除く）は、ビーズ担体へのペプチド固定化量を２μｍｏｌ、５ｍｇ、又は２ｍｇとしたこと以外は、前記実施例３に記載の手順に従って実施した。また、２番目のＮを欠失させたペプチドの評価は、ビーズ担体0.2 g（実施例３−１では0.5 g）、２−ヨードエタノール0.5 mL（実施例３−１では1 mL）、ピリジン50 μL（実施例３−１では100μL）、ペプチド溶液2 mg/mL, 1 mL（実施例３−１では5 mg/mL, 1 mL）、ＬＰＳ溶液0.8 mL（実施例３−２では2 mL）、測定用サンプル50μL（実施例３−２では200μL）を用いて、５分後、３０分後、６０分後（実施例３−２では３０分後、６０分後）にサンプリングしたこと以外は、前記実施例３に記載の手順に従って実施した。

Ｃ末端欠失型ペプチドに関する結果を表３に、塩基アミノ酸置換型ペプチドに関する結果を表４に、２番目のＮを欠失させたペプチドに関する結果を表５及び表６に、それぞれ示す。表３〜表５において、欄Ａは、ペプチド固定化ビーズ担体とＬＰＳ溶液とを混合した直後（経過時間＝０分）に回収したサンプル中のＬＰＳ濃度（単位＝ng/mL）を示し、欄Ｂは、前記混合から３０分間経過した後に回収したサンプル中のＬＰＳ濃度（単位＝ng/mL）を示す。表６において、欄Ａは、ペプチド固定化ビーズ担体とＬＰＳ溶液とを混合した直後（経過時間＝０分）に回収したサンプル中のＬＰＳ濃度（単位＝ng/mL）を示し、欄Ｂは、前記混合から５分間経過した後に回収したサンプル中のＬＰＳ濃度（単位＝ng/mL）を示す。

（４−４）結果
前記実施例４−２及び実施例４−３の結果を、血中安定性のデータと併せて、表７に示す。また、使用したペプチドを表８にまとめた。
なお、血中安定性は、以下の方法により評価した。先ず、ペプチドを１０ｍｇ／ｍＬとなるように蒸留水で溶解した。更にそれを蒸留水で１０倍に希釈し、終濃度１ｍｇ／ｍＬとなるように調整した。ペプチド溶液１０μＬを５０μＬの血漿（ヒト）に加え、５分後、３０％ＴＣＡ２５μＬを添加することにより反応を止めた。良く攪拌後、１２，０００ｒｐｍ、５分の遠心で変性タンパク質を沈殿させ、上澄みをＨＰＬＣにかけた。高速液クロ（ＨＰＬＣ）は以下の条件で行なった：
カラム：トーソーＯＤＳ ８０ＴＭ（４．６×１００ｍｍ）
溶媒Ａ：０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）
溶媒Ｂ：９０％アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ中）
流速 ：０．８ｍＬ／ｍｉｎ
グラディエント：１０〜６０％Ｂ（５５分間）
モニターは２１０ｎｍ（１．０ＡＵＳＦ）と２８０ｎｍ（０．２ＡＵＳＦ）の吸光
各時間ごとに上記操作を行ない（３０％ＴＣＡ２５μＬを加えて反応を止め、遠心で変性タンパク質を沈殿させ、上澄みをＨＰＬＣで分析し）、ピークの高さを測定した。また、そのピークのアミノ酸配列をシークエンサーにて分析することにより、分解産物を確認し、血漿中の安定性を評価した。

表７において、（ａ）欄は、結合力（ＫＤ）であり、（ｂ）欄は、ＬＰＳ（50μg/mL）時の結合量（Ｒｍａｘ）［BIACOREソフトウェアによる計算値］であり、（ｃ）欄は、ビアコアシステムによる評価［すなわち、（ａ）欄及び（ｂ）欄に基づく評価］であり、（ｄ）欄は、バッチ法による評価であり、（ｅ）欄は、血中安定性に関する評価であり、（ｆ）欄は、総合評価［すなわち、（ｃ）欄〜（ｅ）欄に基づく評価］である。

欄（ｃ）〜欄（ｆ）における評価は、４段階評価であり、記号「Ａ」は、極めて優れていることを示し、記号「Ｂ」は、優れていることを示し、記号「Ｃ」は、通常使用には耐えることを示し、記号「Ｄ」は、単独では劣るが、繰り返し配列からなるマルチマーや、高密度にペプチドを固定化する方法などにより使用可能であることを示す。
より具体的には、（ｃ）欄のビアコアシステムによる評価［（ａ）欄及び（ｂ）欄に基づく評価］では、（ａ）欄及び（ｂ）欄を総合評価したときに、ペプチドLi5 Cより優れている場合を評価「Ａ」とし、ペプチドLi5 Cと同程度である場合を「Ｂ」と評価し、ペプチドLi5 Cよりやや劣る場合を「Ｃ」と評価し、ペプチドLi5 Cより劣る場合を「Ｄ」と評価した。
また、（ｄ）欄におけるバッチ法による評価では、同時に測定したペプチドLi5 CよりもＬＰＳ吸着能が優れているか、またはＬＰＳ除去効率が７０％以上の吸着能を示す場合を評価「Ａ」とし、ペプチドLi5 Cと同等か、またはＬＰＳ除去効率が５０％〜６９％の吸着能を示す場合を評価「Ｂ」とし、ペプチドLi5 Cよりもやや劣るか、またはＬＰＳ除去効率が３０〜４９％の吸着能を示す場合を評価「Ｃ」とし、ペプチドLi5 Cよりも劣るか、またはＬＰＳ除去効率が１０〜２９％の吸着能を示す場合を評価「Ｄ」とした。
また、（ｅ）欄における血中安定性に関する評価では、血漿中で１時間以上経過しても残存が確認できた場合を評価「Ａ」とし、血漿中において３０分〜１時間以内で分解された場合を評価「Ｂ」とし、血漿中において１０分〜３０分以内に全て分解された場合を評価「Ｃ」とし、血漿中において１分〜１０分以内に全て分解された場合を評価「Ｄ」とした。

これまでの各試験から導かれる結果として、Ｎ末端に塩基性のアミノ酸（特にＫ）があることが好ましい。これはＮ末端のＫを除去するとＬＰＳ結合能が低下することから言える。また、Ｎ末端のアミノ基をアセチル化することで結合力が弱まることから、Ｎ末端のアミノ基もフリーであることが好ましい。また、Ｎ末端から１１番目又は１０番目のアミノ酸が塩基性のアミノ酸（特にＲ）であることが好ましい。これはＣ末端から削った場合、この塩基性アミノ酸が削られるとＬＰＳ結合能が低下することから考えられる。安定性の面では、Ｎ末端アミノ酸をＤ体にすることが好ましい。また更に安定化させる為にはＣ末端となるアミノ酸もＤ体化すると相乗的に有効である。また、２番目のＮを欠失させたペプチドに関する結果から、Ｎ末のＫをＤ体Ｋに置換することで、ＬＰＳ吸着効率が更に増すことがわかった。更に、両サイドをＤ体に変えたペプチドについてもＬＰＳ吸着能が確認でき、Ｎ末端をＤ体、若しくは両サイドをＤ体に変えても吸着能の劣らないことが示された。

表８において、小文字で示す各アミノ酸（ｋ、ｒ、ｎ、及びｃ）は、Ｄ体アミノ酸であることを意味し、「ak」は、ペプチドのＮ末端アミノ基のアセチル化を意味する。

《実施例５：オープンカラム法によるＬＰＳの除去》
（５−１）ペプチドLi5 Cのビーズ担体への固定化とカラム作製
本実施例では、酸塩化物が結合しているシリカゲル（Propionyl chloride functionalized silica gel 200-400 mesh；シグマ・アルドリッチ社製）（以下、ビーズ担体と称する）に溶媒を加えて反応させ、最終的にＣ末端のシステインのチオール基を利用してペプチドLi5 Cを固定化した。なお、下記に記載した緩衝液、蒸留水、実験器具等は特に記載しない限り、全てエンドトキシンフリーのものを用いた。

具体的には、先ず、ビーズ担体（1.0 g）を量り取り、乾熱滅菌試験管に移し替えた。そこに２−ヨードエタノール（和光純薬社）（2 mL）を加え、ビーズ担体と結合している酸塩化物とヨードエタノールの水酸基とを反応させ、共有結合させた。その際に副生成物として塩化水素（HCl）が発生するので、ヨードエタノールが反応し副反応が起こるのを防ぐため、ピリジン（和光純薬社）（アミン塩基を含むもの）（200μL）を加え混ぜた。これをパラフィルムで覆い、よく混ぜた後、穏やかに攪拌しながら、室温で４時間反応させた。

反応物をエコノカラム（カタログ番号737-0516、内径＝0.5cm、長さ＝15cm、底面積＝0.2cm²；BIO-RAD社）に移し代え、蒸留水でよく洗浄した後、カップリングバッファー（50mmol/L Tris-HCl, 5mmol/L EDTA・2Na, pH 8.5）で平衡化した。それに、カップリングバッファーに溶解したペプチドLi5 C溶液（2.5 mg/mL, 2 mL）を加え混ぜ、穏やかに攪拌しながら、室温で３時間放置した。ペプチドLi5 C固定化後、未反応のペプチドを洗い流すため、蒸留水でビーズ担体を洗浄し、更に、カップリングバッファーにて平衡化した。続いて、ブロッキングバッファー（２−メルカプトエタノールを100 mmol/Lとなるようにカップリングバッファーに溶解したもの）を、平衡化したビーズ担体に加え混ぜ、穏やかに攪拌しながら室温にて３時間放置し、非特異的吸着を防ぐためのブロッキングを行なった。ブロッキング後、蒸留水で良く洗浄し、未反応のメルカプトエタノールを取り除いた。その後、ＰＢＳで平衡化し、カラム上部と下部の蓋を閉め、使用するまで４℃で保存した。

ペプチドLi5 C固定化ビーズ担体へのペプチド固定化量を、ＳＨ基定量試薬（Ellman’s Reagent；PIERCE社）で定量したところ、４．９５ｍｇが固定化されており、９９％の固定化効率であった。また、コントロール用ビーズ担体として、メルカプトエタノールで完全にブロッキングしたものを調製した。

（５−２）ＬＰＳ除去試験
ＬＰＳ溶液として、大腸菌由来ＬＰＳ（E. coli O111:B4；フナコシ社）をＰＢＳに溶解（1 mg/mL）し、更にＰＢＳで希釈することにより、ＬＰＳ溶液（最終濃度＝500 ng/mL）を作成した。実施例５−１で調製したカラム中の溶液（ＰＢＳ）をビーズ担体の表面と同じ高さまで排除して揃えた。前記ＬＰＳ溶液（10 mL）をカラム上部から流し、通流させ、カラム下部から０．５ｍＬずつ溶液を乾熱滅菌試験管に回収した。回収したサンプル中のＬＰＳ量は、実施例３−２に記載の方法により定量した。コントロールでは、カラム添加後、しばらくすると飽和状態に達してしまうのに対して、ペプチドLi5 C固定化カラムでは、ＬＰＳ除去率が９１．１％であり、ＬＰＳを効率よく除去可能であることが示された。

《実施例６：ペプチド固定化ビーズ担体を用いたＬＰＳの定量》
本実施例では、前記実施例４−１で合成したペプチドLi5 K1dK N2del H10R C12dCの固定化ビーズ担体を用いて、ＬＰＳと反応させた後、ビーズ担体に結合したＬＰＳ量を測定し、定量ができることを確認した。また、これと同時にメルカプトエタノールで完全ブロキングしたビーズ担体のみのものをコントロールとして比較した。なお、下記に記載した緩衝液、蒸留水、実験器具等は特に記載しない限り、全てエンドトキシンフリーのものを用いた。

（６−１）ペプチドLi5 K1dK N2del H10R C12dCのビーズ担体への固定化
本実施例では、酸塩化物が結合しているシリカゲル（Propionyl chloride functionalized silica gel 200-400 mesh；シグマ・アルドリッチ社製）（以下、ビーズ担体と称する）に溶媒を加えて反応させ、最終的にＣ末端のシステインのチオール基を利用してペプチドを固定化した。

具体的には、先ず、ビーズ担体［10mg（１サンプル分）］を量り取り、乾熱滅菌試験管に移し替えた。そこに２−ヨードエタノール（和光純薬社）（0.1mL）を加え、ビーズ担体と結合している酸塩化物とヨードエタノールの水酸基とを反応させ、共有結合させた。その際に副生成物として塩化水素（HCl）が発生するので、ヨードエタノールが反応し副反応が起こるのを防ぐため、ピリジン（和光純薬社）（アミン塩基を含むもの）（10μL）を加え混ぜた。これをパラフィルムで覆い、よく混ぜた後、穏やかに攪拌しながら、室温で４時間反応させた。

反応物をエコノカラム（BIO-RAD社）に移し代え、蒸留水でよく洗浄した後、カップリングバッファー（50mmol/L Tris-HCl, 5mmol/L EDTA・2Na, pH 8.5）で平衡化した。それに、カップリングバッファーに溶解したペプチド溶液（20 mg/mL, 0.25 mL）を加え混ぜ、穏やかに攪拌しながら、室温で３時間放置した。ペプチド固定化後、未反応のペプチドを洗い流すため、蒸留水でビーズ担体を洗浄し、更に、カップリングバッファーにて平衡化した。続いて、ブロッキングバッファー（２−メルカプトエタノールを100 mmol/Lとなるようにカップリングバッファーに溶解したもの）を、平衡化したビーズ担体に加え混ぜ、穏やかに攪拌しながら室温にて３時間放置し、非特異的吸着を防ぐためのブロッキングを行なった。ブロッキング後、蒸留水で良く洗浄し、未反応のメルカプトエタノールを取り除いた。その後、ＰＢＳで平衡化し、ビーズ担体をカラムから乾熱滅菌試験管（生化学工業社）に移し変え、使用するまで４℃で保存した。

ペプチド固定化ビーズ担体へのペプチド固定化量を、ＳＨ基定量試薬（Ellman’s Reagent；PIERCE社）で定量したところ、90％以上の固定化効率であった。また、コントロール用ビーズ担体として、メルカプトエタノールで完全にブロッキングしたものを調製した。

（６−２）ＬＰＳ吸着能試験
先ず、大腸菌（E. coli O113:H10株）由来の米国薬局方エンドトキシン標準品（RSE：Reference Standard Endotoxin：生化学工業社製）をエンドトキシンフリーの蒸留水（LRW：LAL Reagent Water；生化学工業社製）で溶解し（2,000EU/mL）、更にＰＢＳで希釈することにより、濃度の異なるＬＰＳ溶液（最終濃度＝10EU/mL、5EU/mL、2.5EU/mL、0EU/ｍL）を作成した。次に、前記実施例６−１で調製したペプチド固定化ビーズ担体とコントロール用ビーズ担体について、その乾熱滅菌試験管中に混入している溶液（上清）を完全に取り除いた。各濃度のＬＰＳ溶液（1 mL）をそれぞれのビーズ担体に加え混ぜ、パラフィルムで試験管の口を覆い、穏やかに攪拌しながら室温で３０分間反応させた（その際に上澄みを10μl回収し、添加直後の溶液とした）。その後、直ちに卓上遠心器で数秒間遠心してビーズを沈殿させてから、上澄みを新しい乾熱滅菌試験管に移し代えた（反応後の上澄みとした）。一方、沈殿させたビーズにＰＢＳ溶液（0.5mL）を添加し、混合後ビーズを沈殿させてから上澄みを取り除くという操作を繰り返し行ない、未結合のＬＰＳを取り除く為、ビーズを洗浄した。この操作を６回（計3mL）繰り返し行なった。この洗浄後の溶液も最終的にＬＰＳ濃度を定量する為、乾熱滅菌試験管にて保管した（洗浄後の溶液とした）。
また、ビーズ担体にはＰＢＳ溶液（1mL）を加え混ぜた。その後、添加直後や反応後の上澄み、洗浄後の溶液、ビーズに結合したＬＰＳ量についてそれぞれ定量した。ＬＰＳ量は、市販の測定キット（エンドスペシーES-50Mセット；生化学工業社）を用いて測定した。結果を表９に示す。

その結果、コントロールでビーズに結合したＬＰＳ量はほぼ０ＥＵであったのに対し、ペプチド固定化ビーズ担体では、濃度依存的にビーズに結合したＬＰＳ量の定量が行なえた。また、ＬＰＳ添加直後の上澄みから投入したＬＰＳ量も相当量であり、洗浄後の溶液にもＬＰＳがほとんど含まれていないこと（０ＥＵ）、反応後の上澄みにも殆どＬＰＳが残っていないことなどから、ビーズに結合したＬＰＳの定量が確実であることが示された。

《実施例７：オープンカラム法によるＬＰＳ除去効率の確認》
本実施例では、ペプチドLi5 K1dK N2del H10R C12dC固定化担体を充填させたカラムと、何も固定化していない担体のみを充填させたカラムとのＬＰＳ除去効率を比較した。なお、下記に記載した緩衝液、蒸留水、実験器具等は特に記載しない限り、全てエンドトキシンフリーのものを用いた。

（７−１）ペプチドのビーズ担体への固定化
本実施例では、チオール基を含む物質をジスルフィド（Ｓ−Ｓ）結合で固定する担体（Thiopropyl Sepharose 6B Lab Pack；アマシャム バイオサイエンス社製）（以下、担体と称する）を用いてペプチドを固定化した。
具体的には、先ず、担体［0.5ｇ（容量1.5mL）］を遠沈管に量り取り、蒸留水を加え膨潤させてからエコノカラム（BIO-RAD社製）（以下、カラムと称する）に移し変えた。カラムに蒸留水（100mL）を通流させ担体を洗浄した。それにペプチド溶液［蒸留水1.35ｍL、0.1mol/L ギ酸（pH4.5）0.15ｍLにペプチド5mgを溶解したもの］を添加し、室温で一晩放置し、ペプチドを固定化した。続いて、ブロッキングバッファー（２−メルカプトエタノールを100 mmol/Lとなるように、蒸留水：0.1mol/L ギ酸（pH4.5）＝９：１の割合の溶液で溶解したもの）をカラムに添加させ、室温で一晩放置し、非特異的吸着を防ぐ為のブロッキングを行なった。ブロッキング後、カラムに蒸留水を通流させ、未反応のメルカプトエタノールを取り除いた。その後、ＰＢＳで平衡化し、使用するまで４℃で保存した。
また、コントロール用担体として、メルカプトエタノールで完全にブロッキングしたものを調製した。

（７−２）ＬＰＳ除去効率確認試験
先ず、カラム中に含まれているＰＢＳ溶液を捨てて担体の表面と同じ位置に合わせた。そのカラムにＬＰＳ溶液（LPS E.coli O111:B4 10ng/mLとなるようにヒト血漿に溶解したもの）８ｍＬを通流させた。カラム下部からＬＰＳ溶液を１ｍＬ又は０．５ｍＬずつ回収した。サンプルは乾熱滅菌試験管にてストックした。
その後、それぞれのサンプル中に含まれるＬＰＳ量の定量を行ない、ペプチドによるＬＰＳ除去効率を確認した。
ＬＰＳ量は、市販の測定キット（エンドスペシーES-50Mセット；生化学工業社）を用いて測定した。

その結果、コントロール（担体のみ）ではＰＢＳ溶液が流れた後、直ぐ飽和状態に達したのに対し、ペプチド固定化カラムは５０％程度のＬＰＳ除去効率を維持した後、徐々に飽和していく傾向を示した。また、ＬＰＳ溶液８ｍＬを流した時点での除去効率はまだ完全に飽和状態に達していなかった。これにより、ペプチド固定化担体は血漿中のＬＰＳを除去することが示された。

《実施例８：ペプチド安定性評価》
本実施例では、ペプチドLi5 K1dK N2del H10R C12dCの安定性を、タンパク質とタンパク質等の分子間における結合の強さや結合量を測定する機器［ビアコアシステム（BIACORE 2000; BIACORE社）］にて測定した。また、ポリミキシンＢ（ＰＭＢ）も同時に測定し、比較した。なお、下記に記載した緩衝液、蒸留水、実験器具等は特に記載しない限り、全てエンドトキシンフリーのものを用いた。

具体的には上記ペプチドを、センサーチップ（BIACORE Sensor Chip CM5；BIACORE社）のフローセル（以下、Ｆｃと称する）２にチオールカップリングにて固定化した。コントロールとしてＦｃ１にシステインを固定化した。比較の為に、アミノ基を介して固定化するアミンカップリングにてＦｃ４にＰＭＢを固定化した。なお、それぞれ、等モルとなるように固定化した。

そのセンサーチップに、濃度が５０μｇ／ｍLのＬＰＳ溶液［緩衝用バッファーHBS-EP（0.01mol/L HEPES、pH7.4、0.15mol/L NaCl、3mmol/L EDTA）］をアナライトとして流し、結合量（ＲＵ：Resonance Unit）を測定した後、強アルカリ溶液（15mmol/L NaOH）を流してセンサーチップを洗浄した。このサイクルを１回として繰り返し行ない、結合量の変化を調べ、安定性を確認した。

その結果、ＰＭＢはサイクルを重ねるごとにＬＰＳ結合量が低下していくのに対し、ペプチドLi5 K1dK N2del H10R C12dCのＬＰＳ結合量は変わらず一定であった。よって、強アルカリ洗浄下において、ペプチドは安定であることが示された。

《実施例９：グラム陰性菌の蛍光染色》
本実施例では、前記実施例４−１で合成したペプチドLi5 K1dK N2del H10R Cを用いてグラム陰性菌（大腸菌及び緑膿菌）及びグラム陽性菌（乳酸菌）の蛍光染色を実施した。

ペプチドLi5 K1dK N2del H10R C［0.5mg/mL in PBS（pH7.2）］１ｍＬを作成し、フルオレセイン−５−マレイミド（PIERCE社製）５ｍｇを定法に従って加え、室温で２時間反応させた後、Ｌ−システイン５０ｍｇを添加してブロッキングを行うことにより、フルオレセイン標識化ペプチドを調製した。各菌は、充分に増殖させたところ（full growth）で遠心して沈殿を回収し、遠心前の培地量の１０倍量の水に再懸濁したものを使用した。得られた各菌の懸濁液５μＬを、シラン処理したスライドガラスに滴下し、乾燥させた。固定のために、１００％エタノール１０μＬを滴下し、乾燥させた。フルオレセイン標識化ペプチド溶液（２５μｇ／ｍＬ）１００μＬを滴下し、そのまま３時間放置し、染色を実施した。なお、コントロールとして、フルオレセイン標識化ペプチド溶液の代わりに、フルオレセイン標識化システイン溶液又は水を使用した。

蛍光顕微鏡（ＢＸ５０ＷＩ；オリンパス）による観察の結果、グラム陰性菌である大腸菌又は緑膿菌は、フルオレセイン標識化ペプチドにより染色されたのに対して、グラム陽性菌である乳酸菌は染色されなかった。また、コントロールとして使用したフルオレセイン標識化システインでは、グラム陰性菌及びグラム陽性菌のいずれも染色されなかった。

《実施例１０：Ｌｉ５−０２５と各種ＬＰＳとの結合力（親和性）評価（ビアコアシステムによる）》
本実施例では、実施例４−１で合成したペプチドLi5 K1dK N2del H10R C（以下、ペプチドＬｉ５−０２５の名称を併用する）について、ビアコア（BIACORE）システム（BIACORE 2000; BIACORE社）を用いて、種の異なる各種ＬＰＳとの結合力を評価した。
具体的には、合成したペプチド（Ｌｉ５−０２５）をセンサーチップ（BIACORE Sensor Chip CM5；BIACORE社）のフローセル（以下、Ｆｃと称する）２にチオールカップリングにて固定化した。コントロールとして、Ｆｃ１にシステインを固定化した。
前記センサーチップに、各種［Bordetella pertussis（Bp）、Vibrio cholerae serotype Inaba 569B (Vc)、Klebsiella pneumoniae (Kp)、Pseudomonas aeruginosa Serotype 10 (Pa)、Escherichia coli O111:B4 (Ec)］の異なるＬＰＳ［濃度＝50 μg/mL, 25 μg/mL, 12.5 μg/mL, 6.25 μg/mL；緩衝用バッファーＨＢＳ−ＥＰ（Tween-20無し）（0.01 mol/L HEPES, pH 7.4, 0.15 mol/L NaCl, 3 mmol/L EDTA）］をアナライトとして、それぞれ薄い濃度から順に流して測定した。
その結果、ＬＰＳとの結合力［解離定数平均値（Ｋｄ）］は、Ｂｐ、Ｋｐ、Ｅｃでは１０^−８であり、Ｖｃでは１０^−８〜１０^−９であり、Ｐａでは１０^−１１〜１０^−１２であり、ＬＰＳがいずれの場合であってもＫｄ＝１０^−８オーダとＬＰＳに強く結合することが確認された。

《実施例１１：Ｌｉ５−０２５による各種ＬＰＳとの吸着能評価（バッチ法による）》
実施例１０で用いたのと同じペプチド（Ｌｉ５−０２５）と各種ＬＰＳを用いて、ペプチドLi5-025とそれぞれのＬＰＳとの吸着能をバッチ法にて測定すると共に、ポリミキシンＢ（ＰＭＢ）とも比較した。なお、下記に記載した緩衝液、蒸留水、実験器具等は特に記載しない限り、全てエンドトキシンフリーのものを用いた。

（１）ペプチドの固定化方法
酸塩化物が結合しているシリカゲル（Propionyl chloride functionalized silica gel 200-400 mesh（シグマ・アルドリッチ社製）（以下、ビーズ担体と称する）に溶媒を加えて反応させ、最終的にＣ末端のシステインのチオール基を利用し、共有結合にてペプチドＬｉ５−０２５を固定化した。
具体的には、先ず、ビーズ担体（0.2 g）を量り取り、乾熱滅菌試験管に移し替えた。そこに２−ヨードエタノール（和光純薬社製）（0.4 mL）を加え、ビーズ担体と結合している酸塩化物とヨードエタノールの水酸基を反応させ共有結合させた。その際に副生成物として、塩化水素（HCl）が発生するので、ヨードエタノールが反応し副反応が起こるのを防ぐため、ピリジン（和光純薬社製）（アミン塩基を含むもの）（40 μL）を加え混ぜた。これをパラフィルムで覆い、よく混ぜた後、穏やかに攪拌しながら、室温で４時間反応させた。
これをエコノカラム（BIO-RAD社製）に移し代え、蒸留水でよく洗浄した後、カップリングバッファー（50 mmol/L Tris-HCl, 5 mmol/L EDTA・2Na, pH 8.5）で平衡化した。それに、Ｌｉ５−０２５（2 mg/mL）となるようにカップリングバッファーに溶解したペプチド溶液（1 mL）を加え混ぜ、穏やかに攪拌しながら、室温で６時間放置した。なお、ペプチド固定化後溶液を用いて、ＳＨ基定量試薬（Ellman’s Reagent；PIERCE社製）にてペプチド固定化量を定量した。
Ｌｉ５−０２５固定化後、未反応のペプチドを洗い流すため、蒸留水でビーズ担体を洗浄し、更に、カップリングバッファーにて平衡化した。一方で、２−メルカプトエタノール（関東化学社製）を１００ｍｍｏｌ／Ｌとなるように、カップリングバッファーで溶解し、ブロッキングバッファーを作成した。それを、平衡化したビーズ担体に加え混ぜ、穏やかに攪拌しながら室温で３時間以上放置し、非特異的吸着を防ぐためのブロッキングを行なった。
ブロッキング後、蒸留水で良く洗浄し、未反応のメルカプトエタノールを取り除いた。その後、ＰＢＳで平衡化し、ビーズ担体をカラムからリムルス試験管（スクリューキャップ付き）（第一化学薬品社製）に移し変え、使用するまで４℃で保存した。

（２）ポリミキシンＢ（ＰＭＢ）の固定化方法
酸塩化物が結合しているシリカゲル（Propionyl chloride functionalized silica gel 200-400 mesh；シグマ・アルドリッチ社製）（以下、ビーズ担体と称する）に溶媒を加え反応させ、最終的にアミノ基を利用して共有結合にてＰＭＢを固定化した。
具体的には、先ず、ビーズ担体（0.2 g）を量り取り、乾熱滅菌した試験管に移し変えた。そこに蒸留水（H₂O）を加え混ぜ、パラフィルムで覆い、室温で穏やかに攪拌しながら、気泡がなくなるまで放置し、ビーズ担体に結合している酸塩化物と水とを反応させ、共有結合によって、塩素部分を水酸基（-OH）に置換した。
試験管中の気泡が無くなったことを確認してから、エコノカラム（BIO-RAD社製）に移し代え、蒸留水で洗浄した。その後、0.1 mol/L NaHCO₃ バッファー（pH 8.0）で平衡化した。それに、ＥＤＣ［1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride］とＮＨＳ（N-hydroxysuccinimide）を加え混ぜ、室温で１時間反応させた。反応後、カラム内の溶液を排出し、0.1 mol/L NaHCO₃ バッファーを流した。そこに、ＰＭＢ（2 mg/mL）となるように0.1 mol/L NaHCO₃ バッファーに溶解したＰＭＢ溶液（1 mL）を加え混ぜ、穏やかに攪拌しながら、室温で６時間放置した。なお、ＰＭＢ固定化後溶液を用いて、アミノ基定量キット（CBQCA Protein Quantitation Kit；Molecular Probes社製）にてＰＭＢの固定化量を定量した。
ＰＭＢ固定化後、未反応のＰＭＢを洗い流すため、蒸留水でビーズ担体を洗浄した。その後、更に0.1 mol/L NaHCO₃ バッファーにて平衡化した。一方で、アミンエタノール（和光純薬社製）を１．０ｍｏｌ／Ｌとなるように、蒸留水で溶解し、塩酸でｐＨ８．５に調整し、ブロッキングバッファーを作成した。ブロッキングバッファー（3 mL）をビーズ担体に加え混ぜ、穏やかに攪拌しながら室温で３時間以上放置し、非特異的吸着を防ぐためのブロッキングを行なった。
ブロッキング後、蒸留水で良く洗浄し、未反応のエタノールアミンを除去した。その後、ＰＢＳで平衡化し、ビーズ担体をカラムからリムルス試験管（スクリューキャップ付き）（第一化学薬品社製）に移し代え、使用するまで４℃で保存した。

（３）コントロール（なにも固定化していないビーズ担体のみのもの）の作製方法
コントロールは、前記項目（１）に記載のＬｉ５−０２５固定化法におけるブロッキング処理のみを行うことにより、メルカプトエタノールで完全ブロッキングしたものをコントロールとした。

（４）ＬＰＳ（エンドトキシン）吸着能試験及びサンプル回収方法
ＬＰＳ溶液を作成し、ペプチド（又はＰＭＢ）固定化ビーズ担体と混合させ、時間を追ってサンプルを回収し、測定用のサンプルを準備した。
具体的には、先ず、各固定化又はブロッキングビーズ担体の分散溶液（上清）を完全に取り除いた。一方で、それぞれのＬＰＳをＰＢＳで溶解し、５００ｎｇ／ｍＬとなるように調整し、ＬＰＳ溶液を作成した。このＬＰＳ溶液（0.8 mL）をビーズ担体によく混合させた後、２００μＬを回収し、別の新しい乾熱滅菌試験管に移し代えた。回収したサンプルは直ちに、卓上遠心器で数秒遠心し、ビーズを沈殿させ、上澄みを新しい乾熱滅菌試験管に移し代えた。一方、サンプル回収後のビーズ溶液は、溶液と良く混ぜ、穏やかに攪拌しながら、室温でインキュベートした。経時的に同様の方法でサンプリングした。

（５）エンドトキシン量の定量
回収したサンプル中のエンドトキシン量を、市販の測定キット（エンドスペシー ES-50Mセット；生化学工業社製）にて測定し、ＬＰＳ吸着能力を確認した。
具体的には、先に回収したサンプルを蒸留水にて希釈した（この希釈は、エンドスペシーの定量範囲内のレンジに定まるよう希釈した）。これをトキシペット プレート ポリスチレン製96 well（Et Free）（生化学工業社製）に５０μｌ／ｗｅｌｌずつ入れた。次に、エンドスペシーES-50Mセットを準備した。キット中のライセート試薬（１本）に、キット添付の緩衝液１本（全量）を加え、泡立てないように５分間手で振って溶解した。これを、サンプル添加ウェルに５０μＬ／ｗｅｌｌずつ添加し、よく混合させた。その後、３７℃で穏やかに攪拌しながら３０分間インキュベートした。
その後、吸光光度計（ARVO；wallac社製）にて、４０５ｎｍの吸光度を測定した。またその際に、検量線を作成し、近似直線の方程式からＬＰＳ濃度を算出した。

結果を表１０に示す。この表１０において、各記号Ｂｐ、Ｖｃ、Ｋｐ、Ｅｃは、それぞれ、Bordetella pertussis、Vibrio cholerae serotype Inaba 569B、Klebsiella pneumoniae、Escherichia coli O111:B4を意味する。
コントロールは混ぜてから直ぐのＬＰＳ量と、６０分後のＬＰＳの濃度が変わらずほぼ一定なのに対し、Ｌｉ５−０２５固定化ビーズ担体では、それぞれのＬＰＳにおいてＬＰＳ濃度が有意に低下し、ＬＰＳ吸着作用が認められた。ＰＭＢと比較してもＬＰＳ除去効率が高いことが示された。
Li5-025固定化ビーズ担体を用いたＢｐ（Bordetella pertussis）吸着試験では、５００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳを９５％以上吸着させた。また、Ｖｃ（Vibrio cholerae serotype Inaba 569B）では９０％以上、Ｋｐ（Klebsiella pneumoniae）では５０％以上（最大８０％程度）、Ｐａ（Pseudomonas aeruginosa Serotype 10）では９５％以上、Ｅｃ（Escherichia coli O111:B4）では９５％以上と、様々な種類のＬＰＳに対して高い吸着能を持つことが示された。
同時に測定したＰＭＢは、Ｂｐ吸着試験では、５００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳを９５％以上、Ｖｃでは６０％以上、ＫｐやＰａでは吸着能が殆ど見られないなど、ＬＰＳの種類によって吸着能に大きく差のあることが示された。

《実施例１２：Ｌｉ５−０２５固定化ビーズによる低濃度ＬＰＳ吸着能評価（バッチ法による）》
実施例１１と同様の方法により作製したペプチドＬｉ５−０２５（又はＰＭＢ）固定化ビーズ担体を用い、これらに１ＥＵ／ｍＬと低い濃度のＬＰＳ溶液（1 mL）を加え混ぜ、バッチ法を行うことにより低濃度のＬＰＳ吸着能について確認した。ＬＰＳとしては、Escherichia coli O113：H10由来のものを使用した。バッチの測定方法は実施例１０に準じた。
結果を表１１に示す。コントロールのＬＰＳ濃度は最後まで低下しなかったのに対し、Ｌｉ５−０２５又はＰＭＢ固定化ビーズは最終的に１ＥＵ／ｍＬのＬＰＳを７０％以上吸着し、０．３ＥＵ／ｍＬ以下にすることが示された。オープンカラム法で測定することにより、更に低濃度まで除去することができると期待される。

《実施例１３：Ｌｉ５−０２５固定化ビーズによる１％ＢＳＡ溶液中でのＬＰＳ吸着能評価（バッチ法による）》
実施例１１と同様の方法により作製したペプチドＬｉ５−０２５（又はＰＭＢ）固定化ビーズ担体を用い、これらに１％ＢＳＡ溶液（ＬＰＳ濃度＝500 ng/mL）１ｍＬを加え混ぜ、バッチ法を行うことにより１％ＢＳＡ溶液中でのＬＰＳ吸着能について調べた。ＬＰＳとしては、Escherichia coli O111:B4由来のものを使用した。バッチ法の基本的な流れは実施例１０に準じた。
結果を表１２に示す。１％ＢＳＡ共存下において、５００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳを６０％以上吸着することが示された。以前に実施済みのペプチド固定化濃度依存試験（例えば、実施例３−３）の結果から、ペプチドの固定化量を増やすことによって、ＬＰＳ吸着能を高めることが可能であると考えられる。

《実施例１４：ポリリジン類似ペプチドとＬｉ５−０２５を用いたＬＰＳ吸着能の比較（バッチ法による）》
ＬＰＳ結合体として既存品であるポリリジンと、Ｌｉ５−０２５（又はＰＭＢ）を比較するため、ポリリジン類似ペプチドとして、
ペプチドＫ７Ｃ：ＫＫＫＫＫＫＫＣ（配列番号１２４）
をシグマ社にて合成した。実施例１１と同様の方法にて作製したペプチド（又はＰＭＢ）固定化ビーズ担体に１０ｎｇ／ｍＬ濃度のＬＰＳ溶液２ｍＬを加え混ぜ、バッチ法にてＬＰＳ吸着能を確認し、比較した。ＬＰＳとしては、Escherichia coli O111:B4由来のものを使用した。基本的な操作は実施例１１に準じて行なった。
結果を表１３に示す。Ｌｉ５−０２５は約９０％程度、ＰＭＢは６５％程度、Ｋ７Ｃは約２０％程度のＬＰＳ吸着能であり、ポリリジンのＬＰＳ吸着能は低いことが示された。

《実施例１５：Ｌｉ５−０２５とその誘導体を用いたＬＰＳ吸着能評価（１）（バッチ法による）》
本実施例では、表１４に示すＬｉ５−０２５とその誘導体を用い、バッチ法にてＬＰＳ吸着能を比較した。
具体的には、基本的な操作は実施例１１と同様に行なった。また、添加ＬＰＳ溶液は、ＬＰＳ濃度５００ｎｇ／ｍＬ（０．８ｍＬ）を使用した。ＬＰＳとしては、Escherichia coli O111:B4由来のものを使用した。

［アミノ酸配列中、小文字で示すアミノ酸（ｋ、ｃ）は、Ｄ体アミノ酸であることを示す］

得られた結果の一部を表１５に示す。Ｌｉ５−０２５のＬＰＳ吸着能は５００ｎｇ／ｍＬ濃度のＬＰＳを９５％以上吸着し、Ｌｉ５−０３２では約８５％程度、Ｌｉ５−０２９及びＬｉ５−０３０は約７５％程度の吸着能であり、Ｌｉ５−０２５が最も高いＬＰＳ吸着能を持つことが示された。

《実施例１６：Ｌｉ５−０２５とその誘導体を用いたＬＰＳ吸着能評価（２）（バッチ法による）》
本実施例では、表１６に示すＬｉ５−０２５とその誘導体を用い、バッチ法にてＬＰＳ吸着能を比較した。
具体的には、基本的な操作は実施例１１と同様に行なった。また、添加ＬＰＳ溶液は、ＬＰＳ濃度１０ｎｇ／ｍＬ（２．０ｍＬ）を使用した。ＬＰＳとしては、Escherichia coli O111:B4由来のものを使用した。

［アミノ酸配列中、小文字で示すアミノ酸（ｋ、ｃ）は、Ｄ体アミノ酸であることを示す］

結果を表１７に示す。その結果、Ｌｉ５−Ｉ６Ｆ Ｉ９Ｆは約７５％程度のＬＰＳ吸着能であり、その他のＬｉ５−０２５、Ｌｉ５−Ｉ６Ｆ、Ｌｉ５−Ｉ９Ｆについては１０ｎｇ／ｍＬ濃度のＬＰＳをほぼ１００％近く吸着し、とても強いＬＰＳ吸着作用が認められた。

《実施例１７：Ｌｉ５−０２５固定化カラムによるＬＰＳ除去効率評価（１）（オープンカラム法による）》
Ｌｉ５−０２５固定化カラムを作製し、オープンカラム法によりＬＰＳ除去効率について確認した。同時に、ＰＭＢ固定化カラムや何も固定化していないカラムを作製し、ＬＰＳ除去効率を比較した。
具体的には実施例１１と同様の方法でペプチド（又はＰＭＢ）を固定化したカラムを作製し、そのカラム上部から１０ｎｇ／ｍＬ濃度のＬＰＳ溶液７ｍＬを通流し、カラム下部から溶出されたＬＰＳを０．４ｍＬずつ回収し、その検体中に含まれるＬＰＳ量を定量することにより、ＬＰＳ除去効率を評価した。カラム条件は以下の通りである。
カラム：エコノカラム（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）
カタログ番号７３７−０５１６、内径０．５ｃｍ、
長さ１５ｃｍ、底面積０．２ｃｍ^２
カラムビーズ：Ｓｉ−アシッドクロライドビーズ（Si-Acid Chloride beads）
（０．８ｇ）
（カラム容量＝１．２ｍＬ）
リガンド：ペプチドＬｉ５−０２５又はＰＭＢ（８ｍｇ）
エンドトキシン：ＬＰＳ（E.coli O111:B4）
エンドトキシン溶液：１０ｎｇ／ｍＬ（７ｍＬ）
保持容量：０．４ｍＬ
流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ

その結果、コントロールはすぐ飽和状態に達してしまったのに対し、Ｌｉ５−０２５固定化カラムは１０ｎｇ／ｍＬ濃度のＬＰＳを０．１ｎｇ／ｍＬ以下まで除去することが示された。その除去効率は、ＬＰＳ溶液を流している間、０．１ｎｇ／ｍＬ以下を保持し続けた。また、ＰＭＢ固定化カラムのＬＰＳ除去効率は約５０％程度であった。

《実施例１８：Ｌｉ５−０２５固定化カラムによる低濃度ＬＰＳ除去効率評価（２）（オープンカラム法による）》
Ｌｉ５−０２５固定化カラムを作製し、オープンカラム法により低濃度のＬＰＳ除去効率について確認した。同時に、ＰＭＢ固定化カラムや何も固定化していないカラムを作製し、ＬＰＳ除去効率を比較した。
具体的には実施例１１と同様の方法でペプチド（又はＰＭＢ）を固定化したカラムを作製し、そのカラム上部から２ＥＵ／ｍＬ濃度のＬＰＳ溶液７ｍＬを通流し、カラム下部から溶出されたＬＰＳを０．４ｍＬずつ回収し、その検体中に含まれるＬＰＳ量を定量することにより、低濃度のＬＰＳ除去効率を評価した。カラム条件は以下の通りである。
≪カラム条件≫
カラム：エコノカラム（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）
カタログ番号７３７−０５１６、内径０．５ｃｍ、
長さ１５ｃｍ、底面積０．２ｃｍ^２
カラムビーズ：Ｓｉ−アシッドクロライドビーズ（Si-Acid Chloride beads）
（０．８ｇ）
（カラム容量＝１．２ｍＬ）
リガンド：ペプチドＬｉ５−０２５又はＰＭＢ（８ｍｇ）
エンドトキシン：ＵＳＰ ＲＳＥ（LPS E.coli O113:H10菌株由；生化学工業社製）
エンドトキシン溶液：２ＥＵ／ｍＬ（７ｍＬ）
保持容量：０．４ｍＬ
流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ

その結果、コントロールはすぐ飽和状態に達してしまったのに対し、Ｌｉ５−０２５固定化カラムは２ＥＵ／ｍＬの低濃度のＬＰＳを０．０５ＥＵ／ｍＬ以下まで吸着除去し、低濃度のＬＰＳでも更に除去できることが示唆された。また、ＰＭＢ固定化カラムのＬＰＳ除去効率は約６０％程度であった。

《実施例１９：Ｌｉ５−０２５固定化カラムによる１％ＢＳＡ溶液中でのＬＰＳ除去効率評価（３）（オープンカラム法による）》
Ｌｉ５−０２５固定化カラムを作製し、オープンカラム法により１％ＢＳＡ溶液中のＬＰＳ除去効率について確認した。同時に、ＰＭＢ固定化カラムや何も固定化していないカラムを作製し、ＬＰＳ除去効率を比較した。
具体的には実施例１１と同様の方法でペプチド（又はＰＭＢ）を固定化したカラムを作製し、そのカラム上部から１％ＢＳＡ溶液（ＬＰＳ濃度１０ｎｇ／ｍＬ）７ｍＬを通流し、カラム下部から溶出されたＬＰＳを０．４ｍＬずつ回収し、その検体中に含まれるＬＰＳ量を定量することにより、１％ＢＳＡ溶液中のＬＰＳ除去効率を評価した。カラム条件は以下の通りである。
カラム：エコノカラム（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）
カタログ番号７３７−０５１６、内径０．５ｃｍ、
長さ１５ｃｍ、底面積０．２ｃｍ^２
カラムビーズ：Ｓｉ−アシッドクロライドビーズ（Si-Acid Chloride beads）
（０．８ｇ）
（カラム容量＝１．２ｍＬ）
リガンド：ペプチドＬｉ５−０２５又はＰＭＢ（８ｍｇ）
エンドトキシン：ＬＰＳ（E.coli O111:B4）
エンドトキシン溶液：１０ｎｇ／ｍＬ（７ｍＬ）
保持容量：０．４ｍＬ
流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ

その結果、コントロールはすぐ飽和状態に達してしまったのに対し、Ｌｉ５−０２５固定化カラムは１％ＢＳＡ溶液中に混在する１０ｎｇ／ｍＬのＬＰＳを約４０％程度除去することが示された。また、ＰＭＢ固定化カラムのＬＰＳ除去効率はコントロールと同じ範囲内であり、ＬＰＳ除去能が殆ど見られなかった。シリカビーズを用いたＰＭＢ固定化カラムでは他のタンパク質共存下条件において、ＬＰＳ除去効率が発揮されないと考えられる。

《実施例２０：Ｌｉ５−０２５固定化カラムによる１％ＢＳＡ溶液中でのＬＰＳ除去効率評価（４）（ペプチド固定化濃度依存性評価）（オープンカラム法による）》
ペプチドの固定化量を増やしたカラムを用いて実施例１９と同様の試験を行ない、１％ＢＳＡ溶液中のＬＰＳ除去能を測定することにより、ペプチド固定化濃度依存性について評価した。ペプチド固定化量を８ｍｇから２４ｍｇに変えたこと以外は、実施例１９と同様の条件で行なった。
その結果、コントロールはすぐ飽和状態に達してしまったのに対し、Ｌｉ５−０２５固定化カラムは１％ＢＳＡ溶液中に混在する１０ｎｇ／ｍＬのＬＰＳを約９０％以上除去し、ペプチドの固定化量を増加することによりＬＰＳ除去効率が増すことが示唆された。また、ＰＭＢ固定化カラムは実施例１９と同様、ＬＰＳ除去能が殆ど確認されなかった。

《実施例２１：ファインチューニングしたペプチドを用いたＬＰＳ中和能評価》
Ｌｉ５−００１をファインチューニングした、表１８に示すペプチド３種をシグマジェノシスにて合成し、ＬＰＳの中和能について評価した。上記ペプチドとＬＰＳを混ぜ、その後のＬＰＳ量を測定することにより、ＬＰＳの中和能について評価した。ＰＭＢをポジティブコントロールとし、比較した。なお、下記に記載した緩衝液、蒸留水、実験器具等は、特に記載しない限り、全てエンドトキシンフリーのものを用いた。

［アミノ酸配列中、小文字で示すアミノ酸（ｋ、ｃ）は、Ｄ体アミノ酸であることを示す。また、ペプチドＷｉｎｅ ＯｐｅｎｅｒのＣ末端のＬ（ロイシン）はアミド化されている］

具体的には、先ず、それぞれのペプチド（又はＰＭＢ）を蒸留水で溶解し、１ｍｇ／ｍＬの濃度に調製した。それらを蒸留水で１０倍希釈し、１ｎｇ／ｍＬまでの１０希釈系列を作製した。それらに終濃度１ＥＵ／ｍＬとなるようにＬＰＳ（USP Reference Standard Endotoxin、E.coli O113:H10株由来；生化学工業社）を加えまぜ、穏やかに攪拌しながら室温で３０分インキュベートした。その後、検体中のＬＰＳ量を、市販の測定キット（エンドスペシー ES-50Mセット；生化学工業社）にて測定した。
その結果、どのペプチドも濃度依存的な中和能が確認され、１００μｇ／ｍＬで１ＥＵ／ｍＬのＬＰＳを７０％以上中和することが示された。中でもペプチドＷｉｎｅ Ｏｐｅｎｅｒは１００ｎｇ／ｍＬで８７％以上の中和能を示し、ＰＭＢより１００倍程度強い中和能を持つことが示された。

《実施例２２：Ｌｉ５−０２５を用いたＬＰＳ検出感度（ビアコアシステムによる）》
本実施例では、Ｌｉ５−０２５によるＬＰＳ測定感度についてビアコア（BIAOCORE）システム（BIACORE 2000; BIACORE社）を用いて確認し、表面プラズモン共鳴法によるＬＰＳ検出法を検討した。
具体的には、センサーチップ（BIACORE Sensor Chip CM5; BIACORE社）のフローセル（以下、Ｆｃと称する）２に固定化量２７１ＲＵ、Ｆｃ３に８４３ＲＵのＬｉ５−０２５をチオールカップリングにて固定化した。コントロールとして、Ｆｃ１にシステインを固定化した。
前記センサーチップに対し、濃度の異なるＬＰＳ（E.coli K12株）［濃度＝10 ng/mL, 100 ng/mL, 1000 ng/mL；緩衝用ＨＢＳバッファー（0.01 mol/L HEPES, pH 7.4, 0.15 mol/L NaCl, 3 mmol/L EDTA）］をアナライトとして、それぞれ薄い濃度から順に流して測定した。
その結果、Ｆｃ２で検出されたシグナルは、１０ｎｇ／ｍＬでは１．７ＲＵ、１００ｎｇ／ｍＬでは２ＲＵ、１０００ｎｇ／ｍＬでは３．３ＲＵが測定され、感度として１０ｎｇ／ｍＬ程度であることが示された。また、Ｆｃ３においては１０ｎｇ／ｍＬで３．２ＲＵが検出され、Ｌｉ５−０２５のチップ固定化量依存性も示された。

《実施例２３：蛍光標識Ｌｉ５−０２５によるグラム陰性菌の染色》
Ｌｉ５−０２５にフルオレセインを融合し、グラム陰性菌の染色を試みた。
蛍光標識ペプチドは、Ｌｉ５−０２５のＣ末端のシステインのＳＨ基を利用してフルオレセインを融合することにより調製した。菌としては、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）及び乳酸菌（Lactobacillus casei）を用いた。それぞれ液体培地にて充分に増殖させた後、純水で１００倍希釈し混合してスライドガラスに塗布した。乾燥後、１００％エタノールを滴下し、エタノール固定を行なった。
固定化後、１μｇ／ｍＬのＬｉ５−０２５フルオレセインを滴下し、１５分間遮光して室温でインキュベートした。純水で洗浄後、蛍光顕微鏡にて観察した。
グラム陰性菌である緑膿菌が強く蛍光染色され、グラム染色の代替法となることが示された。

《実施例２４：Ｌｉ５−０２５固定化カラムを用いた血中エンドトキシン除去》
Ｌｉ５−０２５を固定化［０．８ｇのビーズ（Si-Acid Chloride）に８ｍｇのペプチド又はＰＭＢを固定化）したカラムを用い、全血でのエンドトキシン除去効果をオープンカラムにて比較した。なお、コントロールは何も固定化していない、ブロッキングのみのビーズを用いた。
方法としては、ＬＰＳ濃度２ｎｇ／ｍＬとなるようにヒト全血に溶解し、５ｍＬ流し、溶出された全血を新しい全血＋ＲＰＭＩ培地に加え、３７℃で４時間インキュベートした。評価はＬＰＳによるＴＮＦα誘導量によって行なった。全血は３名の静脈から採取し、１０ｕｎｉｔｓのヘパリンと混合した。
ＬＰＳ（エンドトキシン）はＴＮＦαの発現を誘導するため、ＴＮＦαの誘導量によって、ＬＰＳの吸着能を間接的に評価することができる。

誘導されたＴＮＦαの値を表１９に示す。コントロールに比べ、Ｌｉ５−０２５固定化ビーズを通流した血液は、ＴＮＦαの誘導量が低下しており、カラムによってＬＰＳが除去されたことを示唆する。

《実施例２５：Ｌｉ５−０２５誘導体による敗血症治療及び予防効果》
Ｌｉ５−０２５誘導体として、実施例２１で合成したペプチドＷｉｎｅ Ｏｐｅｎｅｒ（以下、ペプチドＷＯと称する）を用い、マウスエンドトキシン血症モデルに対する治療・予防効果を評価した。
マウスはＣ３Ｈ／ＨｅＮを用いた。投与方法は以下の通りである。また、それぞれのグループは８匹で構成されている。
グループＡ：コントロール。マウスに生理食塩水を静脈注射し、３０分後に再度静脈注射。
グループＢ：生理食塩水を静脈注射後、３０分後にペプチドＷＯを１０ｍｇ／ｋｇを静脈投与。
グループＣ：２ｍｇ／ｋｇのＬＰＳを静脈投与後、３０分後に生理食塩水を静脈投与。
グループＥ：２ｍｇ／ｋｇのＬＰＳを静脈投与後、３０分後にペプチドＷＯを１０ｍｇ／ｋｇを静脈投与。
グループＧ：２ｍｇ／ｋｇのＬＰＳと１０ｍｇ／ｋｇのペプチドＷＯを混合後に静脈投与。

評価は敗血症性ショックによって誘導される体重減少を投与前体重との比で示した。３日目、６日目の体重減少量（比）を表２０に示す。表２０において、数値は平均減少量（投与前との体重比）を示し、括弧内はグループの平均からの解離の上限と下限を示した。

表２０に示す通り、ＬＰＳのみ投与群（Ｃ）ではコントロール（Ａ）と比較し、３日目、６日目共に有意な体重減少が見られた。またＬＰＳ投与後３０分後にＷＯを投与した群（Ｅ）では、１日目まではグループＣと同様の体重減少が見られたが、３日目、６日目では有意に回復が見られた。また、ＬＰＳとＷＯの混合投与群（Ｇ）では有意な体重減少は見られず、ＷＯには予防的な効果も見られることが示された。
また、グループＢのペプチドのみ投与群ではコントロール（グループＡ）と比較し、有意な体重減少は見られず、ペプチド単独の体重に影響する短期毒性は見られなかった（表には示さず）。

本発明のリポ多糖及び／又はリピッドＡ結合剤は、例えば、リポ多糖及び／又はリピッドＡ除去、あるいは、リポ多糖及び／又はリピッドＡ中和の用途に適用することができる。

配列表の配列番号１〜１２４の配列で表される各アミノ酸配列は、リポ多糖及び／又はリピッドＡ結合ペプチドである。
配列表の配列番号１２５の配列で表されるアミノ酸配列は、マーカー配列である。
配列表の配列番号１、１６、２４、３０の配列で表される各アミノ酸配列における１番目及び１１番目の各アミノ酸「Xaa」は、それぞれ独立に、リジン、アルギニン、又はヒスチジンを意味する。
配列表の配列番号２、５、２０〜２３、２５〜２９、７１〜７４、７６〜８０の配列で表される各アミノ酸配列における１番目のアミノ酸「Xaa」は、リジン、アルギニン、又はヒスチジンを意味する。
配列表の配列番号３、５４〜５６の配列で表される各アミノ酸配列における１番目及び１１番目の各アミノ酸「Xaa」は、それぞれ独立に、リジン、アルギニン、又はヒスチジンを意味し、２番目〜１０番目の各アミノ酸「Xaa」は、それぞれ独立に、任意のアミノ酸を意味する。
配列表の配列番号４、６７、７５、８１、８２の配列で表される各アミノ酸配列における１番目及び１０番目の各アミノ酸「Xaa」は、それぞれ独立に、リジン、アルギニン、又はヒスチジンを意味する。
配列表の配列番号６、１０６〜１０８の配列で表される各アミノ酸配列における１番目及び１０番目の各アミノ酸「Xaa」は、それぞれ独立に、リジン、アルギニン、又はヒスチジンを意味し、２番目〜９番目の各アミノ酸「Xaa」は、それぞれ独立に、任意のアミノ酸を意味する。
配列表の配列番号３６、３７、４３、４４の配列で表される各アミノ酸配列における１０番目のアミノ酸「Xaa」は、リジン、アルギニン、又はヒスチジンを意味する。
配列表の配列番号４５〜５３の配列で表される各アミノ酸配列における２番目〜１０番目の各アミノ酸「Xaa」は、それぞれ独立に、任意のアミノ酸を意味する。
配列表の配列番号８８、８９、９５、９６の配列で表される各アミノ酸配列における９番目のアミノ酸「Xaa」は、リジン、アルギニン、又はヒスチジンを意味する。
配列表の配列番号９７〜１０５の配列で表される各アミノ酸配列における２番目〜９番目の各アミノ酸「Xaa」は、それぞれ独立に、任意のアミノ酸を意味する。

Claims (19)

1. 配列番号４又は配列番号１で表されるアミノ酸配列、あるいは、前記アミノ酸配列において１個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列（但し、配列番号４又は配列番号１におけるＮ末端の塩基性アミノ酸が欠失した場合を除く）、あるいは、配列番号１で表されるアミノ酸配列においてＣ末端の２個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号１１０で表されるアミノ酸配列からなるペプチドと同じ又は優れたリポ多糖及び／又はリピッドＡ結合活性を示すペプチド、あるいは、その誘導体（但し、前記リポ多糖及び／又はリピッドＡ結合活性を示し、且つ、ペプチドの安定性を向上させる修飾を施した誘導体であって、前記修飾が、Ｌ体アミノ酸のＤ体化、Ｎ末アミノ基のアセチル化、Ｃ末端カルボキシル基のアミド化、天然型アミノ酸から、性質の類似した非天然型アミノ酸への置換、又はこれらの組合せである、前記誘導体に限る）を有効成分として含む、リポ多糖及び／又はリピッドＡ結合剤。
2. 前記誘導体が
   アミノ酸配列：ｋＹＳＳＳＩＳＳＩＲＧＧＬＬＬＬＬＬＬ
   （アミノ酸配列中、小文字で示すアミノ酸（ｋ）はＤ体アミノ酸であることを示し、Ｃ末端のＬ（ロイシン）はアミド化されている）
   からなる、請求項１に記載のリポ多糖及び／又はリピッドＡ結合剤。
3. 請求項１又は２に記載のペプチド又はその誘導体を有効成分として含む、リポ多糖及び／又はリピッドＡ除去剤。
4. 請求項１又は２に記載のペプチド若しくはその誘導体、前記ペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを有効成分として含む、リポ多糖及び／又はリピッドＡ中和剤。
5. 請求項１又は２に記載のペプチド若しくはその誘導体を有効成分として含む、敗血症治療剤。
6. 請求項１又は２に記載のペプチド又はその誘導体と、リポ多糖及び／又はリピッドＡとを接触させる工程を含む、リポ多糖及び／又はリピッドＡの結合方法。
7. リポ多糖及び／又はリピッドＡを含む可能性のある処理対象と、請求項１又は２に記載のペプチド又はその誘導体とを接触させる工程、及びリポ多糖及び／又はリピッドＡと複合体を形成した前記ペプチド又は誘導体と、前記処理対象とを分離する工程を含む、リポ多糖及び／又はリピッドＡの除去方法。
8. 請求項１又は２に記載のペプチド若しくはその誘導体、前記ペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを、リポ多糖及び／又はリピッドＡ中和の必要な対象（但し、ヒトを除く）に、有効量で投与することを含む、リポ多糖及び／又はリピッドＡ中和方法。
9. 請求項１又は２に記載のペプチド若しくはその誘導体を、敗血症治療の必要な対象（但し、ヒトを除く）に、有効量で投与することを含む、敗血症治療方法。
10. 請求項１又は２に記載のペプチド又はその誘導体の、リポ多糖及び／又はリピッドＡ中和剤を製造するための使用。
11. 請求項１又は２に記載のペプチド又はその誘導体の、リポ多糖及び／又はリピッドＡ除去剤を製造するための使用。
12. 請求項１又は２に記載のペプチド若しくはその誘導体、前記ペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターの、リポ多糖及び／又はリピッドＡ中和剤を製造するための使用。
13. 請求項１又は２に記載のペプチド若しくはその誘導体の、敗血症治療剤を製造するための使用。
14. アミノ酸配列：ｋＹＳＳＳＩＳＳＩＲＧＧＬＬＬＬＬＬＬ
    （アミノ酸配列中、小文字で示すアミノ酸（ｋ）はＤ体アミノ酸であることを示し、Ｃ末端のＬ（ロイシン）はアミド化されている）
    からなるペプチド誘導体。
15. 請求項１４に記載のペプチド誘導体と、薬剤学的若しくは獣医学的に許容することのできる通常の担体又は希釈剤とを含む、医薬組成物。
16. 請求項１又は２に記載のペプチド又はその誘導体を用いることを特徴とする、リポ多糖及び／又はリピッドＡの分析方法。
17. リポ多糖及び／又はリピッドＡを含む可能性のある被検試料と、請求項１又は２に記載のペプチド又はその誘導体とを接触させる工程、前記ペプチド又は誘導体に結合したリポ多糖及び／又はリピッドＡを分析する工程を含む、リポ多糖及び／又はリピッドＡの分析方法。
18. 請求項１又は２に記載のペプチド又はその誘導体を用いることを特徴とする、グラム陰性菌の分析方法。
19. グラム陰性菌を含む可能性のある被検試料と、請求項１又は２に記載のペプチド又はその誘導体とを接触させる工程、前記ペプチド又は誘導体に結合したグラム陰性菌を分析する工程を含む、グラム陰性菌の分析方法。