JP2690415B2 - 発熱性物質吸着体とそれを用いた発熱性物質の定量方法 - Google Patents
発熱性物質吸着体とそれを用いた発熱性物質の定量方法Info
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Description
【産業上の利用分野】本発明は、医療領域で極めて重要
な問題と考えられる、発熱性物質の定量方法に関する。
な問題と考えられる、発熱性物質の定量方法に関する。
【従来の技術】臨床医学の領域では注射剤に混入する不
純物により、静脈注射後に悪寒戦りつを伴う発熱がある
ことは、好ましいことではない。それ故に注射剤の製造
工程では、これらの悪寒戦りつを伴う発熱性物質の混入
を防止することは、極めて重要である。また、製造され
た注射剤が発熱性物質を含有しないことを確認すること
も極めて重要なことである。ウサギを用いてin vivoで
発熱性物質の有無を検出する試験を発熱性物質試験とい
う。近年、ウサギを用いた発熱性物質試験に代わり、カ
ブトガニの血球成分を用いたin vitroのリムルス試験
（Limulus test）が汎用されるようになっている。日本
ではリムルス試験に用いられるカブトガニの血球成分に
標準規格が定められておらず、また、抽出成分の純度
や、反応試薬中に存在する反応阻害物質の問題等、克服
すべき問題が多い。
純物により、静脈注射後に悪寒戦りつを伴う発熱がある
ことは、好ましいことではない。それ故に注射剤の製造
工程では、これらの悪寒戦りつを伴う発熱性物質の混入
を防止することは、極めて重要である。また、製造され
た注射剤が発熱性物質を含有しないことを確認すること
も極めて重要なことである。ウサギを用いてin vivoで
発熱性物質の有無を検出する試験を発熱性物質試験とい
う。近年、ウサギを用いた発熱性物質試験に代わり、カ
ブトガニの血球成分を用いたin vitroのリムルス試験
（Limulus test）が汎用されるようになっている。日本
ではリムルス試験に用いられるカブトガニの血球成分に
標準規格が定められておらず、また、抽出成分の純度
や、反応試薬中に存在する反応阻害物質の問題等、克服
すべき問題が多い。
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は従来、
血液及び蛋白製剤を検査対象としたリムルス試験にもと
められた前処理、後処理の問題、リムルス試験の特異性
の欠如の問題（(１→３)-β-D-Glucan に対する非特異
反応の問題）を一挙に克服しようとするものである。即
ち、被検検体が血液または蛋白製剤である場合、従来の
リムルス試験では、検体中の非特異的なアミダーゼ活性
及びリムルス反応阻害物質（α2−プラスミンインヒビ
ター、アンチトロンビンＩＩＩ、α1−アンチトリプシ
ン）を除去する為、クロロホルム法、エーテル法、酸処
理法、アルカリ処理法等の前処理が必須であった。また
従来のリムルス試験では、被検検体がビリルビン等によ
り黄褐色に呈色していた場合、エンドトキシンの作用に
より、合成基室から最終的に遊離されるｐ−ニトロアニ
リンの吸収波長（４０５ｎｍ）と検体の黄褐色の吸収波
長（４００ｎｍ付近）が重なり合い、正確な値が得られ
なかった。この為 ｐ−ニトロアニリンを更にジアゾ化
し、黄褐色系色素の影響を除く必要があった。更に、従
来のリムルス試験では、カブトガニ血球抽出液全体を用
いている為、凝固因子の一つであるFactorGを介してエ
ンドトキシン以外の物質（(１→３)-β-D-Glucan、真菌
多糖、クレスチン、レンチナン、ザイモサン、セルロー
ス系血液透析膜の洗浄液等）に対しても反応するという
問題があった。この問題を解決する為には、カブトガニ
血球抽出液からFactorGを除去する操作が必要であっ
た。
血液及び蛋白製剤を検査対象としたリムルス試験にもと
められた前処理、後処理の問題、リムルス試験の特異性
の欠如の問題（(１→３)-β-D-Glucan に対する非特異
反応の問題）を一挙に克服しようとするものである。即
ち、被検検体が血液または蛋白製剤である場合、従来の
リムルス試験では、検体中の非特異的なアミダーゼ活性
及びリムルス反応阻害物質（α2−プラスミンインヒビ
ター、アンチトロンビンＩＩＩ、α1−アンチトリプシ
ン）を除去する為、クロロホルム法、エーテル法、酸処
理法、アルカリ処理法等の前処理が必須であった。また
従来のリムルス試験では、被検検体がビリルビン等によ
り黄褐色に呈色していた場合、エンドトキシンの作用に
より、合成基室から最終的に遊離されるｐ−ニトロアニ
リンの吸収波長（４０５ｎｍ）と検体の黄褐色の吸収波
長（４００ｎｍ付近）が重なり合い、正確な値が得られ
なかった。この為 ｐ−ニトロアニリンを更にジアゾ化
し、黄褐色系色素の影響を除く必要があった。更に、従
来のリムルス試験では、カブトガニ血球抽出液全体を用
いている為、凝固因子の一つであるFactorGを介してエ
ンドトキシン以外の物質（(１→３)-β-D-Glucan、真菌
多糖、クレスチン、レンチナン、ザイモサン、セルロー
ス系血液透析膜の洗浄液等）に対しても反応するという
問題があった。この問題を解決する為には、カブトガニ
血球抽出液からFactorGを除去する操作が必要であっ
た。
【課題を解決するための手段】本発明の発明者らは発熱
性物質の定量方法について鋭意検討した結果、 （１）容器、試験管、ビーズ、ボール、磁性粒子、チッ
プ、薄板、小片、薄膜、小棒、マイクロタイタープレー
ト、ストリップ及びろ紙ディスクからなる群から選ばれ
る器具であって、該器具上に、発熱性物質と結合しうる
アミノグリコシド系抗生物質（カスガマイシン、エディ
ン、ストレプトマイシン、カナマイシン、ネオマイシ
ン、パロモマイシン、ゲンタマイシン、スペクチノマイ
シン、アミカシン等）を固定化したゲル状の発熱性物質
吸着体が固相化されていることを特徴とする、発熱性物
質の定量に用いる器具、 （２）容器、試験管、ビーズ、ボール、磁性粒子、チッ
プ、薄板、小片、薄膜、小棒、マイクロタイタープレー
ト、ストリップ及びろ紙ディスクからなる群から選ばれ
る器具であって、該器具上に、発熱性物質と結合しうる
リガンドであるアミノグリコシド系抗生物質（カスガマ
イシン、エディン、ストレプトマイシン、カナマイシ
ン、ネオマイシン、パロモマイシン、ゲンタマイシン、
スペクチノマイシン、アミカシン等）を共有結合させた
反応性官能基が固相化されていることを特徴とする、発
熱性物質の定量に用いる器具、を用いて発熱性物質を吸
着した後、従来のリムルス試験で発熱性物質の定量を行
なう方法が、従来の難問を一挙に解決することを発見し
た。即ち、本発明に関わる器具を使用し、発熱性物質を
特異的に吸着した後、リムルス試験、或いは、放射イム
ノアッセイ法、非放射イムノアッセイ法等により、発熱
性物質を定量することにより、従来技術で不可欠であっ
た検体の前処理、後処理の必要が全く無くなるという利
点が生ずる。また、本発明に関わる器具が発熱性物質
（エンドトキシン）のみを特異的に吸着する為、カブト
ガニ血球注出液全体を用いてリムルス試験を行なっても
(１→３)-β-D-Glucan等に対する非特異反応に配慮する
必要はない。尚、上記反応性官能基としては、例えば-N
=CH-(CH2)n-CH=NH、-NH-(CH2)n-OH、-CO-(CH2)n-COOH、
-NH-(CH2)n-NH2、-N=CH-(CH2)n-COOH、-NH-(CH2)n-COO
H、-N=CH-(CH2)n-NH2(n=1,2,3,4,5…)、-CONH2等が挙げ
られる。１９９５年代に、米国産カブトガニ（Limulus
polyphemus）の血球抽出成分（Amebocyte Lysate）がグ
ラム陰性細菌のエンドトキシン（リポ多糖）により、ゲ
ル化されることが報告されて以来、当該現象は、リムル
ス試験（ＬＡＬテストともいう）として、エンドトキシ
ンの検出及び定量に利用されてきた。リムルス試験は、
エンドトキシンとカブトガニの血球抽出成分が反応して
できるゲルを判定の指標とする(i)ゲル化法・比濁時間
法と、合成基質を用いて発色したものを吸光度で測定す
る(ii)合成基質法に大別される。従来、リムルス試験
は、(i)ゲル化法・比濁時間法でも、(ii)合成基質法で
も、遊離状態のエンドトキシン（リポ多糖）とカブトガ
ニの血球抽出成分が反応することによって反応が進行す
るものと考えられてきた。本発明の発明者らは、アミノ
グリコシド系抗生物質によって捕捉されたエンドトキシ
ン（リポ多糖）もまた、リムルス試験によって検出・定
量することが可能であることを発見し、本発明を完成し
た。ポリペプチド系抗生物質によってエンドトキシン
（リポ多糖）が捕捉されることは、同業者によってすで
に解明されているが、アミノグリコシド系抗生物質によ
って捕捉されたエンドトキシン（リポ多糖）が、リムル
ス試験によって検出・定量可能であることは、本発明に
おいてはじめて見い出されたことである。
性物質の定量方法について鋭意検討した結果、 （１）容器、試験管、ビーズ、ボール、磁性粒子、チッ
プ、薄板、小片、薄膜、小棒、マイクロタイタープレー
ト、ストリップ及びろ紙ディスクからなる群から選ばれ
る器具であって、該器具上に、発熱性物質と結合しうる
アミノグリコシド系抗生物質（カスガマイシン、エディ
ン、ストレプトマイシン、カナマイシン、ネオマイシ
ン、パロモマイシン、ゲンタマイシン、スペクチノマイ
シン、アミカシン等）を固定化したゲル状の発熱性物質
吸着体が固相化されていることを特徴とする、発熱性物
質の定量に用いる器具、 （２）容器、試験管、ビーズ、ボール、磁性粒子、チッ
プ、薄板、小片、薄膜、小棒、マイクロタイタープレー
ト、ストリップ及びろ紙ディスクからなる群から選ばれ
る器具であって、該器具上に、発熱性物質と結合しうる
リガンドであるアミノグリコシド系抗生物質（カスガマ
イシン、エディン、ストレプトマイシン、カナマイシ
ン、ネオマイシン、パロモマイシン、ゲンタマイシン、
スペクチノマイシン、アミカシン等）を共有結合させた
反応性官能基が固相化されていることを特徴とする、発
熱性物質の定量に用いる器具、を用いて発熱性物質を吸
着した後、従来のリムルス試験で発熱性物質の定量を行
なう方法が、従来の難問を一挙に解決することを発見し
た。即ち、本発明に関わる器具を使用し、発熱性物質を
特異的に吸着した後、リムルス試験、或いは、放射イム
ノアッセイ法、非放射イムノアッセイ法等により、発熱
性物質を定量することにより、従来技術で不可欠であっ
た検体の前処理、後処理の必要が全く無くなるという利
点が生ずる。また、本発明に関わる器具が発熱性物質
（エンドトキシン）のみを特異的に吸着する為、カブト
ガニ血球注出液全体を用いてリムルス試験を行なっても
(１→３)-β-D-Glucan等に対する非特異反応に配慮する
必要はない。尚、上記反応性官能基としては、例えば-N
=CH-(CH2)n-CH=NH、-NH-(CH2)n-OH、-CO-(CH2)n-COOH、
-NH-(CH2)n-NH2、-N=CH-(CH2)n-COOH、-NH-(CH2)n-COO
H、-N=CH-(CH2)n-NH2(n=1,2,3,4,5…)、-CONH2等が挙げ
られる。１９９５年代に、米国産カブトガニ（Limulus
polyphemus）の血球抽出成分（Amebocyte Lysate）がグ
ラム陰性細菌のエンドトキシン（リポ多糖）により、ゲ
ル化されることが報告されて以来、当該現象は、リムル
ス試験（ＬＡＬテストともいう）として、エンドトキシ
ンの検出及び定量に利用されてきた。リムルス試験は、
エンドトキシンとカブトガニの血球抽出成分が反応して
できるゲルを判定の指標とする(i)ゲル化法・比濁時間
法と、合成基質を用いて発色したものを吸光度で測定す
る(ii)合成基質法に大別される。従来、リムルス試験
は、(i)ゲル化法・比濁時間法でも、(ii)合成基質法で
も、遊離状態のエンドトキシン（リポ多糖）とカブトガ
ニの血球抽出成分が反応することによって反応が進行す
るものと考えられてきた。本発明の発明者らは、アミノ
グリコシド系抗生物質によって捕捉されたエンドトキシ
ン（リポ多糖）もまた、リムルス試験によって検出・定
量することが可能であることを発見し、本発明を完成し
た。ポリペプチド系抗生物質によってエンドトキシン
（リポ多糖）が捕捉されることは、同業者によってすで
に解明されているが、アミノグリコシド系抗生物質によ
って捕捉されたエンドトキシン（リポ多糖）が、リムル
ス試験によって検出・定量可能であることは、本発明に
おいてはじめて見い出されたことである。
【実施例】以下に実施例を挙げて、本発明を更に詳細に
説明するが、本発明は以下の実施例には、なんら限定さ
れるものではない。
説明するが、本発明は以下の実施例には、なんら限定さ
れるものではない。
【実施例１】＜ストレプトマイシンを固定化したゲル状
の発熱性物質吸着体を固相化した小片の調製＞ ストレプトマイシンを定法に従い、架橋アガロース担体
（Sepharose CL-4B）に結合させた（結合量５ｍｇ／ｍ
ｌ）。次に、当該担体を定法に従い、凍結乾燥した。次
に瞬間接着材を用いて、当該担体を縦横２ｃｍ、厚さ１
ｍｍの正方形のポリスチレン製小片の両面に塗布した。
の発熱性物質吸着体を固相化した小片の調製＞ ストレプトマイシンを定法に従い、架橋アガロース担体
（Sepharose CL-4B）に結合させた（結合量５ｍｇ／ｍ
ｌ）。次に、当該担体を定法に従い、凍結乾燥した。次
に瞬間接着材を用いて、当該担体を縦横２ｃｍ、厚さ１
ｍｍの正方形のポリスチレン製小片の両面に塗布した。
【実施例２】容量５ｍｌのガラス製試験管に実施例１で
調製した小片とエンドトキシン溶液（緩衝液に溶解した
エンドトキシン、又は血清に溶解したエンドトキシン；
濃度はいずれも０．５００ＥＵ／ｍｌ）２ｍｌを秤量
し、室温で３０分インキュベート（incubate）した。次
に、当該試験管のリン酸緩衝液（又は血清）を除去した
後、小片の入った当該試験管をリン酸緩衝液３ｍｌで３
回洗浄した。最後に、発熱性物質定量用試薬エンドスペ
シー（(１→３)-β-D-Glucanは検出しない）及びトキシ
カラー（(１→３)-β-D-Glucanも検出する）を用いて、
発熱性物質の定量を行ない、その結果を表１に示した。
尚、以上の操作に用いた器具、緩衝液等はすべてエンド
トキシンフリー及び(１→３)-β-D-Glucanフリーのもの
を用いた。
調製した小片とエンドトキシン溶液（緩衝液に溶解した
エンドトキシン、又は血清に溶解したエンドトキシン；
濃度はいずれも０．５００ＥＵ／ｍｌ）２ｍｌを秤量
し、室温で３０分インキュベート（incubate）した。次
に、当該試験管のリン酸緩衝液（又は血清）を除去した
後、小片の入った当該試験管をリン酸緩衝液３ｍｌで３
回洗浄した。最後に、発熱性物質定量用試薬エンドスペ
シー（(１→３)-β-D-Glucanは検出しない）及びトキシ
カラー（(１→３)-β-D-Glucanも検出する）を用いて、
発熱性物質の定量を行ない、その結果を表１に示した。
尚、以上の操作に用いた器具、緩衝液等はすべてエンド
トキシンフリー及び(１→３)-β-D-Glucanフリーのもの
を用いた。
【表１】 表１に示したように、本発明に関わる発熱性物質吸着物
質を固相化した小片は、発熱性物質の良好な吸着性能を
示した。また、エンドスペシー及びトキシカラーによる
エンドトキシンの定量結果も良好であった。検体が緩衝
液であっても、血清であっても、検査結果に影響はなか
った。
質を固相化した小片は、発熱性物質の良好な吸着性能を
示した。また、エンドスペシー及びトキシカラーによる
エンドトキシンの定量結果も良好であった。検体が緩衝
液であっても、血清であっても、検査結果に影響はなか
った。
【実施例３】＜ストレプトマイシンを固定化したアフィ
ニティクロマトグラフィー担体を用いた発熱性物質の定
量＞ ストレプトマイシンを定法に従い、架橋アガロース担体
（Sepharose CL-4B）に結合させた（結合量５ｍｇ／ｍ
ｌ）。次に、容量５ｍｌのガラス製試験管に当該担体５
０ｕｌとエンドトキシン溶液（緩衝液に溶解したエンド
トキシン、又は血清に溶解したエンドトキシン；濃度は
いずれも０．５００ＥＵ／ｍｌ）１ｍｌを秤量し、充分
に撹拌した後、室温で３０分インキュベートした。次
に、当該試験管のリン酸緩衝液（又は血清）を除去した
後、小片の入った当該試験管をリン酸緩衝液３ｍｌで３
回洗浄した（ストレプトマイシンを固定化したアフィニ
ティクロマトグラフィー担体とリン酸緩衝液の分離は遠
心分離により行った）。最後に、発熱性物質定量用試薬
エンドスペシー（(１→３)-β-D-Glucanは検出しない）
及びトキシカラー（(１→３)-β-D-Glucanも検出する）
を用いて、発熱性物質の定量を行ない、その結果を表２
に示した。尚、以上の操作に用いた器具、緩衝液等はす
べてエンドトキシンフリー及び(１→３)-β-D-Glucanフ
リーのものを用いた。
ニティクロマトグラフィー担体を用いた発熱性物質の定
量＞ ストレプトマイシンを定法に従い、架橋アガロース担体
（Sepharose CL-4B）に結合させた（結合量５ｍｇ／ｍ
ｌ）。次に、容量５ｍｌのガラス製試験管に当該担体５
０ｕｌとエンドトキシン溶液（緩衝液に溶解したエンド
トキシン、又は血清に溶解したエンドトキシン；濃度は
いずれも０．５００ＥＵ／ｍｌ）１ｍｌを秤量し、充分
に撹拌した後、室温で３０分インキュベートした。次
に、当該試験管のリン酸緩衝液（又は血清）を除去した
後、小片の入った当該試験管をリン酸緩衝液３ｍｌで３
回洗浄した（ストレプトマイシンを固定化したアフィニ
ティクロマトグラフィー担体とリン酸緩衝液の分離は遠
心分離により行った）。最後に、発熱性物質定量用試薬
エンドスペシー（(１→３)-β-D-Glucanは検出しない）
及びトキシカラー（(１→３)-β-D-Glucanも検出する）
を用いて、発熱性物質の定量を行ない、その結果を表２
に示した。尚、以上の操作に用いた器具、緩衝液等はす
べてエンドトキシンフリー及び(１→３)-β-D-Glucanフ
リーのものを用いた。
【表２】
【実施例４】マイクロプレート（住友ベークライト社
製）に反応性官能基-N=CH-(CH2)3-CH=NHを結合させて固
相化し、その官能基の末端アミノ基に、発熱性物質と結
合するリガンドであるストレプトマイシンを共有結合さ
せて、発熱性物質吸着マイクロタイタープレートを調製
した。その発熱性物質吸着マイクロタイタープレート
（ブロック済）に、エンドトキシン溶液（緩衝液に溶解
したエンドトキシン、又は血清に溶解したエンドトキシ
ン；濃度はいずれも２．５００ＥＵ／ｍｌ）２００ｕｌ
を秤量し、室温で３０分インキュベートした。次に、マ
イクロタイタープレートの各穴をリン酸緩衝液２００ｕ
ｌで３回洗浄した。最後に、発熱性物質定量用試薬エン
ドスペシー（(１→３)-β-D-Glucanは検出しない）及び
トキシカラー（(１→３)-β-D-Glucanも検出する）を用
いて、発熱性物質の定量を行ない、その結果を表３に示
した。尚、以上の操作に用いた器具、緩衝液等はすべて
エンドトキシンフリー及び(１→３)-β-D-Glucanフリー
のものを用いた。
製）に反応性官能基-N=CH-(CH2)3-CH=NHを結合させて固
相化し、その官能基の末端アミノ基に、発熱性物質と結
合するリガンドであるストレプトマイシンを共有結合さ
せて、発熱性物質吸着マイクロタイタープレートを調製
した。その発熱性物質吸着マイクロタイタープレート
（ブロック済）に、エンドトキシン溶液（緩衝液に溶解
したエンドトキシン、又は血清に溶解したエンドトキシ
ン；濃度はいずれも２．５００ＥＵ／ｍｌ）２００ｕｌ
を秤量し、室温で３０分インキュベートした。次に、マ
イクロタイタープレートの各穴をリン酸緩衝液２００ｕ
ｌで３回洗浄した。最後に、発熱性物質定量用試薬エン
ドスペシー（(１→３)-β-D-Glucanは検出しない）及び
トキシカラー（(１→３)-β-D-Glucanも検出する）を用
いて、発熱性物質の定量を行ない、その結果を表３に示
した。尚、以上の操作に用いた器具、緩衝液等はすべて
エンドトキシンフリー及び(１→３)-β-D-Glucanフリー
のものを用いた。
【表３】 表３に示したように、本発明に関わる発熱性物質吸着マ
イクロタイタープレートは、発熱性物質の良好な吸着性
能を示した。また、エンドスペシー及びトキシカラーに
よるエンドトキシンの定量結果も良好であった。
イクロタイタープレートは、発熱性物質の良好な吸着性
能を示した。また、エンドスペシー及びトキシカラーに
よるエンドトキシンの定量結果も良好であった。
【実施例５】マイクロプレート（住友ベークライト社
製）に反応性官能基-NH-(CH2)3-OHを結合させて固相化
し、その官能基に発熱性物質と結合するリガンドである
ストレプトマイシンを共有結合させて調製したマイクロ
タイタープレートを用いたこと以外は、すべて実施例４
と同様にして試験を行った。結果を表４に示す。
製）に反応性官能基-NH-(CH2)3-OHを結合させて固相化
し、その官能基に発熱性物質と結合するリガンドである
ストレプトマイシンを共有結合させて調製したマイクロ
タイタープレートを用いたこと以外は、すべて実施例４
と同様にして試験を行った。結果を表４に示す。
【表４】
【実施例６】マイクロプレート（住友ベークライト社
製）に反応性官能基-CO-(CH2)2-COOHを結合させて固相
化し、その官能基の末端カルボキシル基に、発熱性物質
と結合するリガンドであるアミカシン（アミノグリコシ
ド系抗生物質）をアミド化法により共有結合させて、発
熱性物質吸着マイクロタイタープレートを調製した。そ
の発熱性物質吸着マイクロタイタープレート（ブロック
済）に、エンドトキシン溶液（緩衝液に溶解したエンド
トキシン、又は血清に溶解したエンドトキシン：濃度は
いずれも２．５００ＥＵ／ｍｌ）２００ｕｌを秤量し、
室温で３０分インキュベートした。次に、マイクロタイ
タープレートの各穴をリン酸緩衝液２００ｕｌで３回洗
浄した。最後に、発熱性物質定量用試薬エンドスペシー
（(１→３)-β-D-Glucanは検出しない）及びトキシカラ
ー（(１→３)-β-D-Glucanも検出する）を用いて、発熱
性物質の定量を行ない、その結果を表５に示した。尚、
以上の操作に用いた器具、緩衝液等はすべてエンドトキ
シンフリー及び(１→３)-β-D-Glucanフリーのものを用
いた。
製）に反応性官能基-CO-(CH2)2-COOHを結合させて固相
化し、その官能基の末端カルボキシル基に、発熱性物質
と結合するリガンドであるアミカシン（アミノグリコシ
ド系抗生物質）をアミド化法により共有結合させて、発
熱性物質吸着マイクロタイタープレートを調製した。そ
の発熱性物質吸着マイクロタイタープレート（ブロック
済）に、エンドトキシン溶液（緩衝液に溶解したエンド
トキシン、又は血清に溶解したエンドトキシン：濃度は
いずれも２．５００ＥＵ／ｍｌ）２００ｕｌを秤量し、
室温で３０分インキュベートした。次に、マイクロタイ
タープレートの各穴をリン酸緩衝液２００ｕｌで３回洗
浄した。最後に、発熱性物質定量用試薬エンドスペシー
（(１→３)-β-D-Glucanは検出しない）及びトキシカラ
ー（(１→３)-β-D-Glucanも検出する）を用いて、発熱
性物質の定量を行ない、その結果を表５に示した。尚、
以上の操作に用いた器具、緩衝液等はすべてエンドトキ
シンフリー及び(１→３)-β-D-Glucanフリーのものを用
いた。
【表５】 表５に示したように、本発明に関わる発熱性物質吸着マ
イクロタイタープレートは、発熱性物質の良好な吸着性
能を示した。また、エンドスペシー及びトキシカラーに
よるエンドトキシンの定量結果も良好であった。
イクロタイタープレートは、発熱性物質の良好な吸着性
能を示した。また、エンドスペシー及びトキシカラーに
よるエンドトキシンの定量結果も良好であった。
【実施例７】ビーズに反応性官能基-N=CH-(CH2)3-CH=NH
を結合させて固相化し、その官能基の末端アミノ基に、
発熱性物質と結合するリガンドであるカナマイシンを共
有結合させて、発熱性物質吸着ビーズを調製した。小試
験管に緩衝液２ｍｌ、発熱性物質吸着ビーズ（ブロック
済）、エンドトキシンＡ液（プール血清にエンドトキシ
ン５．０００ＥＵ／ｍｌを溶解）、または、エンドトキ
シンＢ液（プール血清にエンドトキシン５．０００ＥＵ
／ｍｌ及びレンチナン１ｕｇ／ｍｌを溶解）２００ｕｌ
を秤量し、室温で３０分インキュベートした。次に、前
記ビーズをリン酸緩衝液２ｍｌで３回洗浄した。次に、
発熱性物質定量用試薬エンドスペシー（(１→３)-β-D-
Glucanは検出しない）及びトキシカラー（(１→３)-β-
D-Glucanも検出する）を用いて、発熱性物質の定量を行
ない、その結果を表６に示した。尚、以上の操作に用い
た器具、緩衝液等はすべてエンドトキシンフリー及び
(１→３)-β-D-Glucanフリーのものを用いた。
を結合させて固相化し、その官能基の末端アミノ基に、
発熱性物質と結合するリガンドであるカナマイシンを共
有結合させて、発熱性物質吸着ビーズを調製した。小試
験管に緩衝液２ｍｌ、発熱性物質吸着ビーズ（ブロック
済）、エンドトキシンＡ液（プール血清にエンドトキシ
ン５．０００ＥＵ／ｍｌを溶解）、または、エンドトキ
シンＢ液（プール血清にエンドトキシン５．０００ＥＵ
／ｍｌ及びレンチナン１ｕｇ／ｍｌを溶解）２００ｕｌ
を秤量し、室温で３０分インキュベートした。次に、前
記ビーズをリン酸緩衝液２ｍｌで３回洗浄した。次に、
発熱性物質定量用試薬エンドスペシー（(１→３)-β-D-
Glucanは検出しない）及びトキシカラー（(１→３)-β-
D-Glucanも検出する）を用いて、発熱性物質の定量を行
ない、その結果を表６に示した。尚、以上の操作に用い
た器具、緩衝液等はすべてエンドトキシンフリー及び
(１→３)-β-D-Glucanフリーのものを用いた。
【表６】 表６に示したように、本発明に関わる発熱性物質吸着ビ
ーズは、発熱性物質の良好な吸着性能を示した。また、
エンドスペシー及びトキシカラーによるエンドトキシン
の定量結果も良好であった。即ち、レンチナンによる影
響は認められなかった。尚、実施例１〜実施例７に用い
たエンジスペシー及びトキシカラーは、何れも（株）生
化学工業（東京）の製品である。
ーズは、発熱性物質の良好な吸着性能を示した。また、
エンドスペシー及びトキシカラーによるエンドトキシン
の定量結果も良好であった。即ち、レンチナンによる影
響は認められなかった。尚、実施例１〜実施例７に用い
たエンジスペシー及びトキシカラーは、何れも（株）生
化学工業（東京）の製品である。
Claims (5)
- 【請求項１】 容器、試験管、ビーズ、ボール、磁性粒
子、チップ、薄板、小片、薄膜、小棒、マイクロタイタ
ープレート、ストリップ及びろ紙ディスクからなる群か
ら選ばれる器具であって、該器具上に、発熱性物質と結
合しうるアミノグリコシド系抗生物質を固定化したゲル
状の発熱性物質吸着体が固相化されていることを特徴と
する、発熱性物質の定量に用いる器具。 - 【請求項２】 発熱性物質吸着体が、アミノグリコシド
系抗生物質を固定化したアフィニティークロマトグラフ
ィー担体である、請求項１記載の器具。 - 【請求項３】 容器、試験管、ビーズ、ボール、磁性粒
子、チップ、薄板、小片、薄膜、小棒、マイクロタイタ
ープレート、ストリップ及びろ紙ディスクからなる群か
ら選ばれる器具であって、該器具上に、発熱性物質と結
合しうるアミノグリコシド系抗生物質を共有結合させた
反応性官能基が固相化されていることを特徴とする、発
熱性物質の定量に用いる器具。 - 【請求項４】 請求項１〜３のいずれかに記載の器具を
用いて発熱性物質を定量する方法であって、前記器具に
発熱性物質を吸着した後、放射イムノアッセイ法、非放
射イムノアッセイ法、及びリムルス試験法からなる群か
ら選ばれる方法により吸着された発熱性物質を定量する
ことを特徴とする方法。 - 【請求項５】 請求項１〜３のいずれかに記載の器具を
用いて発熱性物質を定量する為に構成された発熱性物質
定量キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3169479A JP2690415B2 (ja) | 1991-01-26 | 1991-01-26 | 発熱性物質吸着体とそれを用いた発熱性物質の定量方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3169479A JP2690415B2 (ja) | 1991-01-26 | 1991-01-26 | 発熱性物質吸着体とそれを用いた発熱性物質の定量方法 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP33614896A Division JPH09178753A (ja) | 1996-12-16 | 1996-12-16 | 発熱性物質吸着体とそれを用いた発熱性物質の定量方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0666806A JPH0666806A (ja) | 1994-03-11 |
| JP2690415B2 true JP2690415B2 (ja) | 1997-12-10 |
Family
ID=15887311
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3169479A Expired - Fee Related JP2690415B2 (ja) | 1991-01-26 | 1991-01-26 | 発熱性物質吸着体とそれを用いた発熱性物質の定量方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2690415B2 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9816441D0 (en) * | 1998-07-28 | 1998-09-23 | Hartley Frank R | Analysis of liquids |
| JP2009294113A (ja) * | 2008-06-05 | 2009-12-17 | Kowa Co | エンドトキシン測定方法、エンドトキシン測定用キット及び、エンドトキシン測定装置。 |
| JP5564193B2 (ja) * | 2009-04-07 | 2014-07-30 | 株式会社ペプタイドドア | リポ多糖又はリピッドａの分析方法 |
| EP2495344A1 (en) | 2009-10-30 | 2012-09-05 | Panasonic Corporation | Electrode foil and capacitor using same |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5813519A (ja) * | 1981-07-16 | 1983-01-26 | Seikagaku Kogyo Co Ltd | エンドトキシン吸着材及びそれを用いるエンドトキシンの除去方法 |
| KR940005589B1 (ko) * | 1986-04-02 | 1994-06-21 | 다이닛뽄세이야꾸 가부시끼가이샤 | 핵산 또는 엔도톡신의 제거제 및 제거방법 |
| JP2524406B2 (ja) * | 1988-07-05 | 1996-08-14 | 田辺製薬株式会社 | パイロジェン定量方法 |
-
1991
- 1991-01-26 JP JP3169479A patent/JP2690415B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0666806A (ja) | 1994-03-11 |
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|---|---|---|---|
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