JPS60113154A - 全血試料の分析法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、全血試料中のアナライト　（被分析成分）を
分析する方法に関し、更に詳しくは、その様な分析を行
なうための、新規な方法並びに組成物に関するものであ
る。

血液試料中のアナライトの分析は、診断および治療の両
医学分野においてますまず重要になってきた。通常、血
清を用いて行なわれる分析を実施するためには、予め試
料中の赤血球を分離しておかねばならない。このことは
、特に、酵素標識イムノアッセイの如ぎ標識を用いた分
析、中でも、定量的な測定を行なう様な分析の場合には
、まさしくそうである。これらの測定においては通常、
アナライトの濃度は様々であり、しかも、２種の低濃度
のアナライト相互の間の差異を検出するのが普通である
。この様な場合、赤血球細胞が特異結合対（ｓｂｐ）構
成成分（メンバー）開で起きる結合を阻害するかもしれ
ないことから、該細胞を全血試料から分離する作業は必
須である。しがち、この細胞は生成した信号を妨害し得
る様な酵素活性をも有している。定量分析には高い精度
が要求されるので、赤血球細胞の存在によってひた起こ
される、分析に対してのバンクグラウンド妨害を許容す
ることはできない。

かくして、全血試料に関するエンザイムイムノアッセイ
には２段階が含まれることとなる。第１段階においては
、全血中の血清から赤血球を分離する。この分離は一般
に遠心分離法で行なわれ、該細胞は底部に沈降するので
、デカンテーションまたは他の方法で血清を分離するこ
とができる。

この、血清からの赤血球の分離は、通常、全血試料を採
集した場所で行なわれる。分離した後、該１ｆｏ清を分
析の場所まで運ふ゛。分離工程が含まｈているために、
患者から比較的大量の全血紙オ収一般に約０．１〜５．
０−程度）を採取する必要がある。全血試料の採取は侵
襲的な操作なので、多くの医師は、常套手段として、こ
の分析を指示することに乗り気でない。更に問題を複雑
にしているのは、大多数の診療室には内部に血液分離装
置が備えられていないということである。その結果、血
漿からと赤血球の分離を行なうことができる場所まで、
血液試料を移送しなければならないことになる。

従って、少量の全血試料に適用することのできる分析法
が必要となる。その様な分析法は、赤血球細胞の分離工
程を含ま「、がっ、ピンで刺して滴下させた程度の少量
の、患者から得た全血試料に対しても適用することので
とるものでなけれはならない。この様な分析法であれば
、医師等をして、アナライトの分析を、より日常的なも
のとして実施せしめるであろう。

２、先行技術 Ａｎｄｅｒｓｏｕ（Ａｎａｌ、　Ｂ　ｉｏＪ＋ｅｍ、　
（１９７０）３　侭１７５〜１８９）は、セルロース芯
を用いた凝集反応の監視について述べている。エンサイ
ム・クロマトグラフィツク・イム／アッセイは、アメリ
カ特許出願第３９８，５０５号（１９８２年７月１５［
１出願）により開示された。顆ネス！−含有媒質中のア
ナライトの測定は、アメリカ特許第５１９゜３００号（
１９８３年７　Ｊ１２９日出類）によって開示されてい
る。

アメリカ特許第４．１６８，１００号には、抗原を用い
てイムノクロマトグラフィーを行ない、次いで、このイ
ムノクロマトグラフを標識抗原と接１Ｉ１１！すせるこ
とからなるイムノアッセイが記載されている。アメリカ
特許第４，２３３，４．０２号には、１つの酵素の基質
がもう１つの酵素の産物であるような１組の酵素を用い
たホモノーニアス・アッセイ（均質分析）法が記載され
ている。この産物の生産の増大は、分析媒質中のアナラ
イトの量に関連している。アメリカ特許第４＋２７５＋
　１．４９％では、酵素を組み合わせて用いる顆粒を使
用する方法が記載されており、この場合、顆粒の存在に
よって２つの酵素間の相互作用が高められるものであり
、また、一方の酵素の産物がもう一方の酵素の基質とな
っている。特異的に結合すｇ一対の構成要素の結合の結
果物である、顆粒に結合した２個の酵素の存在に基づく
最終産物の生産の増大は、媒質中のアナライトの量と関
連している。

様々なタイプの試験紙に種々の試薬を固定したものに関
する特許にはアメリカ特許第３，９９３゜４５１号；第
４，０３８，４８５号；第４．０４６゜５１４号；第４
．１２９，４１７号；第４．１３３゜６３９号およびｔ
ＩｔＪ４，１６０，００８号がある。結合または非結合
型の抗原の分離を含む様々な方法を開示している特許に
は、アメリカ特許ｖＩＪ２９゜１６９号；第３，９４９
，０６４号；第３，９８４゜５３３号；第３．９８５，
８６７号；　＄４，０２０゜１５１号；第４．０３９．
６５２号；第４，０６７゜９５９号；第４，１０８，９
７２号；第４，１４５゜４０８号および第４，１６８，
１４８号かある。

発明の要約 本発明は、全血試料中に含まれる、′＃ｒ異的結合対（
３１〕＋１と称する）の構成要素（メンバー）の存在を
検出するための方泡並びにｍ産物が提供するものである
。これらのｓｂｌ＋メンバーはリガンドおよびホモロー
ガス（同族の）なりセブターとから成る。

本発明方法においては、赤血球細胞が分離されていない
全血試料を、該試料中の赤血球細胞に対する結合剤に、
水性の緩衝化された媒質中で結合させる。分析のプロト
コールに適するならば、検出可能な信号を生産し得るよ
うな、１または１以上の信号生成系を含有させることも
ある。少くとも１個のｓ　ｂ　ｐメンバーが固体の吸収
性要素（固体吸収材）に実質的に均一に結合している。

固体吸収材のあらカルめ定めた領域に分析用の媒質を接
触させると、赤血球細胞は、気／液境界面に隣接してい
る、固体の吸収材」ニガ領域に濃縮されることになる。

そして、−１−記の媒質が、固体の吸収材を横切って通
過する。そして、残りの信号生産系の構成要素が固体の
吸収材に結合する。このＳ　１）１１メンバーの結合の
結果として生産された信号を検出し、試料中のｓｂｌ＋
メンバーの量に関連づける。

全血試料中の５ｌａｐメンバーの存在を測定するのｌこ
用いる分（ハ用キットは、試料中の赤血球に対する結合
剤、１つのＳｌ）＋１メンバーと結合する、少くとも１
個の標識を含む１つの信号生成系、固体の吸収材、およ
び本発明のイムノアッセイを実施するのに必要な補助物
質のすべて、を配合した充填物（パッケージ）からなる
。

好ましい衷施韮曇 上記の如く、本発明の方法によれば、アナライトを含ん
でいるがもじれない全血試料中のアナライ）（ｓｂｌ＋
メンバーの１つである）を測定することができる。本発
明方法は、水性媒質中で、気／液両相の境界面を規定し
ている固体の吸収材の、あらｈ化め定められた領域に、
全面試料と、赤血球の結合剤とを接触させることからな
る。該吸収材は、その表面に均一に結合している１つの
ｓ　ｂ　ｐメンバーを有している。接触は、アナライト
の量に関連して境界線が明確に定まると共に、赤血球細
胞か気／液境界面で凝集する状態で」１記吸収材を横切
る様にして行なう。この境界線の決定は、標識ｓｂｐメ
ンバーを含有する信号生成系に基づいて行なう。

本発明方法では、試料を水性媒質中で結合剤と混合十為
。もし適切なら、ば、この水性媒質中に１またはそれ以
」二の信号生成系の構成要素を加えることもある。

赤血球細胞は、全血試料中の主な妨害物質である。その
他の細胞性物質も妨害物質として分類することができる
。この細胞性物質は、全血中に少量しか存在しないので
、その存在が分析における寅質的なバックグラウンド妨
害に帰着することはない。さらに、これらの細胞性物質
の内にあるものは、赤血球細胞と凝集し、本発明方法を
適用する開に分析用媒質中から除去されてしまう。

結合剤を加えｔこ後、１つのｓｂｐメンバーが結合して
いる固体の吸収材のある部位、通常は一端、に試料を接
触させる。媒質をこの固体の吸収材に沿って拡散（展開
）させると、赤血球細胞は気／液境界面に保持される。

拡散終了後、信号生成系の残りのメンバーが固体吸収材
に結合し、試料中のアナライトの量に関連して定まる境
界線（縁）が定まる。

ここで、まず本明細書中で用いる多くの語句の定義を述
べる。

アナライト−測定しようとしている化合物または組成物
であって、リカ゛ンドであってもよく、少くとも１個の
、共通の抗原決定基、あるいはりセプターを共有してい
る、単一または複数の決定基を有する、抗原性またはハ
プテン性の単数または複数の化合物群を指す。

特異的結合対−２個の異なる分子であって、１個の分子
がもう１個の分子の特定の空間的な、あるいは極性的な
組織体に特異的に結合することので終る領域を、その表
面まｔこは空洞（くぼみ）の中に有している様な１月の
分子を指す。

リガンド−そのものに対するリセプターか天然に存在し
ているか、あるいは調製することか′できる、全ての有
機化合物を指す。

リセプター（抗リガンド）−ある分子の特定の空間（立
体）的な、または極性の部位（即ち、抗原決定基）を認
識することのでとる化合物または組成物のすべてを指す
。例示的なりセプクーには、例えば、チロキシン結合グ
ロブリン、抗体類、酵素類、Ｆａｂフラグメント類およ
びレクチン類等が含よれる。

リカ゛ンド同族体−類似しているりガントとリセプター
を競合し合うことができる様な、修飾の施されたりガン
トであって、該修飾によって、リガンド同族体がもう一
つの分子に結合する手段を与えられているものである。

このリガンド同族体は通常、１個の水素原子を該リガン
ド同族体をｌ＋　Ｌｌ　ｌ）または標識と結合させるよ
うな結合手で置換した程度以」二に、すガントと異なっ
ているものである。

ポリ（リガンド−同族体）−普通はｔ＋　ｕ　ｌ）核に
対し、複数のリガンドまたはリガント同族体が一緒に共
有結合したものを指す。このｌ＋ｕｂ核は多機能性物質
、普通はポリマーであって、通常、結合部位として複数
個の官能基（例えは、水酸基、アミン基、メルカプト基
およびエチレン基等）を有するものである。この１１品
核は水溶性または水不溶性であってよいが、水溶性であ
ることが好ましく、また、分子量は少くとも約３５，０
００から＋０．０００．ＯＯＯあるいはそれ以上である
かもしれないが、通常は６００．０００以下であり、３
００，０００以下であることがより一般的である。ｈ　
ｕ　ｂ核の例として、ポリサッカライド（多糖類）、タ
ンパク質や核酸を含むポリペプチド、」１ミびにイオン
交換樹脂等を挙げることができる。

信号生成系−信号生成系は、１または１以上の成分を有
することがで外るが、その内の少くとも１成分は特異的
結合対メンバーの１つと結合している。この信号生成系
は外的な手段、通常、電磁的放射線を用いた測定法、に
よって検出することがでべろ。大部分の場合、この信号
生成系は発色団を含有しており、それらの発色団には紫
外または可視領域の光を吸収する染料、りん光、けい光
および化学的ミネンセンスを発する染料が含まれている
。大部分の場合、信号としては一般に紫外または可視領
域の電磁波を吸収または発するものか好都合である。

標識（ラベル）−標識は、もう１つの分子と結合（抱合
）しているならば、如何なる分子でもよく、いずれの分
子を標識にするかという選択は任意である。本発明にお
ける標識は、信号生成系の１つのメンバーと結合してい
る、特異的結合対の１ノンバーであろう。

結合対標識−自身と類１以したメンバーと結合するのに
用いられる、特異的結合対の１つのメンバーを指す。

信号標識−結合対メンバーに対して直接または間接的に
結合（特異的結合対間の結合を介して）している信号生
成系の１メンバーを指す。

標識されたりガント−特異的結合対のリガンドメンバー
と、信号生成系の１メンバーとが、共有結合的または非
共有結合的に結合したものであり、共有結合の場合は、
結合手、連結基、または１１篩核を介して結合したもの
である。この標識されたりガントは、１または１以上の
りガント（リガンド同族体を含む）あるいは１よたは１
す、」二の標識、もしくは両方を複数固有することがで
き、後者の場合には、ポリ（リガンド同族体）−ポリ標
識と呼ばれる。

標識されたりセプターーリセプターと信号生成系の１メ
ンバーとが共有結合または非共有結合的（通常は、連結
基を介する共有結合により）に結合したものであって、
それらの中には、該標識に対して１または１以」二のり
セプターが結合しているものもあるかもしれないが、該
リセブターに対して１または１以上の標識が結合してい
るのが普通である。

結合剤−赤血球細胞の結合剤であって、全血中の赤血球
細胞を凝集させることのできる物質を指す。この結合剤
は、媒質が吸収材に接触した際に、赤血球細胞を表面と
液相との中間に分配させることによって該赤血球を媒質
から分離する能力を有していなければ゛ならない。例え
ば、この結合剤は、赤血球細胞を相互に付着させる様な
凝集剤（例、赤血球細胞の特異抗体）であってもよい。

その他の型の凝集剤としては、ポリリジン、ポリアルギ
ニン、およびポリブレン等の重合アミノ酸類、並びに、
小麦胚芽凝集素（ＴｒｉＬｉｃａｍ　ｖｕｌＢａｒｉｓ
）等のレクチン類がある。

吸収祠−気相と液相との境界面から液体を毛管現象によ
って移動させるような吸収性の固形材料のすべてを指す
６紙、セルロース粒子、シリカゲルおよび吸収性セルロ
ース・ビーズ等を含む種々の材料がある。凝集した赤血
球細胞を気／液境界面上、またはその近くに、鋭いバン
ドまたは線としで保持することができる様、その表面が
比較的滑らかであることが好ましい。吸収性物質のサイ
ズおよび形は、その材料の使用目的、即ち、凝集した赤
血球を保持すると共に、アナライトの分析を行なうため
の支持体であること、を考慮して広範囲に変化し得る。

その表面は様々な異なった物理的性質を有するであろう
し、種々の異なる化学的組成物で成ってもよく、もしく
は、組成物または積層物（ラミネート）、あるいはこれ
らの複合物を混合したもの、の如く、１ホたは１以上の
組成物から成るものであってもよい。様々な材料を使用
できるが、第１義的に考慮すべきことは、気／液境界面
で赤血球細胞が凝集し得ること、並びにこの材料の表面
に対して結合し易いこと、である。

ｎ取材ｓｂｐメンバー結合（イムノクロマトグラフ）−
少くとも１個のｓｂｐメンバーが共有結合的、または非
共有結合的に吸収材の表面に対して非拡散的に結合して
いることである。この状態は、文献記載の方法（例えば
、アメリカ特許第第４，１６８．１４６号および第４，
２９９．９　ｊ　６号参照）に従って達成することがで
とる。

５ｌａｐメンバーの表面への結合は、液体が、その領域
を横切って、アナライトおよび、もし適当ならば信号生
成系のメンバーを輸送すべく移動し得る様な領域内で生
しる。信号生成系の１または１以−にのメンバーは、共
有結合的、または非共有結合的な手段で吸収性支持体に
月賦非拡散的に結合するで゛あろう。

方店 本発明方法は、１つの分析法における２種の異なった機
能、即ち、赤血球細胞の如と妨害細胞の血漿からの分離
とアナライトのｊｌｌ定、を−＃ｅにして一工程で行な
うようにするものである。分析すべき全血試料を水性媒
質（通常は緩衝化されている）中で結合剤と、さらに、
そうするのが適当ならば、１または１以」二の信号生成
系のメンバーと混合する。

結合剤は一般に、媒質を吸収材の一部に接触させたとき
、赤血球細胞を表面と液層との間に分配させるのに充分
なだけの量を用いる。赤血球細胞に対して特異的な抗体
の如き凝集剤については、全血約５０μ夕に対し、抗体
溶液的１〜２０μで（特異抗体０．５〜２０μｇを含有
）を用いる。ポリ（アミノ酸）の場合には、全血試料的
５０μρに対し、約１０〜２００μｇを用いる。レクチ
ンを結合剤として使用する場合は、全血的５０μ℃に対
し、約１〜５０μ８を用いるとよい。

本発明方法には、試料を結合剤と結合させた後、保持時
間を要しないという利点がある。試料を結合剤と結合し
た後、直もに媒質と吸収材とを接触させてもよい。その
様な状態において、結合剤と結合した赤血球細胞は、気
／液境界面で凝集する。

別法として、媒質を約０．５〜１０分間、好ましくは１
〜２分間の間、保持しておいてもよい。分析の遂行に対
し、保持時間の有無が影響を及ぼすことはない。

上記の如く、本発明方法を実施するには、通常水性媒質
が用いられるであろう。また、極性有機溶媒、通常炭素
原子数が一般に１〜６、より一般的には１〜４の酸化型
の有機溶媒（例えばアルコールやエーテル等を含む）も
また含有させることがで終る。これらのコブルベント類
は、少くとも約４０重量％以下、より一般的には約２０
重量％以下の割合で存在することになるであろう。

媒質のｐＨは、一般に約４−４１の間、より一般（＋′
Ｊｌこは約６〜１（）の間であることがわかった。

通常、５ｌａｐメンバ一間に有意なレベルの結合が達成
されるような１）１」を選択する必要かある。所望のｐ
ＬＩ値に調節し、かつ測定の間、この１川値を維持する
ために様々な緩衝液を用υ・でもよし・。その様な緩衝
液の中には、例えばホウ酸塩、リン酸塩、トリス、およ
びバルビタール等の緩衝液が含まれる。使用された特定
の緩衝液か、本発明方法にとって臨界的なものではなく
、個々の分析に際して、あるｉ衝液が池のもの上り適切
であると５・うことが起こるであろう。

イオン強度は、一般に約０．０１−１．０の範囲内とす
ることがでとるが、約０．１〜０．４の範囲が好よしい
。特定の分析、並びに用（・る試薬ｌ二１８して、上記
範囲内において最適なｐ　Ｈおよびイオン強度を選ぷ゛
ことがでとる。イオン強度１土、赤＋ｆｔｔ球細胞が気
／液境界面に保持され得るｈ・否ｈ・に影響を及ぼす。

分析に際しての温度は、分析作業に影響を及ｉｒすこと
なく、約４°　〜３７°Ｃの範囲範囲とし１件るが、約
２０°〜２５°Ｃの間がより一般的で麦、る。

媒質を、イムノクロマトグラフの一部分、通常は一端、
に接触させる。媒質が接触部分力・らｎ「方へ移動し、
イム７クロマトグラフの該水性媒質１こ推していない部
分を横切るのに充分なだけの時間をかける。」二記の条
件下で、細胞性物質は気／液境界面に実質的に保持され
る。実質的に保持される、という語句は、赤血球細胞が
、試料中のアナラ０を、バックグラウンド妨害がほとん
どまｔこ全く無い状態で検出することとの関係１こよ、
３０て、信号生成性媒質中からの信号を検出すること力
Ｃでトる程度−ニス／１夜境界面に充分、保持さ）１て
−）る、ということを意味する。

イムノクロマトグラフに沿っての媒質の拡散ｌこ伴って
、信号生成系の残りのメン／＼′−はすべてイム／りロ
マトグラフと結合する。信号生成系の各成分と吸収材と
の結合順序は、従ったプロトコールに依存する。

分析されるアナライトの濃度は一般に約１０−４〜１０
−’５Ｍ、より一般的には約１０−６〜１０−１”Ｍの
範囲で変化し得る。通常、その分析が定性的、準定性的
、もしくは定量的なもののし）ずＪｔで゛あるか、また
、特定の検出方法、および対象とするアナライトの濃度
等を考慮して池の試薬の濃度を決定する。

種々の試薬を加える順序は、実施する分析の性質、特定
の標識、該標識か結合する化合物、アナライトの性質、
並びにアナライトと試薬類との第１１対濃度ち依り、広
範囲に装動し得る。

標識した３１１１）メンバーは、少くとも３種類の異な
った方法で使用することがでｂる。例え＋ｒ、その内の
２方法は、標識ｓｂｐメンバーを、イムノクロマトグラ
フに接触させる前に、水性媒質中に存在させておくこと
を含む方法であり、３番目の方法は、水性媒質がイム７
りロマトグラフに沿って拡散した後に用いられる試薬溶
液中に、該標識ｓｌ＋ｐメンバー（す〃ンドおよびリセ
プター）を存在させておくことを含む方法である。最初
の２力法の場合には、ｓｂｌ〕メンバー−標識は、アナ
ライトと同時にイム７クロマトグラフを横切り、事実−
に、結合可能な部位をアナライトと競合するか；よたは
、ｓ　１１１１メンバーは明らかな競合作用を有さず、
アナライトの結合帯域を越えた直後の帯域に一次的に結
合するか、のいずれかである。ある場合には、試料含有
溶媒のイムノクロマトグラフに対する最初の接触ライン
から、移動しつつある媒質の境界線まで及ぶ結合帯を得
ることかある。また、池の状況下では、アナライトが結
合している帯域と、そうでない帯域が境界線で区別され
る。

上記の第３番目の方法（この場合のアナライトは抗原性
である）は、まず最初に試料を接触させることを含む。

試料がイム７クロマトグラフを横切った後、該イム７り
ロマトグラフを標識Ｓ　ｂ　ｐメンバーを含有する溶液
に浸し、抗原と結合させる。

この分析法は、従来からサンドイツチ法と呼ばれている
。勿論、ハプテンが含まれている場合には、所定量のポ
リリガンドを提供することができる。

即ち、そのリガンドが重合またはｌ＋　ｕ　ｌ）核に結
合することによって、ハンプテン性アナライトとポリリ
ガンドに共通の複数個の決定基を提供することができる
のである。実際には、その移動の程度が試料中のアナラ
イトの量に関連しているような合成抗原を製造する。

イムノクロマトグラフを、標識Ｓ　１１１１メンバーを
含有する溶液に浸漬や噴霧等によって実質的に均一に接
触させると、該標識Ｓ＋１１１メンバーは抗原の結合し
得る決定基と結合し、その結果、試ね中のアナライトの
量に関連した領域を指す検出可能な信号を与えることに
なる。浸漬による接触は、吸収材を水性媒質から出して
標識ｓ　ｌ＋　＋１メンバーを含有する溶液の中に置く
ことで行なわれる。別法として、標識ｓｂｌ＋メンバー
を含む溶液をイムノクロマトグラフを含む水性媒質に加
えてもよい。

２個の抗体間の橋渡しとして作用する抗原を用いるより
も、むしろ、イムノクロマトグラフ上にある８１１１１
メンバーと相互関係にあるＳ　１１　ｐメンバーを溶液
に加えてもよい。アナライトをイム／りロマトグラフを
横切って通過させた後、このイムノクロマトグラフを、
例えば浸漬や噴霧等により、再び実質上均一に標識Ｓ　
１１１１メンバーの溶液と接触させる。この標識５ｌａ
ｐメンバーは、イム７クロマトグラフに結合している３
１１１１メンバーと相補的であるので、この標識ｓｂｐ
メンバーはイムノクロマトグラフ」二の結合し得る部位
に結合し、アナライトの存在しない領域を明確に示す。

この方法では、アナライトの移動距離は、アナライト含
有領域内での認め得る信号の不存在によって指示され、
また、その境界線は、アナライトが存在しない領域にお
ける信号の存在によって明確となる。

特定のプロトコールにより、洗浄は有用または必要であ
ったり、回避されたりする。好ましいプロトコールは、
操作誤差を生ずる可能性が最少である、最少数の工程を
与えるものである。従って、分析における誤差に係る洗
？ｆＩおよび測定の両工程がいずれも最少数であるプロ
トコールが考案されねばならない。本発明方法によれは
、最少数の工程で全面試料を分析することができる。

条件の変動によってアナライトの移動距離を変化させる
ことができる程、イムノクロマトグラフが標準化されて
いない場合には、既知量のアナライトを含有する標準分
析を提供することができる。

アナライト試料と標準試料とに関して同時に実施し、標
準試料とアナライト試料との定量的な比較を行なうこと
かできる。必要ならば１以上の標準試料を使用し、種々
の濃度における移動距離を図に表わし、特定の試料を定
敵するのに用いることかでｂる。

大部分の場合、イムノクロマトグラフに要する時間は比
較的短い。通常、試料が免疫性吸収域を通過するのに、
最少限度３０秒を要するが１時間を越えることはなく、
より一般的には約１分がら３０分間を要する。また信号
の展開は、通常３０秒から３（）分間、より一般的には
約３０秒から５分間の間で起こる。

エンザイムイム／アンセイの場合、信号生成系は少くと
も１個の酵素を有し、更に、１まｔこは１以」二の池の
成分、あるいは１または１以上の基質を有していてもよ
い。この信号生成系には、フエンサイム類が含有されて
いてもよい。ある酵素またはコエンザイムを標識として
用いてもよく、この場合、イムノクロマトグラフ上の標
識の存在により、該標識の付近の信号が本質的に変化す
る。

通常、標識は酵素であるが、他の標識を用いてもよい。

標識は、基質の酵素的代謝回転をもたらすことにより、
その近傍の事象を多様化する。このように、標識として
用いられる信号生成系の構成要素（メンバー）とは酵素
的に信号を増幅するものを意味し、」二記で指摘したメ
ンバーに限定される。

酵素標識の客々、または組合わせは、広範囲に変動し得
る。検出し得る信号を生成する生産物は染料、けい光を
発するもの、または化学発光を生ずるもの、等である。

信号は、吸収、けい光、または化学発光に基づく視覚観
察によって検出される。他方、吸収、反射、けい光また
は化学発光の測定を利用した分′Ｌ丸度法的な測定を行
なうこともでとる。

最も興味深い酵素はオキシドリグクターゼ類およびヒド
ロラーゼ類である。多くの興味深い酵素がアメリカ特許
第４＋２７５＋１４９号に記載されている。酵素を併用
した場合には、一方の酵素はイム７クロマトグラフに非
拡散的に結合しており、もう一方の酵素は５ｌａｐメン
バーに結合している。

標識−５ｂｐメンバ一結合体（抱合体）が試料と結合し
ていない場合には、試料がイム／クロマトグラフを横切
った後、このイムノクロマトグラフを標識−５ｂｐメン
バ一結合体を含有する溶液に、実質」１均−に接触させ
る。標識およびプロトコールにより、１または１以上の
信号生成系の他のメンバーをも含有させることができる
。

酵素−５ｂｌ＋メンバ一結合体の場合には、イム７クロ
マトグラフを酵素−３ｔｉｌ＋メンバ一結合体および基
質、さらには所望により捕捉剤を含有する溶液に接触さ
せる。この状態において、一方の酵素はイム／クロマト
グラフに結合しており、この酵素と５ｌ）Ｉ）メンバー
に結合している酵素とは、一方の酵素の基質がもう一方
の酵素の生産物である、という関係にある。この酵素−
ｓｂμメンバー結合物は、通常水性緩衝液中に入ってお
り、利用し得る結合部位の数よりも実質」二、過剰に存
在している。ｐＨ域および緩衝液に関しては、既に考察
した。この酵素−３１１１１メンバ一結合物が、リガン
ドまたはりセプターのいずれか一方と結合すると共に、
呈色するのに充分な時間の経過後、該溶液からイム／ク
ロマトグラフを取除く。２種の酵素が含まれていること
から、酵素−５ｌａｐメンバ一結合物と基質とを同じ溶
液内で結合させることができ、従って、イムノクロマト
グラフと接触させる前に予め反応させておくことがない
ので、プロトコール中の１工程を省略することがで終る
。

酵素−ｓｌ〕ｐメンバー結合物とイムノクロマトグラフ
とを接触させた後、このイム７クロマトグラフを基質溶
液に浸漬することにより、展開する。

この場合、１つの酵素は、イム／クロマトグラフに結合
してもよく、いなくともよい。

フエンザイム標識を用いた場合には、展開溶液は、通常
、（１）コエンザイムを再生するための１または１以」
二の酵素、および（２）基質を含有するであろう。酵素
反応にはフエンザイムが要求されるので、酵素と基質と
は、免疫吸収帯と接触させる前になんら反応させずに、
単一の展開試薬として結合させておくことができる。

基質は酵素に伴って変化し、それは通常、速度を制限す
ることがない様、実質上過剰に存在させる。また、水）
音波は通常、酵素系のために適当に緩衝化されており、
かっ、ある酵素の生産物であって他の酵素の基質である
物質に対する捕捉剤（例えは、尿酸分解酵素の産物であ
る過酸化水素に対するカタラーゼ）を含有していてもよ
い。

このイムノクロマトグラフを、充分に検出可能な信号生
成性化合物が生産され、イムノクロマトグラフのアナラ
イト結合域が明確になるまで、充分な時間、展開溶液に
接触させておく。検出し得る信号が生産されたならば、
クロマトグラフの一端からの距離を測定し、試料中のア
ナライトを定量するための尺度とする。

境界線に幾分かの乱れが認められるがもしれないが、大
多数の場合、境界線は、かなり明瞭なので、広範囲に及
ぶアナライトに関し、２またはそれ以下の因子の濃度変
化を、μｇ単位からＩ１ｇ単位の範囲内で検出すること
がで外る。かくして、基質に適当な染料前駆物質を用い
ることにより、アナライトの量を、使用者による、妨害
に対する感受性が比較的少ないプロトコールで、単一の
測定（試料）を含む視覚的な観察により、定量的に測定
することができる。

朋 本発明方法に用いる成分は次の通りである。吸収性支持
体、結合剤、ｓｂｐメンバー結合体（ｓｂｐメンバーお
よび標識を含む）、イムノクロマトグラフ上の特定の帯
域（免疫吸収性帯域）内の吸収材に結合しているｓｂｐ
メンバー、信号生成系の残りのメンバー、アナライトを
含有している試料、並びに、適当ならは′、ポリリガン
ドまたは多価リセプター。

アナライト 本発明のりガントアナライトは、単一の抗原決定基また
は多価抗原決定基を有することを特徴とするのに対して
リセプターアナライトは、単一または複数個の結合部位
を有していてもよい。多抗原決定基性のアナライトは、
通常、ポリ（アミノ酸）、即ち、ポリペプチドおよびタ
ンパク質、多糖類、核酸類、およびそれらの配合物であ
ろう。

その様な配合物または集合物には、バクテリア、ウィル
ス、染色体、遺伝子、ミトコンドリア、核、および細胞
膜等が含まれている。

本発明で用いられる多抗原決定基性リガンドの大部分は
、分子量が少くとも約５．０００、あるいは通常、少く
とも約１０，０００であるポリ（アミノ酸）の範ちゅう
に属するものであって、興味深いポリ（アミノ酸）の分
子量は、一般に約５０，０００から５，０００゜０００
の範囲が、より一般的には、約２０，０００から１．Ｏ
ｏｏ、ｏｏｏであり、興味深いホルモンの場合の分子量
は、約５，０００から６０，０００の範囲内である。

有用なりガントに関する広範囲のリストは、アメリカ特
許第４，２７５，１５９号に見られ、それらは、第１２
欄から第１７４１ｉ１１にかけて開示されている。

単−抗原決定基性リガントの分子量は一般に、約１００
から２　、０００であり、より一般的には約１２５から
１　、　ＯＯＯの範囲である。興味深いアナライトには
、薬剤、代謝産物、殺虫剤および汚染物質等が含まれる
。

興味深い数多くのアナライトがアメリカ特許第４．２７
５，１４９号、第１７憫および第１８（閑に掲載されて
いる。

リセプターアナライトの分子量は、通常、約１（］４か
ら２　Ｘ　１．０６の範囲内であり、より一般的には、
約３ＸｉＯ”〜２Ｘ１０６の範囲内であろう。

免疫グロブリンについては、Ｉ　８７＋、ＩｇＤ、■８
Ｅ、ＩｇＧおよびＩｇＭの分子量は、約１６（’１．０
００から約１０６の範囲内で変化するであろう。

酵素類は並通、約ｉｏ、ｏｏｏ〜６００，０００ダルト
ンの間で変化し得る。天然のりセブターは広範囲に変化
するが、その分子量は一般に、少くとも約２５，０００
、さらに、約１（）６およびそれ以上であり、その様な
物質には、アビノン、チロキシワ結合グロブリン、チロ
キシン結合プレアルブミン、トランスコルチンおよび膜
表面タンパク質等が含まれる。

リガンドか他の分子または支持体と結合する場合、リガ
ンドはしはしば、特定の部位に特定の官能基を有するよ
うに修飾される。この修飾によってリガンド同族体とし
て表わされる産物か得られる。アメリカ１、！５乍第４
，２７５，１４４〕号、第１８および第１９欄にかけて
、広範囲なり〃ンド同族本に関する記述が認められる。

楚令選 本発明方法では、全血中の赤血球細胞を凝集させること
のできれ結合剤のすべてを用いることができる。ただし
、それらの結合剤は、ｓｂｐメンバ−を凝集したり、３
ｂｌ＋メンバー自身の結合を妨害する、等の作用によっ
て本発明の分析を妨害するものでないことを条件とする
。この結合剤は、赤血球細胞を表面と液相との中間に分
配させるものでなければならない。

結合剤の１つのグループは、赤血球細胞を相互にイ′−
１着させるような凝集剤である。その様な凝集剤の例に
は、赤血球細胞に対する特異抗体がある。

例えば、ヒト−赤血球細胞に関しては、その様な細胞に
対する抗体を、非−ヒト宿主中で常法に従って生しさせ
ることができる。別法として、当該技術分野で周知の方
法により、ヒト赤血球細胞に対するモノクローナル抗体
を生産することがでとる。

また、全血試料中の赤血球細胞を凝集することので外る
他の物質を結合剤として用いてもよい。

その様な物質の例として、ボリリノンおよびポリアルギ
ニンの如きアミノ酸重合体、並びに小麦胚芽凝集素やコ
ンカナバリンＡの始終レクチン類がある。

イムノクロマトグラフ イムノクロマトグラフには、毛管現象で液体を通過せし
めると共に、ｓｂｌ〕メンバーを非拡散的に結合させる
吸収を含むが、更に、信号生成系の１または１以上のメ
ンバーを含有することもある。

異なった寸法（特に厚み）、異なった材料および異なっ
た形状の、広範囲に及ぶ様々な資材を用いることができ
る。大多数の場合、その形状は伸長された形状であり、
矩形状の切片（スＩ・リンプ）が便利である。この切片
の少くとも一部には、該切片に均一に結合したｓｂｐメ
ンバーが保持されている。この切片の大きさは、ある程
度、取扱い上の便宜に委ｆンられている。また、免疫吸
収帯は、アナライトが関心を引くような濃度範囲内で存
在していると思われるアナライト分子の全てに適応する
ことかできるよう、充分な大きさでなげればならない。

そのプロトコールが、アナライトと標識５ｌ）ｐメンバ
ーの両方を結合することを内容とするものであれば、免
疫吸収帯は、アナライトと標識ｓｂｐメンバーの両者の
ための容量を有する必要がある。

広範囲に及ぶ吸収材を用いることができ、それらは、天
然または合成の重合物質、特に、１紙やクロマト用紙等
の繊維を含む紙類の如とセルロース性の物質、架橋させ
たデキストラン、アクリレートの如き合成ポリマーまた
は天然起源のポリマーに改良を加えたもの、を含み、そ
のままで、あるいはシリカの如きセラミ・ンク材料に抱
合させて゛用いられる。

イムノクロマトグラフの厚みは、通常的０．０５ｍｍか
ら約２ｍｍの範囲で変動するが、約（１，１ｍｍ〜約０
．５１がより一般的であり、約０　、２　ｎｕｎ〜約“
０．４ｍ勤（好ましい。１紙の構造は広範囲に変化し、
細い中程度に細い、中程度、中程度に粗い、粗いものが
含まれる。その表面は、硬度および柔軟度をも組合わせ
て、滑らかな状態と、４ト・状態の様々な組合わせで変
動し得る。

このイムノクロマトグラフは種々の不活伯な支持体（Ｍ
ｙｌａｒＲ（ＤｕｐｏｎＬ）、ポリスチレン、ポリ−エ
チレン等々）によって支持することができる。

支持体は、イムノクロマトグラフと１ｌｆｉ隔をあけて
その裏打ちとして用いてもよく、縁どりまたはその飢、
イムノクロマトグラフの機械的強度を増大するような構
造で用いることができる。

このイム／クロマトグラフは、その性質を改良するため
に広範な種類の物質で被覆してもよい。

被膜には、タンパク質膜、多糖類膜、砂糖あるいは、特
に、該支持体と抱合している物質の安定性を増大させる
のに用いられる物質が含まれる。これらの化合物はまた
、種々の物質、例えばｓｂｌ＋メンバー、あるいはイム
７クロマトグラフに結合した信号生成系のメンバーの結
合を改良するのにも用いることか”できる。

イム７りロマトグラフは、その表面に抱合されるべぎ有
機物質を共有結合させるように、反応性の官能基化に上
りで活性化する。イムノクロマトグラフの吸収材表面を
一活性化する方法には、アシル基による官能基化（例え
ばカルボニルンイミダゾール）臭化シアンまたはグルタ
ルアルデヒドやコハク酸の如トニ官能基性化合物を用い
る方法が含まれる。種々の物質を吸収材表面に結合させ
る方法は文献の中に見出すことができる。例えば、アメ
リカ特許第４．１６８．１４６号参照。

表面に結合したｓｂｐメンバーの量は、表面の大きさお
よび全アナライトが結合するのに要求される量、並びに
、所望により、標識ｓ　ｂ　ｐメンバーの数によって変
動し得る。一般に、３１１１１メンバーの量は約１０−
５−１０−”モル／ｃｍ２、より一般的には約１０−”
〜１０−”モル／Ｃｍ２の範囲内であろう。単位面積当
りのモル数は、アナライトによって横切られた距離につ
き、関心のある濃度範囲を区別することを充分に保証す
るために、変化させる。

好ましい実施態様では、信号生成系の１メンバーは、吸
収材の表面に非拡散的に結合している。

特ニ、１つの酵素は表面に結合しており、これがもう一
つの酵素で標識されている標識５ｌａｐメンバーと反応
する。酵素類の関係は、信号生成系に関する記述の中で
議論する。

ｓｂｐメンバーと信号生成系とは種々の表面に対して共
有結合よりもむしろ吸着によって結合している。このこ
とは、吸収材をｓｂｐメンバーおよび／または信号生成
性メンバーを含有する溶液と接触させることを含む。イ
ム７りロマトグラフと溶液とは、浸漬、噴霧、塗布、そ
の地均−性を与えるような方法で接触される。

通常、比較的大きいシートを使用し、これを適当な大き
さに切断して用いる。

信号生成系 信号生成系は、大抵の場合、電磁放射、特に紫外部およ
び可視部領域の光、より詳細に言うと約ＩＬ　００〜８
００　ｎｍの範囲の波長の放射、の吸収または放射が関
与する検出可能な信号の生成に係るものである。免疫ク
ロマトグラフの性質」二、検出可能な信号を得るには、
単位面積当り、十分な濃度のラベル（標識）が存在して
いることか必要である。従って、大抵の場合、個々のラ
ベルは所望の感度が得られる程十分ではないであろう。

そのため、１個のラベルされたｓｂｌ＋メンバーについ
て複数個の検出可能な分子を生成せしめる手段を設けな
ければならない（その様な生成のための手段を提供する
信号−生成ラベルが、ラベルされたｓ　１１１）メンバ
ーの免疫吸収帯通過を妨げない場合には）。

従って、酵素または補酵素の様な、検出され得る多数の
分子を生成し得るラベルを使用する。それで、１個のラ
ベルの存在によって増幅が得られる。

光を吸収する生成物、例えば染料、あるいは発光または
化学反応によって光を発する生成物、即ち蛍光物質また
は化学発光体を生成することによって所望の増幅を達成
する酵素や補酵素が使用される。この様な生成物を与え
る多数の酵素または補酵素が、米国特許第４，２７５．
］４９号の１９〜２３欄、米国特許第４，３１８．９８
０号の１０〜１４欄に記載されている。

１個の酵素の生成物が、もう１つの酵素の基質であると
いう関係にある酵素群の組み合せを使用するのが特に重
要である。この様にして、結合したアナライトを含んで
いる領域と含んでいない領域との境界を、より有効に決
定する。

多数の酵素の組み合せが米国特許第４．２７５゜１４９
号の２３〜２８１９１１に記載されており、それらの組
み合せを本発明で使用することがで外る。

過酸化水素の生成に関与する酵素、およびその過酸化水
素を使って染料前駆体を酸化して染料にするものが特に
重要である。具体的な組み合せは、糖類オキシダーゼ、
例えばグルコースおよびガラクトースオキシグーゼ、ま
たはへテロ環式オキシダーゼ、例えばウリカーゼおよび
キサンチンオキシダーゼを、染料前駆体を酸化するのに
過酸化水素を使用する酵素、例えばペルオキシダーゼ、
ミクロペルオキシグーゼおよびチトクロームＣオキシダ
ーゼと組み合せたものである。その池の酵素の組み合せ
か、上記の文献に記載されている。」−記の酸化還元酵
素の組み合せが好ましいが、加水分解酵素、転移酵素、
および」二記のもの以外の酸化還元酵素などのその池の
酵素も使用することができる。

使用し得る補酵素には、ＮＡＥ［Ｉ（］；　ＮＡＤＰ［
１−１］、ピリドキサル燐酸；　ＦＡＤ［ｌ（］；　Ｆ
ＭＮ［８１など、通常、酸化還元酵素と結合する補酵素
が含まれる。サイクリング反応に関与する多数の補酵素
については特に米国特許第４，３１８．９８０号参照。

酵素反応の生成物は通常染料または蛍光物質である。非
常に多くの蛍光物質の例が米国特許第４゜２７５．１４
９号の３０〜３１欄に記載されている。

ラベルｓｂｐメンバー抱合体、リセプター、吸収性担体
およびアッセイを行なう条件を適当に選択または操作す
ることにより、本発明を２つの異なった手順（プロトフ
ール）で実施することができる（アナライトおよび酵素
＝ｓｂｐメンバーを同し溶液で免疫クロマトグラフに適
用する）。　１つの手順においては、アナライトが通過
した免疫吸収帯領域か、アナライトが存在している領域
全体に渡って実質的に均一に検出可能な信号が生成され
ることによって観察することができる。もう１つの手順
では、主として、アナライトによって占められる免疫吸
収帯の中の領域に関係において検出可能な信号を観察し
得る。

アナライトと比較して、ラベル−５ｂｐメンバ一抱合体
の異なった結合定数、移動率、吸着などによって、異な
った結果が得られるがもしれない。

ラベルに結合した、ｓｂｐメンバー、特にハプテン性ア
ナライトの数を変えることにより、吸収材に結合したり
セプターの結合特異性を変えることにより、例えばハブ
テンアナライトと抗原との間に１個の結合基を持ってい
る免疫原に対する抗体をつくり、そして、ラベル−パブ
テンアナライト抱合体との異なった結合基を使用するこ
とにより、Ｒｆファクターを変えるために溶媒および／
または担体を変化させることにより、あるいはその他の
方法で゛この様な変化を達成することがでとる。

ラベルとして１個の酵素を持った信号生成系に２個の酵
素を使用する結果として、簡単な手順を採用することが
でた、また、アナライトが進行した先端の正確な輪郭を
提供する強い検出可能な信号が得られる。吸収材に結合
している酵素の生成物を、ｓｂｐメンバーに抱合された
酵素の基質としているので、鋭く、迅速で均一な検出可
能信号の展開が免疫クロマトグラフ上で観察される。更
に、検出可能な信号を生成する化合物が、その表面に素
早く沈降するのを促進するために、免疫クロマトグラフ
に結合した酵素のための基質濃度を局所的に高くする。

本発明は、先行技術の方法より優れた多くの利点を有す
る。本発明の主な利点は、アッセイを全血試料に適用し
得るという点にある。即ち、アッセイを行なう前に、ま
ず、赤血球から血漿を分ｇｔｔする必要がない。

本発明のアッセイは、全血試料から赤血球細胞を分離す
るための複雑な装置を使用することなく、特別の訓練を
受けていない人によって、診療室で行なうことができる
。もう１つの本発明の利点は、極く少量の全血試料でア
ッセイを行なうことができるという点にある。通常、ア
ッセイを行なうのに１．２滴の血液、即も約５０〜１５
０μ夕の血液が必要なだけである。この様に、本発明は
、アッセイを行なうのにずっと多量の全血試料を採血す
るという行き過ぎた操作を避けるものである。指を刺し
て一滴の血液を採取するだけで十分な試料を得ることが
できる。

λ１上 簡便化のため、この免疫クロマトグラフは、アナライト
をアッセイするに際して試料を組み合せるための池の試
薬類を組み合せて包装したキットとして提供することが
でとる。このキットの成分は、予め決められた比率にし
ておく。２種の酵素を入れる場合は、他の試薬には酵素
ラベル化ミンプ（ｍｉｐ）、吸収材に結合した酵素の基
質、酵素に必要な補酵素およびその北の基質、および検
出し得る発色団または発蛍光団を提供する染料前駆体が
含まれる。補酵素ラベルについては、補酵素ラベル化メ
ンバーおよび染料前駆体を含んでいる適当な酵素（群）
か含まれよう。更に、安定化剤、緩衝剤などのその池の
添加物を含ませてもよい。各種の試薬の相対量は、アッ
セイの感度を実質的に最高にする溶液中の試薬濃度とな
る様に、広範囲に変えることができる。特に、これらの
試薬は、賦形剤を含んでいる乾燥粉末、通常、凍結乾燥
品として提供することができる。この乾燥粉末を溶解さ
せると、試料と混合するための適当な濃度の試薬溶液が
得られる。

以下に実施例を挙げるが、本発明はこれらの実施例に制
限されるものではない。

実施例において使用した略号は、ｌす下の意味を有する
：ＨＲＰ−ワサビペルオキシグーゼ、ＷＧＡ−コムギ胚
凝集索、Ｎ　ＨＳ　−Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド、
ＥＤＡＣ−エチルジメチルアミ７ブロピルカルボジイミ
ド ムアミド、ＢＳＡ−牛血清アルブミン、Ｂ　Ｇ　Ｇ　−
牛ガンマーグロブリン。温度は特（４旧尚しない限り摂
氏で表わしている。液体の混合物は容量で示すが、その
池は重量部で表わしである。

実施例Ｉ　Ｈ［）−オキシアミンの調製５ｍＭの酢酸ナ
レ戸ンム（ｐｌ（４．５の緩衝液）中に１．ＯｍＦ１７
ｍβのワサビペルオキシダーゼを入れた液５　＋ｎ　Ｅ
に、０．２Ｍ過沃素酸す）　＋７ウム５０１１加え、こ
の混合物を３０分間撹拌した後、Ｇ−５０セフ７デツク
スＲカラムクロマトグラフイーにかけ、２ｍＭ酢酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ４、５）で溶出しｒこ。蛋白質画分
を集め（２９Ｊ）、この混合したものを４’Ｃｊこ冷却
し、Ｏ　、　Ｓ　Ｍ炭酸緩衝液（ｐｔ−１９．５）中の
０．２Ｍ　２．２’−オキシービメーエチルアミン２．
９Ｊを４”Ｃで添加した。

この混合物の１）Ｉ（を、ＩＮ水酸化ナトリウムで９。

５に調節して２時間撹拌し、４ｍＨ／Ｊの水素化硼素ナ
トリウム／水溶液３．５２箱灸を加え、この混合物を３
時間反応させた後、セフ７デンクス８Ｇ−５０カラムで
クロマトグラフィーした。

トＩＲＰ４００ｍｇを用いて上記の操作を繰り返し、２
、２゛−オキシ−ビス−エチルアミン３．５８を得た。

もとのアミンと修飾したアミン（更に約４個のアミノ基
を有するもの）には、酵素活性における有意な変化は観
察されなかった。

実施例２　免疫クロマトグラフの調製 １枚のワンドマン３］．ＥＴシ戸紙（１８５Ｘ２３０ｍ
ｍ）を１、８でのピリジン（０．２Ｍ、カルボニルシイ
ミグゾール中）に浸し、その混合物を室温で１時間、お
だやかに撹拌した。もう１枚の濾紙を同じ活性化溶液中
で活性化した。濾紙をそれぞれテトラヒドロ７ラン３０
０−で洗浄し、空気噴射器を使って約２０秒間風乾した
。

重炭酸緩衝液（ｐ）（９．５、７　０ｍｌｌＩ４　Ｎａ
ｌ（Ｃｌ，Ｌと３０ｍＭ　Ｎａ２Ｃｏ，）に入れた抗テ
オフィリン溶液（２ｍｇ／ｍ．ｅ）１　１）Ｏｍｌを皿
に入れた。」二テ調製した一枚の濾紙を皿に入れ、上記
の抗体溶液でフロントした。１時間後にエタノールアミ
ン５０（）−を皿に加え、更に１時間後に皿からシ戸紙
を取り出し、１００ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ＋（ｐＨ７．０
）および２００ｍＭＮａＣｌを含んでいる緩衝液５００
ｍβで２回洗浄した。次いで濾紙を脱イオン水５００１
１Ｉｆｌ　で１回洗浄した。洗浄後、濾紙を（）。

５％の水性ポリビニルアルコール２５０Ｊ　に約２０分
間浸した。このポリビニルアルコール溶液から濾紙を取
り出してフロットし、６５°Ｃで５分間トンネル乾燥し
た。

実施例３　テオフィリンおよびＨ　Ｒ　Ｐの抱合反応７
ラスフに１−メチフレ−３−（３’−カルボキシプロピ
ル）キサンチン８．１ｍｇ，ＮＨＳ３．８ｍｇ，ＥＤＡ
Ｃ６．７ｍＢおよびＤＭＦｌ．２Ｓμ夕を入れ、この混
合物を室温で１夜放置した。

０、１Ｍ炭酸ナトリウム（ｐＨ９．０）にＨ　Ｒ．　Ｐ
　−オキシアミン（１ｍε）を入れた１　、　３　ｍ　
ｐの試料を４っ用意し、これに、」二で調製した種々の
量のエステルを加え、Ｈ　Ｒ　Ｐに対するテオフィリン
のモル比が４００、２００、１００および１　ｏ　Ｏで
ある標本を得た。１番目の反応混合物（モル比：　４０
０）に、ＤＭＦｏ．２　１　７Ｊおよび８．２５μ，１
２増量の上記エステル６６μｆを約２時間で添加した。

２番目の反応混合物（モル比：２００）に、ＤＭＦｏ、
２３８ｍでを加え、８．２５μ！増量のニスチル３３μ
ｒを添加した。３番目の反応混合物（モル比：１００）
に、ＤＭＦｏ．２４Ｊを加え、８。

２μ℃増量のエステル１６．５μ夕を加えた。最後の反
応混合物（モル比：］ＯＯ）には、Ｄ　Ｎａ　Ｆを添加
せず、２．１μρ増量のニスチル８．２５μｆを加えた
。添力１沖、温度４°に保持し、この混合物を４°で一
夜放置した。

次いで反応混合物を、標準的な緩衝液を使用し、Ｇ−２
５セフアデツクス　クロマトグラフイ−によって後処理
した。７オリン（Ｆｏｌｉｎ）およびｔＪ■スペクトル
分析により、テオフィリン／ＨＲＰ比はそれぞれ６．１
〕、４．０．１．６および２．１であることがわかった
。

実施例４　赤血球−特異結合剤を用いたアッセイ 全血試料００μづつ）をテオフィリンと混合し、実施例
３の抱合体０．２μｇ／Ｊ、グルコースオキシダーゼ１
０Ｌす／Ｉｎ！、ＢＳＡ１ｍｇ／ｍｌ、ヒトの赤血球に
対して特異な抗体５μ℃を更に含有している水性媒質中
、それぞれの濃度かＯ１２゜５．５．１０，２０および
４０μｇ／Ｊのテオフィリンを含む２％血液懸濁液とな
る様にした。

実施例２で調製したシ戸紙をＴめ６　、５　Ｘ　９０　
ｍｒｎの切片で切断した。一連の別々の切片の末端（約
Ｓｍ１ｏ）を、」１記の試料のそれぞれに浸した。

１０分後、グルコース６ｔ）＋ｎＭ、燐酸ナトリウム０
．１Ｍ　ＮａＣｌ！、０．２Ｍの）薄液（ｐｌ−１７、
０）で・あって、４００μｇ／論Ｉの４−クロロ−１−
す７トールを含んでいる展開液（８＋ａ　ｌ　）を各試
料に添加した。切片の底辺から色の先端主での距離を、
テオフィリンの）農度を異ｔこする各試料についてめた
。

比較（対照）のため、テオフィリン溶液に全血試料を加
えないことを除いて上記と同じ操作を行なった。

結果を表１にまとめた。２回の測定の平均値を示した。

表　１ （＋　１８　１８．５ ２．５　２４．５　２３ Ｓ　３１．５　３１．５ １０　３９．５　４２ ２０　４７．５　５０．５ ４０　５８　５７．５ 上の結果は、本発明方法によれば妨害となる赤血球細胞
を除去することなく、“全血試料について、テオフィリ
ンの正確なアッセイをすることができることを示してい
る。

実施例５　非特異的結合剤を用り・たアンセイ非特異的
結合剤、例えばレクチン（植物凝集素）を用いて７ノセ
イを行なうために、全血試料（各１２．５μｌ）を、実
施例３の抱合体（テオフィリン／　Ｉ−Ｉ　ＲＩ）　）
　０．８μｇ／Ｊ、グルコースオキシダーゼ１００　μ
ｇ／ｍｌ、ＢＧＧ１ｍｇ／＋Ｊおよび小麦胚芽凝集素（
ＷＧＡ）１０μ℃を更に含有してν・ろ水性媒質中の、
実施例４と同し濃度のテオフィリンと混合した。

免疫クロマトグラフィー切片の末端を上記の各試料に浸
した。１０分後、各切片を展開し、切片の底辺から色の
先′４までの距離を、実施例４と同様にして、テオフィ
リンの濃度を異にする試料について；則定した。

テオフィリン溶液に全血試料を添加しな０ことを除けば
、」二に記載したものと同し試料を用（・て、実施例４
と同様に対照試験を行なった。

結果を以下の表２に示す。２回の測定値の平均値を示し
た。

表　２ テオフィリン　高　さ　（■ｍ） 皇病（μ８／題ｆ）　２％全唾　対　照０　１７．５　
１６，５ ２、’５　２９．５　２７ ５　３５．５　３５．５ １０　４４　４４ ２０　５３．５　５４．５ ４０　０１．５−　Ｇも下− 」二の結果は、妨害する赤血球細胞を除去するための別
個の工程な設けなくても、植物凝集素の様な非特異的結
合剤を用いて、全血試料中のテオフィリンを正確に分析
することができることを示している。

上記の方法に従って、もう１つの対照試験を行なった。

この場合はテオフィリン溶液にＷＧＡを添加しないで行
なった。

その結果、赤血球細胞が色の先端と共に移動しその先端
を不明瞭にするのを防止し、従って、色の先端の移動距
離の測定を困難にするσ）を防止するのに、赤血球細胞
の非特異的結合剤、この場合は植物凝集素、が重要であ
ることがわかった。

特許出１１ａ人　シンテ・ノクス（ニー・ニス・エイ）
インコーホレイテッド 代理人弁理士青　山　葆　はか１名 手続補正書（睦） 昭和５９年１２月１３日 特許庁長官　殿 ２発明の名称 全血試料の分析法 ３補正をする者 事件との関係　特許出願人 インコーホレイテッド ４代理人 ５補正命令の日付：自　発

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．９〃ンドおよびホモローガスリセプクーからなる特
   異結合対の１メンバーである全血試料中のアナライトを
   測定する方法であって、水性媒質中で（Ａ）表面に特異
   結合対の１メンバーが実質的に均一に結合している吸収
   材を、その気／液境界面となっている予定された領域で
   、（Ｂ）全血試料および（Ｃ）全血試料中に存在する赤
   血球細胞のたちの結合剤と接触させ、そうすることｌこ
   よって、該媒質が該吸収材を横切って形成するアナライ
   トの量に関連した境界線を得ると共に、該赤血球細胞を
   、該気／液境界面において凝集させ、次いで、該境界線
   を、標識した特異結合対の１メンバーを含む信号生成系
   を用いて測定することからなる方法。 ２、結合剤が凝集剤である第１項に記載の方法。 ３、結合剤が赤血球細胞に特異的である第１項に記載の
   方法。 ４、結合剤が赤血球細胞の特異抗体である第１項に記載
   の方法。 ５、結合剤がレクチンである第１項に記載の方法。 ６、結合剤が重合したアミノ酸である第１項に記載の方
   法。 ７、結合剤がボリリノンである第１項に記載の方法。 ８．１）ｌＩが約６〜１０である第１項に記載の方法。 ９、］−程（Ｂ）におけるイオン強度が約０．１〜（１
   ，４の範囲内である第１項に記載の方法。 １０、リカ゛ン「′およびホモローカ゛スリセプターか
   らなる特異結合対の１メンバーを測定する方法であって
   、（１）該試料中の赤血球細胞のための結合剤；（２）
   少くとも１個の特異結合対のメンバーが結合している固
   体吸収材；（３）検出可能な信号を生成することのでき
   る信号生成系であって、そのメンバー中に、特異結合対
   の１メンバーとＰ合している標識が少くとも１個含まれ
   ている系、を使用し、（、）水性媒質中で、該試料、該
   結合剤、および信号生成系のメンバーの全てより少数の
   ものを混合し、（１）該吸収材の一部を該水性媒質に接
   触させて気／液境界面を形成し、該Ｗ貿を該吸収材に沿
   って拡散させると共に、該赤血球細胞を気／液境界面の
   近傍で濃縮させ、（ｃ）該吸収材を信号生成系の残りの
   あらゆるメンバーと接触させ、（ｄ）該信号生成系によ
   って得られた信号を検出することからなり、該信号が該
   試料中の該特異結合対メンバ′−の量に関連するもので
   ある方法。 １１、結合剤が、該赤血球細胞のための特異抗体である
   第１０項に記載の方法。 １２、第１項に記載の方法に用いるキットであって、該
   方法に従って、該試料を組合わせるために予め定めた比
   率で、（ａ）該赤血球細胞のための結合剤、（ｂ）少く
   とも１個のｓｂｐメンバーが結合している吸収材、（ｃ
   ）該試料中に存在するアナライトの量に関連した、検出
   可能な信号を生成することができる信号生成系、および
   （ｄ）補助剤、を１パツケージに配合してなるキット。