JP2590059B2 - クロマトグラフィー装置および同装置を用いる測定方法 - Google Patents

クロマトグラフィー装置および同装置を用いる測定方法

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Description

【発明の詳細な説明】 ［技術分野］ この発明は、クロマトグラフィー装置、および同装置
を用いる測定方法に関する。
［発明の背景］ 診断領域における重要性が認識されるようになって以
来、競合的な蛋白結合測定、即ち特異的結合測定の分野
は著しく発展した。特定化合物の検出、並びに化合物の
定量的測定を可能にする技術の向上によって、多くの薬
物の投与モニタリング（監視）、多くのホルモンの平衡
失調の定量、生理的活性蛋白質群の定量および病原体存
在の診断ができるようになった。各種の手法は分離段階
を加える必要性の有無、標識によって発現される信号
（シグナル）特性、その信号の発現（溶液内または表面
上）および定量に要する測定手段の態様によって区分さ
れる。
測定法を開発する場合、試薬類およびプロトコールの
考案に関して、多くの考慮すべき事項がある。その１つ
は、測定者の熟練の問題である。測定を比較的不馴れな
ものに行なわせ、しかも妥当な定量結果を収め得ること
を期待する場合が多い。比較的未熟な測定者の場合、複
雑な装置を必要とせず、単純かつ迅速な試験による定量
的測定を実施できることが特に望ましい。
［先行技術の説明］ 米国特許第4168146号には、抗原で免疫クロマトグラ
フィーを行ない、この免疫クロマトグラフを、標識抗体
を含有している水溶液と接触させることから成る免疫測
定法を開示している。米国特許第4435504号では、標識
を結合してある特異的結合対の構成要素を用いるクロマ
トグラフィーを行なって境界線を描出し、クロマトグラ
フの一端から上記線までの距離を存在している被検物質
量と関連させる、クロマトグラフィーによる免疫測定を
開示している。分析化学的な方法において有用な試示薬
の短冊状細片（ストリップ）が米国特許第3715192号に
開示されている。米国特許第3620677号では、多孔性毛
管物質と、この毛管物質の外表の少なくとも大部分を包
んでいる不浸透性被覆材料との組合わせを含み、これを
密接して予じめ選ばれた容量の吸収腔を区分して具備す
る表示装置を開示している。音波によって物品をプラス
チック製の台紙にしっかりと固定する方法が、米国特許
第4230757号に開示されている。それぞれ独立して正確
な方向に配設されている一連の排気弁を有し、目視検査
および粉じん計数の目的のため、隣接するフィルター群
の補完区域を露出するのに適している汚染物フィルター
・カバーが、米国特許第3350979号に開示されている。
米国特許第2371405号にはガス分析装置が開示されてい
る。
［発明の要約］ この発明は、クロマトグラフィー装置、および同装置
を用いる測定方法に関する。この装置はハウジングおよ
び、ハウジング内部に取りはずしできないように収容さ
れた吸収（水）性材料から成るストリップ（短冊状の細
片）との組合わせを含んでいる。一般にこのストリップ
は、ハウジング内壁の長さと幅より僅かに短い長さおよ
び幅を有している。ハウジングの内壁には、（１）スト
リップの前後両面がハウジングの内壁に基本的に触れな
いように、（２）ストリップの毛細管作用が実質的に変
化することのないように、また（３）ストリップが紙で
ある場合は、クロマトグラフ中、液体媒質のストリップ
内移動に支障のない程度にストリップがハウジング内で
伸張（膨張）できるように、ストリップをハウジング内
部に支持収容する複数個の突起要素を具備する。ハウジ
ングの底部にはストリップの一部と液体媒質の接触を可
能とする手段、即ち底部開口部に設けてある。またこの
ハウジングは目視的にストリップを観察する手段を有し
ており、さらにこれと連携してクロマトグラフィー試験
の結果の測定に役立つ表示手段を含むことができる。こ
の装置は、被検物質（アナライト、analyte）を含有し
ている疑のある試料中に含まれる被検物質量の定量的な
測定に、特に好適である。このような用途のためには、
毛管作用によってストリップを移動する液体媒質に含ま
れている被検物質に反応性がある１またはそれ以上の試
薬をこのストリップに含ませる。
［図面の要点］ 第１図はこの発明に係る装置をやや側方から把えた視
斜図、第２図はこの装置の前半部を前方から把えた装置
の斜視図、第３図は３−３の線に沿って截断した第２図
の装置の断面図、第４図はこの装置の前半部にある目盛
り（スケール）部分を前方から把えた斜視図、第５図は
この装置の前半部を背面から見た斜視図、第６図は６−
６の線に沿って截断した第５図の装置の断面図、第７図
は７−７の線に沿って截断した第５図の装置の断面図、
第８図はこの装置の後半部を前方から把えた斜視図、第
９図、第10図、第11図は、それぞれ９−９の線、10−10
の線および11−11の線で截断した第８図の装置の断面
図、第12図および第13図は、いずれもこの装置に取付け
ることができるストリップを前方から見た斜視図、第14
図は、第１図の装置の底部開口部を底側から把えた斜視
図、第15図は部分的に組立てたこの発明の装置を前方か
ら把えた斜視図である。
［発明の記載］ この発明は、被検物質を含有している疑のある試料中
の被検物質量の定量的な測定に適用するに特に適したク
ロマトグラフィー装置に関する。この装置は、ハウジン
グ（通常、小さいものである）と、ハウジング内部に取
りはずしのできないように収容されている吸収性の物質
から成るストリップとを含んでいる。一般にストリップ
の長さと幅はハウジング内壁の長さおよび横幅より僅か
だけ短くしてある。ハウジングの内壁には、ストリップ
をハウジング内に支持収容する手段を含んでいる。この
手段は、一般にハウジング内壁の全面および背面から突
出している複数個の要素として具体化される。この手段
は、（１）ストリップの両面がハウジングの内壁に基本
的に触れないよう、（２）ストリップの毛管作用が実質
的に変化することのないよう、また（３）このストリッ
プが紙である場合は、支障なく液体媒質を移動させるた
めにストリップをハウジング内で伸張できるように支持
収容する。ハウジングの底部にはストリップの１部を液
体媒質と接触可能とする手段が設けてある。またこのハ
ウジングは目視的にストリップを観察する手段、即ち底
部開口部およびこれと連携してクロマトグラフィー試験
の結果の測定に役立つ表示手段を具備している。
吸収性の物質から成るストリップは、通常紙のストリ
ップを用い、例えば測定のような化学試験を行なう試
薬、特に免疫測定を行なう試薬を含有している。この発
明の好ましい態様では、ストリップに沿って移動する液
体媒質の距離を測定するため、さらにハウジングに設け
た表示手段を含んでいる。
以下、この発明の説明においては、下記の定義を用い
る。
被検物質（アナライト）−測定すべき化合物または組
成物を言う。なおこれらは少なくとも１個の抗原決定部
位または受容体を共通して保有している単数または複数
個の、モノまたは多エピトープ性抗原リガンドまたはハ
プテンリガンドであることができる。
特異的結合対の構成要素（以下、「sbp」要素と略記
する）−２個の異なった分子であって、それらの分子の
一方が、他方の分子の特定の空間性および極性構造と特
異的に都合する領域を分子の表面またはくぼみ（キャビ
ティ）に有しているものを言う。特異的結合対の構成要
素とはリガンドおよび受容体（「抗リガンド」）を指
す。ほとんどの場合、受容体が抗体であれば、リガンド
は抗原またはハプテンが用いられ、その場合、これらは
免疫的対の構成要素である。
リガンド−その受容体が天然に存在し、またはこれを
作成することができる任意の有機化合物。
受容体（「抗リガンド」）−分子の特定の空間性およ
び極性構造（即ち、抗原決定部位）を認識することが可
能な任意の化合物または組成物。受容体の具体例として
は、例えばチロキシン結合グロブリン、抗体類、酵素
類、FABフラグメント類、レクチン類等の天然に生産さ
れる受容体が挙げられる。
標識−標識とは、他の分子または支持体と結合（コン
ジュゲート）する任意の分子を言い、２つの分子が含ま
れているときは、便宜的に、いずれか１つの分子が標識
となるように選ぶ。この発明では、標識は支持体と結合
しているsbp要素であるか、または支持体またはsbp要素
と結合している信号発信系の要素を表わす。
信号発信系−信号発信系は、少なくともその１成分が
sbp要素と結合（コンジュゲート）している１またはそ
れ以上の部分を有することができる。信号発信系は、外
部の装置、即ち標準的には目視計測によることが望まし
い電磁放射線の測定によって検出できる測定可能な信号
（シグナル）を発信する。ほとんどの場合、信号発信系
は発色団および酵素であって、この場合、発色団として
は、紫外部または可視部領域の光を吸収する色素、りん
光体、蛍光体、化学発光体等が挙げられる。
免疫クロマトグラフ−免疫クロマトグラフは、リガン
ドまたは受容体のいずれかである複数個のsbp要素を吸
収性支持体領域に結合して有しており、支持体は、液体
が被検物質および適当な場合には信号発信系の任意の要
素を運び、この結合領域を横断して移動することを可能
とするものである。sbp要素は、共有結合または非共有
結合によって支持体と非拡散状に結合している。またさ
らに、１またはそれ以上の信号発信系要素を、共有結合
または非共有結合によって吸収性支持体と非拡散状に結
合することができる。
添付図面により、この発明の装置についてさらに詳し
く説明する。但し、この説明によってこの発明の範囲を
制限しようとするものではない。
第１図に示したクロマトグラフィー装置20は、熱加塑
性物質等によって都合よく作成することができるハウジ
ング22を有する。該装置の寸法は、一般に長さ約10〜14
cm、横幅約８〜12mm、奥行約４〜6mmである。吸水性の
材料から成るストリップ24をこのハウジング内に取りは
ずしできないように上端をハウジングに固定して収容す
る。ストリップの長さと幅はハウジングの内壁の長さお
よび横幅より僅かに短くする。吸水性物質から成るスト
リップは紙のストリップが好ましく、さらに免疫クロマ
トグラフが好ましい。
この発明のクロマトグラフィー装置を組立てる好まし
い態様は第２〜15図によって示すことができる。この装
置は前半分の断片部26と後半部の断片部28で示される２
つの断片部（半片）から都合よく組立てられる。26およ
び28の両断片部は、それぞれ断片部26の縁30と断片部28
の縁32に沿って連結される。両断片部は互いに固定し合
う構造を都合よく備えることができる。例えば、前半部
26に突起34を設け、この突起をはめる受理手段36にきっ
ちりはまるように設計することができる。ストリップ24
を断片部28に取付けた後（第15図）、断片部26および28
を互いにその縁に沿って連結し突起34を受理手段36には
めこむ。断片部26と28は音波エネルギー、接着剤、熱等
の通常の手段を適用することによって互いに密封し、ハ
ウジング22を形成することができる。好ましい手段は音
波溶接を作る音波エネルギーの適用であって、縁は好適
なエネルギー導波部を備えることができる。前半部およ
び後半部から成るこの発明の装置の組立ては単に例示的
なものである。この発明の装置を作成し得るその他の手
段は、この明細書に開示した方法を参照すれば、当業者
の容易に想到し得るものである。
ハウジング22の内壁には、ストリップ24を支持し収容
する複数個の突起要素を備えており、下記効果が発揮さ
れるようにしている。（１）ストリップ24の前面および
背面は、ハウジング22の内壁38および40と本質的に接触
することがなく、（２）ストリップの毛細管作用は事実
上、全く変ることなく保持され、（３）ストリップが紙
である場合は、液体媒質が支障なく細片を移動し得るよ
う、これを伸張できるようにする。上記効果は、この発
明の装置を有効に作動させるのに極めて重要である。前
述のように、ストリップの長さと幅はハウジング22の内
壁38および40の長さおよび横幅より僅かだけ短い。この
装置の有効な作動を得られるかどうかは、吸水性の物質
から成るストリップが化学試験を行ない、正確な結果を
得ることができるに足る十分な大きさを有しているかど
うかにかかる。したがって吸水性の物質から成るストリ
ップは、感度が落ちるほどにまで小さくすることができ
ない。また同時に、クロマトグラフィー全体の装置の容
積を大きくする必要が生じる程、ストリップを大きくす
ることはできない。装置は片手の指で容易に操作できな
ければならない。またストリップの毛管作用に支障を来
たすことをなくするために、ハウジングの内壁にストリ
ップが接触しないようにしなければならない。もしスト
リップをハウジングの内壁に接触したまま放置すると、
吸水性のストリップの毛管作用が損われて、測定中、誤
まった結果を生じることがある。さらに、液体媒質が毛
管作用でストリップ中を移動するので、乾いているスト
リップが濡れて伸張する。したがって、ストリップを支
持収容するためハウジングの内壁に取付けられている複
数個の突起要素は、ストリップをハウジングの内壁に接
触させることなく伸張させることができるものでなけれ
ばならない。
そのような手段の例は、ハウジング22の内壁38および
40に見られる突起要素42である。突起要素42は一般に、
ハウジング22の内壁と一体のものであり、円錐形、長方
形または長円形、卵形、直角四辺形および３角形等の柱
状の形をとることができる。突起要素42に肝要な点は、
ストリップ24の毛管現像になんら顕著な変化が起こらな
いようストリップ24との接触面積をできる限り小さくす
ることである。「なんら顕著な変化が起こらない」の語
は、化学試験が顕著な影響をうけ、そのため試験の正確
さが低下または消失するほどストリップ24の毛管現象が
変化しないことを意味する。例えば、ストリップ24が免
疫クロマトグラフである場合、試料中の被検物質を正確
に定量できるためには十分な毛管作用を持続しなければ
ならない。一般に、突起要素42はハウジング22の長手方
向の側面と平行に列を作って並んでいる。一般に突起要
素42は、ストリップの乾燥時にはストリップが前後方向
へわずかに動揺できる程度の余裕をもたせてあるが、移
動液体によってストリップが濡れるとそのような動揺を
防止する。通常、ストリップが乾燥しているときの前後
方向への動揺の幅は0.5mm〜1.0mmである。一般にハウジ
ング22の前および背面の各内壁に、側面当たり約４〜６
個の突起要素が約２〜4mmの距離で配置されている。
ストリップ24は、通常、その上部末端でハウジング22
に固定される（第15図）。したがって、ハウジング22の
前および背面の壁26および28にはストリップ24の上端を
ハウジング22へ圧着固定する手段を備えている。そのよ
うな手段は、例えば壁26および28と一体をなす隆起部44
であって、これらの隆起部44はハウジング22の側壁を横
切っている。これらの隆起部44はストリップ24の上部と
密着し、ストリップ24をハウジング22の内部に固定す
る。第８および９図について説明する。背面壁28はそれ
と一体をなす３角形の隆起部44を含んでいる。隆起部44
はハウジング22の両側壁46へ向って横断して延びてい
る。ストリップ24をハウジング22に固定する部分で、側
壁46は狭まり、ストリップ24の両側部とハウジング22の
狭まった部分48とが密着してストリップ24をハウジング
22に固定するのを助ける。前壁26には、ハウジング22の
側壁と平行している突起部50が設けられている。突起部
はストリップ24と密着するのに十分な大きさであり、し
たがってストリップ24は隆起部44と突起部50との間に固
定される。
また、このクロマトグラフィー装置は、ストリップ24
の１部が液体媒質と接触できるよう、ハウジング22の底
部に設けた開口部を有している。第14図において、ハウ
ジング22は、その底部に底部開口部52を備えている。こ
の底部開口部は２重の機能を有する。即ち、これはスト
リップ24を液体媒質と接触させ、また後壁28にある後壁
開口部53と共に装置からの排水を行う。
この発明のクロマトグラフィー装置は、さらにストリ
ップ24を目視的に観察し得る手段をハウジング22内に具
備する。添付図面で説明すれば、このような手段はハウ
ジング22の前壁26にある窓54により提供される。窓54
は、概してハウジング22の側壁と平行して開口してい
る。窓54の長さは、このクロマトグラフィー装置を使用
して実施される化学試験によって決まる。多くの場合、
ストリップ24が免疫クロマトグラフであれば、窓54の長
さはストリップ24の表面の実質的な部分、即ちその50％
より大きく、好ましくは80％よりも大きい部分を目視で
きるよう設けられる。
また、この発明の装置はストリップを目視的に観察す
るための手段と連携する表示手段を具備する。この表示
手段はクロマトグラフィー試験結果の測定を助ける。添
付図面で説明すれば、表示手段は目盛りした尺度56であ
り得る。ストリップ24が免疫クロマトグラフである場合
には、尺度56の目盛りは未知試料に含まれるある被検物
質の濃度と関連（比例）させることができる。
この発明の装置はさらに、液体媒質がストリップ24を
十分な距離移動して上部末端に達したことを検知するた
め、ハウジング22に設けた手段を含む。ハウジング22の
前壁26はその上部末端に、ストリップ24の上部末端を視
認するための上部開口部58を有する。ストリップ24の上
部末端には、上部開口部の丁度真下に、常用の水溶性色
素を含ませることができる。ストリップ24を移動して来
た水性媒質がこの色素に接触して信号を発生すると、上
部開口部58を通してこれを視認できる。別法として、上
部開口部58を通して見えるストリップ24の上部末端は、
乾燥状態ではある色を、また湿潤状態では別の色を示す
もの、例えば塩化コバルト、塩化銅等のような薬剤を含
むことができる。別の態様として、ストリップ24の上部
開口部58を通して見える部分にpH指示薬を含むことがで
きる。pH指示薬には、移動して来る媒質のpHによって乾
燥時の色と異なる色を発色することができる。そのほか
別法として、液体媒質と接触し、上部開口部58を通して
見ることができる信号を生じる、例えば色素、色素の前
駆物質、酵素、酵素基質等のような化学薬品をストリッ
プ24の上部に含有することができる。
上述のようなこの発明の装置は、特にクロマトグラフ
ィー段階を用いることによる化学試験の結果を測定する
のに使用できる。この装置は、特に被検物質を含有して
いることが考えられる試料中の被検物質量を定量的に測
定する方法に適用できる。この好ましい利用では、スト
リップ24は免疫クロマトグラフである。そのような免疫
クロマトグラフの例および免疫クロマトグラフを使用す
る方法は米国特許第4168148号および同第4435504号に開
示されており、その内容を引用して説明に代える。
既知のクロマトグラフィー法は、吸水性のストリッ
プ、例えば固定した固体相と移動する液体相を含んでい
る段階によって実施される。固定した固体相は多くの異
なる溶液中に含まれる複数個の試薬と接触することがで
きる。
sbp要素が吸水性のストリップと非拡散状に結合して
いる区域を「免疫吸着帯（イムノソルビング・ゾー
ン）」と称する。試料の被検物質は溶媒と共に運ばれ、
溶媒の先端がこの帯と交差する。被検物質は、支持体と
結合しているsbp要素と相同的なsbp要素であっても、ま
たはこれと相補的（レシプロカル）なものであっても、
sbp要素複合体の形成を介して支持体と結合する。信号
発信系は、被検物質が結合している免疫吸着帯にある区
域を、それが含まれていない区域から区分できる方法を
提供するので、免疫クロマトグラフ上の予め定められた
点からの距離は試料中の被検物質量の尺度となる。
好適な溶媒によって試料を溶解し、毛管現象によって
溶液が免疫吸着帯を通過する結果、免疫吸着帯を通る試
料の移動が増加する。
普通、溶媒は水性媒質であり、他の極性溶媒、特に炭
素原子１〜６個、一層普通には１〜４個のアルコール、
エーテル等の酸素含有溶媒を約40重量％まで増加するこ
とができる。通常、溶媒は約20重量％以下の量で存在す
る。
媒質のpHは通常４〜11の範囲であり、より一般的には
５〜10であり、好ましくは約6.5〜9.5である。pHはsbp
要素の結合親和性が高い水準に維持されるように選ばれ
る。溶出中、所望のpHに到達しそのpHを維持するため、
種々の緩衝剤を使用することができる。そのような緩衝
液の例としては、硼酸塩、燐酸塩、炭酸塩、トリス、バ
ルビタール等が挙げられる。使用する個々の緩衝剤は決
定的なものではないが、個々の測定において他の緩衝剤
より優れていることがありうる。
望ましくは約0.05〜0.5重量％の非イオン性洗浄剤を
試料へ加える。約200〜20000ダルトンの種々のポリオキ
シアルキレン化合物が使用できる。
通常、測定を実施するには、緩和で望ましくはほぼ一
定した温度を用いるクロマトグラフィーおよび検出用信
号の発信に用いられる温度は、一般に約10°〜50℃で、
より一般的には約15°〜50℃であり、よく用いられるの
は環境温度、即ち約15°〜25℃である。
測定可能な被検物質の濃度は、一般に約10-4〜約10
-15であり、より一般的には約10-6〜約10-14である。対
象の被検物質濃度およびプロトコール等を考慮して他の
試薬濃度を決定するのが普通である。
一般に試料および試薬中に含まれる多数の試薬類の濃
度は、被検物質の対象濃度範囲によって決められるが、
試薬類の各最終濃度は対象範囲に対して測定の感度を最
適化するように通常実験的に定められる。但しある種の
プロトコールの場合は、測定感度に悪影響を与えること
なく個々の試薬をかなり過剰に使用できる。
前述のような実用上の要件以外には、免疫吸着帯の大
きさに上限を設ける必要はない。多くの場合、低濃度の
測定が行なわれるので、被検物質が対象濃度範囲の全般
において妥当な距離を移動し、妥当な差異を提供するた
めには、免疫吸着帯の幅を比較的狭くする傾向がある。
全般にストリップの幅は約0.2mmより小さくなく、また
約2cmを超えない。一般には約5mm〜20mmであって、好ま
しくは約5mm〜15mmである。
免疫吸着帯の長さは、少なくとも幅の約２〜10倍が好
ましい。即ち、幅は通常少なくとも約2mmであり、より
一般的には少なくとも10mmであり、好ましくは約23mmで
あり、従って長さは約12cmを超えず、通常、約10cmを超
えず、好ましくは約５〜10cmである。移動距離は測定所
要時間の１因子であり、測定所要時間に影響を与える他
の因子と共に加算される。
信号発信系の要素である他の試薬類は、個々のプロト
コールおよび信号発信におけるその役割りによって大き
く濃度を変えることができる。標識したsbp要素と被検
物質の間に「真の」競合状態がある場合、標識したsbp
要素は被検物質の対象となる最高濃度の10倍を超えるこ
とはなく、また対象となる最小濃度の約0.5倍より下廻
ることはない。その他の多くの場合において、sbp要素
複合体の生成に関与する他の試薬の量は被検物質の結合
当量より事実上少ない量、または被検物質の結合当量よ
り事実上過剰量であることができる。したがって簡単な
関係を提示することはできない。
測定を実施する際、通常、プロトコールは試料を溶出
溶媒に溶解することを含む。試料は多くの供給源、例え
ば血液、血清、血漿、尿、眼の水晶体液、髄液等の生理
液、化学的プロセス試料、食品、農薬、汚染物質等から
誘導できる。
装置20の底部（即ち、装置20の液体媒質と接触してい
る底部末端）は溶媒に分散している試料と接触する。こ
の場合、溶媒は通常１またはそれ以上の信号発信系の要
素を含んでいる緩衝性の水性媒質である。信号発信系の
要素が存在していると、少なくとも１要素がsbp要素と
結合してsbp要素−標識結合体を提供する。
溶媒フロントが免疫吸着帯の横断を完了するまで充分
に時間をかけて放置する。横断の完了は、上部開口部58
を通して視認できる。免疫吸着帯には充分なsbp要素が
存在するので、被検物質は、この吸着帯中のsbp要素を
消費し尽くすことなく、すべて確実にこの吸着帯に結合
する。
免疫クロマトグラフの条件の変化によって被検物質の
移動距離の変化する程度が標準化されていない場合は、
既知量の被検物質を含有している標準試料を提供するこ
とができる。被検物質試料および標準試料を同時に試験
し、標準試料と被検物質試料間の定量的な比較を行なう
ことができる。所望により、１個以上の標準試料を使用
して各種濃度に対する移動距離をグラフ化し、特定試料
の定量に利用することができる。
多くの場合、免疫クロマトグラフに要する時間は比較
的短い。通常、試料が免疫吸着帯を通過するには、最低
30秒を要し、１時間を超えることはなく、通常約１〜30
分間を要する。信号の発現は、一般に30秒〜30分間の範
囲であり、普通、約30秒〜５分間である。
信号発信系は少なくとも１つの酵素を有し、信号発信
系の２またはそれ以上の成分または１またはそれ以上の
基質を含むことができ、また補酵素を含むことができ
る。信号発信系の任意の要素を標識として使用できる
が、この場合、免疫クロマトグラフにおける標識の存在
は、標識区域における信号に実質的な変化を与える。し
たがって標識は酵素または補酵素を含むことができる
が、基質を含むことはできない。通常、標識は酵素であ
る。
酵素標識は独立し、またはそれを組み合わせて広い範
囲で変えることができる。検出可能な信号を発する生成
物としては、色素、蛍光体または化学発光体を挙げるこ
とができ、吸収、蛍光または化学発光によって生じる信
号を目視的観察によって検出し、または吸収、反射率、
蛍光または化学発光の測定に用いる分光光度測定によっ
て検出することができる。
多くの場合、対象とする酵素は酸化還元酵素類および
加水分解酵素類である。多数の関連酵素類は、米国特許
第4275149号に要約されているので関連部分を説明の一
部として引用する。２つの酵素を組み合わせるには、一
方の酵素を免疫クロマトグラフに非拡散状に結合させ、
他方の酵素はsbp要素と結合させる。
もし標識−sbp要素結合体（コンジュゲート）を試料
と組み合わせないならば、試料が免疫吸着帯を移動した
後、免疫吸着帯は標識したsbp要素結合体および標識お
よびプロトコールに応じて信号発信系の１またはそれ以
上の他の要素を含有する溶液とほぼ均一に接触する。
酵素−sbp要素結合体（コンジュゲート）の場合、免
疫吸着帯は酵素−sbp要素結合体および基質と接触し、
また所望によりスカベンジャー（除去剤）と接触する。
この場合において、１つの酵素は免疫クロマトグラフと
免疫吸着帯で結合し、これは一方の基質が他方の生産物
という関係でsbp要素に結合する酵素と関係している。
普通、酵素−sbp要素結合体は緩衝水溶液中にあって、
実質上過剰な結合可能部位が存在している。pH範囲およ
び緩衝剤は予め検討しておく。酵素−sbp要素結合体が
リガンドまたは受容体のいのずれかと結合し、そして発
色するに足る時間をかけた後、免疫クロマトグラフを溶
液から回収する。
２つの酵素を有する場合、酵素−sbp要素結合体と基
質は免疫吸着帯と接触する前に、予め反応を起こすこと
なく同一溶液中で組み合わせることができるので、プロ
トコールの中の１段階が省略される。
酵素−sbp要素結合体が試料中に存在することによ
り、免疫クロマトグラフと結合後、これを基質溶液に浸
漬することによって免疫クロマトグラフを展開する。こ
の場合、一方の酵素は免疫クロマトグラフと結合して
も、しなくてもよい。
補酵素標識の場合、補酵素および基質の再生を行なう
ため、展開液は通常１またはそれ以上の酵素を含んでい
る。酵素反応は補酵素が必要であるから、酵素および基
質は単一の展開用試薬として免疫吸着帯と接触するまで
なんら反応することなく、組み合わせることができる。
基質は酵素によって変わるが、律速要因とならないよ
う通常かなり過剰にする（Kmより高い濃度）。水溶液は
酵素系に対して好適なように緩衝化し、酵素生産物に対
するスカベンジャーを含有することができる。なおこれ
は例えばウリカーゼから得られる過酸化水素に対するカ
タラーゼのように、他の酵素の基質である。
被検物質が結合している免疫吸着帯の区域を確認する
ため、クロマトグラフィー装置は、充分に検出可能な信
号発信化合物を生産するに足る十分な時間、展開液と接
触させる。検出可能な信号が一度発生したら、尺度56を
用いることにより、クロマトグラフの１端からの距離を
試料中の被検物質の定量的尺度として測定することがで
きる。
境界においてなんらかの歪みが見られることがある
が、多くの場合、境界はかなり明瞭であり、多くの被検
物質において２またはそれ以下の因子の濃度のμｇ〜pg
の範囲の変化が検出できる。このように好適な前駆物質
を基質として使用することにより、使用者による１回測
定（試料）および干渉に対して比較的鋭敏でない２段階
プロトコールにより、目視的観察による被検物質量の定
量的測定ができる。
リガンド分析質はモノエピトープ性または多エピトー
プ性であることによって特性が表わされるが、受容体分
析質は単数または複数の結合部位を持つことができる。
多エピトープ性被検物質は、通常ポリアミノ酸、即ちポ
リペプチドおよび蛋白質、多糖類、核酸およびその組み
合わせである。そのような組み合わせまたは集合体とし
ては、細菌、ウィルス、染色体、遺伝子、ミトコンドリ
ア、核、細胞膜等が挙げられる。
多くの場合、多エピトープ性リガンド被検物質は、少
なくとも約5000、または通常少なくとも約10000の分子
量を有する。ポリアミノ酸の範疇に入る興味あるポリア
ミノ酸は、一般に分子量が約5000〜5000000であり、よ
り一般的には約20000〜1000000であり、興味あるホルモ
ン類では分子量約5000〜60000である。
米国特許第4275149号の第12〜17欄にわたる開示に、
有用なリガンドのリストが示されており、本明細書に引
用して説明に代える。
モノエピトープ性リガンド被検物質は一般に分子量約
100〜2000であり、より一般的には約125〜1000である。
興味ある被検物質は、医薬品、代謝産物、農薬、汚染物
質等である。
興味ある多数の被検物が米国特許第4275149号の第17
〜18欄に列挙されており、これらの開示を本明細書に引
用して説明に代える。
受容体被検物の場合、分子量は一般に約104〜２×108
であり、より一般的には約３×104〜２×106である。免
疫グロブリンとしては、例えばIgA、IgD、IgE、IgG、Ig
M等、分子量は一般に約160000〜約106の間で変化してい
る。天然受容体の種類は多く、一般に少なくとも約2500
0の分子量で、106またはそれ以上ともなる。これらの中
にはアビジン、チロキシン結合グロブリン、チロキシン
結合プレアルブミン、トランスコルチン、膜表面蛋白質
等が含まれる。
リガンドが他の分子または支持体と結合する場合、リ
ガンドはしばしば修飾され、特定部位に特定官能基を備
える。この修飾によってリガンド同族体と呼ばれる生産
物が生成する。米国特許第4275149号の第18〜19欄にわ
たって、リガンド同族体に関する多くの記載があり、本
明細書の説明に引用する。
免疫クロマトグラフは、毛管現象によって液体が移動
する吸収性の支持体、非拡散状にに結合しているsbp要
素を含んでおり、また１またはそれ以上の信号発信系の
要素を含むことができる。
ストリップとしては多くの吸水性の物質を使用するこ
とができ、これには天然および合成の重合体物質が含ま
れる。とりわけ、例えばフィルター用紙、クロマトグ
ラフィー用紙等、紙を含めて繊維のようなセルロース
様物質、ポリ塩化ビニル、架橋デキストラン、アクリル
酸エステル等のような合成ポリマーまたは天然産ポリマ
ーの修飾物が挙げられ、これらを単独またはシリカのよ
うなセラミック材料と組み合わせて使用できる。
免疫クロマトグラフの吸水性保持体の厚さは、一般
に、約0.05mm〜約2mmであり、より一般的には約0.1mm〜
0.5mmであり、好ましくは約0.2mm〜約0.4mmである。そ
の構造は、密、やや密、中間、やや粗、および粗を含ん
で広く変化することができる。表面は滑らかさおよび粗
さ、硬さおよび軟らかさを種々に組み合わせて広く変化
することができる。
免疫クロマトグラフは、マイラー（商品名:Myler）、
ポリスチレン、ポリエチレン等のような反応性のない各
種の支持体によって支持することができる。支持体は、
免疫クロマトグラフの機械的一体性を高めるため、免疫
クロマトグラフ、縁、またはその他の構造から離れた裏
板として使用できる。
免疫クロマトグラフは、好ましい特性を具備するため
多くの物質で被覆することができる。被服剤には蛋白質
コーティング、多糖類コーティング、糖等が挙げられ、
これらは特に支持体と結合（コンジュゲート）している
物質の安定性を高めるために使用される。また、これら
の化合物は、免疫クロマトグラフに結合するsbp要素ま
たは信号発信系の要素のような物質の結合性をよくする
ために使用できる。
免疫クロマトグラフは、米国特許第4168146号に記載
のように、反応性に富む官能基で活性化され、支持体と
結合する有機物質の共有結合を提供することができる。
支持体に結合するsbp要素の量は、支持体の大きさ
と、被検物質および、必要な場合には、標識したsbp要
素のすべてを結合するのに必要な量によって変わる。一
般にsbp要素の量は約10-5〜10-14モル／cm2の範囲であ
り、より一般的には約10-7〜10-12モル／cm2である。被
検物質の移動距離が対象となる濃度範囲において充分に
差別されることを保証するために単位面積当たりのモル
数を変える。
好ましい態様では、信号発信系の要素を吸収性の支持
体と非拡散的に結合させる。特に酵素を支持体と結合
し、これを別の酵素で標識したsbp要素と反応させる。
酵素同志の関係については、信号発信系の説明の箇所で
論じる。
sbp要素および信号発信系の要素はともに、共有結合
ではなく吸着によって多くの支持体と結合できる。これ
は、吸収性の支持体をsbp要素および／または信号発信
系の要素を含有している溶液と接触させ、免疫クロマト
グラフを溶液から回収し、免疫クロマトグラフを乾燥さ
せることにより行なわれる。別法として、溶液は噴霧、
塗布または均一性が得られるその他の方法を適用するこ
とができる。
一般に、比較的大きいシートを使用し、これを適当な
面積に裁断することができる。ストリップ24の縁を修飾
して、移動する成分の先端の形を調節することができ
る。そのような修飾は、米国特許出願番号第591155号
（出願日、1984年３月16日）に記載のように、鋸歯状に
することおよびその縁に化学処理を施すことを含んでお
り、本明細書の説明に引用する。またストリップ24の縁
は、米国特許出願番号第599386号（出願日、1984年４月
12日）に記載の如く、レーザー光のように圧を加えない
手段で切ることができ、その開示を本明細書の説明に引
用する。
信号発信系は、多くの場合、電磁放射線の吸収または
発射を含む検出可能な信号の生成から成り、特に紫外部
および可視部領域の光線、とりわけ、約400nm〜800nmの
範囲の波長を有する放射線を含んでいる。免疫クロマト
グラフの特性から、検出可能な信号を得るためには単位
面積に充分な標識濃度がある必要がある。したがって、
個々の標識は所望の感度を提供するのに充分でない場合
も多くある。その場合、標識されたsbp要素が免疫吸収
帯を通過するとき、その標識sbp要素の通過によって、
検出可能な分子の生成を提供する標識が妨害されない場
合には、ただ１個の標識sbp要素に伴って複数個の検出
可能な分子が生成するような手段が講じられなければな
らない。それ故に、検出することが可能な多数の分子を
生じる、酵素たまは補酵素のような標識が用いられる。
信号標識の存在により、次いで増幅が行なわれる。
酵素または補酵素を使用すると、光を吸収する生産物
（例えば色素）、または放射または化学反応によって光
を発射する生産物（蛍光体、または化学発光体）の生成
によって所望の増幅が得られる。そのような生産物を与
える多数の酵素および補酵素が、米国特許第4275149号
の第19〜23欄、および米国特許第4318980号の第10〜14
欄に示されており、この開示を本明細書の説明に引用す
る。
特に興味深いことは、１つの酵素の生産物が、他の酵
素の基質となることによって関係し合う２つの酵素の組
み合わせを利用することである。このような方法によ
り、非特異的な妨害が実質的に減少し、結合型の被検物
質を含んでいる帯と被検物質を含んでいない帯との間の
境界を一層有効に確定できる。
多数の酵素の組み合わせが米国特許第4275149号の第2
3〜28欄にかけて示されており、これらの組み合わせは
この発明において有用であることが判る。この開示を本
明細書の説明に引用する。
特に興味深い酵素類は、過酸化水素を生産し、この過
酸化水素を利用して色素前駆物質を色素へと酸化する働
きを有する酵素である。特に興味ある組み合わせは、例
えばグルコースおよびガラクトース・オキシダーゼのよ
うな糖オシキダーゼ、またはウリカーゼおよびキサンチ
ン・オキシダーゼのような複素環オキシダーゼを、過酸
化水素を用い色素前駆物質を酸化する酵素、例えばペル
オキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼ、およびチトク
ロームＣ・オキシダーゼ等と組み合わせたものである。
このような酵素の組み合わせは、引用した参考文献中に
さらに追加して見出される。上記の酸化還元酵素の組み
合わせは好ましいものであるが、このほかの酵素の中に
も、加水分解酵素類、転移酵素類、および上記以外の酸
化還元酵素類のように有用性を見出すことのできるもの
がある。
利用できる代表的な補酵素は、MZD［Ｈ］;NADP
［Ｈ］、燐酸ピリドキサール;FAD［Ｈ］;FMN［Ｈ］等、
通常サイクル反応系に組み込まれる補酵素類であって、
これらについては特に米国特許第4318980号を参照され
たい。
酵素反応の生産物は通常、色素または蛍りん光体であ
る。多数の代表的な蛍光体の例は米国特許第4275149号
の第30および31欄に示されており、この開示の１部を本
明細書の説明に引用する。
sbp要素の結合体、受容体、吸収性の支持体および測
定の遂行に用いる条件を好適に操作または選択すること
によって、被検物質および酵素−sbp要素を同一溶液中
で免疫クロマトグラフに適用するこの発明の２つの異な
った態様を実施することができる。その１態様では、被
検物質の通過する免疫吸着帯の区域が、被検物質が存在
している区域全体にわたって実質上均一に検出できる信
号の生成によって観察できるものである。もう１つの態
様では、免疫吸着帯中の被検物質が占めている区域に係
る境界においてだけ、検出可能な信号が専ら観察できる
ものである。
異なった結果は、被検物質と比較した標識−sbp要素
結合体の種々の結合定数、移動率、または吸着率等と関
係している。様々な変化は、標識と結合しているsbp要
素、特にハプテン性被検物質の数の変化、吸収性支持体
と結合している受容体の結合特異性の変化によって達成
できる。これは、例えば、ハプテン被検物質と抗原との
間に１連結基を有する免疫原に対する抗体を作り、標識
−ハプテン被検物質結合体（コンジュゲート）と異なる
連結基を使用し、溶媒および／または支持体を変えてRf
係数を変え、またはその他の手技によって達成すること
ができる。
２つの酵素を信号発信系に用い、その１酵素を標識と
して用いた結果、単純化したプロトコールが使用できる
だけでなく、進行する被検物質の先端を正確に描出する
ことができる、強力な検出可能な信号が得られる。吸収
性の支持体と結合した酵素の生産物を、sbp要素と結合
した酵素の基質とすることによって、検出可能な信号
の、鋭敏で、迅速かつ均一な展開が免疫クロマトグラフ
上に観察される。またさらに、免疫クロマトグラフ上に
結合している酵素基質の濃度を局所的に高めることが確
立すれば、その表面に、検出可能な信号を発生する化合
物の迅速な沈積を促進することができる。
このクロマトグラフィー装置は、便宜上、予め測定し
た量を試薬類と組み合わせた包装で、被検物質の測定用
キットとして提供することができる。２つの酵素が含ま
れている場合は、試薬として、酵素標識sbp要素、免疫
クロマトグラフに結合している酵素の基質、酵素に必要
な他の基質類および補酵素類、および検出可能な発色団
または蛍光団を提供する色素前駆物質が含まれる。また
その他の添加物として、安定剤、緩衝剤等を含むことが
できる。測定感度を最適化する試薬溶液濃度を得るため
に、種々の試薬の相対量を広く変えることができる。特
に試薬類は、通常、凍結乾燥し、溶解時、試料と組み合
わせて好適な濃度の試薬溶液が得られるように賦形剤を
加えた乾燥粉末として提供することができる。
以上、この発明について明確な理解を得るためやや詳
細に例を挙げて説明を行ったが、ある種の変更または修
正はこの発明の範囲内で当然実施できるものであること
は明らかである。
【図面の簡単な説明】
第１図はこの発明に係る装置をやや側方から把えた斜視
図、第２図はこの装置の前半部を前方から把えた装置の
斜視図、第３図は３−３の線に沿って截断した第２図の
装置の断面図、第４図はこの装置の前半部にある尺度
（目盛り）部分を前方から把えた斜視図、第５図はこの
装置の前半部を背面からみた斜視図、第６図は６−６の
線に沿って截断した第５図の装置の断面図、第７図は７
−７の線に沿って截断した第５図の装置の断面図、第８
図はこの装置の後半部を前方から把えた斜視図、第９
図，第10図，第11図は、それぞれ９−９の線、10−10の
線および11−11の線で截断した第８図の装置の断面図、
第12図および第13図は、いずれもこの装置に取り付ける
ことができるストリップを前方から見た斜視図、第14図
は、第１図の装置の底部開口部を底側から把えた斜視
図、第15図は部分的に組み立てたこの発明の装置を前方
から把えた斜視図である。 20…クロマトグラフィー装置、22…ハウジング、24…ス
トリップ、34…突起、36…受理手段、42…突起要素、44
…隆起部、54…窓、56…尺度、58…上部開口部。
フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭55−113953（ＪＰ，Ａ) 特開 昭51−101122（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−28662（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−90056（ＪＰ，Ａ) 特開 昭47−11099（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−90056（ＪＰ，Ａ) 実公 昭47−40556（ＪＰ，Ｙ１)

Claims (11)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】（イ）ハウジング、 （ロ）上端をハウジングに固定し、上記ハウジング内部
    に取りはずしのできないように収容された、吸収性材料
    から成るストリップ、 （ハ）上記ストリップを、 （１）ストリップの前後両面がハウジングの内壁に基本
    的に触れないように、また （２）ストリップの毛管作用が実質的に変化することの
    ないように、 上記ハウジング内部に支持収容するため、上記ハウジン
    グの前壁および背壁に付設された複数個の突起要素、 （ニ）上記ストリップの１部を液体媒質と接触可能とす
    るため、ハウジングの底に設けた底部開口部、および （ホ）上記ストリップを目視的に観察するため、このハ
    ウジングに設けた手段の組合わせを含んでなるクロマト
    グラフィー装置。
  2. 【請求項２】液体媒質がストリップに沿って移動する距
    離を測定するためのものであって、上記ストリップを目
    視的に観察する目的でハウジングに設けた手段と連携す
    る、表示手段をさらに含んでなる、特許請求の範囲第１
    項記載のクロマトグラフィー装置。
  3. 【請求項３】吸収性材料からなるストリップが紙ストリ
    ップである特許請求の範囲第１項記載のクロマトグラフ
    ィー装置。
  4. 【請求項４】ハウジングの前壁および背壁に付設された
    複数個の突起要素が、さらに、クロマトグラフ中、液体
    媒質のストリップ内移動に支障のない程度にストリップ
    がハウジング内で伸長できるようにストリップをハウジ
    ング内に支持収容するものである、特許請求の範囲第３
    項記載のクロマトグラフィー装置。
  5. 【請求項５】吸収性材料からなるストリップが化学試
    験、測定または免疫測定実施用の試薬を含有している特
    許請求の範囲第１項記載のクロマトグラフィー装置。
  6. 【請求項６】免疫測定実施用の試薬が、複数個の特異的
    結合対の構成要素および酵素から成る特許請求の範囲第
    ５項記載のクロマトグラフィー装置。
  7. 【請求項７】（イ）ストリップが毛管作用によってスト
    リップ内を移動する液体媒質中の被検物質と反応性を示
    す１またはそれ以上の試薬を含んでいる紙ストリップで
    あって、この場合、被検物質がストリップに沿って移動
    する距離が試料中の被検物質量に相関しているストリッ
    プであり、 （ロ）ハウジングの形態が、ストリップの長さおよび幅
    がハウジングの内壁の長さおよび横幅より僅かに短いハ
    ウジングであり、 （ハ）上記ストリップを目視的に観察する手段と連携
    し、被検物質が上記ストリップに沿って移動する距離を
    上記試料中の被検物質量と相関させる表示手段、および （ニ）液体媒質がストリップを十分な距離移動して上部
    末端に達したことを検知するためにハウジングに設けた
    手段をさらに組合わせて含んでいる、被検物質が含有さ
    れている疑のある試料中の被検物質量を定量的に測定す
    るために用いる、特許請求の範囲第３項記載のクロマト
    グラフィー装置。
  8. 【請求項８】被検物質と反応性のある試薬が、被検物質
    の特異的結合の相手および酵素である特許請求の範囲第
    ７項記載のクロマトグラフィー装置。
  9. 【請求項９】液体媒質がストリップを十分な距離移動し
    て上部末端に達したことを検知する手段が、ストリップ
    の上部末端を視認するため、ハウジングの表面に設けた
    上部開口部を含み、さらにストリップの上部末端には、
    液体媒質と反応し視認して得る信号を生じる試薬が含ま
    れていることから成る特許請求の範囲第７項記載のクロ
    マトグラフィー装置。
  10. 【請求項１０】（イ）ハウジング、 （ロ）上端をハウジングに固定し、上記ハウジング内部
    に取りはずしのできないように収容された、吸収性材料
    から成るストリップ、 （ハ）上記ストリップを、 （１）ストリップの前後両面がハウジングの内壁に基本
    的に触れないように、また （２）ストリップの毛管作用が実質的に変化することの
    ないように、 上記ハウジング内部に支持収容するため、上記ハウジン
    グの前壁および背壁に付設された複数個の突起要素、 （ニ）上記ストリップの１部を液体媒質と接触可能とす
    るため、ハウジングの底に設けた底部開口部、および （ホ）上記ストリップを目視的に観察するため、このハ
    ウジングに設けた手段の組合わせを含んでなるクロマト
    グラフィー装置を使用することを特徴とする、前記液体
    媒質中に被検物質を含んでいる疑のある試料中の被検物
    質の定量的測定方法。
  11. 【請求項１１】該クロマトグラフィー装置の使用が、 （イ）該クロマトグラフィー装置と被検物質を含んでい
    る疑のある液体媒質とを接触させ、 （ロ）少なくとも上記クロマトグラフィー装置のストリ
    ップ中において液体媒質を移動させ、 （ハ）表示手段を読んで、ストリップに沿う被検物質の
    移動距離を求め、そして （ニ）ストリップに沿う被検物質の移動距離を試料中の
    被検物質量と相関させることを含む、特許請求の範囲第
    10項に記載の定量的測定方法。
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