JPH02261395A - 定量クロマトグラフィー法および装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、クロマトグラフィー試験ストリップを使用し
た酵素活性の定量法および装置に関する。

さらに詳しくは、本発明は、移動相が進行するにつれて
実質的に枯渇し得る（ｄｅｒ）ＩｅｔａｂＩｅ）量の色
原体基質を可溶性の色原体から不溶性の発色団に変換さ
せ、その結果、該不溶性の発色団が該試験ストリップ上
に固定化されて色のカラム（ｃｏｌ　ｕｍｎ）を生成す
ることによる酵素活性の定量法に関する。

色のカラムの長さおよび／または強度は酵素活性と相関
させる。本発明は、酵素−分析対象物の直接定量、およ
び酵素に結合させることのできる分析対象物の間接定量
に有用である。

（従来の技術および発明が解決しようとする課題）本発
明の従来技術としては、分析対象物の定量のための数多
くのクロマトグラフィー法が含まれる。たとえば、米国
特許第４，２９８，６８８号明細書［カリーズ（Ｋａｌ
ｌｉｅｓ）］；同第４４，５９．４０７号明細書［ホッ
ホンユトラッサー（Ｈｏｃｈｓｔｒａｓｓｅｒ）コ；同
第４１６８．１４６号明細書［グラツブ（Ｇｒｕｂｂ）
］　；および同第４４，３５．５０４号明細書［ズク（
Ｚｕｋ）］を参照できる。これらの例はすべて可溶性の
色原体を用いており、この色原体が可溶性の発色団に変
換される。

可溶性の発色団は、定量クロマトグラフィーアッセイ法
の開発に数多くの問題を呈示している。すなわち、可溶
性発色団は移動溶媒フロントととらに細い線として進行
するので定量が不可能である。

この問題を回避し定量クロマトグラフィーアッセイ法を
実現するため、移動が起こってしまった後にのみ発色団
を発色させるクロマトグラフィーアッセイ法が得られて
いる。これらアッセイ法は移動の問題を回避はするもの
の、多工程手順が必要となる。

可溶性発色団での他の問題点は、可溶性発色団が時間と
ともに拡散していく傾向があることである。それゆえ、
色の測定は正確に時間を指定しなければならず、特に色
の移動距離が存在する分析対象物の量に比例するときは
そのようにしなければならない。加えて、従来の反応動
力学は、発色の間、正確な時間に結果を読み取ることを
指示している。

米国特許出願第１１８．１４８号明細書（１９８７年ｉ
ｔ月６日出願）には、クロマトグラフィーストリップ装
置を使用した酵素活性定量法が開示されている。酵素を
含む試料を該ストリップ上の反応部位に固定し、基質／
補助因子の溶液を該部位上を移動させて反応生成物を生
成させ、該生成物をさらに先の検出領域まで移動させる
。ついで、反応物の消費速度または生成物の生成速度を
測定する。

可溶性発色団の問題点を解決するための他の試みとして
は、移動水相を必要としないデイツプスティック試験を
用いる方法がある。これらの装置は、別々のゾーン（す
なわち層）中に入れた複数の試薬を有している。試料を
この試験装置に適用すると上記試薬は溶解し、デイツプ
スティック上で均一に混合する。色は試験装置の表面上
を均一に分散していく。定量は、もしできたとしても、
標準と比較するか、または反射率もしくは透過分光測光
が可能な器械によってのみ行うことができる。

（課題を解決するための手段） 本発明は、吸湿性（ｂｉｂｕｌｏｕｓ）試験ストリップ
を使用した酵素活性の定量法であって、該吸湿性試験ス
トリップは、 水性移動相中の試験試料を加えるための近位末端、およ
び遠位末端； 該近位末端と該遠位末端との間に配置され、所定の実質
的に枯渇し得る量の変換し得る酵素基質を導入した基質
ゾーンであって、該基質は該水性試験試料に可溶であり
、酵素による変換後に該吸湿性試験ストリップ上に固定
化されて検出可能なシグナルを生成するもの；および 該基質ゾーンと該遠位末端との間に配置されたゾーンで
あって、移動相が進行するにつれ、変換された固定化基
質が該酵素の活性と相関する量のシグナルのカラムを生
成する定量ゾーン、からなり、 （ａ）該試験ストリップの該近位末端を水性試験試料と
接触させて該水性試験試料を定量ゾーンまで移動させ、
ついで （ｂ）該定量ゾーン中に生成したシグナルの量を測定し
て酵素活性を測定する ことを特徴とする方法；および 試料中の酵素活性を定量するためのクロマトグラフィー
固相装置であって、水性試験ストリップからなり、該水
性試験ストリップが 水性移動相中の試験試料を加えるための近位末端、およ
び遠位末端； 該近位末端と該遠位末端との間に配置され、所定の実質
的に枯渇し得る量の変換し得る酵素基質を導入した基質
ゾーンであって、該基質は該水性試験試料に可溶であり
、酵素による変換後に該吸湿性試験ストリップ上に固定
化されて検出可能なシグナルを生成するもの；および 該基質ゾーンと該遠位末端との間に配置されたゾーンで
あって、移動相が進行するにつれ、変換された固定化基
質が該酵素の活性と相関する量のシグナルのカラムを生
成する定量ゾーン、からなることを特徴とする装置 を提供することを目的とする。

本発明は、酵素活性の定量クロマトグラフィー分析のた
めの単一工程方法および装置を提供する。

この酵素は、それ自身が分析対象物であってもよいし、
または分析対象物に結合した標識であってもよい。

一つの態様において、本発明は、試料中の酵素の活性の
定量のための改良されたクロマトグラフィー固相装置に
関する。本発明の装置は、近位末端および遠位末端を有
する、吸湿性試験ストリップからなり、該近位末端には
、水性移動相中の試験試料が加えられる。該近位末端と
該遠位末端との間には、所定の実質的に枯渇し得る量の
変換し得る酵素基質を導入した基質ゾーンが配置されて
いる。

この基質は該水性試験試料に可溶性でなければならず、
酵素により変換されると該吸湿性試験ストリップ上に固
定化されて色などの検出可能なシグナルを生成する。

該基質ゾーンと該遠位末端との間には定量ゾーンが配置
されており、移動相がストリップ上を進行していくにつ
れて、変換され固定化された基質が該酵素の活性と相関
する量のシグナルのカラムを生成する。一般に、該シグ
ナルは、色のカラムの長さまたは強度を測定することに
より該酵素活性と相関させうるような発色団（好ましく
は不溶性）である。

別の態様において、本発明は、酵素活性の定量法であっ
て、（ａ）上記吸湿性試験ストリップの近位末端を水性
試験試料と接触させ、該水性試験試料を定量ゾーンまで
移動させ、ついで（ｂ）生成したシグナルの量を測定し
て酵素活性を測定する、ことを特徴とする方法を提供す
る。

最後に、分析対象物の定量法は、分析対象物に結合した
酵素標識の活性を直接または間接に定量し、ついで該酵
素活性を分析対象物の量と相関させることを特徴とする
。

以下、本発明をさらに詳しく説明する。

本発明は、酵素活性の定量のための改良されたクロマト
グラフィー法および装置に関する。本発明の方法および
装置は、固体固定相としての吸湿性試験ストリップ、移
動相としての水溶液、および実質的に枯渇し得る量の変
換し得る基質を用い、該基質は、最初は水相により可溶
化されるが、変換されて固定化されシグナルを生成する
。

本発明の装置の２つの態様を第１図および第３図に示し
である。吸湿性試験ストリップ１０．３０は、それぞれ
近位末端１２および遠位末端１４を育している。近位末
端ｆ２は試料受領末端であり、ここに試験試料を適用し
、ここからクロマトグラフィー移動が開始される。遠位
末端１４で移動は停止する。

場合により、遠位末端１４は試薬を含浸させた指示ゾー
ンＩ６を含んでいてもよく、該試薬は、第２Ａ図、第２
Ｂ図、第４Ａ図および第４Ｂ図にそれぞれ番号４４．５
４．６４および７４で示すように、移動が完了したとき
に指示する。移動相と接触したときに変色する指示試薬
が、このゾーンには適している。Ｃｕ５ＯａやＣｏ（Ｎ
ＯＪｔのような水和したときに変色する脱水遷移金属塩
が水性移動相に適している。特に好ましいのは、ＰＨ指
示染料（たとえば、フェノールフタレイン）であり、（
緩衝）移動相に応答して変色するように選択することが
できる。

「吸湿性試験ストリップ月０，３０は、分析対象物を含
む水溶液を通すことのできる毛管性を有するいかなる多
孔質マトリックスであってよい。

吸湿性試験ストリップとして使用するのに適した物質と
しては、種々のセルロース繊維含有マトリックス、たと
えば濾紙、クロマトグラフィー紙、イオン交換ｉ、　酢
酸セルロースフィルム、ニトロセルロースフィルム、酢
酸セルロースディスク、セルロース薄層クロマトグラフ
ィーディスクなどが挙げられる。吸湿性試験ストリップ
に適した他の物質としては、デンプンを用いた物質、た
とえばセファデックス（Ｒ）ブランド交差デキストラン
鎖、およびその他の物質、たとえばセラミックス物質、
ガラス繊維、塩化ポリビニルのフィルム、および塩化ポ
リビニルとシリカとの組合わせが挙げられる。特に好ま
しいのは、マトリックス物質がガラス繊維である吸湿性
試験ストリップである。

吸湿性試験ストリップの厚さは試料の大きさに依存して
変わり得るが、好ましい厚さは０．１〜１、Ｏｘｍであ
る。試験ストリップは１０．３０は、所望なら水不溶性
の物理支持体（示していない）に付着させ、またはこれ
により支持してよい。

水性移動相は試料自身であってもよいし、または、−層
好ましくは、試料を含有する毛管（吸上）作用を有する
緩衝溶液１１である。試料は、植物または動物から抽出
、希釈もしくは濃縮した生物学的流体であるのが好まし
い。生物学的流体の例としては、血清、血漿、尿、腹水
、腹腔水、羊水、滑液、脳を髄液などが挙げられる。

毛管作用を有する緩衝溶液（以下、単に毛管作用溶液と
いう）は水溶液からなり、低級アルキルアルコール、ア
セトンなどの相溶性有機溶媒を含んでいてよい。該毛管
作用溶液１１の機能は、毛管作用により吸湿性試験スト
リップ１０．３０の縦方向を横切って試料を運ぶことに
ある。毛管作用溶液は、他の成分の化学的および／また
は免疫化学的活性を最大にするためにバッファーを含ん
でいてよい。しかしながら、バッファー、補助因子、界
面活性剤、酵素活性剤および他の所望の成分は、別の１
または２以上のゾーン（たとえば２２および３２）中に
含浸させておくのがより好ましい。これについては、以
下に詳述する。

基質ゾーン１８は、所定の実質的に枯渇し得る量の変換
し得る酵素基質を含んでいる。この基質が変換し得ると
いうことは、本発明の重要な側面である。ここで「変換
し得る」とは、移動相中で可溶性の基質から、固相であ
る吸湿性試験ストリップ上に固定化される生成物／シグ
ナル化合物（変換された基質）へと酵素により変換され
得ることを意味する。それゆえ、［変換ｊとはシグナル
生成と固定化の両方を含む。マトリックス、基質および
毛管作用溶液は、変換を最適にするように選択する。

シグナル化合物は、視覚的に検出可能なシグナルを生成
するのが好ましい。たとえば、変換し得る基質が色原体
（前駆体）であり、一方、生成物（変換された基質）は
発色団であるのが好ましい。しかしながら、検出可能な
シグナルを生成し、酵素による変換で固定化される限り
、蛍光および他のシグナルも本発明の範囲に含まれる。

基質ゾーンＩ８のために選択する特定の基質は、活性を
測定しようとする酵素に依存する。当業者であれば所定
の酵素に対して変換し得る基質を容易に決定できるであ
ろう。たとえば、種々のアルカリホスファターゼおよび
酸性ホスファターゼは、変換し得る基質３−インドキシ
ルホスフェート（シグマ・ケミカル、セントルイス、＃
ｌ５５０５）で測定することができ、β−Ｄ−グルコシ
ダーゼは、変換し得る基質である３−インドキシル−β
Ｄ−グルコシド（シグマ・ケミカル、セントルイス）で
測定することができ、アリールスルフ７ターゼ酵素は、
変換し得る基質である３−インドキシルサルフェート（
シグマ・ケミカル、セントルイス、＃ｌ３８７５）で測
定することができる。

最後に、β−ガラクトシダーゼは、３−インドキシル−
β−Ｄ−ガラクトシドのような変換し得る基質で測定す
ることができる。

同様に、実質的に枯渇し得る量を構成する所定量もまた
活性を測定しようとする酵素およびアッセイ態様に依存
する。酵素が分析対象物で°ある場合は、基質の量は、
臨床的に関係する範囲の最低限の酵素濃度を有する試料
の所定のアリコートにより実質的に完全に変換される量
でなければならない。酵素が標識である場合は、基質の
量は、定員ゾーンに到達した分析対象物：標識結合体の
最少量により実質的に完全に変換される量でなければな
らない。このことが、今度は、特定の分析対象物、試料
アリコート、捕捉ゾーン態様および他の条件により支配
される。当業者であれば所定の酵素に対して、変換し得
る基質の適当な量を容易に決定することができるであろ
う。本明細書においてら特定の若干の例を以下に挙げで
ある。

吸湿性ストリップ上への変換し得る基質の固定化には、
共有結合的固定化および物理的固定化の両方が含まれる
。第一の場合は、リンカ−またはマトリックスの誘導体
化などの公知の反応により共有結合的固定化を達成する
ことができる。この後者の方法の例は、米国特許出願第
２０４，４４３号明細書に見出すことができる。

物理的固定化は、吸着または溶解度により達成すること
ができ、本発明に好ましい。基質の選択は、該基質が水
性移動相の移動により可溶化され、生成物／シグナル化
合物に変換されたときに同じ移動相中で相対的に不溶性
であるように選択する。

可溶化により、まず、乾燥や凍結乾燥により含浸または
沈積してあった基質が基質ゾーン１８中に放出される。

一般に、水相中での不溶化は、極性基の除去またはブロ
ッキングにより引き起こされる（酵素による変換により
）。

定量ゾーン２０は、酵素反応が最初に始まって可溶性の
変換し得る基質がシグナル化合物に変換されるところか
ら始まる。従って、該酵素反応に最後の臨界反応物を提
供するゾーンが定量ゾーン２０の開始点を定める。最後
の臨界反応物は一般に可溶化し変換し得る酵素基質であ
るので、定量ゾーン２０は基質ゾーンＩ８と重複する。

この重複は、図面を比較すれば明らかである。

基質の実質的に枯渇し得る量は、酵素の活性に比例した
割合で酵素が変換する基質の所定量である。それゆえ、
第２Ａ図および第４Ａ図中に４２および６２で示すよう
に、存在する酵素活性が高ければ高いほど、−層速く基
質は枯渇される。逆に、第２Ｂ図および第４Ｂ図中に５
２および７２で示すように、存在する酵素活性が低けれ
ば低いほど、変換の速度は遅くなる。枯渇されるべき所
定量の基質が存在するので、生成されるシグナルの量は
一定である。定量は、未知の酵素活性がすべての基質を
シグナルに変換するのに要する時間により達成される。

この時間は、移動相の移動によるシグナルのカラムの強
度および長さに置き換えられる。進行溶媒フロントの毛
管作用速度は絶対的に一定であるとはいえないが、均一
なマトリックス物質および一定の粘度および温度を仮定
すれば、毛管作用の速度は予測することができる。基質
の枯渇は、酵素による変換の動力学を遅くする傾向があ
る。同時に、毛管作用速度は、該フロントが遠位末端１
４へ移動するにつれて遅くなる。それゆえ、基質の変換
（それゆえ酵素活性）は、シグナルの強度、および−層
重要なことに生成シグナルのカラムの長さの両方に関係
する。

このことは、外部からのタイミング要素が必要ないとい
う点で有利である。従来のデイツプスティックアッセイ
と違って、結果を読み取る時間は重要ではない。タイミ
ングは移動および溶媒の枯渇により達成され、定量が可
能である。定量の正確な機構についてはアッセイ態様に
依存するので、以下で別々に説明する。

第１図および第３図は本発明の装置の種々の態様を示し
ているが、図中に示した種々のゾーンの相対的な長さは
図解のみを目的としている。実際には、個々のゾーンの
長さは、種々の成分の量および溶解性および該ゾーンに
より提供される機能などの因子に依存して変化してよい
。最短の形部においては、ゾーンは、吸湿性試験ストリ
ップ１０．３０の幅を横切る単なる線（示していない）
であってよい。指示ゾーン■６は、移動が完了したこと
を視覚的に示すことができるように充分な長さを有して
いるのが好ましい。

シグナルのカラムの長さは、酵素または分析対象物濃度
に対応する等級８２を何する旧恩て決定したスケール８
０と比較することができる。このスケール８０は、試験
ストリップｔｏ、ａｏ中１ご組み込んでもよい（示して
いない）シ、または、別のものとしてキットの一部を構
成してもよい。該スケール８０は、該装置を含む箱また
はカートンの一部を構成していてもよい。

ゾーン２２は、任意の付属ゾーンである。これらのゾー
ンは１または２以上存在していてよく、界面活性剤、バ
ッファー、酵素補助因子、酵素活性剤または毛管作用溶
液に所望の他の成分を含んでいてよい。一般に、基質ゾ
ーン１８にすぐ隣接するゾーン２２は、バッファーおよ
び目的酵素の活性を最適化する他の成分を含んでいる。

たとえば、酵素がアルカリホスファターゼであるときは
、ゾーン２２はｐＨが約９．４〜１０．５、好ましくｊ
ｉｐＨ９、８０）バッファー、およびホスフェート受容
体を少なくとも含んでいなければならない。毛管作用溶
液の条件、特に９Ｈは、動的範囲を増大させるために酵
素の活性を変えるべく調節することができる。

バッファーの例としては、リン酸塩、炭酸塩、バルビタ
ール、ジエチルアミン、トリス、２−アミノ−２−メチ
ル−１−プロパツール（Ａ　Ｍ　Ｐ　）などを挙げるこ
とができる。使用した特定のバッファーは常に重要であ
るとは限らないが、ある場合には重要であるかもしれな
い。たとえば、酸性ホスファターゼまたはアルカリホス
ファターゼ活性を分析するときにはリン酸塩バッファー
を用いてはならない。

さらに、米国特許第４，５５５，４８４号明細書により
教示されているように、反応物を含まない領域により付
属ゾーン２２を該基質ゾーンＩ８から分離させたり、ま
た該基質ゾーンから遠位に置くことも考えられる。

本発明の装置の一部または全体を魚肉ゼラチンなどの保
護物でコーティングしてもよい。

Ａ、酵素分析対象物 第１図に示した本発明の装置は、分析対象物としての酵
素濃度を定量するのに特に適している。

所定条件下においては、酵素活性は試料中の酵素濃度に
正比例する。活性は本発明により測定される。典型的な
酵素／分析対象物としては、アルカリホスファターゼ、
酸性ホスファターゼ、５ＧＯＴ、５ＧＰＴ、および特に
低いレベルまたは高いレベルが単独でまたは他の情報と
組み合わせて疾患状態の臨床的指標となるような他の酵
素が挙げられる。

特に第２Ａ図は、第１図と同様、高濃度の酵素を含有す
る試験試料が移動した後の吸湿性試験ストリップ４０を
開示している。高濃度の酵素により移動の早い時期に基
質が枯渇するため、色のカラム４２は非常に短く濃い。

高い酵素活性の結果、変換された基質は一層速やかに固
定化される。最初に所定の枯渇し得る量が存在していた
ので、このカラムは移動の間−層短い距離で生成され、
比較的濃い。対照的に、第２Ｂ図は、低濃度の酵素を含
有する試験試料が移動した後の吸湿性試験ストリップ５
０を示している。低濃度の酵素は基質を枯渇させるのに
一層長い時間がかかるので、色のカラム５２は比較的長
くより淡い。それゆえ、変換された基質（発色団）は−
層長い距離にわたって固定化される。

酵素活性の定量は、このシグナルのカラム４２゜５２の
長さまたは強度を測定することにより達成される。第１
図の態様においては、シグナル（好ましくは色）のカラ
ムの長さは酵素活性および濃度に反比例する。しかしな
がら、シグナルのカラムの強度は、酵素活性および濃度
に正比例する。

Ｂ、酵素標識 酵素が標識を構成する場合に分析対象物を定量するのに
適した本発明の装置３０の態様を第３図に示す。一般に
、分析対象物を直接または間接に結合することのできる
リガンドまたはレセプターに酵素を結合させる。酵素：
リガンドの結合した複合体は、本明細書では［結合体Ｊ
と称する。このような結合複合体を調製するための数多
くの方法が当業者には知られている。抗原性の分析対象
物の場合には、結合体は通常、酵素；抗分析対象物抗体
からなる。しかしながら、結合体はまた、アビジン、ピ
オチン、レクチン、相補的ＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌ
クレオチド、または他の分析対象物特異的リガンドを酵
素標識と複合させたものであってよい。

第３図の吸湿性試験ストリップ３０は、結合体ゾーン３
２、捕捉ゾーン３４、付属ゾーン２２、基質ゾーン１８
、定量ゾーン２０および指示ゾーンＩ６に分けられる。

基質ゾーン１８、付属ゾーン２２および指示ゾーンＩ６
は、上記のものと実質的に同じであり、簡潔を期すため
ここでは詳細に説明しない。定量ゾーン２０は、シグナ
ルのカラム６２．７２が生成されるという点で同じであ
る。分析対象物に対するカラム６２．７２の関係は、上
記のように捕捉ゾーン３４に依存する。

この態様においては、結合体ゾーン３２は、可溶性の分
析対象物特異的結合体を過剰に含有している。試験スト
リップ３０上の該ゾーン３２中に結合体を乾燥させまた
は含浸させる方法は、当業者に知られている。この結合
体は、溶媒フロントの移動の間に移動相中に溶解するこ
とにより該移動相中に移される。

捕捉ゾーン３４の内容物を変化させることにより、当業
者は、長さが分析対象物濃度に正比例または反比例する
シグナルのカラムを生成させることができる。捕捉ゾー
ン３４は、存在する分析対象物の量に関連する仕方で結
合体を基質ゾーン１８へ選択的に通過させる。捕捉ゾー
ン３４は、結合体を直接または間接に捕捉する試薬を固
定して含んでおり、基質ゾーン１８へ通過していく結合
体酵素活性の量が存在する分析対象物の量と直接（直接
結合体捕捉）または間接（間接結合体捕捉）に関連付け
られるようにしている。すでに説明した機構により、本
発明により定量した酵素活性は、シグナルのカラムの長
さと逆の相関を有し、シグナルカラムの強度と正の相関
を有している。それゆえ、結合体の直接的な結合はカラ
ムの長さと分析対象物濃度との間の逆の相関関係となり
、一方、結合体の間接的な捕捉は正の相関関係となる。

正の捕捉の態様においては、捕捉ゾーン３４は前以て決
定した所定の量の固定化分析対象物または分析対象物類
似体（抗原など）を含んでおり、試験試料からの分析対
象物に結合していないあらゆる抗体：酵素結合体を直接
的に捕捉する。分析対象物に結合していない結合体のみ
が溶媒フロントとともに定量ゾーン２０へ進行していく
ことができる。それゆえ、試験試料中の分析対象物の槍
が多ければ多いほど、定量ゾーンに達する結合体の量も
多くなる。第一の態様の場合と同様に、酵素の量が減少
すると生成される色のカラム（たとえば６２）は短くな
り、それゆえ、色のカラムと試験試料中の分析対象物濃
度との間には逆の相関関係が存在する。

捕捉ゾーン３４の長さおよび内容量は、試験試料中に分
析対象物が全く含まれていないときには実質的にすべて
の結合体を捕捉するのに充分な捕捉試薬を含有している
。しかしながら、装置の感度を調節するために捕捉ゾー
ン３４に含まれる固定化分析対象物またはその類似体の
長さおよび量を変化させることは、当業者の範囲内に属
する。

たとえば、前辺て決定した過剰の固定化分析対象物をゾ
ーン３４に置くことにより、一定の閾値を越える分析対
象物濃度を有する試料のみが色のカラムを生成すること
ができるであろう。そのような態様は、通常の血清分析
対象物、たとえば、濃度の上昇が特定の疾患と関連を有
するコレステロール、Ｔ）（Ｓ、５ＧＯＴ１８ＧＰＴ、
アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼなどの上
昇濃度をスクリーニングするのに特に適している。

この態様はウエツジ（Ｗｅｎｇ）らの米国特許第４゜７
４０．４６８号明細書に例示されており、結合パートナ
−を見付けられるかまたは製造することのできるあらゆ
る分析対象物によく適している。

この態様は、特に以下に掲げる分析対象物の検出に有利
である。すなわち、乱用薬物、種々の治療および予防医
薬、ホルモン剤、微生物（ウィルスを含む）および抗原
もしくは抗原決定基を生成することのできる微生物に対
する抗体である。

間接捕捉の態様の場合は、分析対象物に結合することの
できる第二の別のリガンドを該捕捉ゾーン３４中に固定
化することにより、色のカラム長さは試験試料中の分析
対象物の濃度に正比例する。

たとえば、捕捉ゾーン３４は固定化した第二の抗分析対
象物抗体を含んでいてよく、また結合体ゾーン３２は過
剰量の可溶性の酵素：第一抗体複合体（結合体）を含ん
でいてよい。

この態様においては、結合体ゾーン３２を通過するすべ
ての分析対象物が過剰の結合体と複合体を生成すること
により標識される。その後、酵素標識分析対象物は捕捉
ゾーン３４へ通過していき、そこに固定化された第二の
抗体と抗体；分析対象物類似体サンドイッチを生成する
ことにより該固定相上に固定化される。この固定化され
た分析対象物は結合体ゾーンからの酵素標識を有してい
るので、基質ゾーン１８へ通過していく酵素の量は試料
中に存在する分析対象物の量と逆の相関関係を有する。

すでに述べたように、基質ゾーンへ通過する酵素標識が
少なければ少ないほど、変換され得る基質は一層ゆっく
りと枯渇されシグナルのカラムはより長くなる。逆に基
質ゾーン１８へ通過する酵素標識の量が多くなると、酵
素の枯渇は一層速やかに起こり、生成されるシグナルの
長さは短くなる。それゆえ、分析対象物の試験試料中の
高濃度および低濃度は、長いシグナルのカラムおよび短
いシグナルのカラムにそれぞれ関連付けられ、かくして
カラムの長さと試験試料中の分析対象物の濃度との間に
正の相関関係がみられることになる。

この方法は、とりわけ高分子量の抗原および分子当たり
に１よりも多い抗原部位を有する巨大分子を分析するの
に特に適している。そのような巨大分子の例としては、
ヒト絨毛性生殖腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）、濾胞成熟ホ
ルモン（Ｆ　Ｓ　Ｈ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、甲
状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）などが挙げられる。

結合体ゾーン３２および捕捉ゾーン３４は、分析対象物
との反応が始まる何に酵素結合体が両ゾーンの界面で直
ちに捕捉されるのを防ぐため、別々に分離させるのが好
ましい（示していない）。また、分析対象物と結合体と
の間の親和性を維持もしくは最適にするｐＨに、ゾーン
３２またはゾーン３２とゾーン３４の両方を緩衝するの
が好ましい。ｐＨの範囲は約５．５〜約１０．５である
のが好ましく、約６．５〜約９．８であるのがさらに好
ましい。第一の態様と同様、バッファーは毛管作用溶液
ＩＩ中に存在していてもよいし、または結合体ゾーン３
２中に乾燥もしくは含浸させてもよい。

選択したバッファーのｐ）ｌ範囲で酵素標識か活性とな
るように該酵素標識を選択することができる。たとえば
、酵素標識がアルカリホスファターゼであり、バッファ
ーのｐＨ範囲は９゜４〜約９゜８であってよい。また、
付属ゾーン２２が、乾燥もしくは含浸させた可溶化バッ
ファーを含んでいてもよい。この第二のバッファーは、
局所ＰＨが目的酵素と相溶するのに最適なしのとなるよ
う調節するために選択する。この際、酵素の最適１）Ｈ
は分析対象物−結合体親和性反応の最適ｐＨと同じであ
る必要はない。

Ｃ１使用方法 上記装置に加えて、本発明はさらに酵素活性の定量方法
に関する。活性の定量は、今度は酵素分析対象物の濃度
、または酵素標識と複合させた非酵素分析対象物の濃度
と相関させることができる。

本発明の酵素活性の定量法は上記のような試験ストリッ
プ装置１０を用い、 （ａ）試験ストリップの近位末端を水性試験試料と接触
させて該水性試験試料を定量ゾーンまで移動させ、つい
で （ｂ）該定量ゾーン中に生成したシグナルの屑を測定し
て酵素活性を測定する ことを特徴とする。

工程（ａ）の接触法としては、ピペットで移す、じみを
つける、毛管作用に付する、流体に暴露する、または試
験ストリップＩ　Ｏ，３０の近位末端を試験試料または
試験試料含有溶液中に浸すことなどが挙げられる。この
工程はまた、試薬を可溶化する働きをも有する。たとえ
ば、少量の試料を試験ストリップ上にピペットで移すと
きは、試薬の可溶化を容易にするために第一の試薬ゾー
ン２２．３２上に直接ピベ°ットで移してよい。

試料を吸湿性試験ストリップの近位末端と接触させた後
、該試験ストリップの近位末端１２を毛管作用溶液ＩＩ
と接触させて移動を容易にする。

すでに述べたように、この毛管作用溶液は該ゾーン中の
反応を最適にするｐ　Ｉ（に緩衝させるのが好ましい。

バッファーは毛管作用溶液に直接加えることもできるし
、移動相により試薬ゾーン２２゜３２から可溶化するこ
ともできる。吸湿性試験ストリップの近位末端を水性試
験試料、および場合により毛管作用溶液と接触させた後
、該水相を移動させて試験ストリップの遠位末端Ｉ４ま
で進行させる。

酵素活性を測定する本発明の方法の次の工程は、シグナ
ルのカラム４２．５２の長さを測定するか、またはシリ
カゲルのカラムの強度を測定することにより達成される
。前者の方法の方が、面倒な器械化が必要ないので好ま
しい。後者の方法の場合は、一般に、半定量以上の結果
が必要なときは器械化が必要である。別法として、酵素
活性の知られた幾つかの標準を用いることにより検量曲
線を作成することができ、この検量曲線により未知の試
験試料中の酵素活性を得ることができる。試験ストリッ
プの作動範囲を越える酵素活性を有する試験試料は、一
般に０，９％ＮａＣｌでＩ：１０に希釈してから再び定
量を行う。

さらに任意の工程として、酵素活性を試験試料中の酵素
濃度と相関させることが含まれる。

酵素標識に結合した非酵素分析対象物を測定するために
、本発明の第二の態様の装置３０を用いることができる
。この方法は、目的とする分析対象物に直接または間接
に結合させた酵素標識の活性を定量し、ついでこの酵素
活性を分析対象物の濃度と相関させることからなる。す
でに述べたように、定量工程はシグナルのカラム６２．
７２の長さまたは強度を測定することＩこより行う。関
連付けの工程は、酵素活性と試験試料中の分析対象物の
濃度とを相関させるものであり、捕捉ゾーン３４の態様
に依存する。

本発明はまた、上記態様で示した固相装置１０゜３０お
よび試薬（毛管作用溶液１１を含む）からなるキットを
も提供する。場合により、等級８２で検量化したスケー
ル８０を、固相装置に沿ってまたは別の構成部品として
方形の透明なプラスチックハウジング中に導入してもよ
い。等級８２は、カラムの長さを酵素濃度および／また
は分析対象物濃度と相関させる。

つぎに実施例に基づいて本発明をさらに詳しく説明する
が、本発明はこれらに限られるものではない。

実施例１ アルカリホスファターゼの直線読み取りシステム試料の
調製： アルカリホスファターゼのストック溶液（シグマ、ケミ
カル、セントルイス、＃Ｐ６７７４）のアリコートを１
００ｍＭグリシン、１　ｍＭ　Ｍ　ｇ　Ｃ１ｘ、０　、
１　ｍＭ　Ｚ　ｎＣＩｔを含む水溶液（ｐＨ１０，５）
中に希釈して、およそ下記相対濃度のアルカリホスファ
ターゼ活性を有する溶液を調製した。ＯＵ／ｚＲ；２　
Ｕ　／＊Ｑ：　５　Ｕ／ｘ（１：　５０　Ｕ／ｘ（ｌお
よび５００Ｕ／ｘＱ。

ストリップの調製： 下記順序にて粘着支持体上にマトツリクス切片を互いに
流体伝達するよう互いに隣接して粘着させてシートを生
成することによりストリップを調製した。

定量ゾーンの一部としての未処理ファツトマン（Ｗｈａ
ｔｍａｎ）　＃　１６紙の６５ｘｘ幅ストリップ；基質
ゾーンとしての、３−インドキシルホスフェート（シグ
マ・ケミカル、セントルイス、＃【５５０５）のＩＲ９
／Ｊ１１２溶液を含浸させ、ついで凍結乾燥させたファ
ツトマン＃１ｉ１１紙の５ｘｘ幅ストリップ； 毛管（吸上）用の未処理ファツトマン＃１′ａ紙の５ｊ
！１１幅ストリップ。

このシートを横方向に切断して、毛管用部を近位末端に
有し定量ゾーンを遠位末端に有する長さが７５＋ｕで幅
が約１．５ｘｍの多数のストリップを得た。

別のやり方として、旧態て切断したストリップを、該ス
トリップの近位末端近（に所望の長さの基質ゾーンを含
浸させることにより調製することもできる。

アッセイプロトコール： 試験ストリップの近位（毛管作用）末端を、５００Ｕ／
ｚ（ｌのアルカリホスファターゼ活性を有する水溶液（
試験溶液）中に挿入した。室温にて５分後に該水溶液（
移動相）は試験ストリップの遠位末端まで上昇した。

上記手順を上記で調製した各試料アルカリホスファター
ゼ溶液について繰り返した。

結果： 変換された（沈澱した）基質により色の青色カラムが生
成し、下記第１表に示すように、試験試料中のアルカリ
ホスファターゼ活性は色のカラムの長さに反比例した。

第１表中のＲｆは、定量ゾーンの長さ７０１３２？こ対
する色の測定長の比を示す。

上記アッセイ法で上記一連のアルカリホスファターゼ標
準を用いることにより検量曲線が得られ、これを用いて
その後の未知の試料のアルカリホスファターゼ活性を測
定した。

【図面の簡単な説明】

第１図は、酵素が分析対象物である場合に適した本発明
のクロマトグラフィー装置の一つの態様を示す模式図、 第２Ａ図は、高濃度の酵素を含有する試料を第１図に示
したクロマトグラフィー装置に適用した結果を示す模式
図、 第２Ｂ図は、低濃度の酵素を含有する試料を第１図に示
したクロマトグラフィー装置に適用した結果を示す模式
図、 第３図は、酵素が分析対象物に結合した標識である場合
に適した本発明のクロマトグラフィー装置の一つの態様
を示す模式図、 第４Ａ図は、高濃度の酵素を含有する試料を第３図に示
したクロマトグラフィー装置に適用した結果を示す模式
図、 第４Ｂ図は、低濃度の酵素を含有する試料を第３図に示
したクロマトグラフィー装置に適用した結果を示す模式
図である。 （図面の主要符号の説明）

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）吸湿性試験ストリップを使用した酵素活性の定量
   法であって、該吸湿性試験ストリップは、水性移動相中
   の試験試料を加えるための近位末端、および遠位末端： 該近位末端と該遠位末端との間に配置され、所定の実質
   的に枯渇し得る量の変換し得る酵素基質を導入した基質
   ゾーンであって、該基質は該水性試験試料に可溶であり
   、酵素による変換後に該吸湿性試験ストリップ上に固定
   化されて検出可能なシグナルを生成するもの；および 該基質ゾーンと該遠位末端との間に配置されたゾーンで
   あって、移動相が進行するにつれ、変換された固定化基
   質が該酵素の活性と相関する量のシグナルのカラムを生
   成する定量ゾーン、 からなり、 （ａ）該試験ストリップの該近位末端を水性試験試料と
   接触させて該水性試験試料を定量ゾーンまで移動させ、
   ついで （ｂ）該定量ゾーン中に生成したシグナルの量を測定し
   て酵素活性を測定する ことを特徴とする方法。
2. （２）酵素が、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファ
   ターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−Ｄ−グルコシダー
   ゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼおよびアリールスルフ
   ァターゼよりなる群から選ばれたものであり、変換し得
   る酵素基質が３−インドキシルホスフェートである請求
   項（１）に記載の方法。
3. （３）吸湿性試験ストリップを毛管作用を有する溶液と
   接触させる工程をさらに含む請求項（１）に記載の方法
   。
4. （４）生成したシグナルの量の測定を、該シグナルのカ
   ラムの長さを測定し、ついで該長さを酵素活性と逆に相
   関させるか、または該シグナルのカラムの強度を測定し
   、ついで該強度を酵素活性と正に相関させることにより
   行う請求項（１）に記載の方法。
5. （５）試料中の酵素活性を定量するためのクロマトグラ
   フィー固相装置であって、水性試験ストリップからなり
   、該水性試験ストリップが 水性移動相中の試験試料を加えるための近位末端、およ
   び遠位末端； 該近位末端と該遠位末端との間に配置され、所定の実質
   的に枯渇し得る量の変換し得る酵素基質を導入した基質
   ゾーンであって、該基質は該水性試験試料に可溶であり
   、酵素による変換後に該吸湿性試験ストリップ上に固定
   化されて検出可能なシグナルを生成するもの；および 該基質ゾーンと該遠位末端との間に配置されたゾーンで
   あって、移動相が進行するにつれ、変換された固定化基
   質が該酵素の活性と相関する量のシグナルのカラムを生
   成する定量ゾーン、 からなることを特徴とする装置。
6. （６）酵素が、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファ
   ターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−Ｄ−グルコシダー
   ゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼおよびアリールスルフ
   ァターゼよりなる群から選ばれたものであり、変換し得
   る酵素基質が３−インドキシルホスフェートである請求
   項（５）に記載の装置。
7. （７）検出可能なシグナルのカラムが色のカラムからな
   り、該カラムの長さが酵素活性と正比例するものである
   請求項（５）に記載の装置。
8. （８）変換された基質が、水相に不溶性の発色団に変換
   されることにより固定化され、好ましくは該変換された
   基質が、定量ゾーンで試験ストリップに共有結合された
   化合物と結合する反応性化合物に変換されることにより
   共有結合的に固定化される、請求項（５）に記載の装置
   。
9. （９）酵素が分析対象物に結合した標識であり、該分析
   対象物が抗体または抗原と反応性である、請求項（５）
   に記載の装置。
10. （１０）試験ストリップが捕捉ゾーンをさらに含み、該
    捕捉ゾーンは、該近位末端と該基質ゾーンとの間に配置
    され、該定量ゾーン中で定量された酵素活性が分析対象
    物の量と相関するように酵素標識分析対象物を該基質ゾ
    ーンまで選択的に通過させるためのものである請求項（
    ９）に記載の装置。