JPH0232257A - ２成分系発色染料 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、支持マトリックスに共有結合的に結合した発
色染料化合物を用いたアッセイ方法お上び装置に関する
。本発明において、発色染料化合物は２成分染料系の第
一の染料成分と第二の染料成分とが結合することにより
生成し、また第二の染料成分はマトリックス上に共有結
合的に固定化されている。第一の染料成分を加えると、
マトリックスに共有結合的に結合した発色共有結合付加
物が生成される。本発明の装置を製造する方法、利用す
る方法および装置自体も、診断医学に用いられる試験ス
トリップにとりわけ有用であり、発色染料化合物はマト
リックスに永久的に付着しているので漏出したり浸出し
たりすることがない。

（従来の技術および発明が解決しようとする課題）染料
をマトリックスに結合させるための数多くの方法が技術
分野で知られている。織物産業においては、媒染剤を用
いて染料を織物に結合させているが、このような媒染剤
は単独または染料とともに作用して吸収、吸着、または
他のやり方で間に差し込まれ、織物の表面上または織物
の繊維上に固着する。媒染剤および染料は織物に共有結
合的に結合していないので、洗浄によって浸出し退色や
変色を起こす傾向にある。

染料化合物を固定化する他の方法としては、染料分子に
高アルキル疎水性側鎖を供し、この疎水性側鎖が基質ま
たは支持体中にもぐり込み、親水性／疎水性相互反応に
より固定化する方法が挙げられる［たとえば、ブルーム
（Ｂ　ｌｏｏｍ）らの米国特許第３，４４３，９３９号
明細書参照］。

にらかかわらず、分析試験装置に用いる発色染料化合物
は、現在のところ不充分にしか固定化されていない。一
般に、発色化合物はアッセイ溶液に比較して不溶性であ
ることに基づいて固定化されており、共有結合によるこ
となくマトリックス上に沈降させている。他のシステム
では、発色物を支持マトリックス上に吸収、含浸、また
はコーティングしている。この方法の特許の例としては
、米国特許第４，０６９，０１６号、同第４，５４８゜
９０５号および同第４，０３８．０３１号各明細書が挙
げられる。最後に、支持体上に固定化した符号生成酵素
システムにより固相表面にのみ局所化した沈降発色物を
生成させ、そうすることにより発色物を固定化すること
に一部成功した例がある（たとえば、米国特許第４，４
３５，５０４号明細書参照）。

本発明の目的は、上記従来技術の欠点を克服し、指示発
色化合物が支持体に固定化され、浸出したり洗い落とさ
れることがない方法および装置を提供することにある。

（課題を解決するための手段） 本発明は、まず第一に、第一の染料成分と第二の染料成
分とから生成した発色染料化合物を共有結合的に結合す
ることのできる固相マトリックスの調製方法に関する。

すなわち、本発明は、第一の染料成分と第二の染料成分
とから生成した発色染料化合物を固体マトリックス上に
固定化する方法であって、（ａ）該マトリックスまたは
該第二の染料成分のうち少なくとも一方にある反応性の
基を活性化し、（ｂ）該活性化された反応性の基を介し
て該第二の染料成分を該マトリックスに共有結合的に結
合させてマトリックスに結合した第二の染料成分を生成
させ、ついで（ｃ）該マトリックスに結合した第二の染
料成分を第一の染料成分と接触させ、該マトリックス上
に共有結合的に固定化された発色共有結合付加物を生成
させる、ことを特徴とする方法を提供するものである。

本発明はさらに、試験試料中の分析対象物を定性的また
は定量的に決定するためのアッセイ装置であって、分析
対象物が液相に可溶であり該液相は固相と接触しており
、第一の染料成分と第二の染料成分とからなる染料系の
両成分を結合させて発色染料化合物を生成させることに
より分析対象物を比色法により決定する装置において、
該染料系の第二の染料成分が、固相に共有結合的に結合
されており、該液相が該固相と接触したときに該第二の
染料成分が分析対象物、または分析対象物の量に比例す
る第一の染料成分と共有結合的に結合して、分析対象物
の量に比例して固相に共有結合的に固定化した発色染料
化合物を生成することができるようにしてあることを特
徴とするアッセイ装置をも提供する。

本発明はさらに、本発明のアッセイ装置を用いて試験試
料中の分析対象物を定性的または定性的に決定する方法
であって、（ａ）２成分染料系の第一の染料成分が共有
結合的に結合した固相マトリックスを該染料系の第一の
染料成分を含む液相と接触させ、その際、該第一の染料
成分の虫は試験試料中に存在する分析対象物の量と等し
くするかまたは比例するように、また該第一の染料成分
と該第二の染料成分が共有結合的に結合して固定化され
た発色染料化合物を生成するようにし、ついで（ｂ）試
験試料中の分析対象物の分析対象物の測定手段として該
固相マトリックスに共有結合的に結合した発色染料化合
物の量を決定する、ことを特徴とする方法をも提供する
。アッセイ装置の場合と同様に、支持体に共有結合的に
結合した第二の染料成分に結合する第一の染料成分は、
分析対象物それ自身であるか、または分析対象物の量に
比例して支持体に結合し得るようにした第一の染料成分
である。分析対象物は、対象となる特定の分析対象物（
グルコースなど）であってもよいし、分析対象物の濃度
を示すことのできるマーカー、たとえば分析対象物特異
的結合成分に結合した酵素系（たとえば、西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ）により生成した過酸化物であってもよ
い。

本明細書において「発色」とは、マトリックスから識別
し得るということを意味する。各染料成分は、無色の発
色源または染料前駆体であって、これらが−緒に結合し
たときに発色するのが好ましい。しかしながら、各成分
は、最初に本来の色を有しているが、結合したときに識
別可能な無色または発色付加物を生成するようにするこ
ともできる。

以下に、本発明をさらに詳しく説明する。

第一の染料成分と第二の染料成分とから生成した発色染
料化合物を共有結合的に結合することのできる固相マト
リックスは、本発明に従い、（ａ）該マトリックスまた
は該第二の染料成分のうち少なくとも一方にある反応性
の基を活性化し、（ｂ）該活性化された反応性の基を介
して該第二の染料成分を該マトリックスに共有結合的に
結合させてマトリックスに結合した第二の染料成分を生
成さ仕ることにより調製することができる。ついで、該
マトリックスに結合した第二の染料成分に第一の染料成
分を結合させ、該マトリックス上に共有結合的に固定化
された発色共有結合付加物を生成させることができる。

一般に、マトリックスまたは第二の染料成分上の反応性
の基は、アミノ基、または好ましくは水酸基である。水
酸基は、ニルスン（Ｎ　１ｌｓｓｏｎ）らのＢｉｏｃｈ
ｅｉ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｆｆ１
．１０２．４４９〜４５１（１９８１）に教示のごとく
、式：Ｒ−Ｓｏ、−ＣＩで示される有機スルホニルクロ
リドとの反応により活性化されて、対応するスルホン酸
エステルを生成する。この場合、Ｒは、メチル基、エチ
ル基、フェニル基またはトルイル基であってよく、さら
に電子誘引性のハロゲン基が置換しているのが一層好ま
しい。特に好ましいのは、トリフルオロメタンスルホニ
ルクロリド、２．２．２−トリフルオロエタンスルホニ
ルクロリド（トレシルクロリド（ｔｒｅｓｙｌ　ｃｈｌ
ｏｒｉｄｅ））およびｐ−ニトロベンゼンスルホニルク
ロリドである。

別のやり方として、反応性の水酸基はまた、テイユセン
（Ｔ　１ｊｓｓｅｎ）のラボラトリ−・テクニークス・
イン・バイオケミストリー・アンド・モレキュラー・バ
イオロジー（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕ
ｅｓ　ｉｎ　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｍ
ｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂ　ｉｏｌｏｇｙ）、１５巻、「プ
ラクティス・アンド・シオリー・オブ・エンザイム・イ
ムノアッセイズ（Ｐ　ｒａｃｔｉｃｅ　ａｎｄＴｈｅｏ
ｒｙ　ｏｆＥｎｚｙｍｅ　Ｉ　ｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ
）Ｊ、１０９頁、エルスビール・パビリッシャーズ（Ｅ
　１ｓｅｖｉｅｒＰ　ｕｂｌ　１ｓｈｅｒｓ）、Ｎ、Ｙ
、（１９８５）に教示のごとく、過ヨウ素酸塩との反応
によっても活性化することができる。過ヨウ素酸塩によ
る活性化が好ましいが、スペーサーまたはリンカ−の使
用も含めて、マトリックスを活性化または誘導体化する
他の方法が当業者には知られているので、ここでは繰り
返し説明することはしない。

マトリックスは試験試料中で不溶性であり、セルロース
、アガロース、架橋デキストラン、紙、ジオールシリカ
およびグリセリルプロピルコーティングガラスが挙げら
れる。ジオールシリカは、イー・メルク（Ｅ　、Ｍｅｒ
ｃｋ＆　Ｃｏ、　、）（西独）からりクロソープジオー
ル（Ｌ　１Ｃｈｒｏｓｏｒｂ　Ｄ　１ｏｌ）として入手
でき、また上記のように処理されたガラスは、ピアス・
ケミカル（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、
Ｘロックフォード、イリノイ）からグリコフェース（Ｇ
　１ｙｃｏｐｈａｓｅ）ガラスとして市販されている。

紙は好ましいマトリックスである。加えて、固相マトリ
ックスは、キャリヤまたは支持体上に担持させてらよい
し、担持させな（でもよい。マトリックスと支持体とは
全く同一のもの（たとえば、紙）であってよいので、本
明細書にいう「支持体」はマトリックスをも含むもので
あり、マトリックスと置き換えてよいものである。

支持体が活性化されたら、第二の染料成分を支持体に共
有結合的に結合させる。第二の染料成分は、支持体に共
有結合的に固定化することができ、分析対象物または第
一の染料成分と共有結合的に結合して発色産物を生成す
ることができるものであれば、いかなる化合物であって
もよい。有機スルホニルクロリド活性化支持体に第二の
染料成分を共有結合的に固定化するには、該第二の染料
成分は、求核基、たとえばスルフヒドリル基またはアミ
ノ基を含んでいなければならない。過ヨウ素酸塩活性化
支持体に共有結合的に固定化するには、染料成分はアミ
ノ基を含んでいなければならない。

これらの反応は、よく知られた方法に従って進行する。

好ましい第二の染料成分には、パラ非置換フェノール性
化合物、パラ非置換芳香族アミン化合物、パラハロゲン
化フェノール性化合物およびパラハロゲン化芳香族アミ
ン化合物が含まれる。第一の態様において、最も好まし
い第二の染料成分は５−アミノ−２〜ナフタレンスルホ
ン酸であり、これは酸化された４−アミノアンチピリン
またはその類似体と結合して共有結合付加物を生成する
。

アミノアンチピリン（または類似体）は、技術分野でよ
く知られたやり方でペルオキシダーゼ酵素と組み合わせ
たオキシダーゼ酵素を用いた通常の酵素的カスケードに
より酸化することができる。

本発明の第二の態様においては、好ましい第二の染料成
分としてジアゾニウム塩を用い、これは分析対象物であ
るビリルビンを直接捕捉して、マトリックスに共有結合
的に結合した発色染料化合物を生成する。好ましいジア
ゾニウム塩は、過ヨウ素酸塩活性化支持体に結合したジ
アゾ化ｐ−アミノアニリンである。

本発明のさらに別の態様において、試験試料中の分析対
象物を定性的または定量的に決定するためのアッセイ装
置は、染料系の第二の染料成分が共有結合的に結合した
改良された固相を含み、その際、該第二の染料成分は、
分析対象物、または分析対象物の量に比例する第一の染
料成分と共有結合的に結合して、分析対象物の量に比例
して固相に共有結合的に固定化した発色染料化合物を生
成することができるようにしである。そのようなアッセ
イ装置においては、第二の染料成分は分析対象物それ自
身と結合して発色化合物を生成するか、または存在する
分析対象物の量に比例した貴で生成もしくは結合し得る
ようにした第一の染料成分と結合する。

上記の好ましい固相マトリックスを用いた場合、アッセ
イ装置は、種々の試験試料中の特定の分析対象物を検出
および／または定量するために用いるのが好ましい。一
般に、試験試料は、患者から採取した全血、血清、血漿
、唾液、脳を髄液、尿、羊水などの水性流体、または実
験室アッセイ溶液である。アッセイ装置の態様としては
、クロマトグラフストリップおよびデイツプスティック
（ｄｉｐｓｔｉｃｋ）またはパッドタイプアッセイの両
方が含まれる。

クロマトグラフストリップの態様においては、分析対象
物は、ストリップ上に生成した色枠の長さの関数として
定量される。さらに詳しくは、液相中に存在する分析対
象物または第一の染料成分は、第二の染料成分を共有結
合的に結合しであるマトリックスの上部または該マトリ
ックスを通して溶媒フロント（ｆｒｏｎｔ）により進ん
でいく。液相が進行するにつれて、分析対象物または第
一の染料成分は、試験試料中に存在する程度に応じて、
支持体上に固定化された第二の染料成分と共有結合的に
結合する。分析対象物または第一の染料成分が使い尽く
されると、もはや結合も色の生成も起こらない。溶媒フ
ロントは時間とともに進行していくので、色枠の長さは
分析対象物の量と関係付けられる。生成した色は、従っ
て、支持体上に永久に固定化され、浸出したり洗い落と
されたりしない。ストリップの縁に沿って記された度盛
りは、長さを分析対象物の濃度と相関させろために用い
ることかできる。

デイツプスティックまたはパッドタイプの分析装置にお
いては、液相は固相と単に接触するだけであり、固相の
上を進行していくことはない。従って、存在する分析対
象物の量は、固相上に生成した色の量の関数として決定
される。生成した色の量を決定するために技術分野で知
られた方法の幾つかの例としては、強度、蛍光および色
相が挙げられる。

ある場合、たとえばビリルビンの場合には、試験試料を
含有する液相に固相を接触させると色が直接生成するで
あろう。他の場合には、液相はまた、第一の染料成分を
生成するための、または第二の染料成分と結合すること
ができるようにするための試薬手段を含んでおり、この
場合、生成したまたは結合できるようにした第一の染料
成分の虫は分析対象物の量に比例する。そのような試薬
系の例はオキシダーゼ−ベルオキソダーゼ酵素系であり
、これは４−アミノアンチピリン（または類似体）のよ
うな第一の染料成分を酸化して第二の染料成分（たとえ
ば、５−アミノ−２−ナフタレンスルポン酸）と結合で
きるようにする。

すでに述べたように、分析対象物それ自身は第一の染料
成分であってもよいし、グルコース、コレステロールま
たはホルモンのような生物学的に興味のある化合物であ
ってもよい。または、分析対象物は、実際の分析対象物
に比例して生成され、もしくは反応性にされる単なるマ
ーカーであってもよい。そのような場合は、過酸化物（
分析対象物マーカー）をペルオキシダーゼとともに用い
て発色化合物を生成させるときに起こり、その際、ペル
オキシダーゼは抗体に結合しており、抗体は特定の抗原
（実際の分析対象物）に比例して存在するような場合で
ある。従って、本発明のアッセイ装置および方法をイム
ノアッセイに用い、試料中に存在する分析対象物の量に
比例して第一の染料成分を結合できるようにするために
、酵素マーカーで標識した抗体または抗原を間接的に用
いることは本発明の範囲に含まれる。さらに詳しくは、
ＨＲＰＯに結合した抗体はサンドイッチイムノアッセイ
または競合イムノアッセイにおいて抗原を検出すること
ができ、ＨＲＰ　Ｏは過酸化物とともに第一の染料成分
を酸化し、該第一の染料成分が抗原の量に比例して結合
し得るようにすることができる。そのような第一の染料
成分は、４−アミノアンチピリンである。ついで、該第
一の染料成分（結合し得るようにされている）は、支持
体上に共有結合的に固定化された第二の染料成分と結合
し、試料中に存在する抗原の量に比例して発色産物を生
成する。

本発明のアッセイ装置を使用する方法としては、第二の
染料成分が共有結合的に結合した固相を、２成分染料系
の第一の染料成分を含む液相と接触させるが、その際、
該第一の染料成分は、試験試料中の分析対象物の量に等
しいかまたは比例する量で存在する。分析対象物は、液
相中の第一の染料成分と同義であってよい。この接触に
引き続いて、第一の染料成分と固定化された第二の染料
成分との共有結合により固相上に発色化合物か生成する
。その後、発色化合物の量の関数として分析対象物の量
を決定する。

つぎに、実施例に基づいて本発明をさらに詳しく説明す
るが、本発明はこれらに限られるものではない。

実施例１（支持体の活性化） （Ａ）２．２．２−トリフルオロエタンスルホニルクロ
リド（トレシルクロリド）による紙の活性化典型的な手
順において、ファツトマンブランド（Ｗｈａｔｍａｎ　
ｂｒａｎｄ）＃　５４１グレ一ド紙（１０ｇ、湿重量）
を、以下の洗浄液（各＋　００　ｉ（りで順番に洗浄し
た；すなわち、アセトン：水（ｖ／ｖ）を３０・７０お
よび７０：３０で、アセトンで２回、乾燥アセトン（ア
セトンＩＱ当たり２５９の分子ふるいを用いて一夜乾燥
）で３回である。ついで、紙を、乾燥アセトン（３１）
および乾燥ピリジン（１５０μｇ）（分子ふるいで乾燥
）を入れた乾燥ビーカーに移した。撹拌しながらトレシ
ルクロリド［フル力・アクチェン・ゲセルンヤフト（Ｐ
　１ｕｋａ　Ａ　、　Ｇ　、）、ブーフス、スイス］（
１００μＱ）を滴下した。室温で１０分後、紙を以下の
洗浄液（各１００ｉ（りで２回洗浄した：すなわち、ア
セトン、５ｍＭＨＣｌ：アセトン（ｖ／ｖ）を３０ニア
０．５ｏ・５ｏおよび７０：３０で、１ｍＭＨＣｌであ
る。活性化した紙を、使用するときまで４℃で貯蔵した
。

導入されたトレシル基の量は、上記で調製した凍結乾燥
紙の試料について硫黄の元素分析を行うことにより決定
した。その分析によると、乾燥紙Ｉｇ当たりトレシル基
１５０μモルが導入された。

（Ｂ）水酸基含育支持体（紙）の過ヨウ素酸塩による活
性化 室温の蒸留水（２００村）中の過ヨウ素ナトリウム（１
０りの溶液に、シュライヒャー・シュエルグレード（Ｓ
ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｅｌｌ　ｇｒａ
ｄｅ）４１０濾紙（１０ｇ）を加えた。この紙と溶液を
ロータリーシェーカー上で３時間撹拌した。その後、過
ヨウ素酸塩溶液を注ぎ捨て、蒸留水（２００ｍ１２）を
加えた。１５分後、水を注ぎ捨て、さらに蒸留水（２０
０籾）加えた。この最後の工程をさらに２回繰り返し、
結合用の活性化紙を得た。

及籠鯉１ （Ａ）５−アミノ−２−ナフタレンスルホン酸の紙への
結合 ０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７、４，１
００ｘ９）に、５−アミノ−２−ナフタレンスルホン酸
（ＡＮＳ；０．５９）および再結晶水素化ンアノホウ素
ナトリウム（０゜７５ｇ）を溶解した。ついで、この溶
液を、実施例１の活性化紙を入れた容器に加えた。溶液
と紙の混合物を、ロータリーシェーカー上、室温で一夜
撹拌した。必要に応じ、時間を増加または減少させて結
合を増やし、または減らすことができた。インキュベー
ション後、染料結合紙（ＡＮＳ紙）からＡＮＳ溶液を注
ぎ捨て、ＡＮＳ紙を蒸留水（２００ｘ（りで！回すすい
だ。ついで、ＡＮＳｉ度が５μ９／ｍＱまで下がるまで
、新たな蒸留水（２０Ｑｚ（りで各３０分ずつＡＮＳ紙
を洗浄した。このシートを使用に先立って空気乾燥した
。

（Ｂ）活性化および５−アミノ−２−ナフタレンスルホ
ン酸のガラス繊維フィルター活性化物への結合 ガラス繊維フィルター（ンユライヒャー・シュエル、＃
２９）を、６Ｍ硝酸中で一夜洗浄した。

その後、蒸留水ですすぎ、空気乾燥した。ついで、ガラ
ス繊維フィルターを、ｌ０ｍＭ　クエン酸塩（ｐＨ５，
０）で緩衝した３−グリッドキシプロビルトリメトキシ
シランの１０％溶液中に入れ、５０°Ｃにて３０分間イ
ンキュベートした。得られたグリコ相ガラスフィルター
を、ついでアセトン、アセトン／水混合物、最後に水で
洗浄した。その後、フィルターを１％Ｎａ１Ｏａ中で一
夜インキユベートしてアルデヒドを生成した。ついで、
過ヨウ素酸塩が本質的に除かれるまでフィルターを水で
洗浄した。ついでフィルターを、５−アミノ−２−ナフ
タレンスルホン酸の１％（Ｖ／Ｖ）溶液、１００ｍＭ　
ＮａＣＮＢＨ，および１００１１Ｍ　リン酸ナトリウム
（ｐＨ７，４）を含む溶液中で一夜インキユベートした
。インキュベーション後、生成物を水中で徹底的に洗浄
して未結合物質を除き、空気乾燥して貯蔵した。

実施例３（ｐ−アミノアニリンの支持体への結合および
ジアゾ化） セルロース濾紙（ファツトマン＃１およびＳ＆５４１０
）を、１％（ｗ／ｖ）Ｎａ　Ｉ　Ｏ−（過ヨウ素酸塩）
中、室温で一夜撹拌しながら酸化した。ついで紙を水中
で洗浄して過剰の過ヨウ素酸塩を除いた。

ついで紙を、１００＋ｎＭｐ−アミノアニリン、２０ｍ
Ｍ　リン酸ナトリウム（ｐＨ７，４）および１００ｍＭ
　Ｎ　ａ　ＣＮ　Ｂ　Ｈｓ中、室温で２８半インキュベ
ートして紙を誘導体化した。紙重量当たり約１０容量の
溶液を用いた。ついで紙を、まずＰＢＳで、ついで水で
数回洗浄した。この紙を６％（ｗ／ｖ。

水溶液）ヘキサフルオロリン酸および５０ｍＭ硝酸ナト
リウム中、水上で１０分間インキュベートすることによ
り、入手可能なアミンをジアゾ化した。ジアゾ化した紙
を水中で洗浄し、空気乾燥し、乾燥した冷暗所で貯蔵し
た。

実施例４（標準溶液の調製） （１）０．５Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７，４）ｐ）（
が７．４となるまで、０　、５　Ｍ　ＮａｚＨＰ　Ｏ−
溶液を０　、５　Ｍ　Ｎ　ａＨｔ　Ｐ　Ｏ−溶液で滴定
した。

（２）グルコースストック溶液の調製 ０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７，４，１００屑ｇ０
．５Ｍリン酸バッファー、ｐＨ７，４，１００肩ｇを蒸
留水５００肩σで希釈したもの）にグルコース（１００
０ｘｇ）を加えてグルコースストック溶液（１０００ｕ
ｇ／ｄｃ）を調製した。この溶液を２倍ずつ繰り返し希
釈して、５００　ｔｘ９／ｄＱ、　２５０　ｉ９／ｄρ
、１２５ｘ９／ｄＱ’８ヨＵ６３ｍ９／ａＱ（１）グル
コース溶液を得た。

（３）酵素溶液 （ａ）グルコース不キシダーゼ溶液 ０．１ＮＮａＯＨでｌ）Ｈを５．６に調節した０、１Ｍ
（１，９５９／　１００ｘ（ｌ脱イオン水）ＭＥ　Ｓ　
（２［Ｎ−モルホリノ〕エタンスルホン酸Ｘ１０１Ｑ）
に、グルコースオキシダーゼ（ｉｏｏｏ単位）、４−ア
ミノアンチピリン（３０ｊＩ９）およびムタロターゼ（
５単位）を加えた。混合物を穏やかに撹拌し、溶液とし
た。

（ｂ）ペルオキシダーゼ溶液 脱イオン水（１００ｘｆ２）中に溶解した２［Ｎ−モル
ホリノ］エタンスルホン酸（１，９５１？）から調製し
＃＝０．１Ｍ　ＭＥＳ（ｌ　Ｏｘσ）に、西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ（３００単位）を加えた。

実施例５（ＡＮＳ紙を用いたグルコース用診断試験スト
リップの調製） （Ａ）方法ｌ： １０００肩９／ｄ（ｌグルコース標準溶液（２０μＱ滴
）に、グルコースオキシダーゼ溶液およびペルオキシダ
ーゼ溶液をそれぞれ各１ｕ１２ずつ加えた。溶液を５秒
間混合した。この溶液中に、５−ＡＮＳ染料結合紙（実
施例２Ａ）の狭ストリップの底辺を浸した。５−ＡＮＳ
染料結合紙は、溶液が全長にわたって毛管作用により運
ばれるように充分小さくカッティングしてあった。以上
の手順を各標準グルコース溶液について繰り返した。

（Ｂ）方法２： 実施例２Ａの５−ＡＮＳ染料結合紙（２０μｇがすっか
り湿らせることができるように充分小さくカッティング
してあった）のストリップの一端に、グルコースオキシ
ダーゼ溶液（約ｌμ１２）をピペットにて加えた。その
すぐ隣にペルオキシダーゼ溶液（約１μρ）をピペット
にて加えた。試験ストリップを空気乾燥し、その底辺を
１０００　ｍ９／ｄＱ標準グルコース溶液（２０μｍ２
）中に浸した。液相が頂点に達したときに試験は完了し
たものとみなした。

この手順を各標準グルコース溶液について繰り返した。

（Ｃ）読み取り結果 酸化された４−アミノアンチピリンと紙に共有結合的に
結合した５−ＡＮＳとの結合により、湿潤ストリップ上
に色条が生成した。第１表に示すように、色条の高さは
、グルコースストック試験溶液中のグルコースの濃度に
比例することがわかった。

実施例６（ビリルビン用診断試験ストリップの調製） （Ａ）粘着マイクロタイタープレートカバー上に押し付
けることにより、実施例３のジアゾ化紙のシート（４７
ｕ幅）を支持および蒸発コントロール用プラスチック裏
板に接着した。１　、５　Ｍｍの不活性紙芯（ｗｉｃｋ
Ｘシュライヒャー・シュエル４１０）をジアゾ化紙の縁
に付着させ、これを他のマイクロタイタープレートカバ
ーでカバーして紙をサンドイッチにした。このサンドイ
ッチ状にした紙から約１．５＊ｘの多数の試験ストリッ
プをカッティングした。各ストリップは、ノアゾ化領域
および芯部分を有していた。

（Ｂ）ＤＭＳＯ（２ｘ＆）および０．ＩＭ　ＮａｔＧＯ
，Ｃ４Ｘａ）中にビリルビン（シグマ・ケミカル、セン
トルイス）（６０１Ｋｇ）を溶解することにより、ビリ
ルビンストック溶液を調製した。充分量のビリルビンス
トック溶液を、２００ｍＭ炭酸塩（ｐＨＩｏ、５）、１
５０ｍＭノフィリン（ｄｉｐｈｙｌｌｉｎｅ）および０
．２％ＴＸ−［００に加え、０．１．３．５．７．５．
１０．２０および３０次９ビリルビン／ｄＱの作業希釈
液を調製した。

（Ｃ）ビリルビンの作業希釈液を等容量の正常ヒト血漿
と混合して試験試料を調製した。各試験試料（２０μＱ
）をマイクロタイタープレートウェルに加え、試験スト
リップの広端を室温（約２０℃）で各試料と接触させた
。５分後に液相フロントは試験ストリップの頂点に達し
、結果を読み取った。

試験ストリップ上に生じた色条の高さを測定し、ビリル
ビンの濃度に対してプロットして第１図に示す結果を得
た。

実施例７（ＡＮＳ紙を用いたコレステロール用診断試験
ストリップの調製） （Ａ）実施例２ＡのＡＮＳ紙（１０μｅがすっかり湿ら
仕ることができるように充分小さくカッティングしてお
いた）に、以下の溶液を含浸させた。ストリップの第一
の（指示）領域には、ＩＨ／ＪＩＱＨＲＰＯ溶液および
２２ｇ／ｚ（１４−アミノアンチピリン溶液６約ｌμＱ
をピペットにて加えた。指示領域に隣接する第二の（反
応）領域には、Ｉ　ＯＯｚ９／ｄＱ。

コレステロールオキシダーゼ溶液およびｔｏｉｙ／ｄｃ
コレステロールエステラーゼ溶液各約１μ溶液側約１μ
Ｑ三の領域には、５％トリトンＸ−１００（約ｌμＱ）
を含浸させ、ストリップの残りの部分はブランクにして
おいた。使用するに先立って、ストリップを冷凍し、凍
結乾燥した。

（Ｂ）標準コレステロール溶液を、シグマ・ケミカル、
セントルイスから１００．２００および４００ｎ／ｄＱ
ａ度を有する検量キット中で得た。３００１９／ｄ（ｌ
ａ度ハ、４００　ｘｇ／　ｄ（２ＪＩ度？Ｊ　Ｍヲ希’
Ｒすることにより調製した。

（Ｃ）標準コレステロール溶液６約ｌＯμｑを、マイク
ロタイタープレートウェル中に入れた。試験ストリップ
のブランク領域をウェル中に浸し、溶液をストリップ中
に毛管進行させた。Ｒｆ指数は、端から溶媒フロントま
での長さで除した色条の長さ（第一の領域と第二の領域
との間からその末端までを測定）として計算した。第２
図に示すように、色条の長さは、試験溶液中のコレステ
ロールの濃度に比例することがわかった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の試験ストリップを用いて得られた、
ビリルビン濃度に対して色条の高さをプロットしたグラ
フ、第２図は、コレステロール濃度に対して色条の長さ
のＲｆ値をプロットしたグラフである。 特許出願人　アボット・ラボラトリーズ化　理　人　弁
理士　青　山　　葆ほか１名第１図 ビリルビン濃度 （ｍｇ／ｄＬ）

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）第一の染料成分と第二の染料成分とから生成した
   発色染料化合物を固体マトリックス上に固定化する方法
   であって、 （ａ）該マトリックスまたは該第二の染料成分のうち少
   なくとも一方にある反応性の基を活性化し、（ｂ）該活
   性化された反応性の基を介して該第二の染料成分を該マ
   トリックスに共有結合的に結合させてマトリックスに結
   合した第二の染料成分を生成させ、ついで （ｃ）該マトリックスに結合した第二の染料成分を第一
   の染料成分と接触させ、該マトリックス上に共有結合的
   に固定化された発色共有結合付加物を生成させる ことを特徴とする方法。
2. （２）第二の染料成分が、パラ非置換フェノール性化合
   物、パラ非置換芳香族アミン化合物、パラハロゲン化フ
   ェノール性化合物およびパラハロゲン化芳香族アミン化
   合物よりなる群から選ばれた化合物である請求項（１）
   記載の方法。
3. （３）第二の染料成分が、５−アミノ−２−ナフタレン
   スルホン酸またはジアゾニウム塩である請求項（１）ま
   たは（２）記載の方法。
4. （４）第一の染料成分が、該第二の染料成分と発色染料
   化合物を生成することのできる分析対象物である請求項
   （１）、（２）または（３）記載の方法。
5. （５）試験試料中の分析対象物を定性的または定量的に
   決定するためのアッセイ装置であって、分析対象物が液
   相に可溶であり該液相は固相と接触しており、第一の染
   料成分と第二の染料成分とからなる染料系の両成分を結
   合させて発色染料化合物を生成させることにより分析対
   象物を比色法により決定する装置において、該染料系の
   第二の染料成分が、固相に共有結合的に結合されており
   、該液相が該固相と接触したときに該第二の染料成分が
   分析対象物、または分析対象物の量に比例する第一の染
   料成分と共有結合的に結合して、分析対象物の量に比例
   して固相に共有結合的に固定化した発色染料化合物を生
   成することができるようにしてあることを特徴とするア
   ッセイ装置。
6. （６）第二の染料成分が、パラ非置換フェノール性化合
   物、パラ非置換芳香族アミン化合物、パラハロゲン化フ
   ェノール性化合物およびパラハロゲン化芳香族アミン化
   合物よりなる群から選ばれた化合物である請求項（５）
   記載のアッセイ装置。
7. （７）第二の染料成分が、５−アミノ−２−ナフタレン
   スルホン酸またはジアゾニウム塩である請求項（５）ま
   たは（６）記載のアッセイ装置。
8. （８）固相がクロマトグラフストリップからなり、液相
   が始点から終点まで該固相に沿って進み、可溶性分析対
   象物または分析対象物の量に比例する第一の染料成分が
   共有結合的に結合した第二の染料成分と結合して、その
   長さが試験試料中の分析対象物の量に比例する発色染料
   化合物のストリップを生成する請求項（５）、（６）ま
   たは（７）記載のアッセイ装置。
9. （９）請求項（５）、（６）または（７）記載のアッセ
   イ装置を用いて試験試料中の分析対象物を定性的または
   定性的に決定する方法であって、 （ａ）２成分染料系の第一の染料成分が共有結合的に結
   合した固相マトリックスを該染料系の第一の染料成分を
   含む液相と接触させ、その際、該第一の染料成分の量は
   試験試料中に存在する分析対象物の量と等しくするかま
   たは比例するように、また該第一の染料成分と該第二の
   染料成分が共有結合的に結合して固定化された発色染料
   化合物を生成するようにし、ついで （ｂ）試験試料中の分析対象物の分析対象物の測定手段
   として該固相マトリックスに共有結合的に結合した発色
   染料化合物の量を決定する ことを特徴とする方法。
10. （１０）第一の染料成分が分析対象物である請求項（９
    ）記載の方法。