JPS61228354A - 濃縮免疫化学テストストリツプ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の背景］ （発明の分野） 特定の化合物のアッセイにおいて、その化合物に対応す
る天然のレセプターまたは抗体を使用することが可能で
あるということが、イムノアッセイ研究の開花をもたら
した。各アッセイにおいて、リガンドおよびレセプター
（アンチリガンド）を含む特異的結合対（「ｓｂｐＪ）
成分の相同対（通例、免疫対）を用い、そのｓｂｐの一
方を検出可能なシグナルを発生する標識で標識する。イ
ムノアッセイ法を行うと、ｓｂｐ構成員の複合体と結合
したシグナル標識および未結合シグナル標識間にシグナ
ル標識の分布が生ずる。結合シグナル標識と未結合シグ
ナル標識の識別は、未結合シグナル標識から結合シグナ
ル標識を物理的に分離するか、または結合および未結合
シグナル標識の検出可能なシグナルを変調すること龜よ
って行うことができる。

通例、イムノアッセイは、臨床研究室において関心の対
照である多種の化合物の定量に供されており、比較的精
巧な装置および慎重な技術を必要とする。イムノアッセ
イは、半定量的または定性的結果を目的とし、測定に非
実験技術者があたる場合（例えば、家庭または病院にお
いて）は広く実用化されでいない。臨床研究室において
も、非熟練者でも実施し得る簡単で迅速なスクリーニン
グ試験があれば、多くの費用を節約できるであろう。

イムノアッセイの進歩については、考慮すべきことが多
数ある。その一つは、結合したシグナル標識から発生す
るシグナルと未結合シグナルから発生するシグナルとの
実質的な識別である。測定化合物を含有する可能性のあ
る試料中の内在物質による妨害を最小にすることも考慮
しなければならない。また、シグナルを検出し、関心の
ある濃度範囲内での濃度の測定を容易にすることも考慮
しなければならない。他の要素としては、試薬調製の容
易さ、試料および試薬溶液の調製および測定に要する正
確さ、試薬の貯蔵安定性、プロトコルに要する操作数、
および各操作に要する技術と正確さがある。すなわち、
非熟練者でも実施し得るアッセイ（例えば、家庭で、法
医学において、または開業医によって実施し得るアッセ
イ）の開発においては、プロトコルの実施の仕方の相異
によって得られる結果の変動を最小限にするか、または
種々の操作の実施方法を簡単にすべきである。

（従来の技術） 試料特定性の測定用、特に液体試料中の物質の測定用の
試験装置が、米国特許第４，０９４，６４７号に開示さ
れている。薄層クロマトグラフィー用装置およびクロマ
トグラフィー試験法が、米国特許第４．３８４，９５８
号に開示されている。標識抗体を固定化アナライト類縁
体から駆逐するイムノアッセイが、米国特許第４，４３
４，２３６号に開示されている。ミオグロビン検出装置
および検出法が、米国特許第４，１８９，３０４号に開
示されている。液体中に溶解した物質を分析するための
テストストリップが、米国特許第４．４３８゜０６７号
に記載されている。液体試料成分の定量用多層試験装置
およびその試験法が、米国特許第４．１６０，００８号
に記載されている。不溶性抗体を使用する、標識抗原に
よる抗原測定法が、特開昭４８−５９２５号（昭和４８
年１月２５日）に開示されている。

ヘテロジニアスイムノアッセイにおける濃縮域法が、米
国特許第４，３６６．２４１号に開示されている。米国
特許４，１６８，１４６号は、テストストリップ・イム
ノアッセイを記載している。米国特許第３，９９０，８
５０号および同第４．０５５．３９４号は、診断テスト
カードを記載している。生体液の自動定量分析方法は、
米国特許第４゜３２７．０７３号に記載されている。色
素生成支持体イムノアッセイは、国際出願第ＰＣＴ／Ｕ
Ｓ８３１０１８８７号に開示されている。

多くの特許および特許出願によって、イムノアッセイに
おいて検出可能なシグナルを発生させる多様な技術に関
する詳しい文献が堤供されている。

以下のリストは、本発明に関連するこのようないくつか
の技術の単なる例示である。以下に、米国特許および特
許出願並びに標識の種類のリストを挙げる。

米国特許第３，６４６，３４６号、ラジオアクティブ・
ラベル（Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ　　Ｌａｂｅｌ）；同
第３，６５４．０９０号、同第３，７９１．９３２号お
よび同第３，８１７，８３８号、エンザイム・ラベル（
Ｅｎｚｙｍｅ　　Ｌ　ａｂｅｌｓ）　；同第３，９９６
，３４５号、フルオレッサーークエンチャー・ラベル（
Ｆ　Ｉｕｏｒｅｓｃｅｒ−Ｑｕｅｎｃｈｅｒ　　Ｌａｂ
ｅｌｓ）；同第４，０６２，７３３号、ラジオアクティ
ブ・ラベル；同第４，０６７．９５９号、フルオレッサ
ー（Ｆ　１ｕｏｒｅｓｃｅｒ）またはエンザイム・ラベ
ル：同第４，１０４，０２９号、ケミルミネッセント・
ラベル（ＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔＬ　ａｂｅ
ｌ）　；および同第４，１６０，６４５号、ノンーエン
ザイマティック・カタリスト・ラベル（Ｎｏｎ−Ｅｎｚ
ｙｍａｔｉｃ　　Ｃａｔａｌｙｓｔ　　Ｌａｂｅｌ）。

米国特許第３，９６６，８７９号には、抗体域を用いる
電気泳動法が、同第４，１２０，９４５号には、標識ア
ナライトを最初に抗体を介して固形支持体に結合させる
ＲＩＡが記載されている。米国特許第４゜２３３．４０
２号テハ酵素対標識、同第４，７２０゜４５０号では化
学誘導蛍光標識、および同第４゜２８７．３００号では
アニオン性酵素標識を使用する。

［発明の要約コ 本発明の方法および装置は、アナライト（ａｎａｌｙｔ
ｅ）の含有が疑われる試料中のアナライトの存否の測定
に有用である。本発明の装置は、毛管移動により試験溶
液が通過し得る吸収性（ｂｉｂｕｌｏｕｓ）材料のスト
リップである。試験溶液は、試料と、アナライトに結合
し得る特異対（「ｓｂｐ成分」）の第１成分とを含んで
成る。ストリップは、試験溶液と接触させるストリップ
端部から離れたｌ小部位で第１　ｓｂｐ成分を濃縮させ
、非拡散結合させるための第２のｓｂｐ成分を一体的に
含む。通例、第２　ｓｂｐ成分は、アナライトと第１ｓ
ｂｐ成分との結合によって生成した複合体に結合する。

検出可能なシグナルは、シグナル発生系によって発生す
る。試験溶液中のアナライト量に応じてシグナルが発生
する。

−態様において、アナライトの類縁体が、少なくとも試
験溶液と接触するストリップの部分とおよび前記部位と
の間で、ストリップに非拡散結合している。

本発明の方法において、前記部位から離れたストリップ
の端部を試験溶液と接触させると、試験溶液は毛管移動
によって吸収性材料に浸透する。

ストリップを、シグナル発生系成分を含有する顕色（ｄ
ｅｖｅｌｏｐｅｒ）液と接触させ、次いで残りのシグナ
ル発生系成分（試験溶液にも顕色液にも含まれておらず
、またもともとストリップ中にら存在しない成分）があ
ればこれと接触させる。少なくとも一部の試験溶液は、
展開液が前記部位と接触する前に前記部位と接触する。

次いで、前記部位に存在する検出可能なシグナルを、上
記部位以外のストリップの部分における検出可能なシグ
ナルと比較して試験溶液中のアナライトを定量する。

本発明の特定の態様において、試験溶液中にアナライト
が存在する場合、小部位で発生するシグナルは、上記部
位以外のストリップの部分で発生するシグナルと明確な
対照をなす、鋭く明瞭なパターンを有す。

本発明の他の態様においては、第２ｓｂｐ成分が、−小
部位に非拡散結合した粒子を介してストリップの上記−
小部位に非拡散結合する。第１　ｓｂｐ成分がアナライ
トに結合していなくても第２ｓｂｐ成分が第１　ｓｂｐ
成分に結合し得る場合には、第１　ｓｂｐ成分に結合し
得るアナライトの類縁体が、前記部位と端部との間でス
トリップに非拡散結合している。

本発明の方法および装置は、試験溶液中の複数のアナラ
イトの定量に特に適する。試験溶液中に１種またはそれ
以上のアナライトが存在するか否かを、単一のストリッ
プで容易に調べることができる。さらに、本発明の方法
によって、レファレンス物質または器械の運転を必要と
せず、薬物のようなアナライトを検出し得る。

［実施態様］ 前記のように、本発明は、アナライトを含有する疑のあ
る試料中のアナライトを定量するための方法および装置
に関する。試料と、アナライトに結合し得る第１　ｓｂ
ｐ成分とを、水系媒質中に入れることによって、試験溶
液を調製する。毛管移動によってこの試験溶液を通過さ
せ得る吸収性材料のストリップの端部を、試験溶液と接
触させる。

ストリップは、アナライトと第１ｓｂｐ成分とから生成
した複合体に結合し得る第２　ｓｂｐ成分を一体的に含
む。第２ｓｂｐ成分は、ストリップの端部から離れたー
小部位に非拡散結合させる。試験溶液は、ストリップの
少なくとも一部に浸透する。次いで、ストリップを、シ
グナル発生系成分を含有する顕色液に接触させる。この
方法において、少なくとも一部の試験溶液は、前記部位
が展開液と接触する前に前記部位と接触する。次いで、
要すれば、ストリップをシグナル発生系の残りの成分（
試験溶液にも展開液にも含まれず、ストリップ中にも存
在しない成分）と接触させる。次いで、前記部位におけ
る検出可能なシグナルを、その部位以外のストリップの
部分において検出可能なシグナルと比較する。試験溶液
中に存在するアナライトの量に応じて、前記部位におい
てシグナルが発生する。

第２　ｓｂｐ成分は、前記部位において第１　ｓｂｐ成
分を濃縮させ、ストリップに非拡散結合させる手段を提
供する。第１ｓｂｐ成分は、前記部位において試料中の
アナライトの量に応じて検出可能なシグナルを発生する
シグナル発生系の一部である。前記部位の表面領域は、
本質的にストリップ面積よりも狭い。第２ｓｂｐ成分は
、アナライトに直接結合することによって、もしくは第
１ｓｂｐ成分に直接結合（シグナル発生標識への結合を
含む）することによって、または複合体のみに存在する
一部位に結合することによって、第１　ｓｂｐ成分複合
体に結合する性質を有する。第２ｓｂｐ成分が第１　ｓ
ｂｐ成分に直接結合することができ、それ紋末複合第１
ｓｂｐ成分に結合することができる場合、未複合第１　
ｓｂｐ成分に結合し得るアナライト類縁体が、ストリッ
プに結合している。通例、アナライト類縁体は、少なく
とも前記部位と端部の間でストリップに非拡散結合する
。

検出可能なシグナルを発生する手段は、通例、ｌ成分が
ｓｂｐ成分にコンジュゲートして標識−５ｂｐ成分コン
ジュゲートとなっているシグナル発生系である。検出可
能なシグナルを発生する標識の量は、試験溶液中のアナ
ライトの量に対応する。シグナル発生系は、前記部位に
おいて、試料中のアナライトの存在または量に対応した
検出可能なシグナルを発生させるのに必要な、標識−５
ｂｐ成分コンジュゲートおよび他のすべての試薬を含ん
で成る。

本発明の特定の態様において、第２　ｓｂｐ成分は、前
記部位においてストリップに非拡散結合する粒子にコン
ジュゲートしている。

前記小部位は、ストリップに沿って試験溶液が通過する
方向を横切る帯状部位であってよい。前記小部位で発生
したシグナルは、ストリップのその部位以外の部分で発
生したシグナルとは明らかな対照をなす、縁の鋭い独特
の型を有することができる。通例、前記小部位で発生し
たシグナルを、その付近のストリップの領域と比較する
。

本発明は、試験溶液中の複数のアナライトの定量に特に
適する。

本発明の特定の聾様についてさらに記述を進めるに先だ
って、一連の用語を定義する。

アナライト：　測定される化合物または組成物であって
、特異的結合対の一員であり、リガンドであってよく、
これは通例１価または多価抗原性またはハプテン性であ
り、単一化合物、または少な（とも１つの共通エピトー
プ部位もしくは決定部位またはレセプターを共有する化
合物群である。

多価リガンドアナライトは、通例ポリ（アミノ酸）（す
なわちポリペプチドおよびタンパク質）、多糖類、核酸
、およびその組合わせである。そのような組合わせには
、バクテリア、ウィルス、染色体、遺伝子、ミトコンド
リア、核、細胞膜などが含まれる。

アナライトの正確な性質およびその多数の例は、米国特
許第４，２９９，９１６号（特に第１６〜２３欄）に開
示されており、この開示をここに引用して説明の一部と
する。

関心の対象であるアナライトには、薬物、代謝産物、殺
虫剤、汚染物などが含まれる。

そのような薬物には、アルカロイドが含まれる。

アルカロイドには、モルヒネアルカロイド（モルヒネ、
コディン、ヘロインおよびデキストロメトルファンを含
む）、その誘導体および代謝産物：コカインアルカロイ
ド（コカインおよびペンゾイルエクゴニンを含む）、そ
の誘導体および代謝産物；麦角アルカロイド（リゼルグ
酸のジエチルアミドを含む）；ステロイドアルカロイド
；イミナゾイルアルカロイド；キナゾリンアルカロイド
；イソキノリンアルカロイド；キノリンアルカロイド（
キニーネおよびキニジンを含む）；ジテルペンアルカロ
イド、その誘導体および代謝産物がある。

薬物の他の群はステロイドであり、エストロゲン、エス
トゲン、アンドロゲン、アンドレオコルチカルステロイ
ド、胆汁酸、強心配糖体およびアグリコン（ジゴキシン
およびジゴキシゲニン、サポニンおよびサポゲニンを含
む）、その誘導体および代謝産物を含む。ジエチルスチ
ルベストロールのようなステロイド様物質も含まれる。

薬物の他の群は５〜６員環ラクタムであり、パルピッレ
ート（例えばフェノバルビタールおよびセコバルビター
ル）、ジフェニルヒダントイン、プリミドン、エトスク
シミドおよびその代謝産物を含む。

薬物の他の群は炭素原子２〜３個を有するアルキル基を
持つアミノアルキルベンゼンであり、アンフェタミン、
カテコールアミン（エフェドリン、Ｌ−ドーパ、エピネ
フリン、ナルセイン、パパベリンを含む）、およびその
代謝産物を含む。

薬物の他の群はベンゼン縮合複素環であり、オキサゼパ
ム、クロルプロマジン、テグレトール、イミプラミン、
その誘導体および代謝産物を含み、複素環としてはアゼ
ピン、ジアゼピンおよびフェノチアジンを含む。

薬物の他の群はプリンであり、テオフィリン、カフェイ
ン、その誘導体および代謝産物を含む。

薬物の他の群はプリンァナ誘導体であり、カンナビノー
ルおよびテトラヒドロカンナビノールを含む。

薬物の他の群は、ビタミンＡＳＢのようなビタミンであ
り、例えばビタミンＢ１１、Ｃ，Ｄ、Ｅおよびに１葉酸
、チアミンを含む。

薬物の他の群は、水酸化および不飽和の度合および位置
が様々であるプロスタグランジンを含む。

薬物の他の群は抗生物質であり、ベニンリン、クロロマ
イセチン、アクチノマイセチン、テトラサイクリン、テ
ラマイシン、その誘導体および代謝産物を含む。

薬物の他の群はヌクレオシドおよびヌクレオチドであり
、ＡＴＰ、ＮＡＤ、ＦＭＮ、アデノシン、グアノシン、
チミジンおよびシヂジンであって、適当な糖置換基およ
びホスフェート置換基を有するものを含む。　薬物の他
の群は、メサトン、メブロバメート、セロトニン、メペ
リジン、アミトリブチリン、ノルトリブチリン、リドカ
イン、ブロカインアミド、アセチルプロカインアミド、
プロプラノロール、グリセオフルビン、パルプロ酸、ブ
チロフェノン、抗ヒスタミン剤、抗コリン剤（例えばア
トロビン）のような種々の薬物、その誘導体および代謝
産物を含む。

病態関連代謝産物は、スペルミン、ガラクトース、フェ
ニルピルビン酸およびポルフィリン（１）を含む。

薬物の他の群は、ゲンタマイシン、カナマイシン、トブ
ラマイシンおよびアミカシンのようなアミノグリコシド
を含む。

殺虫剤には、ポリハロゲン化ビフェニル、リン酸エステ
ル、チオホスフェート、カルバメート、ポリハロゲン化
スルフェンアミド、その誘導体および代謝産物がある。

特異的結合対成分（「ｓｂｐ成分」）：　１種または２
種の異なる分子であって、他方の分子の特定の空間性お
よび極性構成（ｏｒｇａｎｉｚａｔ　１ｏｎ）に対して
特異的に結合する（そのため相補的と定義される）領域
を表面上またはキャビティ内に有する。特異的結合対の
構成員は、リガンドおよびレセプター（アンチリガンド
）と称される。これらは、通例免疫対の構成員であるが
、他の特異的結合対（例えばビオチン７アビジン、ホル
モン−ホルモンレセプター、核酸対など）は免疫対では
ない。

リガンド；　対応するレセプターが天然に存在するか、
またはレセプターを製造し得る有機化合物。

レセプター（「アンチリガンド」）二　　分子の特定の
空間性または極性構成（例えばエピトープ部位あるいは
決定部位）を認識できる化合物または組成物。レセプタ
ーの例には、天然レセプター類、例えばチロキシン結合
グロブリン、抗体、酵素、Ｐａｂフラグメント類、レク
チン類、核酸、プロティンＡ、補体成分ＣＩｑなどが含
まれる。

リガンド類縁体またはアナライト類縁体二類似リガンド
またはアナライトとレセプターを競合し得る修飾リガン
ド（ｍｏｄｉｆｉｅｄ　　ｌｉｇａｎｄ）もしくは代用
リガンド（ｌｉｇａｎｄ　　ｓｕｒｒｏｇａｔｅ）また
は修飾アナライトもしくは代用アナライトであり、修飾
はリガンド類縁体またはアナライト類縁体を他の分子に
結合する手段を提供する。リガンド類縁体またはアナラ
イト類縁体は、通例リガンド類縁体またはＬナライト類
縁体とハブ（ｈｕ’ｂ）または標識とを連結する結合に
よる水素の置換より多くの点（必要条件ではなしっで、
リガンドまたはアナライトと異なる。代用リガンドまた
は代用アナライトとは、第１　ｓｂｐ成分と結合し得る
化合物を意味する。

すなわち、代用リガンドまたは代用アナライトは、リガ
ンドまたはアナライトと同様に第１　ｓｂｐ成分と結合
し得る。他方、代用物は、例えばリガンドまたはアナラ
イトのイディオタイプ抗体に抗する抗体である。

吸収性材料：　毛管現象によって水性媒質を通過させや
すい、孔径が少なくとも０．１μ、好ましくは少なくと
も１．０μの多孔質材料である。

このような材料は、通例親水性であるか、または親水性
とすることができ、シリカ、硫酸マグネシウムおよびア
ルミナのような無機粉末：天然ポリマー材料、特にセル
ロース性材料およびセルロースから誘導される材料、例
えば繊維含有紙（濾紙、クロマトグラフ用紙など）；ニ
トロセルロース、セルロースアセテート、ポリ（塩化ビ
ニル）、ポリアクリルナミド、架橋デキストラン、アガ
ロース、ポリアクリレートなどのような合成または変性
天然ポリマーを含み、そのまま、またはセラミック材料
などの他の材料と組み合わせて使用する。吸収性材料を
支持体に結合することができる。他方、吸収性材料自身
以外に支持体を供給しなくてもよい。吸収性材料は、多
官能性であるか、または多官能性となることができ、ｓ
ｂｐ成分の共存結合および他の化合物の結合を許し、シ
グナル発生系の一部を形成し得る。

ｓｂｐ成分と吸収性材料の結合は、通例文献に記載のよ
く知られた方法によって行なわれる。例えば「イモビラ
イズド・エンザイムス」（“Ｉ　ｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ
　　Ｅ　ｎｚｙｍｅｓ”、シバタイチロウ、ハルステッ
ド・プレス、ニューヨーク、１９７８年）およびカトレ
カサス、ジャーナル・才ブ・バイオロンカル・ケミスト
リー（Ｊ　、　Ｂｉｏ、　ｃｈｅｍ、　）２４５巻３０
５９頁（１９７０年）参照。

吸収性材料は、ストリップ状に切断したシートのような
単一構造であるか、または例えば薄層クロマトグラフィ
ーに使用するような、支持体または固体表面に結合した
粒状材料であってよい。

支持体を所望するかまたは必要とする場合、吸収性材料
の支持体は、通例水不溶性、非極性かつ硬質であり、吸
収性材料と同じ長さと幅を有するが、吸収性材料よりも
大きくても小さくてもよい。

ストリップの毛管現象もしくはアッセイ化合物の非特異
的結合を妨害せず、かつシグナル発生系を妨害しない限
り、多種の合成および天然の有機または無機材料並びに
その組み合わせを使用し得る。

ポリマーの例としては、ポリエチレン、ポリプロピレン
、ポリ（４−メチルブテン）、ポリスチレン、ポリメタ
クリレート、ポリ（エチレンテレフタレート）、ナイロ
ン、ポリ（ビニルブチレート）、ガラス、セラミックス
、金属などがある。

標識ｓｂｐ成分：　　ｓｂｐ成分にコンジュゲートした
標識（例えば触媒、通例酵素である）であり、シグナル
発生系の構成員である。ｓｂｐ成分は、アナライトに直
接結合し得るか、またはアナライトに相補的なｓｂｐ成
分に結合することによってアナライトに非直接的に結合
し得る。

標識：　標識は、他の分子または吸収性支持体にコンジ
ュゲートした任意の分子であってよく、２種の分子が関
係する場合には、いずれの分子を標識にするかは随意に
選択される。本発明では、標識は、シグナル発生系の構
成員であり、これはｓｂｐ成分とコンジュゲートしてい
る。標識は、同位元素であっても同位元素でなくてもよ
いが、同位元素でない方が好ましい。しかし、写真用フ
ィルムを用いてラジオ−オートグラフィー測定を行う場
合に感度を高めるには、同位元素が好ましいことがある
。

シグナル発生系：　シグナル発生系は、１つまたはそれ
以上の成分を有していてよく、少なくともｌ成分はｓｂ
ｐ成分にコンジュゲートした標識である。シグナル発生
系は、測定可能なシグナルの発生に必要なすべての試薬
を含む。第１　ｓｂｐ成分が標識にコンジュゲートして
いない場合、標識は、通例第１ｓｂｐ成分に相補的なｓ
ｂｐ成分に結合し、通例顕色剤に含まれている。展開剤
の他の成分には、基質、補酵素、エンハンサ−１第２酵
素、活性化剤、補因子、阻害剤、スカベンジャー、金属
イオン、特異的結合物質（シグナル発生物質の結合に必
要）などがある。シグナル発生系の成分は、補酵素、酵
素生成物と反応する物質、他の酵素および触媒などのよ
うなストリップに結合していてよい。シグナル発生系は
、外部的手段、通例電磁放射の測定、好ましくは視覚的
検査により検出できるシグナルを発生する。通例、シグ
ナル発生系は発色性基質および酵素を含み、発色性基質
は、紫外または可視領域の光線、燐光または蛍光を吸収
する色素に酵素的に変換される。

シグナル発生系は、少なくとも１種の触媒（通例少なく
とも１種の酵素）および少なくとも１種の基質を含んで
いてよく、２種またはそれ以上の触媒および複数の基質
を含んでいてもよく、１種の酵素の基質が他方の酵素の
生成物であるような酵素組成物を含んでいてもよい。シ
グナル発生系の作用は、標識ｓｂｐ成分の複合体生成に
よって、前記小部位において、その部位に結合した触媒
量に応じて検出可能なシグナルを発生する生成物を導く
ことである。

シグナル発生系は、化合物、通例シグナル発生化合物を
生成するが、シグナル発生化合物の生成、亢進（ｅｎｈ
ａｎｃｅｍｓ　ｎ　ｔ　）または破壊を伴って、表面に
結合した他の化合物と反応する場合もある。シグナル発
生系において、酵素触媒も非酵素触媒も使用し得るが、
通例少なくとも１種の酵素触媒を使用する。１種の触媒
しか使用しない場合、この触媒は、通例ｓｂｐ成分とコ
ンジュゲートし、ｓｂｐ成分複合体形成によって前記部
位に結合する。触媒に加えて、測定し得る表面において
、変換を行って検出可能なシグナルとなる基質も無くて
はならない。通例標識ｓｂｐ成分に触媒されて変換によ
って得られる生成物は、シグナル発生化合物である。

２種の触媒を使用し得る場合は、酵素および非酵素触媒
の組合わせであってもよく、一方の触媒の生成物が他方
の触媒の基質であるならば、２種とも酵素触媒であって
もよい。この系において、触媒によって連続的に変化し
、検出可能なシグナルを発生する化合物となり得る基質
は１種のみ必要である。しかし、通例一連の第１酵素の
基質および第２の化合物（シグナル発生に関与する化合
物の前駆体、通例シグナル発生化合物を産生ずる）が存
在する。すなわち、第１酵素の生成物をシグナル発生化
合物前駆体と反応させて、シグナル発生化合物を供給す
る。

通例、加水分解または酸化還元反応が関与している。加
水分解を行う場合は、酵素的に不安定な結合を有する誘
導色素前駆体およびそれから不溶性色素生成物への変換
を触媒する酵素が、このような系の例である。酸化還元
反応を行う場合には、第２酵素が酸化基質および色素前
駆体間の反応を触媒するならば、第１酵素は、第２酵素
に必要な必須酸化基質を生成する。

２種の酵素を使用する場合、第１酵素反応は、基質の加
水分解または酸化還元反応を伴い、他の酵素の基質であ
る生成物を供給する。第１の反応は、グルコース−６−
リン酸を触媒的に加水分解してグルコース（グルコース
オキシダーゼの基質）とする反応によって説明される。

第２の反応は、グルコースをグルコースオキシダーゼに
よって酸化して過酸化水素（色素前駆体と酵素的に反応
してシグナル発生体を生成する）を供給する反応によっ
て説明される。

対をなす触媒に、非酵素触媒をさらに加えることもでき
る。酵素が、非酵素触媒に触媒される反応を行う反応物
質を生成し得るか、または非酵素触媒が、酵素の基質（
補酵素を含む）を生成し得る。

使用し得る多種の非酵素触媒が、米国特許第４゜１６０
．６４５号（１９７９年７月ｌＯ日発行）に記載されて
おり、その該当部をここに引用して説明の一部とする。

シグナル発生化合物を与えるために、酵素の種々の組合
わせを使用し得る。特に、加水分解酵素の組合わせを使
用し°ζ不溶性シグナル発生体を生成し得る。また、加
水分解酵素と酸化還元酵素の組合わせも、シグナル発生
化合物を生成し得る。

さらに、酸化還元酵素に組合わせを使用して、不溶性シ
グナル発生化合物を生成することもできる。

酵素の組合わせにおいて、１方の酵素はストリップに非
拡散結合しており、他方の酵素はｓｂｐ成分にコンジュ
ゲートしている。さらに、選択されたシグナル発生系の
種類またはプロトコルの種類によっては、シグナル発生
系の他の１種またはそれ以上の成分がストリップに結合
し得る。

検出可能なシグナルを得るために、前記部位に結合した
標識の存在によって発生したシグナルを増幅する手段を
供給することが望ましい。すなわち、通例標識は、好ま
しくは触媒もしくは発光化合物または放射性同位体であ
り、より好ましくは触媒である。好ましくは、触媒は、
単一の標識から多数のシグナル発生分子を生成し得る酵
素および補酵素である。

光を吸収する生成物（例えば色素）または照射によって
発光する生成物（例えば蛍光物質）゛の生成によってシ
グナルを所望する程度に増幅する酵素および補酵素を使
用する。また、触媒反応によって直接の発光を導くこと
もできる（例えば化学ルミネッセンス）。このような生
成物を生成する多数の酵素および補酵素が、米国特許第
４，２７５，１４９号の第１９〜２３欄および米国特許
第４，３１８．９８０号の第１Ｏ〜１４欄に記載されて
おり、その開示をここに引用して説明の一部とする。

特に興味深い酵素の組合わせにおいて、一方の酵素の生
成物は他方の酵素の基質であるという関係がある。この
ような場合、不安定な基質に対する安定な前駆体を供給
することができ、使用前の反応開始を伴うことなく第２
酵素の基質を第１酵素と共に貯蔵し得る。

多数の触媒の組合わせが、米国特許第４．２７５．１４
９号の第２３〜２８欄に記載されており、その組成物を
本発明に使用し得る。この開示を引用して、説明の一部
とする。

過酸化水素を生成する酵素、および色素前駆体を酸化し
て色素とする過酸化水素の使用が、特に興味深い。色素
前駆体を酸化するために過酸化水素を要する酵素（すな
わち西洋ワサビペルオキシダーゼ、ラクトペルオキンダ
ーゼまたはミクロペルオキシダーゼのようなペルオキシ
ダーゼ）と組み合わせた、糖酸化酵素（例えばグルコー
スおよびガラクトースオキシダーゼ）または複素環酸化
酵素（例えばウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼ
）を含む組合わせが好ましい。さらに他の組合わせは、
引用文献に記載されている。標識として単一の酵素を使
用する場合、加水分解酵素、転移酵素および酸化還元酵
素のような他の酵素、好ましくはアルカリホスファター
ゼおよびβ−ガラクトシダーゼのような加水分解酵素を
使用し得る。また、蛍ルシフェラーゼおよび細菌性ルシ
フェラーゼのようなルシフェラーゼも使用し得る。

使用する補酵素の例には、ＮＡＤ（Ｈ）；　ＮＡ、ＤＰ
（Ｈ）；　ピリドキサールホスフヱート；ＦＡＤ（Ｈ）
；　ＦＭＮ（Ｈ）などが含まれる。通例、補酵素はサイ
クリング反応（ｃｙｃｌｉｎｇ　　ｒｅａｃｔｉｏｎ）
を伴う・米国特許第４，３１８，９８０号参照。

酵素反応の生成物は、通例色素または蛍光物質である。

多数の蛍光物質の例が、米国特許第４゜２７５．１４９
号の第３０〜３Ｉ欄に記載されており、ここに引用して
説明の一部とする。

補助物質二　本発明のアッセイにおいて、種々の補助物
質をしばしば使用する。例えば、緩衝液および安定剤は
、アッセイ系中に通例存在する。

しばしば、これらの添加剤に加えて、アルブミンのよう
な追加のタンパク質、界面活性剤、特に非イオン性界面
活性剤、例えばポリアルキレングリコールのような結合
強化剤などが含まれる。

小部位：　吸収性材料のストリップの領域であり、スト
リップ面積よりも本質的に小さい面積を有する。この部
位は、点状、線状、曲線状、帯状、もしくは点、線、曲
線、帯で形成されたパターンまたはそれらの組み合わせ
であってよい。通例、試験溶液がストリップに浸透する
方向は、この部位を横切る。好ましくは、この部位で発
生したシグナルは、鋭い独特の型を有し、ストリップの
この部位以外の部分で発生するシグナルとは明らかに対
照的である。例えば、試験溶液中のアナライトの略号ま
たは名称、プラス印などで、この部位に印をつけること
ができる。本発明の主要原理によると、この部位は、試
験溶液と接触するストリップ端部かう離れている。試験
溶液を十分に集中させるために、部位を、ストリップを
浸透する溶液の主な部分と接触させなければならない。

本発明の方法において、アナライトと結合し得る第１　
ｓｂｐ成分を、アナライトの含有が疑われる試料と組み
合わせて試験溶液とする。アナライトと第１ｓｂｐ生成
との結合によって生成した複合体と結合し得る第２　ｓ
ｂｐ成分は、前記小部位で、吸収性ストリップに非拡散
結合する。ストリップの一端を試験溶液と接触させると
、試験溶液は毛管作用によってストリップに浸透する。

第２　ｓｂｐ成分への結合を介して前記部位に結合する
第１ｓｂｐ成分の量は、試料中のアナライトの量に関係
している。シグナル発生系は、第１ｓｂｐ成分が結合し
た場合のみ前記部位で検出可能なシグナルを発生し、前
記部位で検出可能なシグナルを、゛ストリップのその部
位以外の部分（通例、前記部位に隣接した部分）で検出
可能なシグナルと比較することによってアナライト量を
定量し得る。第１ｓｂｐ成分は、アナライトに特異的に
結合する。第２　ｓｂｐ成分は、前記部位において非拡
散結合し、第１ｓｂｐ成分に結合し得る。第１　ｓｂｐ
成分の結合部位への直接結合、または第１ｓｂ、ｐ成分
に結合するアナライトの結合部位への非直接結合も起こ
り得る。アナライトと第１　ｓｂｐ成分との複合体に特
有の部位（この部位は、各成分単独では存在しない）に
おける結合も起こり得る。

第１　ｓｂｐ成分と第２ｓｂｐ成分が直接結合する場合
、少なくとも前記部位と端部の間でアナライトの類縁体
をストリップに非拡散結合させることによって、遊離の
第１ｓｂｐ成分を除去することが必要である。通例、ア
ナライトが単一の結合部位を有する場合（例えば薬物で
ある場合）、またはアナライトに相補的なｓｂｐ成分が
１つしかない場合、第１ｓｂｐ成分に直接結合する第２
ｓｂｐ成分を選択する。

通例、ストリップに結合するアナライト類縁体の量は、
試験溶液中にアナライトが存在しなければ、すべての第
１　ｓｂｐ成分が結合するのに十分であるようにすべき
である。通例、このような類縁体を過剰量存在させる。

試験溶液は、毛管現象によってストリップ中を移動する
。ストリップ内の毛管現象によって、試験溶液は前記部
位に運ばれる。好ましくは、ストリップを試験溶液と接
触させた後、顕色液によって前記部位を通過する毛管移
動を続ける。この場合、試験溶液を接触させたストリッ
プ端部に展開液を接触させる。また、ストリップと顕色
液を接触させるために、ストリップ端部を試験溶液と接
触させた後、前記部位を顕色液中に浸してもよい。

いずれにせよ、前記部位が顕色剤と接触する前に、第１
ｓｂｐ成分を前記部位に集中させる。

溶媒は、通例、他の極性溶媒濃度が約４０重量％を越え
ない水性媒体、特に炭素原子１〜６個、通例１〜４個を
有する酸化溶媒（例えばアルコール、エーテルなど）で
ある。通例、共溶媒が、約２０重量％を越えない量で存
在する。

媒体のｐＨは、通例４〜１１、特に５〜１０、好ましく
は約６〜９である。ｓｂｐ成分の結合親和度が適度に保
たれ、シグナル発生系によるシグナルの発生が最適に保
たれるようにｐｉ（を選択する。

所望のｐＨを達成し、アッセイ中のｐ）ｌを保持する・
ために、種々の緩衝液を使用し得る。緩衝液の例には、
ホウ酸、リン酸、炭酸、トリス、バルビツールなどの緩
衝液がある。使用する緩衝液は特定のものに限定されな
いが、好ましい緩衝液はアッセイごとに異なり得る。

非イオン性界面活性剤約０．０５〜０．５重量％を試料
に含めることが望ましい。種々のポリオキシアルキレン
化合物２００〜２０，０００ダルトンを使用し得る。

通例、望ましくは実質的に一定の、中程度の温度でアッ
セイを行う。アッセイを行い、検出可能なシグナルを発
生させる温度は、通例的４〜５０℃、特に約ｌθ〜４０
℃、より特別には室温、すなわち約１５〜２５℃である
。

液体試料中のアッセイを行うアナライトの濃度は、通例
的１０−’〜ｌＯ利５Ｍミ特に約１０１〜１０−１４Ｍ
の範囲で様々である。通例、関心の対象であるアナライ
トの濃度およびプロトコルなどを考慮して、他の試薬の
濃度を決定する。

試料中の種々の試料および試料溶液のほとんどの濃度は
、通例アナライトの濃度範囲によって決定するが、各試
薬の最終濃度は、通例禮験的に全測定範囲にわたってア
ッセイの感度を最適にするように決定する。あるプロト
コルにおいては、アッセイの感度に有害な影響を及ぼす
ことなく、各試薬を実質的に過剰に使用し得る。

ストリップの寸法は、いくつかの事柄を考慮して決定す
る。毛管流が主に上向である場合には、ストリップの長
さおよび厚さによって、前記部位を通過し得る溶液の量
を調節する。第１溶液を大量に移動させるには、前記部
位より上部のストリップの液体受容量が、所望の体積の
液体を収容する゛のに十分であることが必要である。試
験溶液をサイホンで吸い取るように、主に下向の液体に
ストリップを供給する場合には、そのような容量は不亜
−′ｒ−惠ス　六ム？−汁鯰虜彼シ小Ｌｍ　＆ｈ　を−
油田１汁いストリップ端部に吸収性物質を接触させる場
合にも、そのような容量は不要である。通例、可能な限
り大量に前記部位を通過させ、アッセイの感度を最大に
することが望ましい。しかし、アッセイに要する時間お
よび試料の使用量を考慮すると、そのような要求は制限
される。通例、上向流用ストリップでは、前記部位付近
の液体保持容量は、約２０μＱよりも多く、好ましくは
少なくとも５０〜２００μＱである。下向流用ストリッ
プでは、保持容量が２〜２０μＱと低くてもよいが、２
０〜２０′０μＣであることが好ましい。

ストリップの厚さは、通例幅の２０％を越えず、好まし
くは幅の１−１０％、より好ましくは幅の２〜５０％で
ある。

限られた寸法の中に試薬を保護し、試料を供給するため
に、ストリップの幅は、通例比較的狭い（通例２０ｍｍ
を越えない、好ましくはＩ　Ｏｍｍを越えない）。通例
ストリップの幅は、約１０ｎＴｍを越えない、特に約２
〜１’２ｍｍ、好ましぐは約４′〜８ｍｍである。

ストリップの長さは、アナライトの濃度によって、並び
に扱いやすさおよびストリップ上の前記部位の数などを
考慮して決定し、約２〜４０ｃｍ、通例的４〜２５ｃｍ
、好ましくは約６〜２０ｃｍであるが、いずれの実用的
な長さでもよい。ストリップの構造は多様であり、微細
、中微細（ｍｅｄｉｕｍ　　ｒｉ　ｎｅ）、中（ｍｅｄ
ｉｕｍ）、中粗（ｍｅｄｉｕｌｌｃｏａｒｓｅ）、およ
び粗のものを含む。通例、孔径が小さく、細かい材料を
使用するほど、毛管流は遅くなり、ｓｂｐ成分をストリ
ップに十分結合させることができる。

粗の多孔性材料を使用するほど流速は速まるが、結合度
は低下する。特定のアッセイにおけるｓｂｐ成分の結合
速度によって材料の粗さを選択する。

小部位、または複数のアナライトを定量する小部位の位
置は、本発明の基本原理によって管理する。十分量の試
験溶液を毛管現象によって前記部位に通過させ、十分量
のアナライトを前記部位に集中させ、背景に対比して検
出可能なシグナルを発生させる。すなわち、試験溶液を
接触させるストリップ端の近く（ただし、大量の溶液ま
たはメニスカスに接触するほど接近していない位置）に
部位を配置することが望ましい。望ましくは、前記部位
は、そのようなストリップ端から少なくとも５ｍｍ、好
ましくは８ｍｍ離れている。毛管作用によって試験溶液
が前記部位を通過し得るならば、前記部位を端部からよ
り離れた位置に配置してもよい。好ましくは、前記部位
を、そのような端部から、ストリップの長さの２分の１
以上離れた位置には配置しない。このように、前記部位
を前記端部から１離す」。複数の部位を設ける場合には
、各部位を近接させてまとめても、分散させてもよい（
ただし、シグナルを識別できないほど接近させるべきで
はない）。従って、このような部位を、通例Ｉｎｏｎ以
上、好ましくは少なくとも３ＩｎＩ１１離して配置する
。

特定のプロトコルおよびシグナル発生におけるその役割
によって、シグナル発生系の構成員の他の試薬の濃度は
多様であってよい。通例、第１ｓｂｐ成分濃度は、アナ
ライトが多数の結合部位を有する場合には、そのアナラ
イトの最高濃度の１０４倍を越えず、１価のアナライト
を使用する場合には、そのアナライトの最高濃度の１０
３場合を越えない。通例、第１　ｓｂｐ成分濃度は、測
定するアナライトの最低濃度の約０．５倍以上である。

標識が第１　ｓｂｐ成分に直接結合していない場合には
、それに結合する試薬は、第１　ｓｂｐ成分に結合する
ものでなければならず、関心の対象であるアナライトの
最低濃度に対して少なくとも等量存在しなければならな
い。

アッセイの実施において、プロトコルは、通例、アナラ
イトを含有する可能性のある試料を第１ｓｂｐ成分と混
合することによる試験水溶液の調製を含む。生体液（例
えば唾液、血液、血清、血漿、尿、涙液、髄液など）、
化学反応液、食料廃液などのような種々の被検材料から
試料を調製し得る。

ストリップ端部（通例前記部位に最も接近した端）を、
通例端部を試験溶液に浸すことによって試験溶液と接触
させる。通例、少なくとも前記部位が湿潤するまで、毛
管作用によってストリップの肩側を続けろ、、好ましく
は、ストリップの半分を試験溶液で湿潤させる。サイホ
ンで吸い取って下向きに浸透させる場合には、通例スト
リップ全部を湿潤させ、ストリップから、過剰の試験溶
液をサイホンで吸い取ってよい。

たいてい、比較的短時間で、試験溶液はストリップを通
過する。通例、試験溶液のストリップ内の通過には、少
な、くとも３０秒間〜１時間以内、特に約１〜３０分間
を要する。シグナルは、通例３０秒〜３０分、特に約３
０秒〜５分の間に現れる。

ストリップの少なくとも１部分に液体を通過させた後、
ストリップを、シグナル発生系の成分を有する顕色液と
接触させる。ストリップを顕色液に浸すことによってこ
れを行い得るが、好ましくは、ストリップ端のみ（予め
試験溶液と接触している）を、顕色液と接触させる。試
験溶液が、非標識第１　ｓｂｐ成分を含む場合には、顕
色液が、第１ｓｂｐ成分およびアナライトから生成する
複合体に結合し得る標識ｓｂｐ成分を有する。ストリッ
プ端部と顕色液の接触時には、顕色液を、毛管作用によ
ってストリップの少なくとも前記小部位に浸透させ、好
ましくはストリップ全体が湿潤するまで浸透させる。

標識として酵素を使用する場合、通例、反応速度を制限
しないように基質を実質的に過剰にする（Ｋｍよりも高
濃度）。顕色液を、通例酵素系に適するように緩衝する
。

ストリップを顕色液と接触させた後、ストリップを、シ
グナル発生系の残りの成分（顕色液または試験溶液に含
まれず、ストリップにも存在しない成分）と接触させる
。シグナル測定前に十分に時間を経過させ、アナライト
が結合している部位の領域を決定するのに必要なシグナ
ル発生化合物の量を生成させる。検出可能なシグナルが
発生すると、試料中に１種またはそれ以上のアナライト
が存在するか否かがわかる。

リガンド・アナライトは単一の結合部位（１価）または
多数の結合部位（多価）によって特性づけられるが、レ
セプター・アナライトも、単一または多数の結合部位を
有していてよい。多価アナライトは、通例ポリ（アミノ
酸）、すなわちポリペプチドおよびタンパク質、多糖類
、核酸およびその組み合わせである。そのような組み合
わせには、バクテリア、ウィルス、染色体、遺伝子、ミ
トコンドリア、核、細胞膜などが含まれる。

通例、多価リガンド・アナライトの分子量は、少なくと
も約５，０００、特に少なくとも約１０゜０００である
。ポリ（アミノ酸）類の場合、前記のようなポリ（アミ
ノ酸）の分子量は、通例約５，０００〜５，０００，０
００、特に約２０，０００〜１．０００，０００であり
、ホルモンであれば、分子量は約ｓ、ｏ　ｏ　ｏ〜６０
，０００である。

有用なリガンドの多くの例が、米国特許第４．２７５．
１４９号第１２〜１７Ｉ［ｌに記載されており、これを
ここに引用して説明の一部とする。

１価リガンド・アナライトの分子量は、通例約１００〜
２，０００、特に約１２５〜ｔ、ｏｏｏである。関心の
対象であるアナライトには、薬物、ホルモン、代謝産物
、殺虫剤、汚染物質などが含まれる。

このような多くのアナライトが、米国特許第４゜２７５
．１４９号第１７〜１８ｍに挙げられており、これをこ
こに引用して説明の一部とする。

レセプター・アナライトの場合、その分子量は通例約１
０’　〜２ＸｌＯ”、　特に約３Ｘ１０’　〜２×１０
６である。免疫グロブリン（例えばＩｇＡ。

ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ）ならば、分子量
は、通例約１６０，０００−１０’の範囲で多様である
。酵素は、通例約１０，０００〜６００，０００ダルト
ンの範囲で多様である。天然レセプターは、分子量が通
例少なくとも約２５，０００であり、１０８およびそれ
以上であってもよく、アビジン、チロキシン結合グロブ
リン、チロキノン結合プレアルブミン、トランスコルチ
ン、膜表面タンパク質などが含まれる。

リガンドを他の分子または支持体にコンジュゲートする
場合、しばしばリガンドを修飾して特定の部位に特定の
官能基を供給する。この修飾によって、リガンド類縁体
と称される生成物が生成する。

米国特許第４．２７５，１４９号第１８〜１９欄にはリ
ガンド類縁体についても詳細に記載されており、ここに
引用して説明の一部とする。

ストリップを種々の材料で被覆して、性能を高めること
ができる。被覆には、タンパク質被覆１多糖類被覆、合
成ポリマー、糖などが含まれ、これらは特に支持体にコ
ンジュゲートした材料の安定性を高めるために使用され
る。これらの化合物を、ｓｂｐ成分またはシグナル発生
系成分のような物質のストリップへの結合を改良するた
めにも使用し得る。

ストリップまたは前記部位を、反応性官能基で活性化し
て、有機物質をストリップにコンジュゲートさせること
ができる（米国特許第４，１６８゜１４６号参照）。

前記部位でストリップに結合するｓｂｐ成分の量は、す
べての標識ｓｂｐ成分の結合に要する量に応じて様々で
ある。通例、前記部位におけるｓｐｐ成分の量は、少な
くとも前記部位を通過するアナライトの量と等量であり
、アナライト量の１０，０００倍またはそれ以上であっ
てもよい。

第２ｓｂｐ成分、アナライト類縁体、および所望により
シグナル発生系の成分を、共有結合でなく吸着によって
ストリ、ツブに結合させ得る（ただし、結合は非拡散的
でなくてはならない）。これは、吸収性支持体を、スト
リップに結合する物質を含有する溶液と接触させ、スト
リップを乾燥させることによる。通例１、この方法は、
吸収性支持体が比較的疎水性であるか、または表面電荷
が高い場合に限り有用であり、タンパク質、洗剤、多糖
類、または非特異的結合部位を遮断し得る他の物質によ
る後処理を要する。

本発明の好ましい態様では、第１ｓｂｐ成分を粒子また
はビーズに非拡散結合させ得る。次いで、粒子またはビ
ーズを、ストリップの前記部位に適用し得る。通例、粒
子は、非特異的な相互作用をあまり伴わずに標識ｓｂｐ
成分または標識を特異的に結合させる手段を有する。粒
子またはビーズは、天然品または合成品であり、多様な
性質を有する。

この材料は市販されており、市販材料を変性してもよい
。このような粒子またはビーズの例として、バイオゲル
（Ｂ　ｉｌｇｅｌ）　　り（商標）として市販のポリス
チレン製、ポリアクリレート製、ポリアクリルアミド製
のラテックス粒子、またはセファロース（Ｓ　ｅｐｈａ
ｒｏｓｅｑ商標）として市販の多糖類、特に架橋多糖類
（例えばアガロース）、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄ
ｅｘ、商標）として市販のデキストラン、微晶セルロー
ス、デンプンなどのような天然材料がある。他の材料に
は、ポリアクリルアミド、ボリスチレユ、′、ポリビニ
ルアルコール、ヒドロキシエチルメタクリレートとメチ
ルメタクリレートのコポリマー、シリコーン、バイオグ
ラス（Ｂ　ｉｏｇｌａｓ。

商標）として市販のガラス、珪藻土、シリカなどが含ま
れる。第１の必要条件は、材料がシグナル（通例、光の
吸収）に関与しないこと、すなわち、シグナル発生系と
接触させる前に前記部位でストリップの他の部分と異な
るシグナルを発生しないことである。

粒子は、ｓｂｐ成分に非拡散結合し得るものでなければ
ならず、その結合、は共有結合でも非共有結合でもよい
。ｓｂｐ成分が共有結合する場合、粒子は、多官能性で
あるか、または多官能性とし得るものであるべきである
。種々の官能基が存在し、または組み込むことができる
。官能基には、カルボン酸、アルデヒド、アミン、アミ
ド、マレイミド（ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）のような活性エ
チレン、ヒドロキシル、スルホン酸、メルカプタンなど
が含まれる。

種々の化合物を種々の粒子に連結する方法は周知であり
、文献に詳細に記載されている。例えば、ジャーナル・
才ブ・バイオロジカル・ケミストリ（Ｊ　、　Ｂｉｏ１
、　Ｃｈｅｍ、　）２４５巻３０５９頁（１９７０年）
参照。

連結基の長さは、連結する化合物の性質、標識と粒子の
距離が標識の性質に及ぼす影響、標識の架橋能力などに
よって広範に変化する。

粒子は、どのような程度にも移動するものであってはな
らない。粒子の大きさは様々であってよいが、吸収性材
料の孔に浸透し、そこにはまり込むか非拡散結合する大
きさでなくてはならない。すなわち、粒子径は、通例吸
収性材料の最小孔径よりもわずかに大きく、最大孔径よ
りも小さい。通例、粒子径は、約０．１〜５０μ、特に
約０．４〜１０μ、好ましくは０．５μよりも大きい。

非拡散結合したｓｂｐ成分を有する粒子を、縁が厳密に
規定された小部位でｓｂｐ成分をストリップに非拡散結
合させるために使用し得る。いくつかの方法で行い得る
。通例、粒子の懸濁液（しばしば水性懸濁液）をストリ
ップに適用し得る。適用は、静電およびレーザープロペ
ラジェット並びに印刷プローブまたは活字の使用を含む
いずれの標準的なプリント方法であってもよい。さらに
、粒子をテンプレートで供給してもよい。前記部位の形
は、粒子が吸収性ストリップに吸収されるカットパター
ンによって決定される。また、ペンまたはミクロキャピ
ラリーチューブで記入することによって、懸濁液をスト
リップに移すことができる。

乾燥粒子を使用する場合、所望の部位に気体（通例、空
気）中の粒子懸濁物を噴射することによって粒子を供給
する。各場合において、特にプリント法を使用しない場
合は、粒子を供給する面と反対側の面を減圧することが
しばしば望ましい。減圧室を覆うフィルターまたは多孔
性板の上に吸収性材料のシートを置くことによって、好
都合に減圧を行う。材料から空気を吸引しながら懸濁物
を供給する。粒子の供給方法に無関係に、通例、供給後
に前記部位を洗浄して非結合粒子を除去することが好ま
しい。

粒子の懸濁に使用する液体は、通例水性であり、粒子を
溶解するかまたは結合ｓｂｐ成分を損なうか解離させる
ものであってはならない。毛管流を制限し、厳密に制限
された部位に供給するために、増粘剤および界面活性剤
を加えてよい。増粘剤には、ポリビニルアルコール、ポ
リピロリドン、デキストラン、グリセロールなどが含ま
れる。界面活性剤は、イオン性（通例アニオン性）でも
非イオン性でもよい。

本発明の種々の態様を、以下いくぶん詳細に説明する。

−態様において、試料中のアナライトは多価である。ア
ナライトの決定部位を認識する第２ｓｂｐ成分は、吸収
性材料のストリップ上の小部位に非拡散結合している。

前記のいずれの手段によって非拡散結合を行ってもよい
。アナライト含有の疑のある試料および標識ｓｂｐ成分
を混合することによって、ストリップの液体受容量とほ
とんど同体積の試験溶液を調製する（ここで、後者のＳ
ｂｐ成分はアナライトの決定部位と結合して複合体を形
成する）。前記部位に近い方の吸収性ストリップ端部を
試験溶液と接触させると、試験溶液は毛管作用によって
吸収性ストリップに浸透する。試験溶液は、ストリップ
全体が湿潤するか、試験溶液がなくなるまでストリップ
内を移動し、前記部位を通過する。アナライトと標識第
］　ｓｂｐ成分との複合体は、前記部位で第２　ｓｂｐ
成分と結合し、それによって標識ｓｂｐ成分は前記部位
に集中する。

試験溶液を吸収性ストリップに浸透させた後、ストリッ
プを、シグナル発生系（標識もシグナル発生系の一員で
ある）の残りの成分を含有する展開液と接触させる。ア
ナライトが試験溶液中に存在する場合、前記小部位でシ
グナルが発生する。このシグナルは、前記部位に隣接し
た部分で発生したシグナルと識別し得る。

前記態様の変法において、試験溶液の体積は、ストリッ
プの１部分のみに浸透する、すなわちストリップの乾燥
部分の液体受容量が少なくとも端部から小部位に至る部
分の液体受容量に等しくなるように浸透するのに十分で
ある。予め試験溶液と接触させておいたスト４ノツプ端
部を、次いで顕色液と接触させる。顕色液は、毛管現象
によってストリップ内を移動して小部位を通過する。こ
のとき、展開液によって、残りの試験溶液が小部位を通
過する。アナライトが試験溶液中に存在すれば、シグナ
ルが発生する。　前記態様の他の変法においては、第１
ｓｂｐ成分を標識しない。アッセイを同様に行うが、第
１ｓｂｐ成分に相補的な標識Ｓｂｐ成分を顕色剤に含め
る。アナライトが存在すれば、第１　ｓｂｐ成分は前記
部位に結合し、それによって標識ｓｂｐ成分が前記部位
に結合する。この態様において、シグナル発生系のいく
つかの成分を顕色剤に含めず、顕色剤との接触後に、含
めなかった成分（すなわち残りの成分）を含有する溶液
をストリップと接触させることがしばしば好ましい。

前記態様において、複数の多価アナライトを定出し得る
。この目的のために、端部から離れたいくつかの部位を
使用する。１部位において、第１ｓｂｐ成分上の決定部
位を認識する第２ｓｂｐ成分が、吸収性ストリップに非
拡散結合される。他の部位においては、第２のアナライ
ト上の決定部位を認識する他の第２　ｓｂｐ成分を非拡
散結合させる。試験しようとするアナライトの種類だけ
小部位ができるまで同様の操作を行う。次いで、分析す
る試料を、複数の標識ｓｂｐ成分と共に適当な水性媒体
に混合し、試験溶液とする。標識第１　ｓｂｐ成分は、
第１のアナライト上の決定部位を認識するｓｂｐ成分を
含んでおり、この部位は吸収性ストリップ上の第１アナ
ライトと結合する第２　ｓｂｐ成分が認識する決定部位
とは異なる。他の標識第１ｓｂｐ成分は、第２のアナラ
イト上の決定部位を認識するｓｂｐ成分を含んでおり、
この部位は吸収性ストリップ上の第２アナライトと結合
する第２ｓｂｐ成分が認識する決定部位とは異なる。標
識ｓｂｐ成分の数は、試験するアナライトの数に対応す
る。１種またはそれ以上の試験するアナライトが試料中
に存在すれば、各アナライトとそれに対応する標識第１
ｓｂｐ成分との複合体が生成する。アナライトが存在し
なければ、そのような複合体は生成しない。

吸収性ストリップの端部を試験溶液と接触させると、試
験溶液はストリップに浸透する。アナライトと標識ｓｂ
ｐ接触とのいずれの複合体も、ストリップ上の前記各部
位に結合する。アナライトが存在しなければ、複合体は
生成せず、それ故そのアナライトに対応する標識第１ｓ
ｂｐ成分は前記部位で結合せず、シグナルを発生しない
。試験溶液を吸収性ストリップに浸透させた後、ストリ
ップを、用いるシグナル発生系の適当な成分と接触させ
る。

試験するすべてのアナライトに対して単一の顕色剤を使
用するようにアッセイを計画し得る。特定のアナライト
が試料中に存在すれば、その特定の部位でシグナルが発
生する。この方法の特に好ましい変法では、第１ｓｂｐ
成分を標識せず、顕色剤が、第１ｓｂｐ成分に相補的な
標識ｓｂｐ成分を含む。

ストリップをシグナル発生系の残りの成分と接触させた
後、顕色剤と接触させる。

本発明の他の態様においては、アナライトは１価の薬物
である。薬物の含有が疑われる試料を適当な媒体内で標
識第１　ｓｂｐ成分と混合し、試験水溶液とする。標識
第１　ｓｂｐ成分を薬物と結合させる。吸収性ストリッ
プの前記小部位に第２ｓｂｐ成分を供給し、そのｓｂｐ
成分が標識第１ｓｂｐ成分上の決定部位（標識ｓｂｐ成
分と薬物との結合に関与する決定部位とは異なる）を認
識する。例えば、第２ｓｂｐ成分は標識第１ｓｂｐ成分
の標識部分上またはｓｂｐ成分部分上の決定部位を認識
し得る。この態様において、試験試料中に薬物が存在し
ない場合、少なくともすべての標識ｓｂｐ成分の結合に
十分量のアナライトまたは薬物類縁体を、ストリップに
結合させなければならない。通例、このアナライト類縁
体は、試験薬物の誘導体であり、少なくともストリップ
端部と前記部位の間で実質的に過剰にストリップに結合
する。この薬物類縁体は薬物誘導体であることが好まし
いが、他の薬物類縁体、例えば薬物のイディオタイプ抗
体に抗する抗体を使用してもよい。試料および標識第１
　ｓｂｐ成分を混合して試験溶液とし、試料中に薬物が
存在する場合、薬物と標識第１ｓｈｐ成分との複合体が
生成する。薬物と標識第１　ｓｂｐ成分の複合体は、吸
収性ストリップ内を移動して前記部位に達し、標識第１
　ｓｂｐ成分に特異的な第２ｓｂｐ成分と結合すること
によってその部位に結合する。薬物が試料中に存在しな
ければ、薬物と標識第１　ｓｂｐ成分との複合体は生成
しない。試験溶液を吸収性ストリップ端部と接触させる
と、薬物と結合していない標識第１ｓｂｐ成分は、スト
リップに非拡散結合している薬物類縁体と結合する。こ
の薬物類縁体は過剰に存在するので、非結合標識ｓｂｐ
成分は前記小部位に到達しない。次いで試験ストリップ
を顕色させると、前記小部位でのシグナルの発生によっ
て、試料中の薬物の存在が示される。

１価の薬物を試験する後者の態様において、複数の薬物
の試験溶液をアッセイしてもよい。この場合、適当な液
体中で試料と、試験する複数のアナライトに対応する複
数の標識第１５ｂｌ）成分とを混合することによって試
験溶液を調製する。いずれか１種の薬物の存在のみを試
験したい場合には、吸収性ストリップは、前記単一薬物
試験用の部位と同じ部位を有する。しかし、試験する各
薬物に対応する薬物類縁体がストリップ上に存在するこ
とが必要である。どの薬物か存在しているかを知る必要
がある場合には、ストリップは・その薬物に対応する第
１　ｓｂｐ成分に特有の決定部位に特異的に結合する第
２　ｓｂｐ成分が結合している部位を含む。特有の決定
部位は、好ましくは標識第１ｓｂｐ成分にハプテンを結
合させることによって形成され、１２ｓｂｐ成分として
ハブテンに対する抗体を使用する。

便宜のために、この装置を、アナライトのアッセイに使
用する試薬量を予め計量してパッケージされたキットと
して供給し得る。標識として酵素を使用する場合は、試
薬は酵素標識第１ｓｂｐ成分、酵素の基質またはその前
駆体（追加の基質、酵素および補因子を含む）および検
出可能な発色団または蛍光団の供給に必要な酵素的生成
物と反応する物質を含む。さらに、補助試薬のような他
の添加削（例えば安定剤、緩衝液など）を含有していて
よい。種々の試薬の相対的な量を広範に変化させて、ア
ッセイの感度を実質的に最適化するような試薬濃度にし
得る。試薬は乾燥粉末（通例、凍結乾燥され、賦形剤を
含む）として供給し得、このような試薬は、溶解すると
アッセイの実施に適当な濃度の試薬溶液を与える。

［実施例］ 以下、実施例によって本発明をさらに説明する。

実施例について記述する前に、一連の用語を定義する。

ＰＢＳ：　リン酸緩衝食塩液 ＤＭＦ：　ジメチルホルムアミド ＢＳＡ：　ウシ血清アルブミン ＨＣＧ：　ヒトじゅう毛膜性腺刺激ホルモンＨＲＰ：西
洋ワサビペルオキシダーゼ Ｐ０４ニーおよび二塩基性リン酸ナトリウム塩ＥＤＴＡ
：エチレンジアミン四酢酸 ＳＡＭＳＡ：　Ｓ−アセチルメルカプトコハク酸無水物 ＳＭＣＣ：スクンンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメ
チル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート リン酸緩衝液＋　　Ｉ　ＯｍＭ　ＰＯ４、ｐＨ＝７．４
０ＰＢＳ：　　Ｉ　ＯｍＭ　ＰＯ，、ｐＨ＝７．４０１
５０ｍＭ　ＮａＣＱ 緩衝液Ａ　：　　１０　ｍＭ　Ｐ　Ｏ４、ｐＨ＝７．４
０１５０ｍＭ　Ｎａ（Ｊ！ ０．１％ＢＳＡ ０．０５％　トウィーン（Ｔｗｅｅｎ）　−２０（シグ
マ社（Ｓｉｇｍａ　ＣｈｅＩＩｌｉｃａｌ　Ｃｏ、）製
）コンジュゲート緩衝液：　　１００ｍＭ　ＰＯ４、ｐ
Ｈ＝７．４０ １５０ｍＭ　ＮａＣＱ ０．１％ＢＳＡ ０．０５％トウィーンー２０ 顕色剤緩衝液：　　ｌ　ＯｍＭ　ＰＯ−１ｐ）ｌ＝７．
０Ｏ２Ｏｎ＋Ｍ　ＮａＣＮ ０．１％ＢＳＡ Ｏ，００５％　トリトン（Ｔ　ｒｉｒｏｎ）ＱＳ−４４
（シグマ社製） ２００　ｔｔｇ／ｍＱ　４−クロロ−１−ナフトール １　ｍＭ　Ｈｔ　Ｏ２ 炭酸緩衝液：　５０ｍＭ　ＮａｘＣＯ１、ｐＨ＝９．５
０ＰＯ，−ＮａＣρ−ＥＤＴＡＩ街液二 １００ｍＭ　Ｎａ　　ＰＯ４、 ｐＨ＝７．５０ １００ｍＭ　ＮａＯｆｆ ５ｍＭＥＤＴＡ カラム緩衝液：　　Ｉ　００ｍＭ　Ｎａ５ＰＯいｐＨ＝
７．００ ２００ｍＭ　ＮａＣＱ Ｏ１０２％Ｎ　ａ　Ｎ　３ 実施例１ ＨＲＰ　（ＩＶ型、シグマ社製）６０ｍｇを炭酸緩衝液
２ｍＱに溶解し、透析して汚染物を除去した。

乾燥ＤＭＦ中、Ｓ　Ａ　Ｍ　Ｓ　Ａ　（シグマ社製）を
１゜ＯｍＭとした。ＨＲＰ３０ｍｇを１２倍モル過剰の
ＳＡＭＳＡと１時間反応させた。ＰＯ，−ＮａＣＱ−Ｅ
ＤＴＡＩ衝液で平衡にしたセファデックス（Ｓｅｐｈａ
ｄｅｘ）Ｇ−２５小カラムを用いて、生成物を遊離ＳＡ
ＭＳＡから精製した。

ＳＡＭＳＡから遊離−５Ｈ基を得るために、アルゴン気
体中、前記生成物を、体積が１／ｌＯのＩＭＮＨ，ＯＨ
と共にＰＢＳ中で撹拌しながら１時間インキュベートし
た。得られた生成物を、別のセファデックスＧ−２５カ
ラムで精製し、その直後に使用した。

抗体−ＳＭＣＣの調製 コーラ−ら、ネイチャー（ＮａｔｕｒｅＸＩ　９７５年
）２６５巻、４９５〜１９７頁の方法に従って、Ｉ４０
Ｇのβサブユニットのモノクローナル抗体を調製した。

抗体（４〜５　ｍｇ／　ｍＱ）をＰ　Ｏ４ＮａＣＱ　　
Ｅ　Ｄ　ＴＡ緩衝液に対して透析し、汚染物を除去した
。透析後、抗体８ｍｇを２５倍モル過剰のＳ　Ｍ　ＣＣ
（ピアス社（Ｐｉｅｒｃｅ　　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　　Ｃ
ｏ、　）製）と、撹拌下、室温で２時間反応させた。上
記ＳＭＣＣは、乾燥ＤＭＦ中、１００ｍＭ溶液として新
しく調製した。

生成物をセファデックスＧ−２５小カラムで精製し、そ
の直後に使用した。カラムは、Ｐｏ４−ＮａＣＱ−ＥＤ
ＴＡ緩衝液で平衡にした。

ＨＲＰ−８ＡＭＳＡと抗体−９ＭＣＣのコンジュゲーシ
ヨン 抗体−９ＭＣＣおよび１２倍モル過剰のＨＲＰ−９ＡＭ
ＳＡを混合し、室温で４時間反応させた。

１＋＋＋Ｍβ−メルカプトエタノール、次いで１５分後
に２ｍＭＮ−エチルマレイミドを加えて反応を停止させ
た。

１袈 カラム緩衝液で平衡にしたセファクリル（Ｓｅｐｈａｃ
ｒｙｌ）Ｓ　−３００を用いるサイズ・エクスクル−ジ
ョン・クロマトグラフィー（ｓｉｚｅ　　ｅｘｃｌｕｓ
ｉｏｎｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）によって、前記
コンジュゲートを、遊離抗体およびＨＲＰから分離した
。

ポリビード−カルポジキレート・ミクロスフィアーズ（
Ｐｏｌｙｂｅａｄ−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ　　Ｍｉｃ
ｒｏｓｐｈｅｒｅｓ）（直径３．９２μｍ、２．５％懸
濁液、ポリサイエンス（Ｐ　ｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）
社製、９８５０型）を使用した。

ビーズ４００μｅ（１０ｍｇ）をリン酸緩衝液で洗い、
従来の方法（コーラ−ら、前記文献参照）に従って調製
したモノクローナル抗体の２　ｍｇ／　ｍＱリン酸緩衝
液溶液５ｍａに懸濁させた。このモノクローナル抗体は
、ＨＣＧのαサブユニットのみを認識する。

ビーズを抗体溶液中で、ビーズの懸濁を保つために撹拌
しながら室温で一晩インキユベートした。

次いで、ビーズを遠心分離し、抗体溶液をデカントし、
リン酸緩衝液、ＰＢＳおよび緩衝液Ａの各５ｍＱでビー
ズを洗った。

緩衝液Ａで洗浄した後、Ｐ　Ｂ　Ｓ　＋　ｌ　Ｏｍｇ／
ｍ（！ＢＳＡ５ｎ＋（２にビーズを懸濁させ（非特異的
結合を遮断するため）、室温で１時間混合した。

次いで、ビーズを遠心分離した後、緩衝液Ａ４００μｇ
に再懸濁させた。

試験装置の準備 タンパク質（多クローン性アンチテオフィリン）で被覆
したワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）　３１　Ｅ　Ｔ用紙
を使用した。用紙を切断して、幅６ｍｍ長さ９または１
８ｃｍ（アッセイ・プロトコルによる）のストリップと
した。用紙ストリップを直径４　、５　ａｍのガラス・
フリット・フィルター・ホルダーに配置した。

減圧し、ストリップを蒸留水で湿らせた。

前記のように調製した抗体結合ビーズ懸濁液ＩＯμＱ（
ビーズ２５０μｇ含有）を、５μＱキヤピラリー・チュ
ーブでストリップ表面に２回供給することによって用紙
に吸収させた。次いで、ビー・ズを緩衝液Ａｉｍ（！で
用紙に洗い込んだ。ストリップを減圧乾燥させた。

アッセイ Ａ、ＨＣＧ溶液（緩衝液Ａまたは尿中２０ｎｇ／ｍＣ）
１００μｆ２を、ＨＲＰ−ＨＣＧ抗体コンジュゲート溶
液（コンジュゲート緩衝液で１０００倍希釈したもの）
１００μρと混合した。試験装置（長さ９　ｃｍ）の２
ｍｍを前記混合物に浸し、媒体の先端が試験装置の上端
に達するまで浸透させた。次いで、試験装置を顕色剤緩
衝液９ｍρに１０分間浸漬した後、取り出した。抗体結
合ビーズの存在する、試験装置を横切る細い帯状部分が
青灰色になった。

対照として、ＨＣＧ溶液１００μσの代わりに緩衝液Ａ
１００μＱを用いて前記方法を行った。

試験溶液中にＨＣＧが存在しないので、試験装置上に色
帯は現れなかった。

Ｂ、ＨＣＧ溶液１００μ夕をＨＲＰ　−ＨＣＧコンジュ
ゲート溶液と混合した。試験装置（長さ１８　ｃｍ）の
２ｍｍを前記混合物に浸し、混合物全量を試験装置に浸
透させた（約１０分間）。その試験装置の２ｍｍをさら
に展開剤緩衝液２００μＱに浸し、さらに２０分間試験
装置に浸透させた。抗体結合ビーズの存在する、試験装
置を横切る細い帯状部分が青灰色になった。

対照として、ＨＣＧ溶液１００μＱの代わりに緩衝液Ａ
１００μｇを用いて前記方法を行った。

試験溶液中にＨＣＧが存在しないので、試験装置上に色
帯は現れなかった。

実施例２ Ａ、ＴＨＣ被覆用紙の準備 ＣＤＩ被覆ワットマン３１ＥＴ用紙を、０．２％Ｅｔ３
Ｎ−ＴＨＦ溶液で湿らせ、次いで＋１−ツルー△’−Ｔ
ＨＣ−９−カルボン酸（ＴＨＣ＝テトラヒドロカンナビ
ノール）と２．２１−オキシビス（エチルアミン）のア
ミドの５ｍｇ／Ｉ　ＯＯｎ＋Ｑ０．２％Ｅｔ、Ｎ　−Ｔ
　ＨＦ溶液に、密閉容器内で一晩浸漬した。

未反応ＣＤＩ部位を、ＴＨＦ中の０．４％エタノールア
ミンでキャップし、次いで用紙をメタノールで十分に洗
浄して未反応ＴＨＣを除去した。用紙を乾燥し、卵白ア
ルブミンＩｍｇ／ｍ１２．０．２５％胆汁酸塩含有５０
ｍＭＰＢＳで被覆し、乾燥してアッセイに使用した。

コーラ−ら、ネイチ＋　−（ＮａｔｕｒｅＸ　１９７５
年）２６５巻、４９５〜４９７頁の方法に従って、ＴＨ
Ｃのモノクローナル抗体を調製し、プロティン（Ｐ　ｒ
ｏｔｅｉｎ）Ａカラムを用いるクロマトグラフィーによ
って精製した。

操作２：　マレイミド化抗体の調製 １、抗体を、１０　ｍＭ　Ｐ　Ｏ４，１５０ｍＭ　Ｎａ
Ｃρ、ＰＨ＝７．０（アジドを含まない）中で４℃で一
晩透析した。

２、乾燥ＤＭＦ中、０．０５Ｍ　ＳＭＣＣの新しい溶液
を調製した。

３、抗体を室温で平衡にした。

４、ＳＭＣＣを抗体に２５；１のモル比で加え、混合物
を撹拌し、密閉し、３０℃で２時間インキュベートした
。

５、過剰のＳＭＣＣを透析により除去した。

１、ＨＲＰを、Ｉ　ＯＩＩＩＭ’ＰＯ，／１５０ｍＭ　
ＮａＣＬ／ｐＨ７゜５に対して４℃で一晩透析し、室温
で平衡にした。

２、新しい２０ｍＭ５ＰＤＰのエタノール溶液を調製し
た（ＳＰＤＰ＝Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリ
ジルジチオ）プロピオネート）。次いで、５ＰＤＰをＨ
ＲＰに３．５：Ｉのモル比で加え、短時間撹拌して混合
し、パラフィルムで密閉し、室温で３０分間インキュベ
ートした。

３、Ｉ　ＯｍＭ　ＰＯ，／１５０ｍＭ　ＮａＣＱ（ｐＨ
７）で平衡にしたセファクリル（Ｓ　ｅｐｈａｃｒｙｌ
）　Ｓ−３００カラムに試料を通して過剰の５ＰＤＰを
除去し、次いで試料を、ＰＯ，／ＮａＣＬ’１）Ｈ７緩
衝液に対して４°Ｃで一晩透析した（４℃で貯蔵）。

操作４：　　ＨＲＰ−ＤＴＰ上のチオールの活性俣 １、生成したＩｇＧ−Ｍａｌ量の少なくとも１５倍過剰
にあたる十分な量のＨＲＰ−ＤＴＰを採った。

２、ｌ　ＯｍＭ　ＰＯ，／１５０ｍＭ　ＮａＣｌ２／ｐ
Ｈ７０中、新しいＩＭ　ＤＴＴ（ジチオスレイトール）
を調製した。

３、ＨＲＰ−ＤＴＰ１ｍ１２当たりＤＴＴ２５μＣを加
え、ＤＴＴの最終濃度を２５ｍＭとし、室温で２０分間
反応を行った。

４、次いで、床の体積か試料体積の少なくとも１０倍で
あるセファデックスＧ−２５Ｍカラムに試料を通し、１
０ｍＭ　ＰＯ４／１５０ｍＭ　ＮａＣ＋！／ｌ　ＯｍＭ
　ＥＤＴＡ／ｐＨ７，０中、室温で平衡にした。

操作５：　　Ｍａｔ　　ＡｂおよびＨＲＰ　−Ｓ　Ｈの
縮合マレイミド化抗体１　、８　ｍｇおよび１５倍モル
過剰の脱保護チオール化ＨＲＰを混合し、室温で４時間
反応させた。Ｍａｌ　　Ａｂよりも４０倍モル過剰のβ
−メルカブロエタノールを反応物質に添加することによ
って、過剰の反応性Ｍａｌ基をキャップした。

操作６：　　ＨＲＰ−Ａｂコンジュゲートの精製１、キ
ャップしたコンジュゲートを、限外濾過によって濃縮し
た。

２・セファローズ（Ｓ　ｅｐｈａｒｏｓｅ）　４　Ｂカ
ラム（カラム床体積３００　ｍ（１）を、１０ｍＭ　Ｐ
ｏ４／Ｉ　５０ｍＭ　ＮａＣｌ２／ｐＨ７，４で平衡に
した。

３、コンジュゲートをカラムに通した。

Ｃ９抗体結合ビーズ 家兎抗マウスビーズ（バイオラド（ＢＩＯＲＡＤ）社製
）を使用した。

Ｄ、試験装置 家兎抗マウスビーズを、ＴＨＣ被覆用紙の下端から３ｃ
ｍの高さの位置に線状に供給した。

Ｅ、アッセイ 試料としては、７５　ｒｇ／ｍＱ　Ｔ　ＨＣ溶液を用い
た。

ＨＲＰ−Ａｂコンジュゲート、試料としてＴＨＣ溶液、
および家兎抗マウスビーズを有する試験装置を使用した
ことを除いては、実施例１に記載のように、実施例１の
アッセイＡを繰り返した。

ビーズ線上に狭い色帯が観察され、試料中のＴＨＣの存
在を示していた。

本発明は、既知の方法よりも多くの重要な利点を提供す
る。本発明の主な利点は、単一の試験要素を用いて単一
のアッセイによって多数のアナライトを定量し得ること
である。これにより、時間および費用を節約できる。試
薬および装置を容易かつ安価に製造し得るので、さらに
費用を節約できる。アッセイ装置のみによってアッセイ
の結果を測定でき、発生したシグナルが色または蛍光で
ある場合には、装置を他の器具で補助する必要がない。

すなわち、対照が備えつけられている。正の結果は、非
特異的相互作用の結果として試験装置上に現れる背景か
ら容易に区別される。また、背景のシグナルを発生する
因子は、試験装置上の部位および残りの領域に実質的に
同様に作用する。

本発明の他の利点は、わずられしいカラム操作を行わな
くてよいということである。アッセイ装置は、扱いが容
易な吸収性ストリップである。アナライトが小さい領域
（すなわち小部位）に集中することも利点である。多く
のアッセイにおいて、アナライトは非常に少量しか存在
せず、測定が困難である。特にアナライトが少量しか存
在しない場合には、アナライトを小領域に集中させるこ
とによって、測定の正確さが高まる。

本発明の他の利点は、ｓｂｐ成分の一員、通例標識ｓｂ
ｐ成分を過剰に使用し得ることである。ｓｂｐ成分の過
剰な使用は、ｓｂｐ成分複合体生成反応を補助する。

以上、本発明を明らかにし、本発明の理解のために、説
明および例によって本発明の詳細な説明したが、本発明
の範囲内で変更および修正をなし得ることは言うまでも
ない。

特許出願人　シンテックス（ニー・ニス・エイ）インコ
ーホレイテッド

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、リガンドおよびそれに相補的なレセプターから成る
   特異的結合対（「ｓｂｐ成分」）の一員であるアナライ
   トの含有が疑われる試料中のアナライトの測定法であっ
   て、 （ａ）前記試料および前記アナライトに結合し得る第１
   ｓｂｐ成分を含有する試験溶液と、毛管移動によってそ
   の試験溶液を浸透させ得る吸収性材料のストリップ端部
   とを接触させ、そのストリップは、前記端部から離れた
   ストリップ上において、ストリップ面積よりも実質的に
   小さい面積を有する小部位に非拡散結合した第２ｓｂｐ
   成分を有し、第２ｓｂｐ成分は、第１ｓｂｐ成分がアナ
   ライトに結合することによって生成した複合体に結合す
   る性質を有するものであり、但し第１ｓｂｐ成分がアナ
   ライトと結合して複合体を生成しない場合に、第２ｓｂ
   ｐ成分が第１ｓｂｐ成分に結合し得るならば、第１ｓｂ
   ｐ成分に結合し得るアナライト類縁体が少なくとも小部
   位と端部との間でストリップに非拡散結合しており、 （ｂ）試験溶液を、毛管移動によって少なくともストリ
   ップの一部に浸透させ、 （ｃ）ストリップを、（１）シグナル発生系の成分を含
   有する顕色液と接触させることによって、前記部位を試
   験溶液と接触させた後に顕色液と接触させ、（２）シグ
   ナル発生系の残りの成分がある場合にはこれと接触させ
   、シグナル発生系は、前記部位で試料中のアナライト量
   に応じた検出可能なシグナルを発生でき、および （ｄ）前記部位における検出可能なシグナルを、ストリ
   ップの前記部位以外の部分における検出可能なシグナル
   と比較する ことを含んで成る方法。 ２、第２ｓｂｐ成分とコンジュゲートした粒子を、スト
   リップの前記部位に非拡散結合させる特許請求の範囲第
   １項記載の方法。 ３、前記小部位が、試験溶液がストリップ内を浸透する
   方向を横切る帯状部位である特許請求の範囲第１項また
   は第２項記載の方法。 ４、アナライトが試験溶液中に存在する場合、前記小部
   位で発生するシグナルが、ストリップの近接部位で発生
   するシグナルとは明らかな対照をなす縁の鋭い独特のパ
   ターンを有する特許請求の範囲第１〜３項のいずれかに
   記載の方法。 ５、第２酵素が、ストリップの少なくとも前記部位およ
   び前記部位に近接する部分を含む部分に均一に結合し、
   一方の酵素の生成物が他方の酵素の基質である特許請求
   の範囲第１〜４項のいずれかに記載の方法。 ６、試験溶液中の複数のアナライトを定量する方法であ
   って、複数の第２ｓｂｐ成分を、ストリップの端部から
   離れた小部位に非拡散結合させることを含んで成り、第
   １ｓｂｐ成分は試験溶液中の試料と結合し、各第２ｓｂ
   ｐ成分は、対応する第１ｓｂｐ成分にそれぞれ特異的に
   結合し得る特許請求の範囲第１〜５項のいずれかに記載
   の方法。 ７、アナライトの含有が疑われる試料中のアナライトの
   測定法であって、 （ａ）前記試料および前記アナライトの抗体を含有する
   試験溶液と、毛管移動によってその試験溶液を浸透させ
   得る吸収性材料のストリップ端部とを接触させ、前記端
   部から離れたストリップ上において、ストリップ面積よ
   りも実質的に小さい面積を有する小部位には、特異的結
   合対の一員（「ｓｂｐ成分」）が非拡散結合した粒子が
   非拡散結合しており、これは、抗体とアナライトによっ
   て生成する複合体に結合し得るものであり、但し抗体が
   アナライトと結合して複合体を生成しない場合に、ｓｂ
   ｐ成分が抗体に結合し得るならば、抗体に結合し得るア
   ナライト類縁体が小部位と端部との間でストリップに非
   拡散結合しており、 （ｂ）試験溶液を、毛管移動によって少なくともストリ
   ップの一部に浸透させ、 （ｃ）ストリップを、（１）シグナル発生系の成分を含
   有する顕色液と接触させることによって、前記部位を試
   験溶液と接触させた後に顕色液と接触させ、（２）シグ
   ナル発生系の残りの成分がある場合にはこれと接触させ
   、シグナル発生系は、前記部位で試料中のアナライト量
   に応じた検出可能なシグナルを発生でき、および （ｄ）前記部位における検出可能なシグナルを、ストリ
   ップの前記部位以外の部分における検出可能なシグナル
   と比較する ことを含んで成る、特許請求の範囲第１〜６項のいずれ
   かに記載の方法。 ８、抗体が、ヒトじゅう毛膜性腺刺激ホルモンの抗体で
   ある特許請求の範囲第１〜７項のいずれかに記載の方法
   。 ９、試料中の複数のアナライトを定量する方法であって
   、各アナライトに特異的な抗体の混合物を試料と混合し
   、複数の粒子群セットをストリップに非拡散結合させる
   ことを含んで成り、各粒子群セットは、特異抗体とアナ
   ライトから生成する複合体の少なくとも１つに結合し得
   る非拡散結合したｓｂｐ成分を有するものである特許請
   求の範囲第１〜８項のいずれかに記載の方法。 １０、前記各アナライトのアナライト類縁体をストリッ
   プに結合させる特許請求の範囲第９項記載の方法。 １１、アナライトに相補的な特異的結合対（ｓｂｐ成分
   ）の第１ｓｂｐ成分およびアナライトの含有が疑われる
   試料を含む試験溶液中のアナライトを測定する装置であ
   って、 試験溶液と接触させる端部を有し、試験溶液を毛管移動
   によって浸透させ得る吸収性ストリップ、および ストリップの端部から離れ、ストリップ面積よりも実質
   的に小さい面積を有する小部位に非拡散結合した、アナ
   ライトとは異なる第２ｓｂｐ成分を含み、ここで、第２
   ｓｂｐ成分は、第１ｓｂｐ成分とアナライトの結合によ
   って生成する複合体と結合する性質を有するものであり
   、但し第１ｓｂｐ成分がアナライトと結合して複合体を
   生成しない場合に、第２ｓｂｐ成分が第１ｓｂｐ成分と
   結合し得るならば、第１ｓｂｐ成分と結合し得るアナラ
   イトの類縁体が少なくとも前記小部位と端部の間でスト
   リップに非拡散結合しているものである装置。 １２、第２ｓｂｐ成分とコンジュゲートした粒子を、ス
   トリップの前記部位に非拡散結合させる特許請求の範囲
   第１１項記載の装置。 １３、試験溶液中の複数のアナライトを測定する装置で
   あって、第２ｓｂｐ成分群のセットを、ストリップの端
   部から離れた、それぞれ異なる小部位に非拡散結合させ
   ることを含んで成り、ｓｂｐ成分群のセットは、アナラ
   イトと第１ｓｂｐ成分との特異的複合体に結合し得る特
   許請求の範囲第１１項または第１２項記載の装置。 １４、試験溶液中のアナライト測定用キットであって、 （ａ）特許請求の範囲第１１項記載の装置、（ｂ）アナ
   ライトが存在する場合に検出可能なシグナルを発生させ
   るのに必要なシグナル発生系の他の成分、および （ｃ）必要に応じた補助物質 を、パッケージされた組み合わせとして含んで成るキッ
   ト。 １５、特異的結合対の一員（「ｓｂｐ成分」）を吸収性
   材料に非拡散結合させる方法であって、ｓｂｐ成分を非
   拡散結合させた粒子をパターンとして吸収性材料に適用
   することを含んで成り、粒子の大きさは、吸収性材料の
   孔への侵入を可能にするに十分なほど小さいが、孔から
   の拡散を防ぐに十分なほど大きなものである方法。