DK166846B1 - Fremgangsmaade til bestemmelse af indhold af en analyt i en proeve samt indretning og kit til anvendelse ved fremgangsmaaden - Google Patents

Description

i DK 166846 B1

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til bestemmelse af en analyt i en prøve, der menes at indeholde analytten, samt indretning og kit til anvendelse ved fremgangsmåden .

5 Muligheden for at anvende naturligt forekommende receptorer eller antistoffer, der er rettet mod specifikke forbindelser, til analyse for tilstedeværelsen af en forbindelse, som har interesse, har skabt en blomstrende immunoassay-forretning. I hvert assay indgår et homologt par af speci-10 fikke bindingspar ("sbp")-medlemmer, sædvanligvis et immunologisk par, som omfatter en ligand og en receptor (anti-ligand), idet ét af sbp-medlemmerne er mærket med et mærke, som afgiver et detekterbart signal. Immunoassaymetodologien medfører en fordeling af signalmærket mellem et signalmær-15 ke, som er bundet i et complex af sbp-medlemmerne, og ubundet signalmærke. Differentieringen mellem bundet og ubundet signalmærke kan være en følge af fysisk adskillelse af bun- · det og ubundet signalmærke eller modulering af et detekterbart signal mellem bundet og ubundet signalmærke.

20 Som oftest har immunoassayet været rettet på kvantitativ bestemmelse af en lang række forbindelser, som har interesse i kliniske laboratorier, der kræver relativt forfinet udstyr og omhyggelig teknik. Immunoassayet har fundet mindre omfattende kommerciel anvendelse, hvor semikvantitative 25 eller kvalitative resultater ville være acceptable, og bestemmelsen ville involvere personer uden for laboratoriet, såsom i et hjem eller hos en praktiserende læge. Selv i det kliniske laboratorium ville simple og hurtige screeningstests, som udføres af uerfarent personale, tjene til at 30 give betydelige besparelser.

Ved udvikling af et immunoassay skal mange ting tages i betragtning. Et hensyn, der skal tages, er at tilvejebringe væsentlig differentiering mellem det iagttagne signal, der er et resultat af bundet signalmærke, sammenlignet med 35 ubundet signalmærke. Et andet hensyn er at minimere for- DK 166846 B1 2 styrreiser fra endogene materialer i den prøve, der menes at indeholde den forbindelse, som har interesse. Et yderligere hensyn er den lethed, hvormed det iagttagne signal kan detekteres og tjene til at differentiere mellem koncentra-5 tioner i det koncentrationsområde, som har interesse. Andre faktorer omfatter den lethed, hvormed reagenserne fremstilles, den nøjagtighed, hvormed prøverne og reagensopløsningerne skal fremstilles og måles, reagensernes lagerstabilitet, det antal trin, der kræves i processen, og den dygtig-10 hed og nøjagtighed, hvormed hvert af trinnene skal udføres.

Ved udvikling af et assay, som kan anvendes af utrænet personale såsom assays, der kan anvendes i hjemmet, inden for retsmedicinen, af praktiserende læger eller lignende, bør det iagttagne resultat derfor være minimalt påvirket af 15 variationer i den måde, hvorpå metoden udføres eller tilvejebringe simple teknikker til udførelse af de forskellige trin.

En testindretning til bestemmelse af en egenskab ved en prøve, især til bestemmelse af stoffer i flydende prøver, 20 er beskrevet i USA-patentskrift nr. 4.094.647. En tyndt-lagschromatografiindretning og en fremgangsmåde til udførelse af en chromatografitest er beskrevet i USA-patentskrift nr. 4.384.958. Et immunoassay, i hvilket mærket antistof fortrænges fra en immobiliseret analytanalog, er 25 beskrevet i USA-patentskrift nr. 4.434.236. En indretning og en fremgangsmåde til detektion af myoglobin er beskrevet i USA-patentskrift nr. 4.189.304. Teststrimler til analyse af stoffer, som er opløst i væsker, er beskrevet i USA-patentskrift nr. 4.438.067. En mangelaget testindretning 30 til bestemmelse af tilstedeværelsen af en bestanddel af en flydende prøve og en fremgangsmåde til anvendelse af en sådan indretning er beskrevet i USA-patentskrift nr.

4.160.008. En fremgangsmåde til måling af antigen med mærket antigen under anvendelse af uopløseligt antistof er 35 beskrevet i japansk fremlæggelsesskrift nr. 5925/73 (25. januar 1973).

DK 166846 B1 3

En koncentrerende zonemetode til heterogene immunoassays er beskrevet i USA-patentskrift nr. 4.366.241. I USA-patent-skrift nr. 4.168.146 beskrives en immunoassayteststrimmel.

I USA-patentskrift nr. 3.990.850 og nr. 4.055.394 beskrives 5 diagnostiske testkort. En automatiseret metode til kvantitativ analyse af biologiske væsker er beskrevet i USA-patentskrift nr. 4.327.073. Et chromogent underlags-immuno-assay er beskrevet i international patentansøgning nr. PCT/US83/01887.

10 En lang række patenter og patentansøgninger udgør en omfattende litteratur om forskellige teknikker til frembringelse af detekterbare signaler i immunoassays. Nedenstående liste skal blot belyse nogle af disse teknikker, der kan anvendes i den foreliggende opfindelse. I det følgende er angivet en 15 liste over USA-patentskrifter og patentansøgninger og en generel angivelse af den anvendte type mærke: USA-Patentskrift nr. 3.646.346, radioaktivt mærke; 3.654.090, 3.791.932 og 3.817,838, enzymmærker; 3.996.345, mærker af fluorescerende stoffer og udslukningsmidler; 20 4.062.733, radioaktivt mærke; 4.067.959, fluorescens eller enzymmærke; 4.104.029, kemiluminescerende mærke; og 4.160.645, ikke-enzymatisk katalysatormærke. Jfr. USA-patentskrift nr. 3.966.879, hvori der beskrives en elektroforetisk teknik, der anvender en antistofzone, og 25 4.120.945, i hvilket der beskrives et RIA, hvor en mærket analyt indledningsvis bindes til et fast underlag via et antistof. I USA-patentskrift nr. 4.233.402 anvendes en-zymparmærker; i USA-patentskrift nr. 4.720.450 anvendes kemisk inducerede fluorescerende mærker; og i USA-patent-30 skrift nr. 4.287.300 anvendes enzymmærker med anionisk ladning.

Fremgangsmåderne og indretningerne ifølge den foreliggende opfindelse er nyttige til bestemmelse af tilstedeværelsen af en analyt i en prøve, der menes at indeholde analytten.

35 Indretningen er en strimmel af et sugende materiale, som er DK 166846 B1 4 i stand til at blive gennemløbet af en testopløsning ved kapillarbevægelse. Testopløsningen består af prøven og et første medlem af et specifikt par ("sbp-medlem"), der er i stand til at binde analytten. Strimmelen indeholder inte-5 greret deri et andet sbp-medlem til at koncentrere og på ikke-spredende måde binde det første sbp-medlem på et lille område A på strimmelen, som er adskilt fra en endedel af strimmelen, der er indrettet til kontakt med testopløsningen. Generelt binder det andet sbp-medlem til et complex, 10 der dannes ud fra bindingen af analytten til det første sbp-medlem. Et detekterbart signal frembringes ved hjælp af et signalfrembringende system. Signalet frembringes i forhold til tilstedeværelsen af analyt i testopløsningen. I én udførelsesform bindes en analog til analytten på ikke-15 spredende måde til strimmelen i det mindste mellem området og den del af strimmelen, som kommer i kontakt med testopløsningen.

Ved fremgangsmåden bringes en endedel af strimmelen, som er adskilt fra området, i kontakt med testopløsningen, som 20 gennemløber det sugende materiale ved hjælp af kapillarvirkningen. Strimmelen bringes i kontakt med en fremkalderopløsning, som indeholder medlemmer af det signalfrembringende system og derefter med eventuelle resterende medlemmer af det signalfrembringende system, som ikke blev inkor-25 poreret i testopløsningen eller fremkalderopløsningen, eller som ikke indledningsvis var til stede på strimmelen.

I det mindste en del af tes top løsningen bringes i kontakt med området, før fremkalderopløsningen bringes i kontakt med området. Det signal, som kan detekteres i området, 30 sammenlignes derefter med det signal, der kan detekteres på en del af strimmelen, som er en anden end området, for at bestemme tilstedeværelsen af analytten i testopløsningen.

I en særlig udførelsesform for den foreliggende opfindelse har det signal, som frembringes i det lille område A, et 35 skarpkantet distinkt mønster, som danner en skarp kontrast til det signal, som frembringes i dele af strimmelen, som DK 166846 B1 5 ikke er området, når en analyt er til stede i testopløsningen.

I en anden særlig udførelsesform for den foreliggende opfindelse er det andet sbp-medlem på ikke-spredende måde 5 bundet til et lille område på strimmelen via partikler, som på ikke-spredende måde er bundet til det lille område A.

Hvis det andet sbp-medlem er i stand til at binde det første sbp-medlem, når det første sbp-medlem ikke er bundet til analytten, er en analog til analytten, som er i stand 10 til at binde det første sbp-medlem, på ikke-spredende måde bundet til strimmelen mellem området og endedelen.

Fremgangsmåden og indretningen ifølge den foreliggende opfindelse er navnlig anvendelige til bestemmelse af flere analytter i en testopløsning. Tilstedeværelsen eller fravæ-15 reisen af én eller flere analytter i testopløsningen kan let bestemmes på en enkelt strimmel. Endvidere giver fremgangsmåden ifølge opfindelsen mulighed for detektion af analytter såsom lægemidler, uden at der kræves sammenlig-ningsmaterialer eller -instrumentering.

20 Som angivet ovenfor angår den foreliggende opfindelse fremgangsmåder og indretninger til bestemmelse af tilstedeværelsen af en analyt i en prøve, som menes at indeholde analytten. En testopløsning dannes ved i et vandigt medium at kombinere prøven og et første sbp-medlem, som er i stand 25 til at binde analytten. Endedelen af en strimmel af et sugende materiale, som er i stand til at gennemløbes af denne testopløsning ved hjælp af kapillarbevægelse, bringes i kontakt med testopløsningen. Strimmelen indeholder integreret deri et andet sbp-medlem, som er i stand til at 30 binde det complex, der udgøres af analytten og det første sbp-medlem. Det andet sbp-medlem er på ikke-spredende måde bundet i et lille område A på strimmelen, som er adskilt fra endedelen. Testopløsningen lades gennemløbe i det mindste en del af strimmelen. Dernæst bringes strimmelen i kon-35 takt med en fremkalderopløsning, som indeholder medlemmer DK 166846 B1 6 af det signalfrembringende system. Ved fremgangsmåden bringes i det mindste en del af testopløsningen i kontakt med området før kontakt af området med fremkalderopløsningen. Strimmelen bringes derefter om nødvendigt i kontakt med 5 eventuelle resterende medlemmer af det signalfrembringende system, som ikke var inkluderet i testopløsningen eller fremkalderopløsningen eller til stede på strimmelen. Det detekterbare signal i området sammenlignes derefter med det signal, som kan detekteres i en del af strimmelen, som ikke 10 er området. Et signal frembringes i området i forhold til tilstedeværelsen af analyt i testopløsningen.

Det andet sbp-medlem tilvejebringer et middel til at koncentrere og på ikke-spredende måde binde det første sbp-medlem til strimmelen i området. Det første sbp-medlem er 15 en del af et signalfrembringende system, som giver et de-tekterbart signal i området i forhold til mængden af analyt i prøven. Områdets overfladeareal er væsentligt mindre end strimmelens overfladeareal. Det andet sbp-medlem har den egenskab, at det binder et complex af det første sbp-medlem 20 ved direkte binding til analytten, ved direkte binding til det første sbp-medlem, herunder binding til det signalfrembringende mærke, eller ved binding til et sted, som kun findes i complexet. Hvis det andet sbp-medlem er i stand til at binde det første sbp-medlem direkte og derfor er i 25 stand til at binde det ikke-complexerede første sbp-medlem, bindes en analytanalog, som er i stand til at binde det ikke-complexerede første sbp-medlem, til strimmelen. Ana-lytanalogen er sædvanligvis på ikke-spredende måde bundet til strimmelen i det mindste mellem området og endedelen.

30 Midlet til frembringelse af et detekterbart signal er sædvanligvis et signalfrembringende system, der har én bestanddel, som er konjugeret til et sbp-medlem til dannelse af et mærke-sbp-medlemkonjugat. Den mængde mærke, der frem-• bringer det detekterbare signal, er forbundet med mængden 35 af analyt i testopløsningen. Det signalfrembringende system omfatter mærke-sbp-medlemkonjugatet og alle andre reagen- ser, der kræves til frembringelse af et detekterbart signal i området i forhold til tilstedeværelsen eller mængden af analyt i prøven.

DK 166846 B1 7 I en særlig udførelsesform for den foreliggende opfindelse 5 er det andet sbp-medlem konjugeret til partikler, som på ikke-spredende måde er bundet til strimmelen i området A.

Det lille område A kan være et bånd, som løber på tværs af gennemløbsretningen for testopløsningen langs strimmelen.

Det signal, som frembringes i det lille område, kan have et 10 skarpkantet distinkt mønster, som giver en skarp kontrast til det signal, der frembringes i en del af strimmelen, som ikke er området. Sædvanligvis sammenlignes det signal, som genereres i det lille område A, med tilstødende områder på strimmelen.

15 Den foreliggende opfindelse er navnlig anvendelig til bestemmelse af' tilstedeværelsen af flere analytter i en testopløsning.

Før den foreliggende opfindelse bliver beskrevet med henblik på specifikke udførelsesformer, vil et antal termer 20 blive defineret.

"Analyt" betegner den forbindelse eller komposition, som skal måles, og som er et medlem af et specifikt bindingspar og kan være en ligand, der er mono- eller polyvalent, sædvanligvis antigen eller haptenisk, en enkelt eller flere 25 forbindelser, der deler mindst ét fælles epitop- eller determinantsted, eller en receptor.

De polyvalente ligandanalytter er sædvanligvis poly(aminosyrer) , dvs. polypeptider og proteiner, polysaccharider, nucleinsyrer og kombinationer deraf, sådanne kombinationer 30 omfatter bakterier, vira, chromosomer, gener, mitochondri-er, kerner og cellemembraner.

DK 166846 B1 8

Den præcise karakter af analytterne samt talrige eksempler herpå er beskrevet i USA-patentskrift nr. 4.299.916 i navnet Litman et al., især spalte 16-23.

Analytter, som har interesse, omfatter lægemidler, metabo-5 litter, pesticider og forurenende stoffer.

Blandt de lægemidler, som har interesse, er alkaloiderne. Herunder hører morphinalkaloider, som omfatter morphin, codein, heroin, dextromethorphan og derivater og metabolit-ter deraf; cocainalkaloider, som omfatter cocain og benzo-10 ylecgonin og derivater og metabolitter deraf, ergotalkaloi-der, der omfatter lysergsyrediethylamid; steroidalkaloider; iminazoylalkaloider; quinazolinalkaloider, isoquinolinalka-loider; quinolinalkaloider, som omfatter quinin og quini-din; diterpenalkaloider og derivater og metabolitter deraf.

15 Den næste gruppe lægemidler omfatter steroider, herunder estrogener, estogener, androgener, andreocorticosteroider, galdesyrer, cardiotoniske glycosider og aglyconer, som omfatter digoxin og digoxigenin, saponiner og sapogeniner og derivater og metabolitter deraf. Steroidmimetiske stof-20 fer såsom diethylstilbestrol er også omfattede.

Den næste gruppe lægemidler er lactamer med 5-6 ringled, hvilke omfatter barbiturater, fx phenobarbital og secobarbital, diphenylhydantonin, primidon, ethosuximid og metabolitter deraf.

25 Den næste gruppe lægemidler er aminoalkylbenzener med alkyl med 2-3 carbonatomer, hvilket omfatter amfetaminer, cate-cholaminer, herunder ephedrin, L-dopa, epinephrin, narcein, papaverin og metabolitter deraf.

Næste gruppe lægemidler er benzheterocycliske forbindelser, 30 herunder oxazepam, chlorpromazin, tegretol, imipramin og derivater og metabolitter deraf, idet de heterocycliske ringe er azepiner, diazepiner og phenothiaziner.

Næste gruppe lægemidler er puriner, herunder theophyllin, caffein og metabolitter og derivater deraf.

DK 166846 B1 9 Næste gruppe lægemidler omfatter sådanne, som er afledt af marihuana, og som omfatter cannabinol og tetrahydrocannabi-5 nol.

Næste gruppe lægemidler omfatter vitaminerne såsom A-, B-, fx B12-, C-, D-, E- og K-vitamin, folinsyre og thiamin.

Næste gruppe lægemidler er prostaglandiner, der er forskellige i graden og stederne af hydroxylering og umætning.

10 Næste gruppe lægemidler er antibiotika, herunder penicillin, chlormycetin, actinomycetin, tetracyclin, terramycin og metabolitter og derivater deraf.

Næste gruppe lægemidler er nucleosiderne og nucleotiderne, der omfatter ATP, NAD, FMN, adenosin, guanosin, thymidin og 15 cytidin med deres hensigtsmæssige sukker- og phosphatsub-stituenter.

Næste gruppe lægemidler er forskellige individuelle lægemidler, herunder methadon, meprobamat, serotonin, meperi-din, amitriptylin, nortriptylin, lidocain, procainamid, 20 acetylprocainamid, propranolol, griseofulvin, valproinsyre, butyrophenoner, antihistaminer, anticholinerge lægemidler såsom atropin og metabolitter og derivater deraf.

Metabolitter, som er forbundet med sygdomstilstande, omfatter spermin, galactose, phenylpyrodruesyre og porphyrin 25 type 1.

Næste gruppe lægemidler er aminoglycosider såsom gentamy-cin, kanamycin, tobramycin og amikacin.

DK 166846 B1 10

Af pesticider, som har interesse, er polyhalogenerede bi-phenyler, phosphatestere, thiophosphater, carbamater, polyhalogenerede sulfenamider og metabolitter og derivater deraf.

5 "Medlem af et specifikt bindingspar ("sbp-medlem")" betegner ét af to forskellige molekyler med et areal på overfladen eller i et hulrum, som specifikt binder til og derved er defineret som komplementær med en bestemt rumlig og polær organisation af det andet molekyle. Medlemmerne af 10 det specifikke bindingspar betegnes som ligand og receptor (antiligand). Disse vil sædvanligvis være medlemmer af et immunologisk par, selv om andre specifikke bindingspar såsom biotin/avidin, hormoner/hormonreceptorer og nuclein-syreduplexer ikke er immunologiske par.

15 "Ligand" betegner enhver organisk forbindelse, for hvilken der naturligt findes eller kan fremstilles en receptor.

"Receptor ("antiligand")" betegner enhver forbindelse eller komposition, som er i stand til at genkende en bestemt rumlig og polær organisation af et molekyle, fx et epitop-20 eller determinantsted. Eksempler på receptorer omfatter naturligt forekommende receptorer, fx thyroxinbindings-globulin, antistoffer, enzymer, Fab-fragmenter, lectiner, nucleinsyrer, protein A og komplementkomponent Clq.

"Ligandanalog eller analytanalog" betegner en modificeret 25 ligand eller liganderstatning eller modificeret analyt eller analogerstatning, der kan konkurrere med den analoge ligand eller analyt om en receptor, idet modifikationen tilvejebringer midler til at forbinde en ligandanalog eller analytanalog med et andet molekyle. Ligandanalogen eller 30 analytanalogen adskiller sig sædvanligvis fra liganden eller analytten ved mere end erstatning af hydrogen med en binding, som forbinder ligandanalogen eller analytanalogen med et centrum eller mærke, men dette behøver ikke at være tilfældet. Udtrykket "liganderstatning" eller "analyter- DK 166846 Bl 11 statning" betegner en forbindelse, som er i stand til at binde det første sbp-medlem. Således kan liganderstatningen eller analyterstatningen binde til det første sbp-medlem på en måde, som svarer til liganden eller analytten. På den 5 anden side kan erstatningen fx være et antistof, som er rettet mod idiotypen af et antistof for liganden eller analytten.

"Sugende materiale" betegner et porøst materiale med porer på mindst 0,1 μη, fortrinsvis mindst 1,0 μη, hvilket mate-10 riale er i stand til at blive gennemløbet af et vandigt medium som reaktion på kapillærkræfter. Sådanne materialer er sædvanligvis hydrofile eller er i stand til at blive gjort hydrofile og omfatter uorganiske pulvere såsom sili-ciumdioxid, magnesiumsulfat og aluminiumoxid; naturlige 15 polymere materialer, især cellulosematerialer og materialer, som er afledt af cellulose, såsom fiberholdigt papir, fx filterpapir eller chromatografipapir; syntetiske eller modificerede naturligt forekommende polymerer såsom nitrocellulose, celluloseacetat, poly(vinylchlorid), polyacryl-20 amid, tværbundet dextran, agarose og polyacrylat; enten anvendt i sig selv eller sammen med andre materialer; keramiske materialer. Det sugende materiale kan være fastgjort til et underlag. På den anden side kan det sugende materiale udgøre sit eget underlag. Det sugende materiale 25 kan være polyfunktionelt eller være i stand til at blive gjort polyfunktionelt for at muliggøre covalent binding af sbp-medlemmer samt for at muliggøre binding af andre forbindelser, som udgør en del af det signalfrembringende system.

30 Binding af sbp-medlemmer til det sugende materiale kan udføres ved velkendte teknikker, som er almindelig tilgængelige i litteraturen, jfr. fx Ichiro chibata, Immobilized Enzymes. Halsted Press, New York, 1978, og Cuatrecasas, Bio. Chem. 245, 1970, s. 3059.

DK 166846 B1 12

Det sugende materiale kan være en enkelt struktur såsom et ark, der er skåret i strimler, eller det kan være et parti-kelformigt materiale, der er bundet til et underlag eller en fast overflade, således som det fx findes inden for 5 tyndtlagschromatografi.

Underlaget for det sugende materiale, hvor et underlag er ønskeligt eller nødvendigt, er sædvanligvis vanduopløse-ligt, ikke-porøst og stift og har sædvanligvis den samme længde og bredde som den sugende strimmel, men kan være 10 større eller mindre. Der kan anvendes en lang række organiske og uorganiske materialer, såvel naturlige som syntetiske, og kombinationer deraf med det forbehold, at underlaget ikke griber forstyrrende ind i strimmelens kapillarvirkning eller binder assaybestanddele uspecifikt eller 15 griber forstyrrende ind i det signalfrembringende system. Eksempler på polymerer omfatter polyethylen, polypropylen, poly(4-methylbuten), polystyren, polymethacrylat, poly-(ethylenterephthalat), nylon, poly(vinylbutyrat), glas, keramik og metaller.

20 "Mærket sbp-medlem" betegner et mærke, fx en katalysator, sædvanligvis et enzym, der er konjugeret til et sbp-medlem, hvilket er et medlem af det signalf rembringende system. sbp-Medlemmet kan binde direkte til analytten eller kan binde indirekte til analytten ved binding til et sbp-med-25 lem, som er komplementært med analytten.

Et "mærke" kan være et hvilket som helst molekyle, som er konjugeret til et andet molekyle eller til det sugende underlag, og når der indgår to molekyler, vælges det vilkårligt, hvilket molekyle er mærket. I den foreliggende 30 opfindelse er mærkerne medlem af det signalfrembringende system, som er konjugeret til et sbp-medlem. Mærket kan være isotopt eller ikke-isotopt, fortrinsvis ikke-isotopt. Imidlertid kan et isotopt mærke være foretrukket til opnåelse af stor følsomhed, når der anvendes radioautografiske 35 detektioner med fotografisk film.

DK 166846 B1 13 "Signalfrembringende system": Det signalfrembringende system kan have én eller flere bestanddele, hvoraf mindst én bestanddel er det mærke, som er konjugeret til et sbp-med-lem. Det signalfrembringende system omfatter alle de rea-5 genser, der er nødvendige til at frembringe et måleligt signal. Når det første sbp-medlem ikke er konjugeret til et mærke, er mærket normalt bundet til et sbp-medlem, som er komplementært med det første sbp-medlem, og indgår sædvanligvis som en del af fremkalderen. Andre bestanddele i 10 fremkalderen omfatter substrater, coenzymer, forstærkere, sekundære enzymer, aktivatorer, cofaktorer, inhibitorer, scavengerenzymer, metalioner og specifikke bindingsstoffer, som kræves til binding af signalgenererende stoffer. Bestanddelene i det signalfrembringende system kan være bun-15 det til strimmelen såsom coenzymer, stoffer, der reagerer med enzymatiske produkter og andre enzymer og katalysatorer. Det signalfrembringende system afgiver et signal, som er detekterbart ved eksterne foranstaltninger, sædvanligvis ved måling af elektromagnetisk stråling, ønskeligt ved 20 visuel undersøgelse. For det meste omfatter det signalfrembringende system et chromofort substrat og enzym, hvor chromofore substrater enzymatisk omdannes til farvestoffer, der absorberer lys i det ultraviolette eller synlige område, phosphorescerende eller fluorescerende stoffer.

25 Det signalfrembringende system kan omfatte mindst én katalysator, sædvanligvis mindst ét enzym, og mindst ét substrat og kan omfatte to eller flere katalysatorer og flere substrater og kan omfatte en kombination af enzymer, hvor substratet for ét enzym er produktet af det andet enzym.

30 Det signalfrembringende system virker ved at frembringe et produkt, som afgiver et detekterbart signal i det lille område, hvilket signal er forbundet med den mængde katalysator, som er bundet til området, som følge af sbp-medlem-complexdannelse af det mærkede sbp-medlem.

DK 166846 B1 14

Det signalfrembringende system forårsager dannelse af en forbindelse, som sædvanligvis er den signalgenererende forbindelse, men i visse tilfælde kan reagere med en anden forbindelse, der er bundet til overfladen, hvorved den sig-5 nalgenererende forbindelse dannes, forstærkes eller ødelægges. Medens der kan anvendes såvel enzymatiske som ikke-enzymatiske katalysatorer, anvendes der sædvanligvis mindst én enzymkatalysator i det signalfrembringende system. I tilfælde af, at der kun er én katalysator til stede, er 10 denne katalysator sædvanligvis konjugeret til et sbp-medlem til binding til området via sbp-medlem-complexdannelse. Ud over katalysatoren skal der være et substrat, som undergår en transformation, hvilket medfører en forandring i et de-tekterbart signal ved måleoverfladen. Som oftest er det 15 produkt, der er et resultat af den transformation, som katalyseres af det mærkede sbp-medlem, den signalgenererende forbindelse.

Der kan anvendes to katalysatorer, enten en kombination af et enzym og en ikke-enzymatisk katalysator eller to enzy-20 mer, hvor de to katalysatorer er forbundet ved, at produktet af den ene er substrat for den anden. I dette system behøver der kun at være et substrat, som kan undergå successive forandringer katalyseret af katalysatorerne, hvilket fører til den forbindelse, som indgår i frembringelsen 25 af et detekterbart signal. Som oftest vil der imidlertid være et substrat for det første enzym i serien og en anden forbindelse, der tjener som precursor for den forbindelse, der indgår i frembringelsen af signalet, hvorved der normalt tilvejebringes den forbindelse, som frembringer sig-30 nalet. Således kan produktet af det første enzym reagere med precursoren for den signalfrembringende forbindelse, hvorved der tilvejebringes den signalgenererende forbindelse.

Som oftest er de reaktioner, der indgår i processen, hydro-35 lyse- eller redoxreaktioner. I tilfælde af hydrolyse er en derivatiseret farvestof precursor, som har en enzymatisk la- DK 166846 B1 15 bil binding, og et enzym, som katalyserer dens omdannelse til et uopløseligt farvestofprodukt, et eksempel på denne type system. I redoxreaktioner danner et første enzym et essentielt oxiderende substrat, som kræves af det andet 5 enzym, hvor det andet enzym katalyserer reaktionen mellem det oxiderende substrat og en farvestofprecursor.

Når der anvendes to enzymer, kan den første enzymatiske reaktion indebære hydrolytisk spaltning eller en redoxreaktion af substratet, hvorved fås et produkt, som er substrat 10 for et andet enzym. Den første situation kan vises ved glucose-6-phosphat, der katalytisk hydrolyseres af alkalisk phosphatase til glucose, idet glucose er substrat for glucoseoxidase. Den anden situation kan vises ved glucose, der oxideres af glucoseoxidase, hvorved fås hydrogenper-15 oxid, som enzymatisk reagerer med et leucofarvestof til dannelse af en signalgenererende forbindelse.

Koblede katalysatorer kan også omfatte et enzym med en ikke-enzymatisk katalysator. Enzymet kan danne en reaktant, som gennemgår en reaktion, som katalyseres af den ikke-20 enzymatiske katalysator, eller den ikke-enzymatiske katalysator kan danne et substrat (omfatter coenzymer) for enzymet. En lang række ikke-enzymatiske katalysatorer, som kan anvendes, er beskrevet i USA-patentskrift nr. 4.160.645, der er udstedt den 10. juli 1979.

25 Forskellige kombinationer af enzymer kan anvendes til dannelse af en signalgenererende forbindelse. Navnlig kan kombinationer af hydrolaser anvendes til dannelse af en uopløselig signalgenererende forbindelse. Alternativt kan kombinationer af hydrolaser og oxidoreduktaser tilveje-30 bringe den signalgenererende forbindelse. Endvidere kan kombinationer af oxidoreduktaser anvendes til dannelse af en uopløselig signalgenererende forbindelse.

Hvad angår kombinationer af enzymer, kan ét enzym være bundet på ikke-spredende måde til strimmelen, medens det andet DK 166846 B1 16 enzym er konjugeret til et sbp-medlem. Endvidere kan ét eller flere andre medlemmer af det signalfrembringende system være bundet til strimmelen afhængig af det særlige signalfrembringende system, der vælges, eller den bestemte 5 protokol, der følges.

For at få et detekterbart signal er det ønskeligt at tilvejebringe midler til forstærkning af det signal, der frembringes ved tilstedeværelsen af det mærke, der er bundet til området. Derfor foretrækkes det sædvanligvis, at 10 mærket er en katalysator eller luminescerende forbindelse eller en radioisotop, især en katalysator. Foretrukne katalysatorer er enzymer og coenzymer, som kan frembringe flere signalgenererende molekyler ud fra et enkelt mærke.

Der anvendes et enzym eller coenzym, som tilvejebringer den 15 ønskede amplifikation ved at danne et produkt, som absorberer lys, fx et farvestof, eller udsender lys ved bestråling, fx et fluorescerende stof. Alternativt kan den katalytiske reaktion føre til direkte lysemission, fx kemiluminescens. Et stort antal enzymer og coenzymer til tilveje-20 bringelse af sådanne produkter er beskrevet i USA-patent-skrift nr. 4.275.149, spalte 19-23, og USA-patentskrift nr. 4.318.980, spalte 10-14.

Særlig interessant er anvendelsen af en kombination af enzymer, hvor enzymerne er forbundet ved, at produktet af 25 ét enzym er substrat for det andet enzym. Herved kan der tilvejebringes stabile precursorer for labile substrater, og substratet for et andet enzym kan lagres sammen med et første enzym, uden at der for tidligt indledes en reaktion.

Flere enzymkombinationer er beskrevet i USA-patentskrift 30 nr. 4.275.149, spalte 23-28, hvilke kombinationer kan anvendes i den foreliggende opfindelse.

Særlig interessante er enzymer, som indebærer dannelse af hydrogenperoxid og anvendelse af hydrogenperoxidet til oxi- DK 166846 Bl 17 dering af en farvestofprecursor til et farvestof, særlige kombinationer omfatter saccharidoxidaser, fx glucose- og galactoseoxidase, eller heterocycliske oxidaser såsom uri-case og xanthinoxidase koblet til et enzym, som anvender 5 hydrogenperoxidet til oxidering af en farvestofpercursor, dvs. en peroxidase såsom peberrodsperoxidase, lactoperoxi-dase eller mikroperoxidase. Når der anvendes et enkelt enzym som mærke, kan andre enzymer finde anvendelse såsom hydrolaser, transferaser og oxidoreduktaser, fortrinsvis 10 hydrolaser såsom alkalinsk phosphatase og Ø-galactosidase. Alternativt kan der anvendes luciferaser såsom ildflue-luciferase og bakteriel luciferase.

Eksempler på coenzymer, der kan anvendes, omfatter NAD[H], NADP[H], pyridoxal-phosphat, FAD[H] og FMN[H], sædvanligvis 15 coenzymer, der involverer cycliske reaktioner, se især USA-patentskrift nr. 4.318.980.

Produktet af enzymreaktionen vil sædvanligvis være et farvestof eller et fluorescerende stof. Et stort antal eksempler på fluorescerende stoffer er beskrevet i USA-patent-20 skrift nr. 4.275.149, spalte 30-31.

"Hjælpematerialer". Forskellige hjælpematerialer anvendes ofte i assayet ifølge den foreliggende opfindelse. Fx er der normalt puffere til stede i assaymediet samt stabilisatorer. Ud over disse additiver kan der ofte være inkorpore-25 ret yderligere proteiner såsom albuminer eller overfladeaktive midler, især ikke-ioniske overfladeaktive midler, bindingsforstærkere, fx polyalkylenglycoler.

"Lille område" betegner et område på strimmelen af sugende materiale, som har et overfladeareal, der er væsentligt 30 mindre end strimmelens overfladeareal. Området kan være et punkt, en linje, en kurve, et bånd, et mønster dannet af punkter, linjer, kurver, bånd, eller kombinationer deraf. Generelt er testopløsningens gennemløbsretning på strimmelen tværgående i forhold til området. Det signal, der frem- DK 166846 B1 18 bringes i området, har fortrinsvis et skarpkantet distinkt mønster, som giver en skarp kontrast til det signal, der frembringes ved dele af strimmelen, som ikke er området. Fx kan området være en printet afbildning af ét eller flere 5 forkortede navne af analytten eller analytterne i testopløsningen eller af et plustegn. Området er adskilt fra endedelen af strimmelen, som bringes i kontakt med testopløsningen, i overensstemmelse med koncentreringsprincippet ifølge den foreliggende opfindelse. Stedet bør være i 10 kontakt med en stor del af den opløsning, der strømmer gennem strimmelen, for at give effektiv koncentrering.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kombineres et første sbp-medlem, der er i stand til at binde til analytten, med en prøve, som menes at indeholde analytten, hvilket giver 15 en vandig testopløsning. Et andet sbp-medlem, som er i stand til at binde det complex, der dannes efter binding af analytten til det første sbp-medlem, er på ikke-spreden-de måde bundet til den sugende strimmel ved det lille område A. Den ene ende af strimmelen bringes i kontakt med 20 testopløsningen, som gennemløber strimmelen ved hjælp af kapillarvirkning. Den mængde af det første sbp-medlem, der bliver bundet til området via binding til det andet sbp-medlem, relateres til mængden af analyt i prøven. Det signalf rembringende system giver kun et detekterbart signal i 25 området, når det første sbp-medlem er bundet, således at tilstedeværelsen af analytten kan bestemmes ved at sammenligne det signal, der kan detekteres i området, med det signal, der kan detekteres i en del af strimmelen, som ikke er området, sædvanligvis en del af strimmelen, som grænser 30 op til området. Det første sbp-medlem binder specifikt til analytten. Det andet sbp-medlem er på ikke-spredende måde bundet i området og er i stand til at binde det første sbp-medlem. Binding kan forekomme direkte til et bindingssted på det første sbp-medlem eller indirekte til et bindings-35 sted på analytten, som er bundet til det første sbp-medlem. Binding kan også forekomme i et område, som er karakteristisk for complexet af analytten og det første sbp-medlem, DK 166846 B1 19 hvilket område ikke er til stede i nogen af bestanddelene alene.

Når binding af det første sbp-medlem til det andet sbp-medlem sker direkte, er det nødvendigt at sørge for fjer-5 nelse af frit første sbp-medlem ved at tilvejebringe en analog til analytten på ikke-spredende måde bundet til strimmelen i det mindste mellem området og endedelen. Der vælges normalt et andet sbp-medlem, som tilvejebringer direkte binding til det første sbp-medlem, når analytten 10 har et enkelt bindingssted, fx et lægemiddel, eller når der kun er ét sbp-medlem komplementært med analytten tilgængeligt. Generelt bør den mængde analoganalyt, som binder til strimmelen, være tilstrækkelig til at binde hele det første sbp-medlem, når der ikke er analyt til stede i testopløs-15 ningen. En sådan analog er sædvanligvis til stede i en overskydende mængde.

Testopløsningens bevægelse langs med strimmelen skyldes kapillaritet. Denne kapillarbevægelse langs med strimmelen får testopløsningen til at blive båret gennem området.

20 Efter at strimmelen er blevet bragt i kontakt med testopløsningen, sørger en fremkalderopløsning fortrinsvis for fortsættelse af den kapillære bevægelse gennem området. I dette tilfælde bringes fremkalderopløsningen i kontakt med den endedel af strimmelen, som blev bragt i kontakt med 25 testopløsningen. Alternativt kan området for at bringe strimmelen i kontakt med fremkalderopløsningen neddyppes i fremkalderopløsningen, efter at endedelen af strimmelen er blevet bragt i kontakt med testopløsningen. Under alle omstændigheder er det ønsket at tilvejebringe en koncen-30 tration af det første sbp-medlem i området, før området kommer i kontakt med fremkalderen.

Opløsningsmidlet er sædvanligvis et vandigt medium, som kan indeholde op til 40 vægtprocent andre polære opløsningsmidler, især oxygenerede opløsningsmidler med 1-6, især 1-4 35 carbonatomer, herunder alkoholer og ethere. Cosolventerne DK 166846 B1 20 er sædvanligvis til stede i en mængde af under ca. 20 vægtprocent .

Mediets pH er sædvanligvis i området 4-11, især 5-10, fortrinsvis ca. 6-9. pH-Værdien vælges således, at der opret-5 holdes et væsentligt bindingsaffinitetsniveau af sbp-med-lemmerne og optimal signalgenerering ved hjælp af det sig-nalfrembringende system. Der kan anvendes forskellige puffere til at opnå den ønskede pH-værdi og opretholde pH-værdien under assayet. Eksempler på puffere omfatter borat, 10 phosphat, carbonat, tris og barbital. Den specielle puffer, der anvendes, er ikke kritisk, men i individuelle assays kan én puffer være foretrukket fremfor en anden.

Det er ønskeligt at inkorporere ca. 0,05-0,5 vægtprocent af et ikke-ionisk detergens i prøven. Der kan anvendes for-15 skellige polyoxyalkylenforbindelser på ca. 200-20.000 daltons.

Til udførelse af assayet anvendes normalt moderate og helst i det væsentlige konstante temperaturer. Temperaturerne til assayet og til frembringelse af et detekterbart signal er 20 sædvanligvis i området ca. 4-50°c, især ca. 10-40°C, og vil ofte være omgivelsestemperatur, dvs. ca. 15-25°C.

I den flydende prøve vil den analytkoncentration, som kan analyseres, sædvanligvis variere fra ca. 10~4 til ca.

10“15M, især fra ca. 10“6 til ca. 10“14M. Faktorer såsom 25 koncentrationen af den analyt, som har interesse, og protokollen bestemmer sædvanligvis koncentrationen af de andre reagenser.

Medens koncentrationerne af mange af de forskellige reagenser i prøven og reagensopløsningerne sædvanligvis vil være 30 bestemt af det interessante koncentrationsområde for ana-lytten, er slutkoncentrationen af hvert af reagenserne sædvanligvis bestemt empirisk for at optimere assayets følsomhed hen over det interessante område. Med visse protokoller DK 166846 B1 21 kan der anvendes individuelle reagenser i betydeligt overskud uden på ugunstig vis at påvirke assayets følsomhed.

Strimmelens størrelse afhænger af flere hensyn. Hvis kapillarstrømmen hovedsagelig går opad, regulerer strimmelens 5 længde og tykkelse den mængde opløsning, der kan gå gennem området. Overførsel af en stor mængde af første opløsning kræver, at strimmelens væskekapacitet over området er tilstrækkelig til at rumme det ønskede volumen. Hvis strimmelen anvendes til at tilvejebringe en hovedsagelig nedad-10 gående strømning, således at testopløsningen bortledes, er dette volumenbehov ikke påkrævet. Hvis der endvidere tilvejebringes et absorberende materiale, som bringes i kontakt med den ende af strimmelen, der ikke anvendes til kontakt med testopløsningen, elimineres volumenbehovet også.

15 Sædvanligvis er det ønskeligt at overføre et så stort et volumen som muligt gennem området, således at der tilvejebringes den største assayfølsomhed. Andre hensyn såsom tid og tilgængelighed af prøven begrænser imidlertid dette behov. Til strimler med opadgående strømning er væskereten-20 tionsvolumenet over området sædvanligvis større end 20 μΐ, fortrinsvis mindst 50-200 μΐ. I strimler med nedadgående strømning kan der anvendes et så lille retentionsvolumen som 2-20 μΐ, men volumener på 20-200 μΐ er foretrukne.

Strimlernes tykkelse er sædvanligvis ikke større end 20% af 25 bredden, fortrinsvis 1-10%, især 2-5%.

For at muliggøre konservering af reagenserne og tage højde for prøver af begrænset størrelse er strimmelens bredde sædvanligvis relativt smal, sædvanligvis mindre end 20 mm, fortrinsvis mindre end 10 mm. Strimmelens bredde er sædvan-30 ligvis ikke mindre end ca. 1,0 mm og er sædvanligvis i området ca. 2-12 mm, fortrinsvis ca. 4-8 mm.

Strimmelens længde afhænger af analytkoncentrationen og praktiske hensyn såsom håndteringslethed og antallet af områder på strimmelen og er sædvanligvis ca. 2-40 cm, især DK 166846 B1 22 ca. 4-25 cm, fortrinsvis ca. 6-20 cm, men kan være af en hvilken som helst praktisk længde. Strimmelens struktur kan variere inden for vide rammer og omfatter fin, mediumfin, medium, mediumgrov og grov. Generelt giver en mindre pore-5 størrelse og et finere materiale en langsom kapillarstrømning og effektiv binding af bindende sbp-medlemmer på strimmelen. Grovere, mere porøse materialer giver en hurtigere gennemstrømning, men bindingseffektiviteten er nedsat. Udvælgelse af materialets porøsitet afhænger af 10 bindingshastigheden af sbp-medlemmerne i et givet assay.

Positionen af det lille område A, eller de små områder, når der bestemmes flere analytter, bør afhænge af den foreliggende opfindelses grundprincip. Det ønskes at lade en tilstrækkelig mængde af testopløsningen passere gennem området 15 ved kapillarvirkningen til at koncentrere en tilstrækkelig mængde af analytten i området til frembringelse af et signal, som er detekterbart i forhold til baggrundsstøjen. Det er således ønskeligt at anbringe området tæt ved den ende af strimmelen, som skal bringes i kontakt med testopløsnin-20 gen, men ikke så tæt, at det kommer i kontakt med hovedparten af opløsningen eller menisken. Området bør helst være mindst 5 mm, fortrinsvis mindst 8 mm fra en sådan ende af strimmelen. Det kan være anbragt i en hvilken som helst større afstand fra enden, forudsat at testopløsningen kan 25 passere gennem området ved kapillarvirkning. Området er fortrinsvis ikke større end halvdelen af strimmelens længde fra denne ende. Herved er området ''adskilt" fra en sådan endedel. Når der anvendes flere områder, kan områderne være grupperet tæt sammen eller adskilt, men ikke så tæt sammen, 30 at opløsningen af signalet bringes i fare. Som følge heraf bør sådanne områder sædvanligvis have en indbyrdes afstand på ikke under 1 mm, fortrinsvis mindst 3 mm.

Andre reagenser, der er medlemmer af det signalfrembringen-de system, kan variere inden for vide rammer i koncentra-35 tion afhængig af den særlige procedure og deres rolle i signalfrembringelsen. Sædvanligvis overstiger det første DK 166846 B1 23 sbp-medlem ikke 104 gange den interessante maksimumkoncen-tration for analytten, når analytten har flere bindingssteder, og overstiger ikke 103 gange den interessante maksimumkoncentration, når der anvendes en monovalent analyt.

5 Normalt er det første sbp-medlem ikke under 0,5 gange den interessante minimumkoncentration. Når mærket ikke er bundet direkte til det første sbp-medlem, skal det reagens, som det binder til, binde til det første sbp-medlem og vil være til stede i det mindste i en mængde, som er ækvivalent 10 med den laveste interessante koncentration af analytten.

Til udførelse af assayet indebærer processen sædvanligvis, at den prøve, der menes at indeholde analytten, kombineres med det første sbp-medlem til dannelse af en vandig testopløsning. Prøven kan stamme fra en lang række kilder såsom 15 fysiologiske væsker, fx spyt, blod, serum, plasma, urin, øjenlinsevæske og spinalvæske, kemisk spildevand, hushold-ningsspildevand.

Endedelen af strimmelen, der sædvanligvis er den ende, som er tættest på området, bringes i kontakt med testopløsnin-20 gen, sædvanligvis ved neddypning af endedelen i testopløsningen. Befugtning af strimmelen ved kapillarvirkning lades sædvanligvis fortsætte, i det mindste indtil området er vådt. Fortrinsvis er i det mindste halvdelen af strimmelen vædet med testopløsningen. Når der anvendes nedadgående 25 bort ledende gennemstrømning, vil hele strimmelen sædvanligvis være våd, og overskydende testopløsning kan lades bortlede gennem strimmelen.

For det meste indgår relativt korte tidsrum til testopløsningens gennemløb af strimmelen. Sædvanligvis løber testop-30 løsningen gennem strimmelen på mindst 30 sekunder og ikke over 1 time, sædvanligvis fra ca. 1 minut til 30 minutter. Fremkaldelse af signalet sker sædvanligvis på fra 30 sekunder til 30 minutter, især på fra 30 sekunder til 5 minutter.

DK 166846 B1 24

Efter at væsken er løbet gennem i det mindste en del af strimmelen, bringes strimmelen i kontakt med en fremkalderopløsning, der indeholder medlemmer af det signalfrem-bringende system. Dette kan udføres ved neddypning af 5 strimmelen i fremkalderopløsningen, men sædvanligvis bringes kun den ende af strimmelen, der tidligere har været i kontakt med testopløsningen, i kontakt med fremkalderopløsningen. Når testopløsningen indeholder et umærket første sbp-medlem, indeholder fremkalderopløsningen et mærket sbp-10 medlem, der kan binde til det complex, der dannes mellem det første sbp-medlem og analytten. Efter kontakt af strimmelens endedel med fremkalderopløsningen løber opløsningen gennem strimmelen ved kapillarvirkning i det mindste til det lille område, og fortrinsvis til hele strimmelen er 15 våd.

Når der anvendes et enzym som mærke, forefindes substratet sædvanligvis i et væsentligt overskud, således at hastigheden ikke begrænses (større koncentration end Km). Fremkalderopløsningen er sædvanligvis hensigtsmæssigt pufret 20 for enzymsystemet.

Efter at strimmelen er bragt i kontakt med fremkalderopløsningen, bringes strimmelen i kontakt med eventuelle resterende medlemmer af det signalfrembringende system, som ikke er til stede i fremkalder- eller testopløsningerne eller på 25 strimmelen. Der lades gå et tilstrækkeligt tidsrum før måling af signalet til at danne en mængde af en signalfrem-bringende forbindelse, der er nødvendig for at afgrænse den region i området, hvor analytten er bundet. Når det detek-terbare signal er blevet frembragt, vides det, om analytten 30 eller analytterne er til stede eller ikke er til stede i prøven.

Ligandanalytterne er karakteriseret ved at have enkelte bindingssteder (monovalente) eller flere bindingssteder (polyvalente), medens receptoranalytterne også kan have ét 35 eller flere bindingssteder. De polyvalente analytter er 25 DK 166846 B1 sædvanligvis poly(aminosyrer) , dvs. polypeptider og proteiner, polysaccharider, nucleinsyrer og kombinationer deraf. Sådanne kombinationer eller ansamlinger omfatter bakterier, vira, chromosomer, gener, mitochondrier, kerner 5 og cellemembraner.

Som oftest har de polyvalente ligandanalytter en molekylvægt på mindst ca. 5.000, især mindst ca. 10.000. Inden for poly(aminosyre)-gruppen har de poly(aminosyrer), som har interesse, sædvanligvis en molekylvægt på ca. 5.000-10 5.000.000, især ca. 20.000-1.000.000, og de hormoner, som har interesse, har sædvanligvis en molekylvægt på ca.

5.000-60.000.

En omfattende liste over nyttige ligander findes i USA-patentskrift nr. 4.275.149, spalte 12-17.

15 De monovalente ligandanalytter har sædvanligvis en molekylvægt på ca. 100-2.000, især ca. 125-1.000. Interessante analytter omfatter lægemidler, hormoner, metabolitter, pesticider og forurenende stoffer.

Et stort antal interessante analytter er angivet i USA-20 patentskrift nr. 4.275.149, spalte 17 og 18.

Receptoranalytter har sædvanligvis en molekylvægt på fra ca. 104 til 2 x 108, sædvanligvis fra ca. 3 x 104 til 2 x 10®. Immunglobuliner, fx IgA, IgD, IgE, IgG og IgM, har sædvanligvis en molekylvægt på fra ca. 160.000 til ca. 10®.

25 Enzymer varierer sædvanligvis fra ca. 10.000 til 600.000 daltons. Naturlige receptorer varierer inden for et bredt område, idet de sædvanligvis har en molekylvægt på mindst ca. 25.000 og op til 10® eller mere, herunder sådanne materialer som avidin, thyroxinbindingsglobulin, thyroxinbin-30 dingspræalbumin, transcortin og membranoverfladeproteiner.

Når en ligand er konjugeret til et andet molekyle eller et underlag, er liganden ofte modificeret for at tilvejebringe DK 166846 B1 26 en bestemt funktionel gruppe på et bestemt sted. Denne modifikation frembringer et produkt, som betegnes en ligandanalog. I USA-patentskrift nr. 4.275.149 er der også en omfattende beskrivelse af ligandanaloge i spalte 18 og 19.

5 Strimmelen kan være belagt med en lang række materialer, der giver forbedrede egenskaber. Belægninger kan omfatte proteinbelægninger, polysaccharidbelægninger, syntetiske polymerer, sukkere eller lignende, der navnlig anvendes for at forøge stabiliteten af de materialer, som er konjugeret 10 til underlaget. Disse forbindelser kan også anvendes til forbedret binding af materialerne såsom sbp-medlemmet eller det signalfrembringende systemmedlem, som er bundet til strimmelen.

Strimmelen eller området kan aktiveres med reaktive funk-15 tionaliteter for at tilvejebringe covalent binding af de organiske materialer, der skal konjugeres til strimmelen, såsom de materialer, der er beskrevet i USA-patentskrift nr. 4.168.146.

Den mængde sbp-medlem, der er bundet til strimmelen i 20 området, varierer afhængigt af den mængde, der kræves til binding af hele det mærkede sbp-medlem. Generelt er mængden af sbp-medlem i området i det mindste ækvivalent med den mængde analyt, der strømmer gennem området, og kan overstige mængden af analyt med 10.000 gange eller mere.

25 Det andet sbp-medlem, analytanalogen og, om ønsket, medlemmer af det signalfrembringende system kan være bundet til strimmelen ved adsorption snarere end covalent binding, så længe bindingen modstår spredning ved diffusion. Dette indebærer, at det sugende underlag bringes i kontakt med en 30 opløsning, som indeholder de materialer, der skal bindes til strimmelen, og strimmelen lades tørre. Generelt er denne procedure kun anvendelig, når det sugende underlag er relativt hydrofobt eller har en høj overfladeladning, og efterfølgende behandling med proteiner, detergenter, poly- 27 DK 166846 B1 saccharider eller andre materialer, der er i stand til at blokere uspecifikke bindingssteder, er nødvendig.

I en foretrukken udførelsesform for opfindelsen kan det første sbp-medlem være på ikke-spredende måde bundet til 5 partikler eller kugler. Partiklerne eller kuglerne kan derefter påføres på strimmelen i området. Sædvanligvis vil partiklerne have midler til specifik binding af et mærket sbp-medlem eller et mærke uden nogen væsentlig uspecifik interaktion. Arten af partiklerne eller kuglerne kan vari-10 ere inden for vide rammer, og de kan være naturligt forekommende eller syntetiske. Materialerne er kommercielt tilgængelige, eller kommercielt tilgængelige materialer kan modificeres. Eksempler på sådanne partikler eller kugler er latexpartikler fremstillet af polystyren, polyacrylater, 15 polyacry lamid, der er tilgængeligt som Biogel-p®, eller naturligt forekommende materialer såsom polysaccharider, især tværbundne polysaccharider såsom agarose, der er tilgængeligt som Sepharose®, dextran, der er tilgængeligt som Sephadex®, mikrokrystallinsk cellulose, stivelse og lignen-20 de. Andre materialer omfatter polyacrylamider, polystyren, polyvinylalkohol, copolymerer af hydroxyethylmethacrylat og methylmethacrylat, siliconer, glasser, der er tilgængelige som Bioglas®, diatoméjord og siliciumdioxid. Hovedkravet er, at materialerne ikke bidrager med et signal, sædvanlig-25 vis lysabsorption, som ville bevirke, at stedet har et andet signal end andre dele af strimmelen før kontakt med det signalfrembringende system.

Partiklerne skal kunne fastgøres ikke-spredende til et sbp-medlem, hvor fastgørelsen kan opnås ved covalent eller 30 ikke-covalent binding. Når sbp-medlemmet er covalent bundet, bør partiklerne være polyfunktionelle eller i stand til at blive polyfunktionaliseret. En lang række funktionelle grupper er tilgængelige eller kan inkorporeres. Funktionelle grupper omfatter carboxylsyrer, aldehyder, aminer, 35 amider, aktiverede ethylener såsom maleimid, hydroxyler, sul fonsyrer og mercaptaner. Den måde, hvorpå en lang række DK 166846 B1 28 forbindelser forbindes med de forskellige partikler, er velkendt og omfattende eksemplificeret i litteraturen, jfr. fx Cautrecases, J;. Biol. Chem. 245. 1970, s. 3059.

Længden af forbindelsesgrupperne varierer inden for et 5 bredt område afhængig af fx arten af den forbindelse, der forbindes, virkningen af afstanden mellem mærket og partiklen på mærkets egenskaber og muligheden for tværbinding af mærkerne.

Partiklerne bør ikke vandre i noget væsentligt omfang.

10 Partiklernes størrelse kan variere, men skal være af en størrelse, så de kan infiltrere porerne i det sugende materiale og blive indlejret eller på ikke-spredende måde bundet deri. Således er partiklerne sædvanligvis en lille smule større end minimumstørrelsen af porerne i det sugende 15 materiale og mindre end den maksimale porestørrelse. Partiklernes størrelse er sædvanligvis i området ca. 0,1-50 μ-m, især ca. 0,4-10 μιη, fortrinsvis større end 0,5 μια.

Partikler med et på ikke-spredende måde bundet sbp-medlem kan anvendes til på ikke-spredende måde at binde sbp-med-20 lemmet til strimmelen i et lille område med skarpt afgrænsede kanter. Der kan anvendes flere metoder. Sædvanligvis påføres en suspension af partiklerne i en væske, der ofte er vandig, på strimmelen. Påføringen kan foregå ved en hvilken som helst standardtrykningsproces, herunder anven-25 delse af elektrostatiske og laserdrevne strålerør, og en trykprobe eller skrifttyper. Endvidere kan partiklerne påføres ved hjælp af en skabelon. Formen af området kan defineres ved hjælp af et udskåret mønster, hvorigennem partiklerne kan absorberes ind i den sugende strimmel.

30 Alternativt kan suspensionen overføres til strimmelen ved indprentning med en pen eller et mikrokapillarrør. Når der anvendes tørre partikler, kan de påføres ved at rette en stråle af en suspension af partiklerne i en gas, sædvanligvis luft, mod det ønskede område. I hvert tilfælde, især 35 når der ikke anvendes trykkeriteknikker, vil det ofte være DK 166846 B1 29 ønskeligt at sørge for reduceret tryk på den side af strimmelen, som er modsat den side, der anvendes til påføring af partiklerne. Trykreduktion tilvejebringes hensigtsmæssigt ved at anbringe et ark af det sugende materiale på et fil-5 ter eller en porøs plade, der dækker et vakuumkammer. Suspensionen påføres derefter, medens luft trækkes gennem materialet. Uanset metoden til påføring af partiklerne er det sædvanligvis foretrukket at vaske området fri for ubundne partikler, efter at de er blevet påført.

10 Den væske, der anvendes til suspension af partiklerne, er sædvanligvis vandig og må ikke opløse partiklerne eller skade eller frigive det bundne sbp-medlem. Der kan tilsættes fortykningsmidler og overfladeaktive midler for at begrænse kapillargennemstrømningen og tilvejebringe skarpt 15 afgrænsede kanter. Fortykningsmidler kan omfatte polyvinyl-alkohol, polypyrrolidon, dextran eller glycerol. Overfladeaktive midler kan være ioniske, sædvanligvis anioniske, eller ikke-ioniske.

En række udførelsesformer for den foreliggende opfindelse 20 er i det følgende beskrevet i detaljer. I én udførelsesform er analytten i prøven polyvalent. Et andet sbp-medlem, der genkender et determinantsted på analytten, er på ikke-spredende måde bundet i et lille område A på strimmelen af sugende materiale. Den ikke-spredende binding kan udføres 25 ved en hvilken som helst af de metoder, som er beskrevet ovenfor. En testopløsning med et volumen, der er omtrent lig med strimmelens væskekapacitet, fremstilles ved at kombinere den prøve, der menes at indeholde analytten, og et mærket første sbp-medlem, idet dette sbp-medlem binder 30 til et determinantsted på analytten til dannelse af et complex. Den endedel af den sugende strimmel, som er nærmest området, bringes i kontakt med testopløsningen, som lades gennemløbe den sugende strimmel ved kapillarvirkning. Testopløsningen bevæger sig langs strimmelen og gennem om-35 rådet, indtil hele strimmelen er våd, eller indtil der ikke er mere testopløsning. Complexet af analytten og det mærke- DK 166846 B1 30 de første sbp-medlem binder til det andet sbp-medlem i området, hvorved det mærkede første sbp-medlem koncentreres i området. Efter at testopløsningen har gennemløbet den sugende strimmel, bringes strimmelen i kontakt med en frem-5 kalderopløsning, der indeholder de resterende medlemmer af det signalfrembringende system, hvoraf mærket er ét medlem. Hvis analytten er til stede i testopløsningen, vil der frembringes et signal i det lille område A. Dette signal kan adskilles fra signaler, som genereres ved siden af 10 området.

I en variant af den ovenfor beskrevne udførelsesform er testopløsningens rumfang tilstrækkeligt til, at gennemløb deraf muliggøres i kun en del af strimmelen, således at væskekapaciteten i den tørre del af strimmelen er mindst 15 lige så stor som væskekapaciteten af delen fra endedelen gennem det lille område A. Endedelen af strimmelen, der forinden er blevet bragt i kontakt med testopløsningen, bringes derefter i kontakt med fremkalderopløsningen. Fremkalderopløsningen bevæger sig langs med strimmelen 20 gennem det lille område A ved kapillarvirkning. Herved får fremkalderopløsningen resten af testopløsningen til at bevæge sig gennem det lille område. Hvis der er analyt til stede i testopløsningen, genereres et signal.

I en anden variant af den ovenfor beskrevne udførelsesform 25 er det første sbp-medlem ikke mærket. Assayet udføres på samme måde, men et mærket sbp-medlem, som er komplementært med det første sbp-medlem, er inkorporeret i fremkalderen.

Når der er analyt til stede, binder det første sbp-medlem til området og forårsager derved binding af det mærkede 30 sbp-medlem til området. I denne udførelsesform foretrækkes det ofte at udelade nogle medlemmer af det signalfrembringende system fra fremkalderen og bringe strimmelen i kontakt med en opløsning, der indeholder disse udeladte, dvs. resterende, medlemmer efter kontakt med fremkalderen.

DK 166846 B1 31 I ovennævnte udførelsesform kan der bestemmes flere poly-valente analytter. Til dette formål anvendes flere områder, som er adskilte fra endedelen. I ét område er et andet sbp-medlem, som genkender et determinantsted på en første ana-5 lyt, på ikke-spredende måde bundet til den sugende strimmel. I et andet område er et andet sbp-medlem, som genkender et determinantsted på en anden analyt, bundet på ikke-spredende måde. Dette gentager sig, indtil der er et lille område A for hver af de analytter, som man ønsker at teste 10 for. Den prøve, som skal analyseres, kombineres derefter i et hensigtsmæssigt vandigt medium med flere mærkede første sbp-medlemmer til dannelse af testopløsning. Et mærket første sbp-medlem indeholder et sbp-medlem, der genkender et determinantsted på den første analyt, hvilket sted er 15 forskelligt fra det determinantssted, der genkendes af det andet sbp-medlem på den sugende strimmel, som binder til den første analyt. Et andet mærket første sbp-medlem indeholder et sbp-medlem, der genkender et determinantsted på den anden analyt, der er forskelligt fra det determinant-20 sted, der genkendes af det andet sbp-medlem på den sugende strimmel, som binder til den anden analyt. Antallet af mærkede sbp-medlemmer svarer til antallet af analytter, som man ønsker at teste for. Hvis den eller de analytter, som der testes for, er til stede i prøven, dannes der et com-25 plex af hver respektiv analyt med dens tilsvarende mærkede første sbp-medlem. Hvis analytten ikke er til stede, dannes der ikke noget sådant complex. Endedelen af den sugende strimmel bringes i kontakt med testopløsningen, som lades gennemløbe strimmelen. Eventuelle complexer af analyt og 30 mærket sbp-medlem binder til de respektive områder på strimmelen. Hvis der ikke er analyt til stede, dannes der ikke noget complex, og derfor bliver det mærkede første sbp-medlem, som svarer til den pågældende analyt, ikke bundet til området, og der vil ikke frembringes noget sig-35 nal. Efter at testopløsningen har gennemløbet den sugende strimmel, bringes strimmelen i kontakt med de relevante medlemmer af de anvendte signalfrembringende systemer.

Assayet kan udformes således, at der anvendes en enkelt DK 166846 B1 32 fremkalder til alle analytterne, som det ønskes at teste for. Hvis den bestemte analyt er til stede i prøven, vil der frembringes et signal i det relevante område. I en særlig foretrukken variant af denne fremgangsmåde mærkes de 5 første sbp-medlemmer ikke, og fremkalderen indeholder et mærket sbp-medlem, som er komplementært med de første sbp-medlemmer. Strimmelen bringes i kontakt med de resterende medlemmer af det signalfrembringende system efter kontakt med fremkalderen.

10 I en anden udførelsesform for opfindelsen er analytten et monovalent lægemiddel. Den prøve, der menes at indeholde lægemidlet, blandes med et mærket første sbp-medlem i et hensigtsmæssigt medium til dannelse af en vandig testopløsning. Det mærkede første sbp-medlem binder til lægemidlet.

15 Den sugende strimmel indeholder et andet sbp-medlem i det lille område, hvilket sbp-medlem genkender et determinantsted på det mærkede første sbp-medlem, som er forskelligt fra det determinantsted, som indgår i bindingen af det mærkede sbp-medlem til lægemidlet. Fx kan det andet sbp-20 medlem genkende et determinantsted på mærkedelen af det mærkede første sbp-medlem eller på sbp-medlemsdelen. I denne særlige udførelsesform skal en analyt- eller lægemiddelanalog være bundet til strimmelen i en mængde, som i det mindste er tilstrækkelig til at binde hele det mærkede 25 sbp-medlem, når der ikke er noget lægemiddel i den testede prøve. Sædvanligvis er denne analytanalog et derivat af det lægemiddel, der testes for, og er bundet til strimmelen i et betydeligt overskud i det mindste mellem endedelen af strimmelen og området. Selv om det foretrækkes, at denne 30 lægemiddelanalog er et derivat af lægemidlet, kan der anvendes andre lægemiddelanaloge som fx et antistof, der er rettet mod idiotypen af et antistof for lægemidlet. Når prøven og det mærkede første sbp-medlem blandes sammen til dannelse af testopløsningen, og der er lægemiddel til stede 35 i prøven, dannes der et complex mellem lægemidlet og det mærkede første sbp-medlem. Dette complex af lægemiddel og mærket første sbp-medlem bevæger sig langs den sugende DK 166846 B1 33 strimmel, indtil det når det område, hvortil det bliver bundet som følge af binding med et andet sbp-medlem, der er specifikt for det mærkede første sbp-medlem, i området.

Hvis der ikke er lægemiddel til stede i prøven, dannes der 5 ikke noget complex mellem lægemidlet og det mærkede første sbp-medlem. Når testopløsningen bringes i kontakt med endedelen af den sugende strimmel, binder det mærkede første sbp-medlem, der ikke complexes med lægemidlet, til lægemid-delanalogen, der er på ikke-spredende måde bundet til 10 strimmelen. Eftersom denne lægemiddelanalog er til stede i et overskud, når det ucomplexede mærkede sbp-medlem ikke det lille område. Ved den efterfølgende fremkaldelse af teststrimmelen vil tilstedeværelsen af lægemiddel i prøven være vist ved frembringelsen af et signal i det lille 15 område A.

I den sidstnævnte udførelsesform for monovalente lægemidler kan man også analysere en testopløsning for flere lægemidler. I dette tilfælde fremstilles testopløsningen ved sammenblanding i et hensigtsmæssigt flydende medium af prøven 20 og flere mærkede første sbp-medlemmer svarende til antallet af analytter, for hvilke man ønsker at teste. Hvis det kun ønskes at vide, om ét af lægemidlerne er til stede, indeholder den sugende strimmel et område, som er identisk med det område, som er beskrevet ovenfor for et enkelt lægemid-25 del. Det er imidlertid nødvendigt at inkorporere lægemiddelanaloge på strimmelen svarende til hvert af de lægemidler, for hvilke der testes. Hvis det er nødvendigt at vide, hvilke lægemidler der er til stede, indeholder strimmelen et separat område for hvert lægemiddel, i hvilket område 30 der er bundet et andet sbp-medlem, som specifikt binder til et determinantsted, der er karakteristisk for det mærkede første sbp-medlem svarende til det pågældende lægemiddel.

Et karakteristisk determinantsted tilvejebringes fortrinsvis ved at fastgøre en hapten til det mærkede første sbp-35 medlem og anvende et antistof for haptenen som det andet sbp-medlem.

DK 166846 B1 34

For nemheds skyld kan indretningen ifølge den foreliggende opfindelse tilvejebringes i et kit i en pakket kombination med forudbestemte mængder af reagenser til anvendelse til analyse for en analyt. Når der anvendes et enzym som mærke, 5 omfatter reagenserne et enzymmærket første sbp-medlem, substrat for enzymet eller precursorer derfor, herunder eventuelle yderligere substrater, enzymer og cofaktorer og en hvilken som helst reaktionspartner for det enzymatiske produkt, som kræves til tilvejebringelse af den detekter-10 bare chromofor eller fluorophor. Endvidere kan der inkorporeres andre tilsætningsstoffer såsom hjælpereagenser, fx stabilisatorer og puffere. De relative mængder af de forskellige reagenser kan variere inden for vide rammer, således at der tilvejebringes koncentrationer af reagenserne i 15 opløsningen, hvilke koncentrationer i det væsentlige optimerer assayets følsomhed. Reagenserne kan tilvejebringes som tørre pulvere, sædvanligvis lyofiliserede, herunder excipienser, der ved opløsning giver en reagensopløsning med de relevante koncentrationer til udførelse af assayet.

20 Opfindelsen belyses nærmere ved nedenstående eksempler. Forinden er følgende termer definerede.

PBS: phosphatpufret saltopløsning DMF: dimethylformamid BSA: bovint serumalbumin 25 HCG: humant choriongonadotropin HRP: peberrodsperoxidase P04: mono- og dibasisk phosphat, natriumsalt EDTA: ethylendiamintetraeddikesyre 30 SAMSA: S-acetyl-mercapto-ravsyreanhydrid SMCC: succinimidyl-4-(N- maleimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat

Phosphatpuffer: 10 mM P04, pH = 7,40 DK 166846 Bl 35 PBS: 10 inM P04, pH = 7,40 150 mM NaCl

Puffer A: 10 mM P04, pH = 7,40 150 mM NaCl

5 0,1% BSA

0,05% Tween® -20 (Sigma Chemical Co.)

Konjugatpuffer: 100 mM P04, pH = 7,40

150 mM NaCl 0,1% BSA

10 0,05% Tween® -20

Fremkalderpuffer: 10 mM P04, pH = 7,00

20 mM NaCl 0,1% BSA

0,005% Triton® QS -44 (Sigma Chemical 15 Co.) 200 /ig/ml 4-chlor-l-naphthol 1 mM H2O2

Carbonatpuffer: 50 mM Na2C03, pH = 9,50 P04 - NaCl - 20 EDTA-puffer: 100 mM NaP04, pH = 7,50

100 mM NaCl 5 mM EDTA

Søjlepuffer: 100 mM Na3P04, pH = 7,00 200 mM NaCl 25 0,02% NaN3 DK 166846 B1 36 EKSEMPEL 1

Fremstilling af et konjugat af HRP og HCG-antistof Fremstilling af HRP-SAMSA

60 mg HRP (type VI, Sigma Chemical Co.) blev opløst i 2 ml 5 carbonatpuffer og dialyseret til fjernelse af kontaminanter.

SAMSA (Sigma Chemical Co.) blev gjort 100 mM i tørt DMF. 30 mg HRP blev omsat med et 12 ganges molært overskud af SAMSA i 1 time. Produktet blev oprenset fra frit SAMSA under 10 anvendelse af en lille Sephadex® G-25-søjle ækvilibreret med PO4-NaCl-EDTA-puffer.

Til dannelse af frie -SH-grupper fra SAMSA blev ovennævnte produkt inkuberet med 1/10 volumen 1M NH2OH i PBS under omrøring under argon-gas i 1 time. Det resulterende produkt 15 blev oprenset på en anden Sephadex® G-25-søjle og anvendt med det samme.

Fremstilling af antistof-SMCC

Monoklonalt antistof for β-underenheden af HCG blev fremstillet i henhold til den af Kohier et al., Nature 265.

20 1975, s. 495-497 beskrevne metode.

Antistoffet (4-5 mg/ml) blev dialyseret mod PC>4-NaCl-EDTA-puffer til fjernelse af kontaminanter. Efter dialyse blev 8 mg antistof omsat med et 25 ganges molært overskud af SMCC (Pierce Chemical Co.) i 2 timer ved stuetemperatur og 25 under omrøring. SMCC blev frisk fremstillet som en 100 mM opløsning i tørt DMF.

Produktet blev oprenset på en lille Sehapdex® G-25-søjle og anvendt med det samme. Søjlen blev ækvilibreret med PO4-N aCl-EDTA-puf f er.

DK 166846 B1 37

Konjugation af HRP-SAMSA og antistof-SMCC

Antistof-SMCC og et 12 ganges molært overskud af HRP-SAMSA blev kombineret og lodes reagere ved stuetemperatur i 4 timer under omrøring. Reaktionen blev standset med 1 mM 5 β-mercaptoethanol efterfulgt 15 minutter senere af 2 mM N-ethylmaleimid.

Oprensning

Det ovennævnte konjugat blev adskilt fra frit antistof og HRP ved størrelseseksklusionschromatografi på en Sephacryl® 10 S-300-søjle ækvilibreret med søjlepuffer.

Fremstilling af antistofbundne kugler

Polybead-carboxylat mikrokugler med en diameter på 3,92 μη 1 en 2,5%'s suspension fra Polysciences, katalog nr. 9850, blev anvendt. 400 μΐ kugler (10 mg) blev vasket med phos- 15 phatpuffer og suspenderet i 5 ml af en 2 mg/ml opløsning af et monoklonalt antistof i phosphatpuffer, hvilket antistof var fremstillet i overensstemmelse med kendte teknikker (Kohier et al., supra). Dette monoklonale antistof genkender kun a-underenheden af HCG.

20 Kuglerne blev inkuberet ved stuetemperatur natten over i antistofopløsningen under omrøring for at holde kuglerne suspenderet. Kuglerne blev derefter centrifugeret, antistofopløsningen blev fradekanteret, og kuglerne blev vasket med 5 ml hver af phosphatpuffer, PBS og puffer A.

25 Efter vask med puffer A blev kuglerne suspenderet i 5 ml PBS + 10 mg/ml BSA (for at blokere enhver uspecifik binding) og blandet i 1 time ved stuetemperatur.

Derefter blev kuglerne centrifugeret og derefter resuspen-deret i 400 μΐ puffer A.

2 DK 166846 B1 38

Fremstilling af testindretning

Der anvendtes Whatman 31 ET-papir, der var blevet belagt med et protein (polyklonalt anti-theophyllin). Papiret blev skåret i strimler med en bredde på 6 mm og en længde på 9 5 eller 18 cm afhængig af assayproceduren. Papirstrimlerne blev anbragt på en glasfrittefilterholder med en diameter på 4,5 cm. Der påførtes vakuum, og strimlerne blev fugtet med destilleret vand.

10 μΐ af suspensionen af antistofbundne kugler, der var 10 fremstillet som. beskrevet ovenfor (indeholdende 250 μg kugler), blev absorberet i papiret ved at trække et 5 μΐ kapillarrør fyldt med de antistofbundne kugler hen over strimmelens overflade to gange. Kuglerne blev derefter vasket ind i papiret med 1 ml puffer A. Strimlerne lodes 15 tørre i vakuum.

Assay A. 100 μΐ HCG-opløsning (20 ng/ml i puffer A eller i urin) blev blandet med 100 μΐ HRP-HCG-antistofkonjugatopløsning (l/iooo fortyndet i konjugatpuffer). En 2 mm's portion af 20 en testindretning (med en længde på 9 cm) blev neddyppet i ovennævnte blanding, der lodes gennemløbe testindretningen, indtil mediefronten nåede toppen af testindretningen. Testindretningen blev derefter nedsænket i 9 ml fremkalderpuffer i 10 minutter og blev derefter fjernet. Der dannedes 25 et tyndt bånd af blågrå farve tværs over testindretningen, hvor de antistofbundne kugler var anbragt.

Som kontrol blev ovennævnte fremgangsmåde gentaget med undtagelse af, at der anvendtes 100 μΐ puffer A i stedet for 100 μΐ HCG-opløsning. Der viste sig ikke noget farvet 30 bånd på testindretningen, eftersom der ikke var noget HCG til stede i testopløsningen.

DK 166846 B1 39 B. 100 jul af HCG-opløsningen blev blandet med 100 jul HRP-HCG-antistofkonjugatopløsning. En 2 mm's portion af en testindretning (med en længde på 18 cm) blev neddyppet i ovennævnte blanding, som gennemløb testindretningen, indtil 5 blandingen var opbrugt (efter ca. 10 minutter) . En 2 mm's portion af samme testindretning blev yderligere neddyppet i 200 jul fremkalderpuffer, som lodes gennemløbe testindretningen i ca. 20 minutter mere. Der dannedes et tyndt bånd af blågrå farve hen over testindretningen, hvor de 10 antistofbundne kugler befandt sig.

Som kontrol blev ovennævnte fremgangsmåde gentaget med undtagelse af, at der anvendtes 100 μΐ puffer A i stedet for 100 μΐ HCG-opløsning. Der viste sig ikke noget farvet bånd på test indretn ingen, eftersom der ikke var noget HCG 15 til stede i testopløsningen.

EKSEMPEL 2 A. Fremstilling af THC-belagt papir CDI-Belagt Whatman 31ET-papir blev befugtet med en opløsning af 0,2% Et3N-THF og derefter neddyppet i en 5 mg/100 20 ml's opløsning af amidet af ll-nor-A9-THC-9-carboxylsyre (THC = tetrahydrocannabinol) og 2,21-oxybis(ethylamin) i 0,2% Et3N-THF natten over i en lukket reaktionsbeholder. Uomsatte CDI-steder blev blokeret med 0,4% ethanolamin i THF, og papiret blev derefter grundigt vasket med methanol 25 for at fjerne uomsat THC. Papirerne blev tørret, belagt med 50 mM PBS indeholdende 1 mg/ml ovalbumin, 0,25% cholat og tørret før anvendelse i assayet.

DK 166846 B1 40 B. Konjugation af HRP til anti-THC-monoklonalt antistof Trin l: Antistofoprensning

Monoklonalt antistof over for THC blev fremstillet ved den af Kohier et al., Nature 265. 1975, s. 495-497 beskrevne 5 metode og oprenset ved chromatografi på en protein A-søjle.

Trin 2: Fremstilling af maleimideret antistof 1. Antistof blev dialyseret natten over ved 4°C i en puffer bestående af 10 mM P04, 150 mM NaCl, pH 7,0 (uden azid) .

2. Der blev fremstillet en frisk opløsning af 0,05 M SMCC i 10 tørt DMF.

3. Antistof blev aekvilibreret til stuetemperatur.

4. SMCC sattes til antistof i et molforhold på 25:1, og blandingen blev hvirvelblandet, forseglet og inkuberet ved 30“C i 2 timer.

15 5. Overskydende SMCC blev fjernet ved dialyse.

Trin 3: Thioleret HRP (DTP-HRP) (DTP = dithiopyridyl) 1. HRP blev dialyseret mod 10 mM P04/150 mM NaCl,. pH 7,5, natten over ved 4eC og aekvilibreret til stuetemperatur.

2. Der blev fremstillet en frisk opløsning af 20 mM SPDP i 20 ethanol (SPDP = N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propio- nat). SPDP sattes derefter til HRP i et molforhold på 3,5:1, omrørt i kort tid for at blande, forseglet med parafilm og inkuberet i 30 minutter ved stuetemperatur.

3. Overskydende SPDP blev fjernet ved at anbringe prøven på 25 en Sephacryl® S-300-søjle aekvilibreret med 10 mM P04/150 mM

DK 166846 B1 41

Nad, pH 7,0, hvorefter prøven blev dialyseret natten over ved 4°C mod P04/NaCl-puffer, pH 1,0 (lagres ved 4°C).

Trin 4: Aktivering af thioler på HRP-DTP

1. En tilstrækkelig mængde HRP-DTP blev delt i alikvoter 5 til tilvejebringelse af i det mindste et 15 ganges overskud i forhold til den genererede mængde IgG-Mal.

2. Frisk 1M DTT (dithiothreitol) blev fremstillet i 10 mM P04/150 mM NaCl, pH 1,0.

3. 25 μΐ DTT tilsattes pr. ml HRP-DTP til en 10 slutkoncentration på 25 mM DTT, og reaktionen blev udført ved stuetemperatur i 20 minutter.

4. Prøven anbragtes derefter på en Sephadex® G-25M-søjle med et lejevolumen, der var mindst ti gange større end pr øve volumenet, ækvilibreret i 10 mM P04/150 mM NaCl/10 mM 15 EDTA, pH 7,0, ved stuetemperatur.

Trin 5: Kondensation af Mal-Ab og HRP-SH

1,8 mg af det maleimiderede antistof og et 15 ganges molært overskud af det afbeskyttede thiolerede HRP blev kombineret og omsat ved stuetemperatur i 4 timer. Overskydende reak-20 tive Mal-grupper blev blokeret ved tilsætning af et 40 ganges molært overskud i forhold til Mal-Ab af β -mercaptoetha-nol til reaktionsblandingen.

Trin 6: Oprensning af HRP-Ab-konjugat 1. Det blokerede konjugat blev koncentreret ved ultrafil-25 trering.

2. En Sepharose® 4B-søjle (300 ml's lejevolumen) blev ækvilibreret med 10 mM P04/150 mM NaCl, pH 7,4.

DK 166846 B1 42 3. Konjugatet blev anbragt på søjlen.

C. Antistofbundne kugler

Der anvendtes kanin-anti-musekugler (tilgængelige fra BIORAD).

5 D. Testindretning

En linje af kanin-anti-musekuglerne blev anbragt på THC-belagt papir i en højde af 3 cm over papirets nederste ende.

E. Assay 10 Prøven var en 75 ng/ml THC-opløsning.

Assay A fra eksempel 1 ovenfor blev gentaget som beskrevet i eksempel 1, men under anvendelse af HRP-Ab-konjugat, THC-opløsningen som prøve og den med kanin-anti-musekugler forsynede testindretning.

15 Der iagttoges et tyndt farvebånd på kuglelinjen, hvilket viste tilstedeværelsen af THC i prøven.

Den foreliggende opfindelse frembyder flere betydningsfulde fordele i forhold til kendte metoder. En primær fordel ved den foreliggende opfindelse er, at flere analytter kan be-20 stemmes i et enkelt assay på et enkelt testelement. Dette medfører en tidsbesparelse for den, som udfører prøven, og formindskede omkostninger. Reagenserne og testindretningerne kan fremstilles let og billigt, hvilket giver en yderligere formindskelse af omkostningerne. Assayresultatet be-25 stemmes udelukkende under henvisning til assayindretningen, og når det frembragte signal er en farve eller fluorescens, kan indretningen aflæses uden brug af noget instrument. Der tilvejebringes derfor en indbygget kontrol. Et positivt resultat kan let skelnes fra eventuel baggrundsstøj, som

Claims (15)

1. 5 En anden fordel ved den foreliggende opfindelse er, at besværlige søjleteknikker undgås. Assayindretningen er en sugende strimmel, som er let at håndtere. En yderligere fordel er, at analytten er koncentreret i en lille zone, dvs. i det lille område. I mange assaysituationer er ana-10 lytten til stede i meget små mængder, hvilket gør detek-tionen vanskelig. Koncentration af analytten i et lille område forøger bestemmelsens nøjagtighed, navnlig når analytten er til stede i små mængder. En yderligere fordel ved den foreliggende opfindelse er, at 15 der kan anvendes et overskud af ét af sbp-medlemmerne, sædvanligvis det mærkede sbp-medlem. Anvendelse af et overskud af et sbp-medlem er med til at få reaktionen til at frembringe sbp-medlemscomplexerne.
2. 1. Fremgangsmåde til bestemmelse af tilstedeværelsen af en analyt i en prøve, der menes at indeholde analytten, hvilken analyt er et medlem af et specifikt bindingspar ("sbp-medlem") bestående af en ligand og dens komplementære receptor, 25 kendetegnet ved, at a) endedelen af en strimmel af et sugende materiale bringes i kontakt med en testopløsning, som indeholder prøven og et første sbp-medlem, som er i stand til at binde til analytten, hvilket sugende materiale er i stand til at blive 30 gennemløbet af testopløsningen ved kapillarbevægelse, idet strimmelen indeholder et andet sbp-medlem, som er på ikke-spredende måde bundet til et lille område A på strimmelen DK 166846 B1 adskilt fra endedelen, hvorhos overfladearealet af området er i det væsentlige mindre end overfladearealet af strimmelen, idet det andet sbp-medlem har den egenskab, at det binder et complex, som er dannet af det første sbp-medlem, 5 når det første sbp-medlem er bundet til analytten, med det forbehold, at når det andet sbp-medlem er i stand til at binde det første sbp-medlem, når det første sbp-medlem ikke er bundet i complexet til analytten, er en analytanalog, som er i stand til at binde det første sbp-medlem, på ikke-10 spredende måde bundet til strimmelen i det mindste mellem det lille område A og endedelen, b) testopløsningen lades gennemløbe i det mindste den del af strimmelen, der inkluderer området A, ved kapillarbevægelse, 15 c) strimmelen bringes i kontakt med 1) en fremkalderopløsning, som indeholder medlemmer af et signalfrembringende system, til tilvejebringelse af kontakt mellem fremkalderopløsningen og området efter kontakt af testopløsningen med området, og 2) eventuelle resterende medlemmer af det 20 signalfrembringende system, idet det signalfrembringende system er i stand til at frembringe et detekterbart signal i området i forhold til mængden af analyt i prøven, og d) det detekterbare signal i området sammenlignes med det signal, der er detekterbart i en del af strimmelen uden for 25 området.
3. 2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at partikler er på ikke-spre-dende måde bundet til strimmelen i området A, idet partiklerne er konjugerede til det andet sbp-medlem.
4. 3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at det lille område A er et bånd, der er tværgående i forhold til gennemløbsretningen af testopløsningen langs strimmelen. DK 166846 B1
5. 4. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3, kendetegnet ved, at det signal, der frembringes i det lille område A, har et skarpkantet distinkt mønster, 5 der giver en skarp kontrast til det signal, der frembringes i tilstødende områder på strimmelen, når der er analyt til stede i testopløsningen.
6. 5. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav til bestemmelse af tilstedeværelsen af 10 flere analytter i testopløsningen, kendetegnet ved, at flere andre sbp-medlemmer hver især er på ikke-spredende måde bundet til et lille område A på strimmelen, der er adskilt fra endedelen, idet hver af de andre sbp-medlemmer er i stand til specifikt at 15 binde et tilsvarende første sbp-medlem, og de første sbp-medlemmer er kombineret med prøven i testopløsningen.
7. 6. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, kendetegnet ved, at det første sbp-medlem til-20 vejebringes af antistoffer til analytten.
8. 7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at antistofferne er antistoffer for humant choriongonadotropin.
9. 8. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de fore-25 gående krav, kendetegnet ved, at det første sbp-medlem er mærket med et enzym. 1 Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, 30 kendetegnet ved, at et andet enzym er ensartet bundet til strimmelen i det mindste på et areal, som omfatter området A og de dele af strimmelen, som støder op til DK 166846 B1 området, idet enzymerne har en sådan indbyrdes forbindelse, at produktet af ét enzym er substrat for det andet.
10. 10. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav til bestemmelse af flere analytter i prøven, 5 kendetegnet ved, at en blanding af specifikke antistoffer for hver analyt kombineres med prøven, og flere sæt af partikler er på ikke-spredende måde bundet til strimmelen, idet der til hvert sæt af partikler er på ikke-spredende måde bundet et sbp-medlem, som er i stand til at 10 binde mindst ét af de complexer, der er dannet mellem et specifikt antistof og en analyt.
11. 11. Fremgangsmåde ifølge krav 10, kendetegnet ved, at en analy tanalog for hver analyt er bundet til strimmelen.
12. 12. Indretning til bestemmelse af tilstedeværelsen af en analyt i en testopløsning bestående af et første medlem af et specifikt bindingspar (sbp-medlem) komplementært med analytten og en prøve, der menes at indeholde analytten, kendetegnet ved, at den omfatter 20 en sugende strimmel, som er i stand til at blive gennemløbet af testopløsningen ved kapillarbevægelse, idet strimmelen har en endedel, som skal bringes i kontakt med testopløsningen, og et andet sbp-medlem, som er forskelligt fra analytten, og 25 som er på ikke-spredende måde bundet til et lille område A på strimmelen adskilt fra endedelen, idet områdets overfladeareal er væsentligt mindre end overfladearealet af strimmelen, hvorhos det andet sbp-medlem har den egenskab, at det binder et complex dannet af det første sbp-medlem, 30 når det første sbp-medlem er bundet til analytten, med det forbehold, at når det andet sbp-medlem er i stand til at binde det første sbp-medlem, når det første sbp-medlem ikke er bundet til analytten i complexet, er en analog af ana- DK 166846 B1 lytten, der er i stand til at binde det første sbp-medlem, på ikke-spredende måde bundet til strimmelen i det mindste mellem det lille område A og endedelen.
13. 13. Indretning ifølge krav 12, 5 kendetegnet ved, at partikler er på ikke-spredende måde bundet til strimmelen i området A, idet partiklerne er konjugeret til det andet sbp-medlem.
14. 14. Indretning ifølge krav 12 eller 13 til bestemmelse af tilstedeværelsen af flere analytter i testopløsningen, 10 kendetegnet ved, at hver af et sæt af andre sbp-medlemmer er på ikke-spredende måde bundet til et forskelligt lille område på strimmelen, som er adskilt fra endedelen, idet hvert sæt af sbp-medlemmer er i stand til at binde til et specifikt complex af en analyt og et første 15 sbp-medlem.
15. 15. Kit til anvendelse til bestemmelse af tilstedeværelsen af en analyt i en testopløsning, kendetegnet ved, at det i emballeret kombination omfatter 20 a) indretningen ifølge et hvilket som helst af kravene 11-13, b) efter behov andre medlemmer af et signalfrembringende system til frembringelse af et detekterbart signal i nærværelse af analytten, og 25 c) hjælpematerialer efter behov.