DK167200B1 - Fremgangsmaade til ikke-spredende binding af et medlem af et specifikt bindingspar paa et sugende materiale - Google Patents

Description

DK 167200 B1

Muligheden for at anvende naturligt forekommende receptorer eller antistoffer, der er rettet mod specifikke forbindelser, til analyse for tilstedeværelsen af en forbindelse, som har interesse, har skabt en blomstrende immunoassay-forretning. I 5 hvert assay indgår et homologt par af specifikke bindingspar ("sbp")-medlemmer, sædvanligvis et immunologisk par, som omfatter en ligand og en receptor (antiligand) , idet ét af sbp-medlemmerne er mærket med et mærke, som afgiver et detekter-bart signal. Immunoassaymetodologien medfører en fordeling af 10 signalmærket mellem et signalmærke, som er bundet i et complex af sbp-medlemmerne, og ubundet signalmærke. Differentieringen mellem bundet og ubundet signalmærke kan være en følge af fysisk adskillelse af bundet og ubundet signalmærke eller modulering af et detekterbart signal mellem bundet og ubundet 15 signalmærke.

Som oftest har immunoassayet været rettet på kvantitativ bestemmelse af en lang række forbindelser, som har interesse i kliniske laboratorier, der kræver relativt forfinet udstyr og omhyggelig teknik. Immunoassayet har fundet mindre omfattende 20 kommerciel anvendelse, hvor semikvantitative eller kvalitative resultater ville være acceptable, og bestemmelsen ville involvere personer uden for laboratoriet, såsom i et hjem eller hos en praktiserende læge. Selv i det kliniske laboratorium ville simple og hurtige screeningstests, som udføres 25 af uerfarent personale, tjene til at give betydelige besparelser.

Ved udvikling af et immunoassay skal mange ting tages i betragtning. Et hensyn, der skal tages, er at tilvejebringe væsentlig differentiering mellem det iagttagne signal, der er 30 et resultat af bundet signalmærke, sammenlignet med ubundet signalmærke. Et andet hensyn er at minimere forstyrrelser fra endogene materialer i den prøve, der er under mistanke for at indeholde den forbindelse, som har interesse. Et yderligere hensyn er den lethed, hvormed det iagttagne signal kan detek-35 teres og tjene til at differentiere mellem koncentrationer i det koncentrationsområde, som har interesse. Andre faktorer DK 167200 B1 2 omfatter den lethed, hvormed reagenserne fremstilles, den nøjagtighed, hvormed prøverne og reagensopløsningerne skal fremstilles og måles, reagensernes lagerstabilitet, det antal trin, der kræves i processen, og den dygtighed og nøjagtig-5 hed, hvormed hvert af trinnene skal udføres. Ved udvikling af et assay, som kan anvendes af utrænet personale såsom assays, der kan anvendes i hjemmet, inden for retsmedicinen, af praktiserende læger eller lignende, bør det iagttagne resultat derfor være minimalt påvirket af variationer i den måde, 10 hvorpå metoden udføres eller tilvejebringe simple teknikker til udførelse af de forskellige trin.

En testindretning til bestemmelse af en egenskab ved en prøve, især til bestemmelse af stoffer i flydende prøver, er beskrevet i USA-patentskrift nr. 4.094.647. En tyndtlagschro-15 matografiindretning og en fremgangsmåde til udførelse af en chromatografitest er beskrevet i USA-patentskrift nr.

4.384.958. Et immunoassay, i hvilket mærket antistof fortrænges fra en immobiliseret analytanalog, er beskrevet i USA-patentskrift nr. 4.434.236. En indretning og en fremgangsmåde 20 til detektion af myoglobin er beskrevet i USA-patentskrift nr. 4.189.304. Teststrimler til analyse af stoffer, som er opløst i væsker, er beskrevet i USA-patentskrift nr.

4.438.067. En mangelaget testindretning til bestemmelse af tilstedeværelsen af en bestanddel af en flydende prøve og en 25 fremgangsmåde til anvendelse af en sådan indretning er beskrevet i USA-patentskrift nr. 4.160.008. En fremgangsmåde til måling af antigen med mærket antigen under anvendelse af uopløseligt antistof er beskrevet i japansk fremlæggelsesskrift nr. 5925/73 (25. januar 1973).

30 En koncentrerende zonemetode til heterogene immunoassays er beskrevet i USA-patentskrift nr. 4.366.241. I USA-patentskrift nr. 4.168.146 beskrives en immunoassayteststrimmel. I USA-patentskrift nr. 3.990.850 og nr. 4.055.394 beskrives diagnostiske testkort. En automatiseret metode til kvanti-35 tativ analyse af biologiske væsker er beskrevet i USA-patent- DK 167200 B1 3 skrift nr. 4.327.073. Et chromogent underlags-immunoassay er beskrevet i international patentansøgning nr. PCT/US83/01887.

En lang række patenter og patentansøgninger udgør en omfattende litteratur om forskellige teknikker til frembringelse 5 af detekterbare signaler i immunoassays. Nedenstående liste skal blot belyse nogle af disse teknikker, der kan anvendes i den foreliggende opfindelse. I det følgende er angivet en liste over USA-patentskrifter og patentansøgninger og en generel angivelse af den anvendte type mærke: 10 USA-Patentskrift nr. 3.646.346, radioaktivt mærke; 3.654.090, 3.791.932 og 3.817,838, enzymmærker; 3.996.345, mærker af fluorescerende stoffer og udslukningsmidler; 4.062.733, radioaktivt mærke; 4.067.959, fluorescens eller enzymmærke; 4.104.029, kemiluminescerende mærke; og 4.160.645, ikke-15 enzymatisk katalysatormærke. Jfr. USA-patentskrift nr.

3.966.879, hvori der beskrives en elektroforetisk teknik, der anvender en antistofzone, og 4.120.945, i hvilket der beskrives et RIA, hvor en mærket analyt indledningsvis bindes til et fast underlag via et antistof. I USA-patentskrift nr.

20 4.233.402 anvendes enzymparmærker; i USA-påtentskrift nr.

4.720.450 anvendes kemisk inducerede fluorescerende mærker; og i USA-patentskrift nr. 4.287.300 anvendes enzymmærker med anionisk ladning.

Fremgangsmåderne og indretningerne ifølge den foreliggende 25 opfindelse er nyttige til bestemmelse af tilstedeværelsen af en analyt i en prøve, der mistænkes for at indeholde analy-ten. Indretningen er en strimmel af et sugende materiale, som er i stand til at blive gennemløbet af en testopløsning ved kapillarbevægelse. Testopløsningen består af prøven og et 30 første medlem af et specifikt par ("stop-medlem"), der er i stand til at binde analyten. Strimmelen indeholder integreret deri et andet sbp-medlem til koncentrering og ikke-spredende binding af det første sbp-medlem på et lille område på strimmelen, som er adskilt fra en endedel af strimmelen, der er 35 indrettet til kontakt med testopløsningen. Generelt binder DK 167200 B1 4 det andet sbp-medlem til et complex, der dannes ud fra bindingen af analyten til det første sbp-medlem. Et detekterbart signal frembringes ved hjælp af et signalfrembringende system. Signalet frembringes i forhold til tilstedeværelsen af 5 analyt i testopløsningen. I én udførelsesform bindes en analog til analyten ikke-spredende til strimmelen i det mindste mellem området og den del af strimmelen, som kommer i kontakt med testopløsningen.

Ved fremgangsmåden bringes en endedel af strimmelen, som er 10 adskilt fra området, i kontakt med testopløsningen, som gennemløber det sugende materiale ved hjælp af kapillarvirkningen. Strimmelen bringes i kontakt med en fremkalderopløsning, som indeholder medlemmer af det signalfrembringende system og derefter med eventuelle resterende medlemmer af det 15 signalfrembringende system, som ikke blev inkorporeret i testopløsningen eller fremkalderopløsningen, eller som ikke indledningsvis var til stede på strimmelen. I det mindste en del af testopløsningen bringes i kontakt med området, før fremkalderopløsningen bringes i kontakt med området. Det 20 signal, som kan detekteres i området, sammenlignes derefter med det signal, der kan detekteres på en del af strimmelen, som er en anden end området, for at bestemme tilstedeværelsen af analyten i testopløsningen.

I en særlig udførelsesform for den foreliggende opfindelse 25 har det signal, som frembringes i det lille område, et skarpkantet distinkt mønster, som danner en skarp kontrast til det signal, som frembringes i dele af strimmelen, som ikke er området, når en analyt er til stede i testopløsningen.

I en anden særlig udførelsesform for den foreliggende opfin-30 delse er det andet sbp-medlem ikke-spredende bundet til et lille område på strimmelen via partikler, som er ikke-spredende bundet til det lille område. Hvis det andet sbp-medlem er i-stand til at binde det første sbp-medlem, når det første sbp-medlem ikke er bundet til analyten, er en analog til ana-35 lyten, som er i stand til at binde det første sbp-medlem, t DK 167200 B1 5 ikke-spredende bundet til strimmelen mellem området og endedelen.

Fremgangsmåden og indretningen ifølge den foreliggende opfindelse er navnlig anvendelige til bestemmelse af flere analy-5 ter i en testopløsning. Tilstedeværelsen eller fraværelsen af én eller flere analyter i testopløsningen kan let bestemmes på en enkelt strimmel. Endvidere giver fremgangsmåden ifølge opfindelsen mulighed for detektion af analyter såsom lægemidler, uden at der kræves sammenligningsmaterialer eller -10 instrumentering.

Som angivet ovenfor angår den foreliggende opfindelse fremgangsmåder og indretninger til bestemmelse af tilstedeværelsen af en analyt i en prøve, som mistænkes for at indeholde analyten. En testopløsning dannes ved i et vandigt medium at 15 kombinere prøven og et første sbp-medlem, som er i stand til at binde analyten. Endedelen af en strimmel af et sugende materiale, som er i stand til at gennemløbes af denne testopløsning ved hjælp af kapillarbevægelse, bringes i kontakt med testopløsningen. Strimmelen indeholder integreret deri et 20 andet sbp-medlem, som er i stand til at binde det complex, der udgøres af analyten og det første sbp-medlem. Det andet sbp-medlem er ikke-spredende bundet i et lille område på strimmelen, som er adskilt fra endedelen. Testopløsningen lades gennemløbe i det mindste en del af strimmelen. Dernæst 25 bringes strimmelen i kontakt med en fremkalderopløsning, som indeholder medlemmer af det signalfrembringende system. Ved fremgangsmåden bringes i det mindste en del af testopløsningen i kontakt med området før kontakt af området med fremkalderopløsningen. Strimmelen bringes derefter om nødvendigt i 30 kontakt med eventuelle resterende medlemmer af det signal-frembringende system, som ikke var inkluderet i testopløsningen eller fremkalderopløsningen eller til stede på strimmelen. Det detekterbare signal i området sammenlignes derefter. med det signal, som kan detekteres i en del af strimme-35 len, som ikke er området. Et signal frembringes i området i forhold til tilstedeværelsen af analyt i testo.pløsningen.

DK 167200 B1 6

Det andet sbp-medlem tilvejebringer et middel til koncentrering og ikke-spredende binding af det første sbp-medlem til strimmelen i området. Det første sbp-medlem er en del af et signalfrembringende system, som giver et detekterbart sig-5 nal i området i forhold til mængden af analyt i prøven. Områdets overfladeareal er væsentligt mindre end strimmelens overfladeareal. Det andet sbp-medlem har den egenskab, at det binder et complex af det første sbp-medlem ved direkte binding til analyten, ved direkte binding til det første sbp-10 medlem, herunder binding til det signalfrembringende mærke, eller ved binding til et sted, som kun findes i complexet.

Hvis det andet sbp-medlem er i stand til at binde det første sbp-medlem direkte og derfor er i stand til at binde det ikke-complexerede første sbp-medlem, bindes en analytanalog, 15 som er i stand til at binde det ikke-complexerede første sbp-medlem, til strimmelen. Analytanalogen er sædvanligvis ikke-spredende bundet til strimmelen i det mindste mellem området og endedelen.

Midlet til frembringelse af et detekterbart signal er sædvan-20 ligvis et signalfrembringende system, der har én bestanddel, som er konjugeret til et sbp-medlem til dannelse af et mærke-sbp-medlemkonjugat. Den mængde mærke, der frembringer det detekterbare signal, er forbundet med mængden af analyt i testopløsningen. Det signalfrembringende system omfatter 25 mærke-sbp-medlemkonjugatet og alle andre reagenser, der kræves til frembringelse af et detekterbart signal i området i forhold til tilstedeværelsen eller mængden af analyt i prøven.

I en særlig udførelsesform for den foreliggende opfindelse er 30 det andet sbp-medlem konjugeret til partikler, som er ikke-spredende bundet til strimmelen i området.

Det lille område kan være et bånd, som løber på tværs af gennemløbsretningen for testopløsningen langs strimmelen. Det signal, som frembringes i det lille område, kan have et 35 skarpkantet distinkt mønster, som giver en skarp kontrast til DK 167200 B1 7 det signal, der frembringes i en del af strimmelen, som ikke er området. Sædvanligvis sammenlignes det signal, som genereres i det lille område, med tilstødende områder på strimmelen.

5 Den foreliggende opfindelse er navnlig anvendelig til bestemmelse af tilstedeværelsen af flere analyter i en testopløsning.

Før den foreliggende opfindelse bliver beskrevet med henblik på specifikke udførelsesformer, vil et antal termer blive 10 defineret.

"Analyt" betegner den forbindelse eller komposition, som skal måles, og som er et medlem af et specifikt bindingspar og kan være en ligand, der er mono- eller polyvalent, sædvanligvis antigen eller haptenisk, en enkelt eller flere forbindelser, 15 der deler mindst ét fælles epitop- eller determinantsted, eller en receptor.

De polyvalente ligandanalyter er sædvanligvis poly(aminosyrer) , dvs. polypeptider og proteiner, polysaccharider, nucleinsyrer og kombinationer deraf. Sådanne kombinationer 20 omfatter bakterier, vira, chromosomer, gener, mitochondrier, kerner, cellemembraner og lignende.

Den præcise karakter af analyterne samt talrige eksempler herpå er beskrevet i USA-patentskrift nr. 4.299.916 i navnet Litman et al., især spalte 16-23, hvortil der henvises.- 25 Analyter, som har interesse, omfatter lægemidler, metaboli-ter, pesticider, forurenende stoffer og lignende.

Blandt de lægemidler, som har interesse, er alkaloiderne. Herunder hører morphinalkaloider, som omfatter morphin, codein, heroin, dextromethorphan og derivater og metaboliter 30 deraf; cocainalkaloider, som omfatter cocain og benzoylecgo-nin og derivater og metaboliter deraf, ergotalkaloider, der DK 167200 B1 8 omfatter lysergsyrediethylamid; steroidalkaloider; iminazoyl-alkaloider; quinazolinalkaloider, isoquinolinalkaloider; quinolinalkaloider, som omfatter quinin og quinidin; diter-penalkaloider og derivater og metaboliter deraf.

5 Den næste gruppe lægemidler omfatter steroider, herunder estrogener, estogener, androgener, andreocorticosteroider, galdesyrer, cardiotoniske glycosider og aglyconer, som omfatter digoxin og digoxigenin, saponiner og sapogeniner og derivater og metaboliter deraf. Steroidmimetiske stoffer 10 såsom diethylstilbestrol er også omfattede.

Den næste gruppe lægemidler er lactamer med 5-6 ringled, hvilke omfatter barbiturater, fx phenobarbital og secobarbital, diphenylhydantonin, primidon, ethosuximid og metaboliter deraf.

15 Den næste gruppe lægemidler er aminoalkylbenzener med alkyl med 2-3 carbonatomer, hvilket omfatter amfetaminer, cate-cholaminer, herunder ephedrin, L-dopa, epinephrin, narcein, papaverin og metaboliter deraf.

Næste gruppe lægemidler er benzheterocycliske forbindelser, 20 herunder oxazepam, chlorpromazin, tegretol, imipramin og derivater og metaboliter deraf, idet de heterocycliske ringe er azepiner, diazepiner og phenothiaziner.

Næste gruppe lægemidler er puriner, herunder theophyllin, caffein og metaboliter og derivater deraf.

25 Næste gruppe lægemidler omfatter sådanne, som er afledt af marihuana, og som omfatter cannabinol og tetrahydrocannabinol.

Næste gruppe lægemidler omfatter vitaminerne såsom A-, B-, fx C-, D-, E- og K-vitamin, folinsyre og thiamin.

DK 167200 B1 9 Næste gruppe lægemidler er prostaglandiner, der er forskellige i graden og stederne af hydroxylering og umætning.

Næste gruppe lægemidler er antibiotika, herunder penicillin, chlormycetin, actinomycetin, tetracyclin, terramycin og 5 metaboliter og derivater deraf.

Næste gruppe lægemidler er nucleosiderne og nucleotiderne, der omfatter ATP, NAD, FMN, adenosin, guanos in, thymidin og cytidin med deres hensigtsmæssige sukker- og phosphatsub-stituenter.

10 Næste gruppe lægemidler er forskellige individuelle lægemidler, herunder methadon, meprobamat, serotonin, meperidin, amitriptylin, nortriptylin, lidocain, procainamid, acetylpro-cainamid, propranolol, griseofulvin, valproinsyre, butyrophe-noner, antihistaminer, anticholinerge lægemidler såsom atro-15 pin og metaboliter og derivater deraf.

Metaboliter, som er forbundet med sygdomstilstande, omfatter spermin, galactose, phenylpyrodruesyre og porphyrin type 1.

Næste gruppe lægemidler er aminoglycosider såsom gentamycin, kanamycin, tobramycin og amikacin.

20 Af pesticider, som har interesse, er polyhalogenerede biphe-nyler, phosphatestere, thiophosphater, carbamater, polyhalogenerede sulfenamider og metaboliter og derivater deraf.

"Medlem af et specifikt bindingspar ("sbp-medlem")" betegner ét af to forskellige molekyler med et areal på overfladen 25 eller i et hulrum, som specifikt binder til og derved er defineret som komplementær med en bestemt rumlig og polær organisation af det andet molekyle. Medlemmerne af det specifikke bindingspar betegnes som ligand og receptor (antiligand).

Disae. vil sædvanligvis være medlemmer af et immunologisk par, 30 selv om andre specifikke bindingspar såsom biotin/avidin, DK 167200 B1 10 hormoner/hormonreceptorer, nucleinsyreduplexer og lignende ikke er immunologiske par.

"Ligand” betegner enhver organisk forbindelse, for hvilken der naturligt findes eller kan fremstilles en receptor.

5 "Receptor ("antiligand")" betegner enhver forbindelse eller komposition, som er i stand til at genkende en bestemt rumlig og polær organisation af et molekyle, fx et epitop- eller determinantsted. Eksempler på receptorer omfatter naturligt forekommende receptorer, fx thyroxinbindingsglobulin, anti-10 stoffer, enzymer, Fab-fragmenter, lectiner, nucleinsyrer, protein A, komplementkomponent Clq og lignende.

"Ligandanalog eller analytanalog" betegner en modificeret ligand eller liganderstatning eller modificeret analyt eller analogerstatning, der kan konkurrere med den analoge ligand 15 eller analyt om en receptor, idet modifikationen tilvejebringer midler til at forbinde en ligandanalog eller analytanalog med et andet molekyle. Ligandanalogen eller analytanalogen adskiller sig sædvanligvis fra liganden eller analyten ved mere end erstatning af hydrogen med en binding, som forbinder 20 ligandanalogen eller analytanalogen med et centrum eller mærke, men dette behøver ikke at være tilfældet. Udtrykket "liganderstatning" eller "analyterstatning" betegner en forbindelse, som er i stand til at binde det første sbp-medlem. Således kan liganderstatningen eller analyterstatnin-25 gen binde til det første sbp-medlem på en måde, som svarer til liganden eller analyten. På den anden side kan erstatningen fx være et antistof, som er rettet mod idiotypen af et antistof for liganden eller analyten.

"Sugende materiale" betegner et porøst materiale med porer på 30 mindst 0,1 μτα, fortrinsvis mindst 1,0 μια, hvilket materiale er i stand til at blive gennemløbet af et vandigt medium som reaktion på kapillærkræfter. Sådanne materialer er sædvanligvis hydrofile eller er i stand til at blive gjort hydrofile og omfatter uorganiske pulvere såsom siliciumdioxid, magne- DK 167200 B1 11 siumsulfat og aluminiumoxid; naturlige polymere materialer, især cellulosematerialer og materialer, som er afledt af cellulose, såsom fiberholdigt papir, fx filterpapir, chroma-tografipapir, etc.; syntetiske eller modificerede naturligt 5 forekommende polymerer såsom nitrocellulose,-celluloseacetat, poly(vinylchlorid), polyacrylamid, tværbundet dextran, agarose, polyacrylat, etc.; enten anvendt i sig selv eller sammen med andre materialer; keramiske materialer og lignende. Det sugende materiale kan være fastgjort til et underlag. På den 10 anden side kan det sugende materiale udgøre sit eget underlag. Det sugende materiale kan være polyfunktionelt eller være i stand til at blive gjort polyfunktionelt for at muliggøre covalent binding af sbp-medlemmer samt for at muliggøre binding af andre forbindelser, som udgør en del af det sig-15 nalfrembringende system.

Binding af sbp-medlemmer til det sugende materiale kan udføres ved velkendte teknikker, som er almindelig tilgængelige i litteraturen, jfr. fx Ichiro Chibata, Immobilized Enzymes, Halsted Press, New York, 1978, og Cuatrecasas, J±. Bio. Chem.

20 245/ 1970, s. 3059.

Det sugende materiale kan være en enkelt struktur såsom et ark, der er skåret i strimler, eller det kan være et partikelf ormigt materiale, der er bundet til et underlag eller en fast overflade, således som det fx findes inden for tyndt-25 lagschromatografi.

Underlaget for det sugende materiale, hvor et underlag er ønskeligt eller nødvendigt, er sædvanligvis vanduopløseligt, ikke-porøst og stift og har sædvanligvis den samme længde og bredde som den sugende strimmel, men kan være større eller 30 mindre. Der kan anvendes en lang række organiske og uorganiske materialer, såvel naturlige som syntetiske, og kombinationer deraf med det forbehold, at underlaget ikke griber forstyrrende ind i strimmelens kapillarvirkning eller binder assaybestanddele uspecifikt eller griber forstyrrende ind i 35 det signalfrembringende system. Eksempler på polymerer omfat- DK 167200 B1 12 ter polyethylen, polypropylen, poly(4-methylbuten), polystyren, polymethacrylat, poly(ethylenterephthalat), nylon, poly-(vinylbutyrat), glas, keramik, metaller og lignende.

"Mærket sbp-medlem" betegner et mærke, fx en katalysator, 5 sædvanligvis et enzym, der er konjugeret til et sbp-medlem, hvilket er et medlem af det signalfrembringende system, sbp-Medlemmet kan binde direkte til analyten eller kan binde indirekte til analyten ved binding til et sbp-medlem, som er komplementært med analyten.

10 Et "mærke" kan være et hvilket som helst molekyle, som er konjugeret til et andet molekyle eller til det sugende underlag, og når der indgår to molekyler, vælges det vilkårligt, hvilket molekyle er mærket. I den foreliggende opfindelse er mærkerne medlem af det signalf rembringende system, som er 15 konjugeret til et sbp-medlem. Mærket kan være isotopt eller ikke-isotopt, fortrinsvis ikke-isotopt. Imidlertid kan et isotopt mærke være foretrukket til opnåelse af stor følsomhed, når der anvendes radioautografiske detektioner med fotografisk film.

20 "Signalfrembringende system": Det signalfrembringende system kan have én eller flere bestanddele, hvoraf mindst én bestanddel er det mærke, som er konjugeret til et sbp-medlem.

Det signalfrembringende system omfatter alle de reagenser, der er nødvendige til at frembringe et måleligt signal. Når 25 det først sbp-medlem ikke er konjugeret til et mærke, er mærket normalt bundet til et sbp-medlem, som er komplementært med det første sbp-medlem, og indgår sædvanligvis som en del af fremkalderen. Andre bestanddele i fremkalderen omfatter substrater, coenzymer, forstærkere, sekundære enzymer, akti-30 vatorer, cofaktorer, inhibitorer, scavengerenzymer, metalioner, specifikke bindingsstoffer, som kræves til binding af signalgenererende stoffer og lignende. Bestanddelene i det signa.lfrembringende system kan være bundet til strimmelen såsom coenzymer, stoffer, der reagerer med enzymatiske pro-35 dukter, andre enzymer og katalysatorer og lignende. Det DK 167200 B1 13 signalfrembringende system afgiver et signal, som er detek-terbart ved eksterne foranstaltninger, sædvanligvis ved måling af elektromagnetisk stråling, ønskeligt ved visuel undersøgelse. For det meste omfatter det signalfrembringende 5 system et chromofort substrat og enzym, hvor chromofore substrater enzymatisk omdannes til farvestoffer, der absorberer lys i det ultraviolette eller synlige område, phos-phorescerende eller fluorescerende stoffer.

Det signalfrembringende system kan omfatte mindst én kata-10 lysator, sædvanligvis mindst ét enzym, og mindst ét substrat og kan omfatte to eller flere katalysatorer og flere substrater og kan omfatte en kombination af enzymer, hvor substratet for ét enzym er produktet af det andet enzym. Det signalfrembringende system virker ved at frembringe et pro-15 dukt, som afgiver et detekterbart signal i det lille område, hvilket signal er forbundet med den mængde katalysator, som er bundet til området, som følge af sbp-medlem-complexdannel-se af det mærkede sbp-medlem.

Det signalfrembringende system forårsager dannelse af en 20 forbindelse, som sædvanligvis er den signalgenererende forbindelse, men i visse tilfælde kan reagere med en anden forbindelse, der er bundet til overfladen, hvorved den signalgenererende forbindelse dannes, forstærkes eller ødelægges. Medens der kan anvendes såvel enzymatiske som ikke-25 enzymatiske katalysatorer, anvendes der sædvanligvis mindst én enzymkatalysator i det signalfrembringende system. I tilfælde af, at der kun er én katalysator til stede, er denne katalysator sædvanligvis konjugeret til et sbp-medlem til binding til området via sbp-medlem-complexdannelse. Ud over 30 katalysatoren skal der være et substrat, som undergår en transformation, hvilket medfører en forandring i et detekterbart signal ved måleoverfladen. Som oftest er det produkt, der er et resultat af den transformation, som katalyseres af det mærkede sbp-medlem, den signalgenererende forbindelse.

DK 167200 B1 14

Der kan anvendes to katalysatorer, enten en kombination af et enzym og en ikke-enzymatisk katalysator eller to enzymer, hvor de to katalysatorer er forbundet ved, at produktet af den ene er substrat for den anden. I dette system behøver der 5 kun at være et substrat, som kan undergå successive forandringer katalyseret af katalysatorerne, hvilket fører til den forbindelse, som indgår i frembringelsen af et detekterbart signal. Som oftest vil der imidlertid være et substrat for det første enzym i serien og en anden forbindelse, der tjener 10 som precursor for den forbindelse, der indgår i frembringelsen af signalet, hvorved der normalt tilvejebringes den forbindelse, som frembringer signalet. Således kan produktet af det første enzym reagere med precursoren for den signalfrem-bringende forbindelse, hvorved der tilvejebringes den signal-15 genererende forbindelse.

Som oftest er de reaktioner, der indgår i processen, hydrolyse- eller redoxreaktioner. I tilfælde af hydrolyse er en derivatiseret farvestofprecursor, som har en enzymatisk labil binding, og et enzym, som katalyserer dens omdannelse til et 20 uopløseligt farvestofprodukt, et eksempel på denne type system. I redoxreaktioner danner et første enzym et essentielt oxiderende substrat, som kræves af det andet enzym, hvor det andet enzym katalyserer reaktionen mellem det oxiderende substrat og en farvestofprecursor.

25 Når der anvendes to enzymer, kan den første enzymatiske reaktion indebære hydrolytisk spaltning eller en redoxreaktion af substratet, hvorved fås et produkt, som er substrat for et andet enzym. Den første situation kan vises ved gluco-se-6-phosphat, der katalytisk hydrolyseres af alkalisk phos-30 phatase til glucose, idet glucose er substrat for glucoseoxi-dase. Den anden situation kan vises ved glucose, der oxideres af glucoseoxidase, hvorved fås hydrogenperoxid, som enzymatisk reagerer med et leucofarvestof til dannelse af en signalgenererende forbindelse.

DK 167200 B1 15

Koblede katalysatorer kan også omfatte et enzym med en ikke-enzymatisk katalysator. Enzymet kan danne en reaktant, som gennemgår en reaktion, som katalyseres af den ikke-enzymati-ske katalysator, eller den ikke-enzymatiske katalysator kan 5 danne et substrat (omfatter coenzymer) for enzymet. En lang række ikke-enzymatiske katalysatorer, som kan anvendes, er beskrevet i USA-patentskrift nr. 4.160.645, der er udstedt den 10. juli 1979, og der henvises til relevante dele deraf.

Forskellige kombinationer af enzymer kan anvendes til dannel-10 se af en signalgenererende forbindelse. Navnlig kan kombinationer af hydrolaser anvendes til dannelse af en uopløselig signalgenererende forbindelse. Alternativt kan kombinationer af hydrolaser og oxidoreduktaser tilvejebringe den signalgenererende forbindelse. Endvidere kan kombinationer af 15 oxidoreduktaser anvendes til dannelse af en uopløselig sig-nalgenererende forbindelse.

Hvad angår kombinationer af enzymer, kan ét enzym være ikke-spredende bundet til strimmelen, medens det andet enzym er konjugeret til et sbp-medlem. Endvidere kan ét eller flere 20 andre medlemmer af det signalfrembringende system være bundet til strimmelen afhængig af det særlige signalfrembringende system, der vælges, eller den bestemte protokol, der følges.

For at få et detekterbart signal er det ønskeligt at tilvejebringe midler til forstærkning af det signal, der frem-25 bringes ved tilstedeværelsen af det mærke, der er bundet til området. Derfor foretrækkes det sædvanligvis, at mærket er en katalysator eller luminescerende forbindelse eller en radioisotop, især en katalysator. Foretrukne katalysatorer er enzymer og coenzymer, som kan frembringe flere signalgenere-30 rende molekyler ud fra et enkelt mærke.

Der anvendes et enzym eller coenzym, som tilvejebringer den ønskede amplifikation ved at danne et produkt, som absorberer lys, fx et farvestof, eller udsender lys ved bestråling, fx et fluorescerende stof. Alternativt kan den katalytiske reak- DK 167200 B1 16 tion føre til direkte lysemission, fx kemiluminescens. Et stort antal enzymer og coenzymer til tilvejebringelse af sådanne produkter er beskrevet i USA-patentskrift nr.

4.275.149, spalte 19-23, og USA-patentskrift nr. 4.318.980, 5 spalte 10-14, hvortil der henvises.

Særlig interessant er anvendelsen af en kombination af enzymer, hvor enzymerne er forbundet ved, at produktet af ét enzym er substrat for det andet enzym. Herved kan der tilvejebringes stabile precursorer for labile substrater, og 10 substratet for et andet enzym kan lagres sammen med et første enzym, uden at der for tidligt indledes en reaktion.

Flere enzymkombinationer er beskrevet i USA-patentskrift nr.

4.275.149, spalte 23-28, hvilke kombinationer kan anvendes i den foreliggende opfindelse. Der henvises til denne referen- 15 ce.

Særlig interessante er enzymer, som indebærer dannelse af hydrogenperoxid og anvendelse af hydrogenperoxidet til oxidering af en farvestofprecursor til et farvestof. Særlige kombinationer omfatter saccharidoxidaser, fx glucose- og 20 galactoseoxidase, eller heterocycliske oxidaser såsom uricase og xanthinoxidase koblet til et enzym, som anvender hydrogenperoxidet til oxidering af en farvestofpercursor, dvs. en peroxidase såsom peberrodsperoxidase, lactoperoxidase eller mikroperoxidase. Yderligere enzymkombinationer kan findes i 25 det materiale, hvortil der er henvist. Når der anvendes et enkelt enzym som mærke, kan andre enzymer finde anvendelse såsom hydrolaser, transferaser og oxidoreduktaser, fortrinsvis hydrolaser såsom alkalinsk phosphatase og B-galactosida-se. Alternativt kan der anvendes luciferaser såsom ildflue-30 luciferase og bakteriel luciferase.

Eksempler på coenzymer, der kan anvendes, omfatter NAD[H], NADP_[.H], pyridoxal-phosphat, FAD[H], FMN[H], etc., sædvanligvis coenzymer, der involverer cycliske reaktioner, se især USA-patentskrift nr. 4.318.980.

DK 167200 B1 17

Produktet af enzymreaktionen vil sædvanligvis være et farvestof eller et fluorescerende stof. Et stort antal eksempler på fluorescerende stoffer er beskrevet i USA-patentskrift nr.

4.275.149, spalte 30-31, hvortil der henvises.

5 ,,Hjælpematerialer,,. Forskellige hjælpematerialer anvendes ofte i assayet ifølge den foreliggende opfindelse. Fx er der normalt puffere til stede i assaymediet samt stabilisatorer.

Ud over disse additiver kan der ofte være inkorporeret yderligere proteiner såsom albuminer eller overfladeaktive mid-10 ler, især ikke-ioniske overfladeaktive midler, bindingsforstærkere, fx polyalkylenglycoler, eller lignende.

"Lille område" betegner et område på strimmelen af sugende materiale, som har et overfladeareal, der er væsentligt mindre end strimmelens overfladeareal. Området kan være et 15 punkt, en linje, en kurve, et bånd, et mønster dannet af punkter, linjer, kurver, bånd, eller kombinationer deraf eller lignende. Generelt er testopløsningens gennemløbsretning på strimmelen tværgående i forhold til området. Det signal, der frembringes i området, har fortrinsvis et skarp-20 kantet distinkt mønster, som giver en skarp kontrast til det signal, der frembringes ved dele af strimmelen, som ikke er området. Fx kan området være en printet afbildning af ét eller flere forkortede navne af analyten eller analyterne i testopløsningen, af et plustegn eller lignende. Området er 25 adskilt fra endedelen af strimmelen, som bringes i kontakt med testopløsningen, i overensstemmelse med koncentreringsprincippet ifølge den foreliggende opfindelse. Stedet bør være i kontakt med en stor del af den opløsning, der strømmer gennem strimmelen, for at give effektiv koncentrering.

30 Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kombineres et første sbp-medlem, der er i stand til at binde til analyten, med en prøve, som mistænkes for at indeholde analyten, hvilket giver en vandig testopløsning. Et andet sbp-medlem, som er i stand til at binde det complex, der dannes efter binding af analy-35 ten til det første sbp-medlem, er ikke-spredende bundet til DK 167200 B1 18 den sugende strimmel ved det lille område. Den ene ende af strimmelen bringes i kontakt med testopløsningen, som gennemløber strimmelen ved hjælp af kapillarvirkning. Den mængde af det første sbp-medlem, der bliver bundet til området via bin-5 ding til det andet sbp-medlem, relateres til mængden af ana-lyt i prøven. Det signalfrembringende system giver kun et detekterbart signal i området, når det første sbp-medlem er bundet, således at tilstedeværelsen af analyten kan bestemmes ved at sammenligne det signal, der kan detekteres i området, 10 med det signal, der kan detekteres i en del af strimmelen, som ikke er området, sædvanligvis en del af strimmelen, som grænser op til området. Det første sbp-medlem binder specifikt til analyten. Det andet sbp-medlem er ikke-spredende bundet i området og er i stand til at binde det første sbp-15 medlem. Binding kan forekomme direkte til et bindingssted på det første sbp-medlem eller indirekte til et bindingssted på analyten, som er bundet til det første sbp-medlem. Binding kan også forekomme i et område, som er karakteristisk for complexet af analyten og det første sbp-medlem, hvilket 20 område ikke er til stede i nogen af bestanddelene alene.

Når binding af det første sbp-medlem til det andet sbp-medlem sker direkte, er det nødvendigt at sørge for fjernelse af frit første sbp- medlem ved at tilvejebringe en analog til analyten ikke-spredende bundet til strimmelen i det mindste 25 mellem området og endedelen. Der vælges normalt et andet sbp-medlem, som tilvejebringer direkte binding til det første sbp-medlem, når analyten har et enkelt bindingssted, fx et lægemiddel, eller når der kun er ét sbp-medlem komplementært med analyten tilgængeligt. Generelt bør den mængde analog-30 analyt, som binder til strimmelen, være tilstrækkelig til at binde hele det første sbp-medlem, når der ikke er analyt til stede i testopløsningen. En sådan analog er sædvanligvis til stede i en overskydende mængde.

Testppløsningens bevægelse langs med strimmelen skyldes 35 kapillaritet. Denne kapillarbevægelse langs med strimmelen får testopløsningen til at blive båret gennem.området. Efter DK 167200 B1 19 at strimmelen er blevet bragt i kontakt med testopløsningen, sørger en fremkalderopløsning fortrinsvis for fortsættelse af den kapillære bevægelse gennem området. I dette tilfælde bringes fremkalderopløsningen i kontakt med den endedel af 5 strimmelen, som blev bragt i kontakt med testopløsningen. Alternativt kan området for at bringe strimmelen i kontakt med fremkalderopløsningen neddyppes i fremkalderopløsningen, efter at endedelen af strimmelen er blevet bragt i kontakt med testopløsningen. Under alle omstændigheder er det ønsket 10 at tilvejebringe en koncentration af det første sbp-medlem i området, før området kommer i kontakt med fremkalderen.

Opløsningsmidlet er sædvanligvis et vandigt medium, som kan indeholde op til 40 vægtprocent andre polære opløsningsmidler, især oxygenerede opløsningsmidler med 1-6, især 1-4 15 carbonatomer, herunder alkoholer, ethere og lignende. Cosol-venterne er sædvanligvis til stede i en mængde af under ca.

20 vægtprocent.

Mediets pH er sædvanligvis i området 4-11, især 5-10, fortrinsvis ca. 6-9. pH-Værdien vælges således, at der oprethol-20 des et væsentligt bindingsaffinitetsniveau af sbp-medlemmerne og optimal signalgenerering ved hjælp af det signalfrembrin-gende system. Der kan anvendes forskellige puffere til at opnå den ønskede pH-værdi og opretholde pH-værdien under assayet. Eksempler på puffere omfatter borat, phosphat, 25 carbonat, tris, barbital og lignende. Den specielle puffer, der anvendes, er ikke kritisk, men i individuelle assays kan én puffer være foretrukket fremfor en anden.

Det er ønskeligt at inkorporere ca, 0,05-0,5 vægtprocent af et ikke- ionisk detergens i prøven. Der kan anvendes for-30 skellige polyoxyalkylenforbindelser på ca. 200-20.000 daltons .

Til udførelse af assayet anvendes normalt moderate og helst i det væsentlige konstante temperaturer. Temperaturerne til assayet og til frembringelse af et detekterbart signal er DK 167200 Bl 20 sædvanligvis i området ca. 4-50°C, især ca. 10-40“C, og vil ofte være omgivelsestemperatur, dvs. ca. 15-25°C.

I den flydende prøve vil den analytkoncentration, som kan analyseres, sædvanligvis variere fra ca. 10-4- til ca. 10-15M, 5 især fra ca. 10-6 til ca. 10-14M. Faktorer såsom koncentrationen af den analyt, som har interesse, og protokollen bestemmer sædvanligvis koncentrationen af de andre reagenser.

Medens koncentrationerne af mange af de forskellige reagenser i prøven og reagensopløsningerne sædvanligvis vil være be-10 stemt af det interessante koncentrationsområde for analyten, er s lutkoncentrationen af hvert af reagenserne sædvanligvis bestemt empirisk for at optimere assayets følsomhed hen over det interessante område. Med visse protokoller kan der anvendes individuelle reagenser i betydeligt overskud uden på 15 ugunstig vis at påvirke assayets følsomhed.

Strimmelens størrelse afhænger af flere hensyn. Hvis kapillarstrømmen hovedsagelig går opad, regulerer strimmelens længde og tykkelse den mængde opløsning, der kan gå gennem området. Overførsel af en stor mængde af første opløsning 20 kræver, at strimmelens væskekapacitet over området er tilstrækkelig til at rumme det ønskede volumen. Hvis strimmelen anvendes til at tilvejebringe en hovedsagelig nedadgående strømning, således at testopløsningen bortledes, er dette volumenbehov ikke påkrævet. Hvis der endvidere tilvejebringes 25 et absorberende materiale, som bringes i kontakt med den ende af strimmelen, der ikke anvendes til kontakt med testopløsningen, elimineres volumenbehovet også. Sædvanligvis er det ønskeligt at overføre et så stort et volumen som muligt gennem området, således at der tilvejebringes den største 30 assayfølsomhed. Andre hensyn såsom tid og tilgængelighed af prøven begrænser imidlertid dette behov. Til strimler med opadgående strømning er væskeretentionsvolumenet over området sædvanligvis større end 20 μΐ, fortrinsvis mindst 50-200 μΐ.

I strimler med nedadgående strømning kan der anvendes et så DK 167200 B1 21 lille retentionsvolumen som 2-20 μΐ, men volumener på 20-200 μΐ er foretrukne.

Strimlernes tykkelse er sædvanligvis ikke større end 20% af bredden, fortrinsvis 1-10%, især 2-5%.

5 For at muliggøre konservering af reagenserne og tage højde for prøver af begrænset størrelse er strimmelens bredde sædvanligvis relativt smal, sædvanligvis mindre end 20 mm, fortrinsvis mindre end 10 mm. Strimmelens bredde er sædvanligvis ikke mindre end ca. 1,0 mm og er sædvanligvis i om-10 rådet ca. 2-12 mm, fortrinsvis ca. 4-8 mm.

Strimmelens længde afhænger af analytkoncentrationen og praktiske hensyn såsom håndteringslethed og antallet af områder på strimmelen og er sædvanligvis ca. 2-40 cm, især ca. 4-25 cm, fortrinsvis ca. 6-20 cm, men kan være af en 15 hvilken som helst praktisk længde. Strimmelens struktur kan variere inden for vide rammer og omfatter fin, mediumfin, medium, mediumgrov og grov. Generelt giver en mindre porestørrelse og et finere materiale en langsom kapillarstrømning og effektiv binding af bindende sbp-medlemmer på strimmelen.

20 Grovere, mere porøse materialer giver en hurtigere gennemstrømning, men bindingseffektiviteten er nedsat. Udvælgelse af materialets porøsitet afhænger af bindingshastigheden af sbp-medlemmerne i et givet assay.

Positionen af det lille område, eller de små områder, når der 25 bestemmes flere analyter, bør afhænge af den foreliggende opfindelses grundprincip. Det ønskes at lade en tilstrækkelig mængde af testopløsningen passere gennem området ved kapillarvirkningen til at koncentrere en tilstrækkelig mængde af analyten i området til frembringelse af et signal, som er 30 detekterbart i forhold til baggrundsstøjen. Det er således ønskeligt at anbringe området tæt ved den ende af strimmelen, som skal bringes i kontakt med testopløsningen, men ikke så tæt, at det kommer i kontakt med hovedparten af opløsningen eller menisken. Området bør helst være mindst .5 mm, fortrins- DK 167200 B1 22 vis mindst 8 mm fra en sådan ende af strimmelen. Det kan være anbragt i en hvilken som helst større afstand fra enden, forudsat at testopløsningen kan passere gennem området ved kapillarvirkning. Området er fortrinsvis ikke større end 5 halvdelen af strimmelens længde fra denne ende. Herved er området "adskilt" fra en sådan endedel. Når der anvendes flere områder, kan områderne være grupperet tæt sammen eller adskilt, men ikke så tæt sammen, at opløsningen af signalet bringes i fare. Som følge heraf bør sådanne områder sædvan-10 ligvis have en indbyrdes afstand på ikke under 1 mm, fortrinsvis mindst 3 mm.

Andre reagenser, der er medlemmer af det signalfrembringende system, kan variere inden for vide rammer i koncentration afhængig af den særlige procedure og deres rolle i signal-15 frembringelsen. Sædvanligvis overstiger det første sbp-medlem ikke 104 gange den interessante maksimumkoncentration for analyten, når analyten har flere bindingssteder, og overstiger ikke 103 gange den interessante maksimumkoncentration, når der anvendes en monovalent analyt. Normalt er det første 20 sbp-medlem ikke under 0,5 gange den interessante minimumkoncentration. Når mærket ikke er bundet direkte til det første sbp-medlem, skal det reagens, som det binder til, binde til det første sbp-medlem og vil være til stede i det mindste i en mængde, som er ækvivalent med den laveste inte-25 ressante koncentration af analyten.

Til udførelse af assayet indebærer processen sædvanligvis, at den prøve, der mistænkes for at indeholde analyten, kombineres med det første sbp-medlem til dannelse af en vandig testopløsning. Prøven kan stamme fra en lang række kilder 30 såsom fysiologiske væsker, fx spyt, blod, serum, plasma, urin, øjenlinsevæske, spinalvæske, etc., kemisk spildevand, husholdningsspildevand, etc.

Endedelen af strimmelen, der sædvanligvis er den ende, som er tættest på området, bringes i kontakt med testopløsningen, 35 sædvanligvis ved neddypning af endedelen i testopløsningen.

DK 167200 B1 23

Befugtning af strimmelen ved kapillarvirkning lades sædvanligvis fortsætte, i det mindste indtil området er vådt. Fortrinsvis er i det mindste halvdelen af strimmelen vædet med testopløsningen. Når der anvendes nedadgående bortledende 5 gennemstrømning, vil hele strimmelen sædvanligvis være våd, og overskydende testopløsning kan lades bortlede gennem strimmelen.

For det meste indgår relativt korte tidsrum til testopløsningens gennemløb af strimmelen. Sædvanligvis løber testop-10 løsningen gennem strimmelen på mindst 30 sekunder og ikke over 1 time, sædvanligvis fra ca. 1 minut til 30 minutter. Fremkaldelse af signalet sker sædvanligvis på fra 30 sekunder til 30 minutter, især på fra 30 sekunder til 5 minutter.

Efter at væsken er løbet gennem i det mindste en del af 15 strimmelen, bringes strimmelen i kontakt med en fremkalderopløsning, der indeholder medlemmer af det signalfrembringen-de system. Dette kan udføres ved neddypning af strimmelen i fremkalderopløsningen, men sædvanligvis bringes kun den ende af strimmelen, der tidligere har været i kontakt med test-20 opløsningen, i kontakt med fremkalderopløsningen. Når testopløsningen indeholder et umærket første sbp-medlem, indeholder fremkalderopløsningen et mærket sbp-medlem, der kan binde til det complex, der dannes mellem det første sbp-medlem og analyten. Efter kontakt af strimmelens endedel med fremkal-25 deropløsningen løber opløsningen gennem strimmelen ved kapillarvirkning i det mindste til det lille område, og fortrinsvis til hele strimmelen er våd.

Når der anvendes et enzym som mærke, forefindes substratet sædvanligvis i et væsentligt overskud, således at hastigheden 30 ikke begrænses (større koncentration end Km). Fremkalderop-løsningen er sædvanligvis hensigtsmæssigt pufret for enzymsystemet .

Efter at strimmelen er bragt i kontakt med fremkalderopløsningen, bringes strimmelen i kontakt med eventuelle resteren- DK 167200 B1 24 de medlemmer af det signalfrembringende system, som ikke er til stede i fremkalder- eller testopløsningerne eller på strimmelen. Der lades gå et tilstrækkeligt tidsrum før måling af signalet til at danne en mængde af en signalfrembringende 5 forbindelse, der er nødvendig for at afgrænse den region i området, hvor analyten er bundet. Når det detekterbare signal er blevet frembragt, vides det, om analyten eller analyterne er til stede eller ikke er til stede i prøven.

Ligandanalyterne er karakteriseret ved at have enkelte bin-10 dingssteder (monovalente) eller flere bindingssteder (poly-valente), medens receptoranalyterne også kan have ét eller flere bindingssteder. De polyvalente analyter er sædvanligvis poly(aminosyrer), dvs. polypeptider og proteiner, polysaccha-rider, nucleinsyrer og kombinationer deraf, sådanne kombina-15 tioner eller ansamlinger omfatter bakterier, vira, chromoso-mer, gener, mitochondrier, kerner, cellemembraner og lignende .

Som oftest har de polyvalente ligandanalyter en molekylvægt på mindst ca. 5.000, især mindst ca. 10.000. Inden for poly-20 (aminosyre)-gruppen har de poly(aminosyrer), som har interesse, sædvanligvis en molekylvægt på ca. 5.000-5.000.000, især ca. 20.000-1.000.000, og de hormoner, som har interesse, har sædvanligvis en molekylvægt på ca. 5.000-60.000.

En omfattende liste over nyttige ligander findes i USA-pa-25 tentskrift nr. 4.275.149, spalte 12-17, hvortil der henvises.

De monovalente ligandanalyter har sædvanligvis en molekylvægt på ca. 100-2.000, især ca. 125-1.000. Interessante analyter omfatter lægemidler, hormoner, metaboliter, pesticider, forurenende stoffer og lignende.

30 Et stort antal interessante analyter er angivet i USA-patent-skrift nr. 4.275.149, spalte 17 og 18, hvortil der henvises.

DK 167200 B1 25

Receptoranalyter har sædvanligvis en molekylvægt på fra ca.

104 til 2 x 108, sædvanligvis fra ca. 3 x 104 til 2 x 106. Immunglobuliner, fx IgA, IgD, IgE, IgG og IgM, har sædvanligvis en molekylvægt på fra ca. 160.000 til ca. 106. Enzymer 5 varierer sædvanligvis fra ca. 10.000 til 600;000 daltons.

Naturlige receptorer varierer inden for et bredt område, idet de sædvanligvis har en molekylvægt på mindst ca. 25.000 og op til 106 eller mere, herunder sådanne materialer som avidin, thyroxinbindingsglobulin, thyroxinbindingspræalbumin, trans-10 cortin, membranoverfladeproteiner, etc.

Når en ligand er konjugeret til et andet molekyle eller et underlag, er liganden ofte modificeret for at tilvejebringe en bestemt funktionel gruppe på et bestemt sted. Denne modifikation frembringer et produkt, som betegnes en ligandana-15 log. I USA-patentskrift nr. 4.275.149 er der også en omfattende beskrivelse af ligandanaloge i spalte 18 og 19, hvortil der henvises.

Strimmelen kan være belagt med en lang række materialer, der giver forbedrede egenskaber. Belægninger kan omfatte protein-20 belægninger, polysaccharidbelægninger, syntetiske polymerer, sukkere eller lignende, der navnlig anvendes for at forøge stabiliteten af de materialer, som er konjugeret til underlaget. Disse forbindelser kan også anvendes til forbedret binding af materialerne såsom sbp-medlemmet eller det signal-25 frembringende systemmedlem, som er bundet til strimmelen.

Strimmelen eller området kan aktiveres med reaktive funk-tionaliteter for at tilvejebringe covalent binding af de organiske materialer, der skal konjugeres til strimmelen, såsom de materialer, der er beskrevet i USA-patentskrift nr.

30 4.168.146.

Den mængde sbp-medlem, der er bundet til strimmelen i området,--.varierer afhængigt af den mængde, der kræves til binding af hele det mærkede sbp-medlem. Generelt er mængden af sbp-medlem i området i det mindste ækvivalent med den mængde ana- DK 167200 B1 26 lyt, der strømmer gennem området, og kan overstige mængden af analyt med 10.000 gange eller mere.

Det andet sbp-medlem, analytanalogen og, om ønsket, medlemmer af det signalfrembringende system kan være bundet til strim-5 melen ved adsorption snarere end covalent binding, så længe bindingen er ikke-spredende. Dette indebærer, at det sugende underlag bringes i kontakt med en opløsning, som indeholder de materialer, der skal bindes til strimmelen, og strimmelen lades tørre. Generelt er denne procedure kun anvendelig, når 10 det sugende underlag er relativt hydrofobt eller har en høj overfladeladning, og efterfølgende behandling med proteiner, detergenter, polysaccharider eller andre materialer, der er i stand til at blokere uspecifikke bindingssteder, er nødvendig.

15 I en foretrukken udførelsesform for opfindelsen kan det første sbp-medlem være ikke-spredende bundet til partikler eller kugler. Partiklerne eller kuglerne kan derefter påføres på strimmelen i området. Sædvanligvis vil partiklerne have midler til specifik binding af et mærket sbp-medlem eller et 20 mærke uden nogen væsentlig uspecifik interaktion. Arten af partiklerne eller kuglerne kan variere inden for vide rammer, og de kan være naturligt forekommende eller syntetiske. Materialerne er kommercielt tilgængelige, eller kommercielt tilgængelige materialer kan modificeres. Eksempler på sådanne 25 partikler eller kugler er latexpartikler fremstillet af polystyren, polyacrylater, polyacrylamid, der er tilgængeligt som Biogel-pi, eller naturligt forekommende materialer såsom polysaccharider, især tværbundne polysaccharider såsom agarose, der er tilgængeligt som Sepharosei, dextran, der er 30 tilgængeligt som Sephadexi, mikrokrystallinsk cellulose, stivelse og lignende. Andre materialer omfatter polyacrylamider, polystyren, polyvinylalkohol, copolymerer af hydroxy-ethylmethacrylat og methylmethacrylat, siliconer, glasser, der _er tilgængelige som Bioglasi, diatoméjord, siliciumdioxid 35 og lignende. Hovedkravet er, at materialerne ikke bidrager med et signal, sædvanligvis lysabsorption, som ville bevirke, DK 167200 B1 27 at stedet har et andet signal end andre dele af strimmelen før kontakt med det signalfrembringende system.

Partiklerne skal kunne fastgøres ikke-spredende til et sbp-medlem, hvor fastgørelsen kan opnås ved covalent eller ikke-5 covalent binding. Når sbp-medlemmet er covalent bundet, bør partiklerne være polyfunktionelle eller i stand til at blive polyfunktionaliseret. En lang række funktionelle grupper er tilgængelige eller kan inkorporeres. Funktionelle grupper omfatter carboxylsyrer, aldehyder, aminer, amider, aktiverede 10 ethylener såsom maleimid, hydroxyler, sulfonsyrer, mercapta-ner og lignende. Den måde, hvorpå en lang række forbindelser forbindes med de forskellige partikler, er velkendt og omfattende eksemplificeret i litteraturen, jfr. fx Cautrecases, J. Biol. Chem. 245. 1970, s. 3059.

15 Længden af forbindelsesgrupperne varierer inden for et bredt område afhængig af arten af den forbindelse, der forbindes, virkningen af afstanden mellem mærket og partiklen på mærkets egenskaber, muligheden for tværbinding af mærkerne og lignende.

20 Partiklerne bør ikke vandre i noget væsentligt omfang. Partiklernes størrelse kan variere, men skal være af en størrelse, så de kan infiltrere porerne i det sugende materiale og blive indlejret eller ikke-spredende bundet deri. Således er partiklerne sædvanligvis en lille smule større end minimum-25 størrelsen af porerne i det sugende materiale og mindre end den maksimale porestørrelse. Partiklernes størrelse er sædvanligvis i området ca. 0,1-50 /zm, især ca. 0,4-10 /zm, fortrinsvis større end 0,5 /zm.

Partikler med et ikke-spredende bundet sbp-medlem kan anven-30 des til ikke-spredende at binde sbp-medlemmet til strimmelen i et lille område med skarpt afgrænsede kanter. Der kan anvendes flere metoder. Sædvanligvis påføres en suspension af partiklerne i en væske, der ofte er vandig, på strimmelen. Påføringen kan foregå ved en hvilken som helst standardtryk- DK 167200 B1 28 ningsproces, herunder anvendelse af elektrostatiske og laserdrevne strålerør, og en trykprobe eller skrifttyper. Endvidere kan partiklerne påføres ved hjælp af en skabelon. Formen af området kan defineres ved hjælp af et udskåret mønster, 5 hvorigennem partiklerne kan absorberes ind i -den sugende strimmel. Alternativt kan suspensionen overføres til strimmelen ved indprentning med en pen eller et mikrokapillarrør.

Når der anvendes tørre partikler, kan de påføres ved at rette en stråle af en suspension af partiklerne i en gas, sædvan-10 ligvis luft, mod det ønskede område. I hvert tilfælde, især når der ikke anvendes trykkeriteknikker, vil det ofte være ønskeligt at sørge for reduceret tryk på den side af strimmelen, som er modsat den side, der anvendes til påføring af partiklerne. Trykreduktion tilvejebringes hensigtsmæssigt ved 15 at anbringe et ark af det sugende materiale på et filter eller en porøs plade, der dækker et vakuumkammer. Suspensionen påføres derefter, medens luft trækkes gennem materialet. Uanset metoden til påføring af partiklerne er det sædvanligvis foretrukket at vaske området fri for ubundne partik-20 ler, efter at de er blevet påført.

Den væske, der anvendes til suspension af partiklerne, er sædvanligvis vandig og må ikke opløse partiklerne eller skade eller frigive det bundne sbp-medlem. Der kan tilsættes fortykningsmidler og overfladeaktive midler for at begrænse 25 kapillargennemstrømningen og tilvejebringe skarpt afgrænsede kanter. Fortykningsmidler kan omfatte polyvinylalkohol, polypyrrolidon, dextran, glycerol og lignende. Overfladeaktive midler kan være ioniske, sædvanligvis anioniske, eller ikke-ioniske.

30 En række udførelsesformer for den foreliggende opfindelse er i det følgende beskrevet i detaljer. I én udførelsesform er analyten i prøven polyvalent. Et andet sbp-medlem, der genkender et determinantsted på analyten, er ikke-spredende bundet i et lille område på strimmelen af sugende materiale.

35 Den ikke-spredende binding kan udføres ved en hvilken som helst af de metoder, som er beskrevet ovenfor.. En testopløs- DK 167200 B1 29 ning med et volumen, der er omtrent lig med strimmelens væskekapacitet, fremstilles ved at kombinere den prøve, der mistænkes for at indeholde analyten, og et mærket første sbp-medlem, idet dette sbp-medlem binder til et determinantsted 5 på analyten til dannelse af et complex. Den endedel af den sugende strimmel, som er nærmest området, bringes i kontakt med testopløsningen, som lades gennemløbe den sugende strimmel ved kapillarvirkning. Testopløsningen bevæger sig langs strimmelen og gennem området, indtil hele strimmelen er våd, 10 eller indtil der ikke er mere testopløsning. Complexet af analyten og det mærkede første sbp-medlem binder til det andet sbp-medlem i området, hvorved det mærkede første sbp-medlem koncentreres i området. Efter at testopløsningen har gennemløbet den sugende strimmel, bringes strimmelen i kon-15 takt med en fremkalderopløsning, der indeholder de resterende medlemmer af det signalfrembringende system, hvoraf mærket er ét medlem. Hvis analyten er til stede i testopløsningen, vil der frembringes et signal i det lille område. Dette signal kan adskilles fra signaler, som genereres ved siden af områ-20 det.

I en variant af den ovenfor beskrevne udførelsesform er testopløsningens rumfang tilstrækkeligt til, at gennemløb deraf muliggøres i kun en del af strimmelen, således at væskekapaciteten i den tørre del af strimmelen er mindst lige 25 så stor som væskekapaciteten af delen fra endedelen gennem det lille område. Endedelen af strimmelen, der forinden er blevet bragt i kontakt med testopløsningen, bringes derefter i kontakt med fremkalderopløsningen. Fremkalderopløsningen bevæger sig langs med strimmelen gennem det lille område ved 30 kapillarvirkning. Herved får fremkalderopløsningen resten af testopløsningen til at bevæge sig gennem det lille område.

Hvis der er analyt til stede i testopløsningen, genereres et signal.

I en_anden variant af den ovenfor beskrevne udførelsesform er 35 det første sbp-medlem ikke mærket. Assayet udføres på samme måde, men et mærket sbp-medlem, som er komplementært med det DK 167200 B1 30 første sbp-medlem, er inkorporeret i fremkalderen. Når der er analyt til stede, binder det første sbp-medlem til området og forårsager derved binding af det mærkede sbp-medlem til området. I denne udførelsesform foretrækkes det ofte at udelade 5 nogle medlemmer af det signalfrembringende system fra fremkalderen og bringe strimmelen i kontakt med en opløsning, der indeholder disse udeladte, dvs. resterende, medlemmer efter kontakt med fremkalderen.

I ovennævnte udførelsesform kan der bestemmes flere polyva-10 lente analyter. Til dette formål anvendes flere områder, som er adskilte fra endedelen. I ét område er et andet sbp-medlem, som genkender et determinantsted på en første analyt, ikke-spredende bundet til den sugende strimmel. I et andet område er et andet sbp-medlem, som genkender et determinant-15 sted på en anden analyt, ikke-spredende bundet. Dette gentager sig, indtil der er et lille område for hver af de analyter, som man ønsker at teste for. Den prøve, som skal analyseres, kombineres derefter i et hensigtsmæssigt vandigt medium med flere mærkede første sbp-medlemmer til dannelse af 20 testopløsning. Et mærket første sbp-medlem indeholder et sbp-medlem, der genkender et determinantsted på den første analyt, hvilket sted er forskelligt fra det determinant s sted, der genkendes af det andet sbp-medlem på den sugende strimmel, som binder til den første analyt. Et andet mærket første 25 sbp-medlem indeholder et sbp-medlem, der genkender et determinantsted på den anden analyt, der er forskelligt fra det determinantsted, der genkendes af det andet sbp-medlem på den sugende strimmel, som binder til den anden analyt. Antallet af mærkede sbp-medlemmer svarer til antallet af analyter, som 30 man ønsker at teste for. Hvis den eller de analyter, som der testes for, er til stede i prøven, dannes der et complex af hver respektiv analyt med dens tilsvarende mærkede første sbp-medlem. Hvis analyten ikke er til stede, dannes der ikke noget sådant complex. Endedelen af den sugende strimmel 35 bringes i kontakt med testopløsningen, som lades gennemløbe strimmelen. Eventuelle complexer af analyt og mærket sbp-medlem binder til de respektive områder på strimmelen. Hvis DK 167200 B1 31 der ikke er analyt til stede, dannes der ikke noget complex, og derfor bliver det mærkede første sbp-medlem, som svarer til den pågældende analyt, ikke bundet til området, og der vil ikke frembringes noget signal. Efter at testopløsningen 5 har gennemløbet den sugende strimmel, bringes strimmelen i kontakt med de relevante medlemmer af de anvendte signal-frembringende systemer. Assayet kan udformes således, at der anvendes en enkelt fremkalder til alle analyterne, som det ønskes at teste for. Hvis den bestemte analyt er til stede i 10 prøven, vil der frembringes et signal i det relevante område.

I en særlig foretrukken variant af denne fremgangsmåde mærkes de første sbp- medlemmer ikke, og fremkalderen indeholder et mærket sbp-medlem, som er komplementært med de første sbp-medlemmer. Strimmelen bringes i kontakt med de resterende 15 medlemmer af det signalfrembringende system efter kontakt med fremkalderen.

I en anden udførelsesform for opfindelsen er analyten et monovalent lægemiddel. Den prøve, der mistænkes for at indeholde lægemidlet, blandes med et mærket første sbp-medlem i 20 et hensigtsmæssigt medium til dannelse af en vandig testopløsning. Det mærkede første sbp-medlem binder til lægemidlet. Den sugende strimmel indeholder et andet sbp-medlem i det lille område, hvilket sbp-medlem genkender et determinantsted på det mærkede første sbp-medlem, som er forskelligt fra det 25 determinantsted, som indgår i bindingen af det mærkede sbp-medlem til lægemidlet. Fx kan det andet sbp-medlem genkende et determinantsted på mærkedelen af det mærkede første sbp-medlem eller på sbp-medlemsdelen. I denne særlige udførelsesform skal en analyt- eller lægemiddelanalog være bundet til 30 strimmelen i en mængde, som i det mindste er tilstrækkelig til at binde hele det mærkede sbp-medlem, når der ikke er noget lægemiddel i den testede prøve. Sædvanligvis er denne analytanalog et derivat af det lægemiddel, der testes for, og er bundet til strimmelen i et betydeligt overskud i det 35 mindste mellem endedelen af strimmelen og området. Selv om det foretrækkes, at denne lægemiddelanalog er et derivat af lægemidlet, kan der anvendes andre lægemiddelanaloge som fx DK 167200 B1 32 et antistof, der er rettet mod idiotypen af et antistof for lægemidlet. Når prøven og det mærkede første sbp-medlem blandes sammen til dannelse af testopløsningen, og der er lægemiddel til stede i prøven, dannes der et complex mellem læge-5 midlet og det mærkede første sbp-medlem. Dette complex af lægemiddel og mærket første sbp-medlem bevæger sig langs den sugende strimmel, indtil det når det område, hvortil det bliver bundet som følge af binding med et andet sbp-medlem, der er specifikt for det mærkede, første sbp-medlem, i områ-10 det. Hvis der ikke er lægemiddel til stede i prøven, dannes der ikke noget complex mellem lægemidlet og det mærkede første sbp-medlem. Når testopløsningen bringes i kontakt med endedelen af den sugende strimmel, binder det mærkede første sbp-medlem, der ikke complexes med lægemidlet, til lægemid-15 delanalogen, der er ikke-spredende bundet til strimmelen. Eftersom denne lægemiddelanalog er til stede i et overskud, når det ucomplexede mærkede sbp-medlem ikke det lille område. Ved den efterfølgende fremkaldelse af teststrimmelen vil tilstedeværelsen af lægemiddel i prøven være vist ved frem-20 bringeisen af et signal i det lille område.

I den sidstnævnte udførelsesform for monovalente lægemidler kan man også analysere en testopløsning for flere lægemidler.

I dette tilfælde fremstilles testopløsningen ved sammenblanding i et hensigtsmæssigt flydende medium af prøven og flere 25 mærkede første sbp-medlemmer svarende til antallet af analy-ter, for hvilke man ønsker at teste. Hvis det kun ønskes at vide, om ét af lægemidlerne er til stede, indeholder den sugende strimmel et område, som er identisk med det område, som er beskrevet ovenfor for et enkelt lægemiddel. Det er 30 imidlertid nødvendigt at inkorporere lægemiddelanaloge på strimmelen svarende til hvert af de lægemidler, for hvilke der testes. Hvis det er nødvendigt at vide, hvilke lægemidler der er til stede, indeholder strimmelen et separat område for hvert lægemiddel, i hvilket område der er bundet et andet 35 sbp-medlem, som specifikt binder til et determinantsted, der er karakteristisk for det mærkede første sbp-medlem svarende til det pågældende lægemiddel. Et karakteristisk determinant- DK 167200 B1 33 sted tilvejebringes fortrinsvis ved at fastgøre en hapten til det mærkede første sbp-medlem og anvende et antistof for haptenen som det andet sbp-medlem.

For nemheds skyld kan indretningen ifølge den foreliggende 5 opfindelse tilvejebringes i et kit i en pakket kombination med forudbestemte mængder af reagenser til anvendelse til analyse for en analyt. Når der anvendes et enzym som mærke, omfatter reagenserne et enzymmærket første sbp-medlem, substrat for enzymet eller precursorer derfor, herunder eventu-10 elle yderligere substrater, enzymer og cofaktorer og en hvilken som helst reaktionspartner for det enzymatiske produkt, som kræves til tilvejebringelse af den detekterbare chromofor eller fluorophor. Endvidere kan der inkorporeres andre tilsætningsstoffer såsom hjælpereagenser, fx stabilisa-15 torer, puffere og lignende. De relative mængder af de forskellige reagenser kan variere inden for vide rammer, således at der tilvejebringes koncentrationer af reagenserne i opløsningen, hvilke koncentrationer i det væsentlige optimerer assayets følsomhed. Reagenserne kan tilvejebringes som tørre 20 pulvere, sædvanligvis lyofiliserede, herunder excipienser, der ved opløsning giver en reagensopløsning med de relevante koncentrationer til udførelse af assayet.

Opfindelsen belyses nærmere ved nedenstående eksempler. Forinden er følgende termer definerede.

25 PBS: phosphatpufret saltopløsning DMF: dimethylf ormamid BSA: bovint serumalbumin HCG: humant choriongonadotropin HRP: peberrodsperoxidase 30 P04: mono- og dibasisk phosphat, natrium salt EDTA: ethy lendiamintetraeddikesyre SAMSA.: S-acetyl-mercapto-ravsyreanhydrid smcc : succinimidyl-4- (N-maleimidomethyl) cyc- 35 lohexan-l-carboxylat DK 167200 B1 34

Phosphatpuffer: 10 mM P04/ pH = 7,40 PBS: 10 mM P04, pH = 7,40 150 mM NaCl

Puffer A: 10 mM P04, pH = 7,40 5 * 150 mM NaCl

0,1% BSA

0,05% Tweeni -20 (Sigma Chemical Co.)

Konjugatpuffer: 100 mM P04, pH = 7,40 150 mM NaCl

10 0,1% BSA

0,05% Tweeni -20

Fremkalderpuffer: 10 mM P04, pH = 7,00

20 mM NaCl 0,1% BSA

15 0,005% Tritoni QS -44 (Sigma Chemical

Co.) 200 μg/ml 4-chlor-l-naphthol 1 mM H202

Carbonatpuffer: 50 mM Na2C03, pH = 9,50 20 P04 - NaCl - EDTA-puffer: 100 mM NaP04, pH = 7,50

100 mM NaCl 5 mM EDTA

Søjlepuffer: 100 mM Na3P04, pH = 7,00 25 200 mM NaCl 0,02% NaN3 EKSEMPEL 1 35 DK 167200 B1

Fremstilling af et konjugat af HRP og HCG-antistof Fremstilling af HRP-SAMSA

60 mg HRP (type VI, Sigma Chemical Co.) blev opløst i 2 ml 5 carbonatpuffer og dialyseret til fjernelse af kontaminanter.

SAMSA (Sigma Chemical Co.) blev gjort 100 mM i tørt DMF.

30 mg HRP blev omsat med et 12 ganges molært overskud af SAMSA i 1 time. Produktet blev oprenset fra frit SAMSA under anvendelse af en lille Sephadexi G-25-søjle ækvilibreret med 10 P04-NaCl-EDTA-puffer.

Til dannelse af frie -SH-grupper fra SAMSA blev ovennævnte produkt inkuberet med 1/10 volumen 1M NH2OH i PBS under omrøring under argon-gas i 1 time. Det resulterende produkt blev oprenset på en anden Sephadexi G-25-søjle og anvendt med 15 det samme.

Fremstilling af antistof-SMCC

Monoklonalt antistof for β-underenheden af HCG blev fremstillet i henhold til den af Kohier et al., Nature 265. 1975, s. 495-497 beskrevne metode.

20 Antistoffet (4-5 mg/ml) blev dialyseret mod P04-NaCl-EDTA-puffer til fjernelse af kontaminanter. Efter dialyse blev 8 mg antistof omsat med et 25 ganges molært overskud af SMCC (Pierce Chemical Co.) i 2 timer ved stuetemperatur og under omrøring. SMCC blev frisk fremstillet som en 100 mM opløsning 25 i tørt DMF.

Produktet blev oprenset på en lille Sehapdexi G-25-søjle og anvendt med det samme. Søjlen blev ækvilibreret med P04-NaCl-EDTA-puffer.

DK 167200 B1 36

Konjugation af HRP-SAMSA og antistof-SMCC

Antistof-SMCC og et 12 ganges molært overskud af HRP-SAMSA blev kombineret og lodes reagere ved stuetemperatur i 4 timer under omrøring. Reaktionen blev standset medl mM β-mercapto-5 ethanol efterfulgt 15 minutter senere af 2 mM N-ethylmale-imid.

Oprensning

Det ovennævnte konjugat blev adskilt fra frit antistof og HRP ved størrelseseksklusionschromatografi på en Sephacryli S-10 300-søjle ækvilibreret med søjlepuffer.

Fremstilling af antistofbundne kugler

Polybead-car boxy lat mikrokugler med en diameter på 3,92 μιη i en 2,5%'s suspension fra Polysciences, katalog nr. 9850, blev anvendt. 400 μΐ kugler (10 mg) blev vasket med phosphatpuffer 15 og suspenderet i 5 ml af en 2 mg/ml opløsning af et monoklo-nalt antistof i phosphatpuffer, hvilket antistof var fremstillet i overensstemmelse med kendte teknikker (Kohier et al., supra). Dette monoklonale antistof genkender kun 0-underenheden af HCG.

20 Kuglerne blev inkuberet ved stuetemperatur natten over i antistofopløsningen under omrøring for at holde kuglerne suspenderet. Kuglerne blev derefter centrifugeret, antistof-opløsningen blev fradekanteret, og kuglerne blev vasket med 5 ml hver af phosphatpuffer, PBS og puffer A.

25 Efter vask med puffer A blev kuglerne suspenderet i 5 ml PBS + 10 mg/ml BSA (for at blokere enhver uspecifik binding) og blandet i 1 time ved stuetemperatur.

Derefter blev kuglerne centrifugeret og derefter resuspen-deret i 400 μΐ puffer A.

DK 167200 B1 37

Fremstilling af testindretning

Der anvendtes Whatman 31 ET-papir, der var blevet belagt med et protein (polyklonalt anti-theophyllin). Papiret blev skåret i strimler med en bredde på 6 mm og en længde på 9 eller 5 18 cm afhængig af assayproceduren. Papirstrimlerne blev an bragt på en glasfrittefilterholder med en diameter på 4,5 cm. Der påførtes vakuum, og strimlerne blev fugtet med destilleret vand.

10 μΐ af suspensionen af antistofbundne kugler, der var frem-10 stillet som beskrevet ovenfor (indeholdende 250 μg kugler), blev absorberet i papiret ved at trække et 5 μΐ kapillarrør fyldt med de antistofbundne kugler hen over strimmelens overflade to gange. Kuglerne blev derefter vasket ind i papiret med 1 ml puffer A. Strimlerne blev tørret i vakuum.

15 Assay A. 100 μΐ HCG-opløsning (20 ng/ml i puffer A eller i urin) blev blandet med 100 μΐ HRP-HCG-antistofkonjugatopløsning (1/1000 fortyndet i konjugatpuffer). En 2 mm's portion af en testindretning (med en længde på 9 cm) blev neddyppet i 20 ovennævnte blanding, der lodes gennemløbe testindretningen, indtil mediefronten nåede toppen af testindretningen. Testindretningen blev derefter nedsænket i 9 ml fremkalderpuffer i 10 minutter og blev derefter fjernet. Der dannedes et tyndt bånd af blågrå farve tværs over testindretningen, hvor de 25 antistofbundne kugler var anbragt.

Som kontrol blev ovennævnte fremgangsmåde gentaget med undtagelse af, at der anvendtes 100 μΐ puffer A i stedet for 100 μΐ HCG-opløsning. Der viste sig ikke noget farvet bånd på testindretningen, eftersom der ikke var noget HCG til stede i 30 testopløsningen.

B. 100 μΐ af HCG-opløsningen blev blandet med 100 μΐ HRP-HCG-antistofkonjugatopløsning. En 2 mm's portion af en testind- DK 167200 B1 38 retning (med en længde på 18 cm) blev neddyppet i ovennævnte blanding, som gennemløb testindretningen, indtil blandingen var opbrugt (efter ca. 10 minutter) . En 2 mm's portion af samme testindretning blev yderligere neddyppet i 200 μΐ frem-5 kalderpuffer, som lodes gennemløbe testindretningen i ca. 20 minutter mere. Der dannedes et tyndt bånd af blågrå farve hen over testindretningen, hvor de antistofbundne kugler befandt sig.

Som kontrol blev ovennævnte fremgangsmåde gentaget med undta-10 gelse af, at der anvendtes 100 μΐ puffer A i stedet for 100 μΐ HCG-opløsning. Der viste sig ikke noget farvet bånd på testindretningen, eftersom der ikke var noget HCG til stede i testopløsningen.

EKSEMPEL 2 15 A. Fremstilling af THC-belagt papir CDI-Belagt Whatman 31ET-papir blev befugtet med en opløsning af 0,2% Et3N-THF og derefter neddyppet i en 5 mg/100 ml's opløsning af amidet af ll-nor-E9-THC-9-carboxylsyre (THC = tetrahydrocannabinol) og 2,21-oxybis(ethylamin) i 0,2% Et3N-20 THF natten over i en lukket reaktionsbeholder. Uomsatte CDI-steder blev blokeret med 0,4% ethanolamin i THF, og papiret blev derefter grundigt vasket med methanol for at fjerne uomsat THC. Papirerne blev tørret, belagt med 50 mM PBS indeholdende 1 mg/ml ovalbumin, 0,25% cholat og tørret før 25 anvendelse i assayet.

B. Konjugation af HRP til anti-THC-monoklonalt antistof Trin 1: Antistofoprensning

Mono^lonalt antistof over for THC blev fremstillet ved den af Kohier et al., Nature 265. 1975, s. 495-497 beskrevne metode 30 og oprenset ved chromatografi på en protein A-.søjle.

DK 167200 B1 39

Trin 2: Fremstilling af maleimideret antistof 1. Antistof blev dialyseret natten over ved 4°C i en puffer bestående af 10 mM P04, 150 mM NaCl, pH 7,0 (uden azid).

2. Der blev fremstillet en frisk opløsning af 0,05 M SMCC i 5 tørt DMF.

3. Antistof blev ækvilibreret til stuetemperatur.

4. SMCC sattes til antistof i et molforhold på 25:1, og blandingen blev hvirvelblandet, forseglet og inkuberet ved 30°C i 2 timer.

10 5. Overskydende SMCC blev fjernet ved dialyse.

Trin 3: Thioleret HRP (DTP-HRP) (DTP = dithiopyridyl) 1. HRP blev dialyseret mod 10 mM PO4/150 mM NaCl, pH 7,5, natten over ved 4°C og ækvilibreret til stuetemperatur.

2. Der blev fremstillet en frisk opløsning af 20 mM SPDP i 15 ethanol (SPDP = N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat). SPDP sattes derefter til HRP i et molforhold på 3,5:1, omrørt i kort tid for at blande, forseglet med parafilm og inkuberet i 30 minutter ved stuetemperatur.

3. Overskydende SPDP blev fjernet ved at anbringe prøven på 20 en Sephacryli S-300-søjle ækvilibreret med 10 mM P04/150 mM

NaCl, pH 7,0, hvorefter prøven blev dialyseret natten over ved 4°C mod P04/NaCl-puffer, pH 7,0 (lagres ved 4°C).

Trin 4: Aktivering af thioler på HRP-DTP

1. En tilstrækkelig mængde HRP-DTP blev delt i alikvoter til 25 tilvejebringelse af i det mindste et 15 ganges overskud i forhold til den genererede mængde IgG-Mal.

DK 167200 B1 40 2. Frisk 1M DTT (dithiothreitol) blev fremstillet i 10 mM P04/150 mM NaCl, pH 7,0.

3. 25 μΐ DTT tilsattes pr. ml HRP-DTP til en s lutkoncentration på 25 mM DTT, og reaktionen blev udført-ved stuetempera- 5 tur i 20 minutter.

4. Prøven anbragtes derefter på en Sephadexi G-25M-søjle med et lejevolumen, der var mindst ti gange større end prøvevolumenet, ækvilibreret i 10 mM P04/150 mM NaCl/10 mM EDTA, pH

7,0, ved stuetemperatur.

10 Trin 5: Kondensation af Mal-Ab og HRP-SH

1,8 mg af det maleimiderede antistof og et 15 ganges molært overskud af det afbeskyttede thiolerede HRP blev kombineret og omsat ved stuetemperatur i 4 timer. Overskydende reaktive Mal-grupper blev blokeret ved tilsætning af et 40 ganges 15 molært overskud i forhold til Mal-Ab af β-mercaptoethanol til reaktionsblandingen.

Trin 6: Oprensning af HRP-Ab-konjugat 1. Det blokerede konjugat blev koncentreret ved ultrafiltrering.

20 2. En Sepharosei 4B-søjle (300 ml's lejevolumen) blev ækvili breret med 10 mM P04/150 mM NaCl, pH 7,4.

3. Konjugatet blev anbragt på søjlen.

C. Antistofbundne kugler

Der anvendtes kanin-anti-musekugler (tilgængelige fra BIO-25 RAD).

DK 167200 B1 41 D. Testindretning

En linje af kanin-anti-musekuglerne blev anbragt på THC-belagt papir i en højde af 3 cm over papirets nederste ende.

E. Assay 5 Prøven var en 75 ng/ml THC-opløsning.

Assay A fra eksempel 1 ovenfor blev gentaget som beskrevet i eksempel 1, men under anvendelse af HRP-Ab-konjugat, THC-opløsningen som prøve og den med kanin-anti-musekugler forsynede testindretning.

10 Der iagttoges et tyndt farvebånd på kuglelinjen, hvilket viste tilstedeværelsen af THC i prøven.

Den foreliggende opfindelse frembyder flere betydningsfulde fordele i forhold til kendte metoder. En primær fordel ved den foreliggende opfindelse er, at flere analyter kan bestem-15 mes i et enkelt assay på et enkelt testelement. Dette medfører en tidsbesparelse for den, som udfører prøven, og formindskede omkostninger. Reagenserne og testindretningerne kan fremstilles let og billigt, hvilket giver en yderligere formindskelse af omkostningerne. Assayresultatet bestemmes 20 udelukkende under henvisning til assayindretningen, og når det frembragte signal er en farve eller fluorescens, kan indretningen aflæses uden brug af noget instrument. Der tilvejebringes derfor en indbygget kontrol. Et positivt resultat kan let skelnes fra eventuel baggrundsstøj, som 25 frembringes på testindretningen som følge af uspecifikke interaktioner. De faktorer, som frembringer baggrundssignalet, påvirker endvidere området og testindretningens resterende areal på i det væsentlige samme måde.

En anden fordel ved den foreliggende opfindelse er, at be-30 sværlige søjleteknikker undgås. Assayindretningen er en sugende strimmel, som er let at håndtere. En yderligere fordel

Claims (1)

1. Fremgangsmåde til ikke-spredende binding af et medlem af et specifikt bindingspar (sbp-medlem) på et sugende materi-15 ale, kendetegnet ved, at der i et mønster på det sugende materiale anbringes partikler, hvortil sbp-medlemmerne er ikke-spredende bundet, idet partiklernes størrelse er tilstrækkelig lille til at muliggøre, at partiklerne infiltrerer 20 porerne i det sugende materiale, men tilstrækkelig stor til at forhindre partiklerne i at diffundere ud fra porerne.