JPH0238972A

JPH0238972A - 免疫学的測定機器及び方法

Info

Publication number: JPH0238972A
Application number: JP19080588A
Authority: JP
Inventors: Tetsuo Watanabe; 哲男渡辺; Takashi Tsuji; 孝辻; Kenjiro Mori; 健二郎森; Hiroshi Yoshikawa; 吉川　浩志
Original assignee: Nitto Denko Corp
Current assignee: Nitto Denko Corp
Priority date: 1988-07-29
Filing date: 1988-07-29
Publication date: 1990-02-08

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】及呈上■肌里立国本発明は、抗原抗体反応を利用する酵素免疫測定法のよ
うな免疫学的測定を簡便、確実に且つ高感度にて行ない
得るようにした免疫学的測定機器及び方法に関する。

ｌ米ｑ侠麦血清、尿等の体液に含まれる稲々の成分や薬物の検出及
び測定は、臨床上、極めて重要であって、従来、種々の
方法によって行なわれている。かかる方法のうち、代表
的には、体液中の被検物質である抗原又は抗体と、これ
らに対して特異的結合性を有する抗体又は抗原を利用す
る免疫学的測定法が知られており、なかでも、抗原抗体
間の反応の有無やその程度を知るために、酵素標識した
抗体や抗原等、酵素標識免疫体を用いる酵素免疫測定法
がその高感度性及び測定の安定性から広く用いられてい
る。

この酵素免疫測定法には、例えば、石川栄治ら著「酵素
免疫測定法」　（医学書院■１９８７年発行）に記載さ
れているように、種々の方法が知られている。−船釣に
は、ポリスチレンビーズ、試験管内壁面、プレート、膜
等、水不溶性固相担体の表面に、例えば被検物質と抗体
抗原反応を行なわせるための抗体を固定し、先ず、これ
に測定すべき被検物質としての抗原を含む被検液を加え
て、抗原抗体反応によって上記抗原を上記抗体を介して
、上記固相担体上に結合させる０次いで、未反応の抗原
を緩衝液等にて洗浄除去し、上記抗原に対応して、酵素
標識した抗体を反応させて、これを前記抗原に結合させ
た後、未反応の酵素標識抗体を洗浄除去し、この後、固
相担体上に結合された標識酵素の量から測定すべき前記
被検物質としての抗原の量を求める。上記ｉｌｌ酵素量
は、例えば、酵素に対応する基質や、或いは基質と発色
剤とを反応させ、反応生成物の生成に基づく液相又は固
相表面上の色変化を肉眼にて測定して抗原を検出し、或
いは光学的に測定する。

近年においては、医療体制の進展化のために、多数の血
清、尿等の体液中の微量成分を迅速且つ高感度に測定す
ることが強く要望されるに至っており、既に、上述した
ような酵素免疫測定法を自動的に行なうようにした測定
機器も知られている。

日が”しようとする晋しかし、上記したような自動測定機器は極めて高価であ
り、他方において、少数の被検液について迅速に試験し
たい場合等には、上記したような自動測定機器による測
定は、却って時間を要して、不便であることが多い。そ
こで、かかる少数の被検液の試験は、従来、ピペットに
よる採取や分注を含む手作業によって行なわれているが
、手作業によるだけに、手間が非常に煩雑であり、しか
も、種々の試剤の使用量も不正確であり、また、種々の
薬剤を用いるために誤動作も多い。更に、試剤が試験の
間に汚染されやすい。このように、従来の手作業による
免疫学的測定は操作が煩雑であって、操作性や迅速性に
欠けるのみならず、確実性にも劣る。

また、例えば、ポリスチレンビーズからなる固相担体上
に被検液を滴下にて分注するような場合は、被検液が固
相担体を避けて通過する傾向があり、その結果、反応効
率が低（、ひいては怒度を低くする。

本発明は、従来の酵素免疫学的測定における上記した問
題を解決するためになされたものであって、蔀単迅速、
正確に且つ高感度に免疫学的測定を実施することを可能
にする簡便な機器及びかかる方法を提供することを目的
とする。

ｉ　を”るための本発明による免疫学的測定機器は、長平方向の所定の領
域に抗体及び／又は抗原（以下、免疫体ということがあ
る。）を固定化して固相化領域を形成してなる親水性の
多孔質基材を筒状の容器に充填すると共に、上記固相化
領域に対応して、上記容器に内部を透視し得る窓を配設
し、更に、上記容器の先端に被検液及び試薬液を上記基
材に吸液させるための吸液口を設けてなることを特徴と
する。

また、本発明による方法は、上記した機器を用いる免疫
学的測定方法において、被検液及び試薬液を前記吸液口
から順次、上記基材に吸液させ、基材内を泳動させ、前
記固相化領域にて抗原抗体反応を起こさせることを特徴
とする。

以下に図面に基づいて、本発明による免疫学的測定機器
を説明する。

第１図は、本発明による免疫学的測定機器１）を示し、
例えば、硬質合成樹脂からなる筒状の容器１２内に親水
性の多孔質基材１３が充填されている。この多孔質基材
は、被検液や試薬液を吸収し、これらを泳動させ得るよ
うに、親水性基材からなる。従って、例えば、ポリアミ
ド、ガラス、ニトロセルロース、酢酸セルロース、酢酸
ビニル−ビニルアルコール共重合体、ポリビニルアルコ
ール、ポリフッ化ビニリデン、ポリエステル等の不織布
からなるものを用いることができる。特に、ガラス材質
からなる多孔質基材は、濡れ性及び吸液性にすぐれ、他
の材質の多孔質基材に比べて、より速やかに吸液するの
で、本発明において好ましく用いられる。

また、上記材料の繊維を樹脂で固めた多孔質成形体も多
孔質基材として用いることができる。基材の親水性を調
整するために、基材に親水性重合体を被覆し、或いは含
浸させることもできる。

上記多孔ｆ基材は、前記容器の軸方向を長手方向とする
スティック状ともし得るが、好ましくは、基材内を液体
が容易に泳動、即ち、移動し得るように、シート状とす
ることが好ましい、また、基材は、吸液用の先端部分は
断面積が小さくとも、これに連なる上部の断面積を大き
くすることによって、吸液時間を短縮させることができ
る。前記容器がこれら多孔質基材の形状、寸法に合致す
る形状、寸法とされることはいうまでもない。

上記多孔を基材１３は、その長手方向の所定の固相化領
域１４において、免疫体を含有している。

用いる免疫体は、目的とする試験、測定に応じて適宜に
選ばれる。固相化領域は、例えば、免疫体の水溶液を前
記多孔質基材の所定領域に吸収させ、乾燥させることに
よって形成することができる。

また、免疫体をポリビニルピロリドンのような水溶性重
合体と共に水溶液化し、これを前記多孔質基材の所定領
域に吸収させ、乾燥させることによっても形成すること
ができる。固相化の方法は、特に、限定されるものでは
なく、例えば、酵素免疫測定法においてよく知られてい
るように、物理的吸着法や共有結合法によることができ
る。また、固相化領域と後述する吸液口との間に適宜に
標識した免疫体を同様にして含有させ、固相化領域を形
成させてもよい。

他方、一般に、多孔質基材における吸液量や液体の泳動
距離は、予めこれらを知ることができるので、吸液量を
選択すれば、その液体を基材の所定の位置まで泳動させ
ることができる。従って、本発明においては、後述する
ように、前記機Ｈ１の先端を吸液口に形成し、免疫体液
の所定量をこの吸液口から吸収させ、多孔質基材内を所
定の領域まで泳動させた後、乾燥させることによっても
、前記免疫体の固相化領域を形成させることができる。

更に、多孔質基材１３は、上記固相化領域１４に隣接し
て、その上方に参照用着色領域１５を有し、更にその上
方に被検液確認用変色領域１６を有する。参照用着色領
域１５は、被検液の陰陽性を判定するのに用いられる。

即ち、固相化領域がこの参照用着色領域よりも濃く発色
すれば陽性、薄く発色すれば陰性であると判定されるよ
うに、必要とする感度、疑陽性のカットオフ値等を考慮
して、予め適宜の程度に着色されている。参照用着色領
域を形成するための染料としては、固相化領域を形成す
る支持体の材質に応じて適宜に選ばれるが、水との接触
によって、水中に溶出しないものが用いられる。また、
単に着色するだけでな（、検出すべき抗原を予め固相化
することによって、参照用着色領域を形成してもよい。

参照用着色領域は、第１図に示すように、視認が容易で
あるように、水平方向に帯として認識され、その幅が１
ｆ１以上であるものが好ましい。更に、参照用着色領域
は、前記固相化領域と接しているか、又はその間の間隔
を５ｆｉ以下とするのが、相互に比較対照しやすく、有
利である。被検液確認用変色領域には、例えば、水に接
触して青く変色するブロムクレゾールグリーンが多孔質
基材に含有されている。

これらの各領域も、前述した免疫体固相領域と同様にし
て、多孔質基材に形成させることができる。多孔質基材
は、これらそれぞれの領域に対しても、内部を透視し得
る窓１７を備えており、これらの窓からそれぞれの領域
の着色又は変色を視認し得る。上記窓は、前記免疫体固
相領域を含むそれぞれの領域に対応して個別に配設され
ていてもよいが、単一の窓として配設されていてもよい
。

前記機器１は、その先端又は下端において、絞られた吸
液口１８に形成されており、後述するように、試験に際
しては、最初に被検液に、次いで、所定の試薬液に順次
に浸漬される。

本発明による免疫学的測定機器は、特にこれに組み合わ
された試薬リザーバーと共に用いることが好ましい。試
薬リザーバー２１は、好ましくは透明な樹脂からなり、
複数のセル２２を有するが、第２図に示すように、リザ
ーバー壁にセルを透視し得る窓２５を設けてもよい。各
セルには試薬液２３が予め充填されている。

これらセルのそれぞれには、所定の免疫学的測定方法に
対応して、用いる順序に試薬液２３が予め一回の使用量
分が注入されている。即ち、それぞれのセルには、前記
機器の吸液口から内部の多孔質基材に吸液されたときに
、前記免疫体の固相化領域まで泳動し得るに足る最小量
の試薬液が充填されている。従って、本発明によれば、
後述するように、かかるセルに前記機器の吸液口を浸漬
することによって、自動的に一定量の被検液又は試薬液
を前記固相化領域まで泳動させることができる。

セルに充填される試薬液としては、例えば、免疫体液、
洗浄液、基質発色液、洗浄・反応停止液等を挙げること
ができる。尚、洗浄液は、必ずしも必要ではないが、洗
浄液をセルに充填するときは、固相化領域を有効に洗浄
し得るように、多孔質基材に吸液させたとき、多孔ｆ基
材の長手方面に前記固相化領域を十分に越えて泳動する
量とすることが望ましい。

第３図に詳細に示すように、試薬リザーバー２１におけ
るそれぞれのセル２２は、底面が下方に弯曲する凹面状
に形成されていることが望ましい。

セルの底面をかかる形状とすることによって、セルに前
記機器の吸液口１８を浸漬したとき、セル内の試薬液２
３の全量を確実に多孔質基材１３に吸液させることがで
きる。尚、吸液口をセルの底部に確実に到達させるため
に、或いは試験者に吸液口がセルの底部に到達したこと
を知らせるために、第３図に示すように、前記容器は、
所定の位置に突起１８を有することが望ましい。この突
起は、環状でもよい。

更に、それぞれのセルは、前記機器の吸液口にて突き破
ることができる合成樹脂フィルム２４で被覆されており
、試薬の保存性を高めると共に、使用前の汚染を防止し
、更に、機器の吸液口をセルに挿入したときに試薬の飛
散を防止する。

第４図は、本発明において好適に用いることができる被
検液採取容器３１を示し、本体３２の底部には、被検液
３３をオーバーフローさせるためのオーバーフロー管３
４と、その直下に所定容量の被検液溜め３５が設けられ
ている。上記本体には、容器状のオーバーフロー液溜め
３６が例えば嵌め込み式に固定される。従って、例えば
、所定量の尿を被検液として得る場合は、前記本体３２
に尿を注げば、所定量のみが被検液溜め３５に集められ
、残余は、オーバーフロー管３４を経て、オーバーフロ
ー液溜め３６に集められる。ここに、上記所定量は、前
記機器１）の多孔質基材１３に吸液させたとき、被検液
が前記固相化領域に泳動し得る最小の必要量とすればよ
い。

次に、上述したような方法を用いる本発明による免疫学
的測定方法について説明する。

先ず、上記したように、所要の被検液を採取容器に採取
し、機器の吸液口を前記被検液溜めに浸漬して、被検液
を前記固相化領域に泳動させる。

被検液が固相化領域に到達したことは、前記被検液確認
用変色領域の変色を前記窓から視認することによって知
ることができる。次いで、機器の吸液口を前記試薬リザ
ーバーの第１のセルに浸漬して、所定の試薬液を同様に
して多孔質基材に吸液させ、この後、必要に応じて、所
要の時間間隔をおいて、順次にセル内の試薬液を多孔質
基材に吸液させ、所要の反応を起こさせる。

本発明によれば、複数の固相化領域に異種の免疫体を含
有させることによって、複数成分の免疫体を含む被検液
を同時に試験することもできる。

大豊開以下に実施例に基づいて、本発明を一層具体的に説明す
る。

実施例１本発明による機器の利用の一例として、尿中のヒト絨毛
性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）を所謂サンドイツチ法によ
る酵素免疫測定法にて検出することによって、妊娠診断
を行なう機器について、以下に説明する。

この診断においては、試薬リザーバーのそれぞれのセル
には、その使用順序に、標識免疫体液、洗浄液、基質・
発色剤液、及び洗浄・反応停止液の所定量が充填されて
いる。

ｈＣＧに対する標識免疫体としては、例えば、アルカリ
ホスファターゼ標識抗ｈＣＧポリクローン抗体が用いら
れる。また、前記多孔質基材の固相化領域には、例えば
、抗ｈＣＧモノクローン抗体が用いられる。この抗体は
、例えば、物理的吸着法によって、予め多孔質基材に担
持される。アルカリホスファターゼに対する基質発色剤
としては、例えば、５−ブロモ−４−クロロ−３−イン
ドリルホスフェートのような染色性の強いものが好まし
く用いられる。

測定に際しては、先ず、かかる機器の多孔質基材に所定
量の尿を吸液させ、固相化領域にて抗原抗体反応によっ
て、尿中のｈＣＧを抗ｈＣＧモノクローン抗体に結合さ
せ、次いで、洗浄液を吸液させて洗浄する。次いで、多
孔質基材に前記アルカリホスファターゼ標識抗ｈＣＧ七
ツクローン抗体液を吸液させ、固相化領域にてｈｃｃと
結合させる。この後、多孔質基材に基質発色剤液を吸液
させ、次いで、洗浄・反応停止液を吸液させる。

このような方法にて試験を行なえば、尿中にｈｃＧが存
在するときは、固相化領域が青色に発色するので、妊娠
診断を行なうことができる。

比較のために、水平に保持した吸水紙の上に上記と同じ
固相化領域を形成した基材を水平にＦ２置し、上方から
それぞれ同量同濃度の被検液及びそれぞれの試薬を順次
に滴下して、上記と同様にして、試験を行なったところ
、本発明によれば、より低濃度のｈＣＧを含む被検液に
対しても発色し、本発明による測定が高感度であること
が示される。

実施例２抗ｈＣＧ抗体（ウサギ抗血清）を粒径０．４２μｍのア
クリル酸（２，８重量％）／スチレン共重合体ラテック
スにカルボジイミド法にて共有結合させた。このラテッ
クス粒子表面上の抗体固定化量は１５．０■／１であっ
た。

このラテックス溶液を固形分濃度６．０重量％に調整し
、その１５μ２をガラス繊維濾紙（６×２０ｎの長方形
状）上に静かに滴下した。１０分間静置した後、これを
真空凍結して、抗ｈＣＧ固相化多孔質膜とした。

この多孔質膜の長手方向の一端を吸水紙で挟み、他端を
吸液口として下方に位置させて垂直に保持し、吸液口か
ら被検液（ｈＣＧ液）１８０μｌを吸液させた後、直ち
にアルカリホスファターアゼ標識抗体液１２０μｌを同
様にして吸液させ、１分間反応させた。次いで、洗浄液
（０，９％食塩及び０．０２％界面活性剤トウイーン２
０含有）２４０μｌ及び基質・発色液（ＢＣＩＰ系）１
２０μｌをこの順序で吸液させ、１分間発色反応させた
。

最後に洗浄・反応停止液２４０μｌを吸液させて、用い
た被検液中のｈｃＧｔＲ度に対して、固相化領域上の発
色の有無及び程度を調べた。結果を第１表に示す。

比較例として、上記と同じ多孔質膜を水平に保持した吸
水紙上に載置、上方からピペットにて被検液（ｈＣＧ液
）１８０μｌを滴下した後、直ちにアルカリホスファタ
ーアゼ標識抗体液１２０μｌを滴下して、１分間反応さ
せた。次いで、洗浄液（０，９％食塩及び０．０２％ト
ウイーン２０μｌ含有）２４０μＥ及び基質・発色液（
ＢＣＩＰ系）１２０μｌをこの順序で滴下し、１分間発
色反応させた。最後に洗浄・反応停止液２４０μＥを滴
下し、用いた被検液中のｈｃＧ’ｌｔｉ度に対して、固
相化領域上の発色の有無及び程度を調べた。結果を第１
表に示す。

本発明によれば、比較例に比べて、約１０倍も感度が高
いことが示される。

光凱■廟果以上のように、本発明の免疫学的測定機器によれば、親
水性の多孔質基材の所定の領域に免疫体を固定化して固
相化領域を形成し、これに上記固相領域まで泳動し得る
予め定めた所定の最小量の被検液及び試薬液を順次に吸
液させることによって、これらを上記固相化領域に泳動
させ、そこで、所定の抗原抗体反応を起こさせ、これを
変色、着色、蛍光の発生等によって観察することによっ
て、免疫学的測定を行なうことができる。

従って、本発明によれば、従来の手作業による測定と異
なり、煩瑣なピペッティングや分注操作を必要とせず、
また、これらに伴う誤動作もないので、簡単且つ迅速に
、しかも正確に免疫学的測定を行なうことができる。

更に、本発明によれば、それぞれの試薬液が多孔質基材
の吸液浸透作用によって、固相化表面を速やかに通液す
るので、測定感度が高い。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明による免疫学的測定機器を示す部分断
面正面図、第２図は、試薬リザーバーを示す正面図、第
３図は、試薬リザーバーの詳細を示す要部拡大断面図、
第４図は、被検液採取容器の一例を示す断面図である。１）・・・免疫学的測定機器、１２・・・容器、１３・
・・親水性多孔質基材、１４・・・免疫体固相化領域、
１５・・・参照用着色領域、１６・・・被検液確認用変
色領域、１７・・・窓、１８・・・吸液口、２１・・・
試薬リザーバー、２２・・・試薬液セル、２３・・・試
薬液、２４・・・合成樹脂フィルム、２５・・Ｔ〜　３
１・・・被検液採取容器、３２・・・本体、３３・・・
被検液、３４・・・オーバーフロー管、３５・・・被検
液溜め、３６・・・オーバーフロー液溜め。第１図特許出願人　日東電気工業株式会社代理人　弁理士　　牧　野　逸　部第３ｒｌ！Ｊ第４図

Claims

【特許請求の範囲】

（１）長手方向の所定の領域に抗体及び／又は抗原を固
定化して固相化領域を形成してなる親水性の多孔質基材
を筒状の容器に充填すると共に、上記固相化領域に対応
して、上記容器に内部を透視し得る窓を配設し、更に、
上記容器の先端に被検液及び試薬液を上記基材に吸液さ
せるための吸液口を設けてなることを特徴とする免疫学
的測定機器。
（２）長手方向の所定の領域に抗体及び／又は抗原を固
定化して固相化領域を形成してなる親水性の多孔質基材
を筒状の容器に充填すると共に、上記固相化領域に対応
して、上記容器に内部を透視し得る窓を配設し、更に、
上記容器の先端に被検液及び試薬液を上記基材に吸液さ
せるための吸液口を設けてなる免疫学的測定機器を用い
る免疫学的測定方法において、被検液及び試薬液を前記
吸液口から順次、上記基材に吸液させ、基材内を泳動さ
せ、前記固相化領域にて抗原抗体反応を起こさせること
を特徴とする免疫学的測定方法。