KR20150101454A

KR20150101454A - 리물루스 시험에 사용되는 안티트롬빈 ⅲ 용 전처리제 및 전처리 방법

Info

Publication number: KR20150101454A
Application number: KR1020157017303A
Authority: KR
Inventors: 마키 아이자와; 도시오 오다; 준 아케타가와
Original assignee: 세이가가쿠 고교 가부시키가이샤
Priority date: 2012-12-28
Filing date: 2013-12-27
Publication date: 2015-09-03
Also published as: EP2940468A4; EP2940468A1; US10132812B2; WO2014104352A1; ES2731595T3; JP6674993B2; CN109085357B; US20190025309A1; CN104884952A; JPWO2014104352A1; US20160061838A1; EP3470846A1; JP6432083B2; EP2940468B1; EP3470846B1; JP2019015740A; ES2816550T3; KR102115633B1; CN109085357A

Abstract

안티트롬빈 Ⅲ 을 리물루스 시험에 사용할 때의 반응 간섭 작용을 저감시키고, 이로써 안티트롬빈 Ⅲ 의 리물루스 시험을 고정밀도로 실시하는 수단을 제공한다. 리물루스 시험에 사용되는 안티트롬빈 Ⅲ 을 2 가 금속염과 공존시킨 상태에서 단백질을 실활시키는 처리에 제공함으로써, 안티트롬빈 Ⅲ 을 리물루스 시험에 사용할 때의 반응 간섭 작용을 저감시킨다.

Description

리물루스 시험에 사용되는 안티트롬빈 Ⅲ 용 전처리제 및 전처리 방법{PRETREATING AGENT FOR ANTITHROMBIN III FOR USE IN LIMULUS TEST, AND PRETREATMENT METHOD}

본 발명은 리물루스 시약을 이용한 엔도톡신 등의 표적 물질의 검출 시험에 사용되는 안티트롬빈 Ⅲ 용 전처리제 및 그 처리제를 함유하는 리물루스 시약 키트, 그리고 이것들을 이용한 안티트롬빈 Ⅲ 의 전처리 방법 및 리물루스 시약을 이용한 엔도톡신 등의 표적 물질의 측정 방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서는, 이하의 약호를 사용하는 경우가 있다.

Et : 엔도톡신

BG : (1→3)-β-D-글루칸

ATⅢ : 안티트롬빈 Ⅲ

엔도톡신은 그램 음성 세균의 세포벽 외막에 존재하는 리포 다당이며, 강한 발열성 물질로 알려져 있다. 또, 엔도톡신은 발열 이외에도, 쇼크 증상 등의 여러 가지 병태를 일으키는 것이 알려져 있다. 그 때문에, 주사제 등의 의약품, 물, 의료 기구 등에 있어서의 엔도톡신의 검출이나 정량은, 의약품 등의 안전성 확보의 관점에서 중요하다.

투구게에 그램 음성 세균이 감염되면, 혈액 응고를 일으키는 것이 알려져 있으며, 이 현상은 엔도톡신의 검출에 이용되어 왔다. 즉, 투구게 혈구 추출액 (투구게·아메보사이트·라이세이트 ; 이하 「LAL」이라고도 한다) 을 사용하여 엔도톡신을 측정할 수 있다. 이것은 리물루스 시험이라 불리며, 엔도톡신이 LAL 에 접촉됨으로써 일어나는 LAL 중에 존재하는 여러 가지 단백질 (모두 세린프로테아제) 의 캐스케이드 반응을 이용하는 것이다.

ATⅢ 은 혈액 중의 항응고 인자이며, 파종성 혈관내 응고 증후군 (DIC) 등의 치료에 사용된다. 여기서, ATⅢ 은 세린프로테아제 인히비터이기 때문에, LAL 중에 존재하는 캐스케이드 반응에 관여하는 단백질의 활성을 저해한다 (비특허문헌 1). 이와 같이, 피검 시료에 따라서는 리물루스 시약에 대한 저해 작용을 나타내는 경우가 있다. 이와 같은 저해 작용은, 피검 시료의 희석에 의해 회피할 수 있는 경우가 있다 (비특허문헌 2). 그러나, ATⅢ 은 리물루스 시약에 대한 저해 작용이 매우 강하여, ATⅢ 제제 (주사제) 를 리물루스 시험에 사용하기 위해서는 64 배 이상으로 희석할 필요가 있었다 (비특허문헌 2). 따라서, 리물루스 시약의 검출 감도 (검량선의 최소 엔도톡신 농도) 를 고려하면, ATⅢ 제제에 리물루스 시험을 적용하는 것은 곤란하다고 생각되어 왔다 (비특허문헌 2). 실제로 ATⅢ 을 함유하는 시료에 대해서는, 현재도 토끼 발열 시험을 이용하여 엔도톡신을 검출하고 있다 (비특허문헌 1).

비특허문헌 1 에는, ATⅢ 제제를 100 배 희석하여, 70 ℃ 에서 20 분간 가열하여 전처리한 후, LAL 과 반응시켜, 광산란법으로 측정하는 것을 특징으로 하는, ATⅢ 제제의 Et 를 측정하는 방법이 개시되어 있다. 이 방법은 Et 의 검출을 고감도화하기 위해, 분광 광도계를 사용한 비탁법 대신에 광산란 측정 장치를 사용한 광산란법을 채용한 것이 기술적 특징이다. 그러나, 이 방법은 상기와 마찬가지로 고배율의 희석이 필요 불가결할 뿐만 아니라, 적어도 이하의 문제가 있었다.

(1) 리물루스 시험의 측정 장치로서 널리 보급되어 있는 것은 분광 광도계이며, 광산란법을 실시하기 위해서는 광산란 측정 장치를 별도로 새로 도입하여, 사용할 필요가 있는 점.

(2) 일본 약국방에서는, Et 의 광학적 정량법으로서 비탁법 및 비색법만이 규정되어 있고, 광산란법은 규정되어 있지 않은 점.

또, 특허문헌 1 에는, 생체 유래 시료를 알칼리 토금속 황산염 또는 알칼리 토금속 할로겐화물과 접촉시키고, 가온하여 전처리한 후, 리물루스 시약을 이용한 측정에 사용하는 것을 특징으로 하는, 생체 유래 시료의 Et 및 BG 의 측정 방법이 기재되어 있다.

또, 특허문헌 2 에는, 생체 유래 시료를 헥사디메스린 화합물, 알칼리 금속 수산화물, 비이온성 계면활성제 및 알칼리 토금속 할로겐화물과 혼합하고, 가온하여 전처리한 후, 리물루스 시약을 이용한 측정에 사용하는 것을 특징으로 하는, 혈액 유래 시료의 Et 및 BG 의 측정 방법이 기재되어 있다.

또, 특허문헌 3 에는, 생체 유래 시료를 리포 다당 및/또는 리피드 A 결합성 펩티드를 고정화한 담체와 접촉시켜 Et 를 흡착 회수한 후, 리물루스 시약 등을 이용한 측정에 사용하는 것을 특징으로 하는, ATⅢ 을 함유할 가능성이 있는 시료의 Et 측정 방법이 기재되어 있다.

그러나, 어느 문헌에도, ATⅢ 의 리물루스 시험을 실시하기 위해, ATⅢ 을 2 가 금속염과 공존시킨 상태에서 단백질을 실활시키는 처리에 제공하여 전처리하는 것에 대해서는 기재도 시사도 되어 있지 않다.

국제 공개 2006/080448호 팜플렛 일본 공개특허공보 평6-70796호 일본 공개특허공보 2010-243342호

엔도톡신·자연 면역 연구 15 -비약하는 자연 면역 연구-, 의학 도서 출판, p.27 ∼ 30, 2012 엔도톡신 연구 12 -자연 면역학의 새로운 전개-, 의학 도서 출판, p.93 ∼ 97, 2009

본 발명은 ATⅢ 을 리물루스 시험에 사용할 때의 반응 간섭 작용을 저감시키고, 이로써, ATⅢ 의 리물루스 시험을 고정밀도로 실시하는 수단을 제공하는 것을 과제로 한다. 여기에서 말하는 「반응 간섭 작용」이란, 리물루스 시험의 측정 대상 물질 (Et 나 BG 등) 이외의 요인에 의해 일어나고, 또한, 리물루스 시험의 결과에 영향을 미치는 모든 작용을 의미한다. 따라서, 「반응 간섭 작용」에는, 예를 들어, ATⅢ 그 자체, ATⅢ 과 공존하고 있는 첨가물 또는 불순물 등의 성분, 전처리시에 공존시키는 전처리제 이외의 시약 등의 성분, 및/또는 리물루스 시약 중의 성분 등에서 기인되는, 이들 성분 자체가 불용화되는 작용, 리물루스 시약의 반응을 촉진 또는 저해하는 작용, Et 의 미셀 구조나 BG 의 고차 구조를 변화시켜 그것들의 활성 (리물루스 시약 중의 C 인자나 G 인자에 대한 반응성) 을 변화시키는 작용 등, 리물루스 시험의 결과에 영향을 미치는 모든 작용이 포함된다.

본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 예의 검토한 결과, ATⅢ 을 2 가 금속염과 공존시킨 상태에서, 열처리나 산처리 등의 단백질을 실활시키는 처리에 제공함으로써, ATⅢ 을 리물루스 시험에 사용할 때의 반응 간섭 작용을 저감시킬 수 있고, 따라서, ATⅢ 의 리물루스 시험을 고정밀도로 실시할 수 있는 것을 알아내어, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 이하의 양태를 포함한다.

[1] 리물루스 시험에 사용되는 안티트롬빈 Ⅲ 용의 전처리제로서,

2 가 금속염을 함유하고,

안티트롬빈 Ⅲ 을 리물루스 시험에 사용하기 전에, 그 안티트롬빈 Ⅲ 을 상기 전처리제와 공존시킨 상태에서 단백질을 실활시키는 처리에 제공하기 위해 사용되는 전처리제.

[2] 상기 2 가 금속염이, 2 가 금속 염화물, 2 가 금속 아세트산염, 및 2 가 금속 황산염으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 또는 그 이상의 금속염인 상기 전처리제.

[3] 상기 2 가 금속염을 구성하는 2 가 금속이, 마그네슘, 칼슘, 망간, 및 아연으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 또는 그 이상의 금속인 상기 전처리제.

[4] 안티트롬빈 Ⅲ 을 상기 전처리제와 공존시켰을 때의 상기 2 가 금속염에서 유래하는 2 가 금속 이온의 농도가 0.5 mM 이상인 상기 전처리제.

[5] 상기 리물루스 시험의 측정 대상 물질이 엔도톡신인 상기 전처리제.

[6] 상기 전처리제를 함유하는 안티트롬빈 Ⅲ 용의 리물루스 시약 키트.

[7] 안티트롬빈 Ⅲ 을 상기 전처리제와 공존시킨 상태에서 단백질을 실활시키는 처리에 제공하는 것을 포함하는, 리물루스 시험에 사용되는 안티트롬빈 Ⅲ 의 전처리 방법.

[8] 상기 단백질을 실활시키는 처리가 열처리 또는 산처리인 상기 전처리 방법.

[9] 상기 열처리가 50 ℃ 초과의 온도에서 실시되는 상기 전처리 방법.

[10] 상기 산처리에 사용되는 산이 염산인 상기 전처리 방법.

[11] 상기 전처리 방법에 의해 안티트롬빈 Ⅲ 을 전처리 하는 것, 및 전처리 된 안티트롬빈 Ⅲ 을 리물루스 시험에 사용하는 것을 포함하는 안티트롬빈 Ⅲ 중의 리물루스 시험의 측정 대상 물질을 측정하는 방법.

[12] 상기 방법에 의해 안티트롬빈 Ⅲ 중의 리물루스 시험의 측정 대상 물질을 측정하는 것을 포함하는, 안티트롬빈 Ⅲ 을 제조하는 방법.

도 1 은, 평행선 정량법을 이용한 시험의 결과를 나타내는 도면이다.
도 2 는, 평행선 정량법을 이용한 시험의 결과를 나타내는 도면이다.
도 3 은, 평행선 정량법을 이용한 시험의 결과를 나타내는 도면이다.

(1) 본 발명의 전처리제

본 발명의 전처리제는, 2 가 금속염을 함유하는, 리물루스 시험에 사용되는 ATⅢ 용 전처리제이다. 본 발명의 전처리제는, ATⅢ 을 리물루스 시험에 사용하기 전에, 그 ATⅢ 을 본 발명의 전처리제와 공존시킨 상태에서 단백질을 실활시키는 처리에 제공하기 위해 사용된다.

여기에서 말하는 「리물루스 시험」이란, 리물루스 시약을 이용하여 표적 물질을 검출 (측정) 하는 시험을 말한다. 동 표적 물질을 「리물루스 시험의 측정 대상 물질」이라고도 한다. 리물루스 시험의 측정 대상 물질은, 리물루스 시험에 의해 검출 가능한 물질이면 특별히 제한되지 않지만, Et 또는 BG 인 것이 바람직하고, Et 인 것이 보다 바람직하다.

여기에서 말하는 「ATⅢ」이란, ATⅢ 을 함유하는 시료이면 특별히 제한되지 않고, ATⅢ 으로 이루어지는 것이어도 되고, ATⅢ 이외의 성분을 함유하는 것이어도 된다. ATⅢ 의 형상도 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, 액상이어도 되고, 동결 건조물, 분말, 과립, 정제 등의 고형상이어도 된다.

ATⅢ 으로는, 예를 들어, ATⅢ 의 주사용 제제를 들 수 있다. 이와 같은 주사용 제제로서, 구체적으로는, 예를 들어, 노이아트 (등록상표 ; 주식회사 베네시스 제조), 안트롬빈 (재단법인 화학 급혈청 요법 연구소 제조), 논스론 (등록상표 ; 닛폰 제약 주식회사 제조) 을 들 수 있다. 이와 같은 ATⅢ 의 주사용 제제를 본 발명의 전처리 및 리물루스 시험에 사용할 때에는, 원액 그대로를 피검체로서 사용해도 되고, 농축된 용액을 피검체로서 사용해도 되며, 물이나 완충액 등의 수성 용매로 임의의 배율로 희석한 용액을 피검체로서 사용해도 된다. 여기에서 말하는 「원액」이란, ATⅢ 을 주사용 제제로서 통상적으로 사용할 때의 농도인 50 Unit/㎖ 의 농도로 함유하는 용액을 의미한다. 「원액」은, 예를 들어, 각 ATⅢ 의 주사용 제제의 첨부 문서에 기재된 방법에 따라 ATⅢ 을 수성 용매에 용해시킴으로써 얻어진다. 여기에서 말하는 「농축된 용액」이란, ATⅢ 을 50 Unit/㎖ 초과의 농도로 함유하는 용액을 의미한다. 「농축된 용액」으로는, 예를 들어, 각 ATⅢ 의 주사용 제제의 제조 공정에서 얻어지는 중간 정제물을 들 수 있다.

또, 원액을 수성 용매로 희석하는 경우의 희석 배율은, 리물루스 시험의 측정 대상 물질을 검출할 수 있는 한 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어, 1 배 초과 64 배 미만인 것이 바람직하고, 1 배 초과 16 배 이하인 것이 보다 바람직하고, 1 배 초과 10 배 이하인 것이 더욱 바람직하고, 1 배 초과 4 배 이하인 것이 보다 더 바람직하고, 1 배 초과 2.5 배 이하인 것이 특히 바람직하고, 1.1 배 이상 2.5 배 이하인 것이 매우 바람직하고, 1.2 배 이상 2.5 배 이하인 것이 특히 매우 바람직하다. 또한, 여기에서 말하는 「희석 배율」이란, 본 발명의 전처리제의 공존하에서 단백질을 실활시키는 처리를 실시하고 있는 반응액의 상기 「원액」에 대한 희석의 배율을 의미한다. 따라서, 희석 배율 「1 배」란, 본 발명의 전처리제의 공존하에서 단백질을 실활시키는 처리를 실시하고 있는 반응액에 있어서의 ATⅢ 농도가 상기 「원액」의 ATⅢ 농도와 동일한 것 (원액인 상태. 원액이 희석되지 않고, ATⅢ 이 50 Unit/㎖ 의 농도로 존재하고 있는 것.) 을 의미한다.

또, ATⅢ 은 재조합 단백질이어도 된다. 재조합 ATⅢ 은 숙주 세포에 발현시킴으로써 취득할 수 있다. 숙주 세포에 의한 발현은 통상적인 방법에 따라 실시할 수 있다. 예를 들어, 야마다 등 (국제 공개 제2005/035563호) 의 방법에 따라 실시할 수 있다. ATⅢ 의 아미노산 배열이나 그것을 코드하는 유전자의 염기 배열은, 공지된 데이터 베이스로부터 취득할 수 있다. 공지된 데이터 베이스로는, 예를 들어, NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 를 들 수 있다. 발현시키는 재조합 단백질은, 천연의 ATⅢ 과 동일한 아미노산 배열을 갖는 단백질 이어도 된다. 또, 발현시키는 재조합 단백질은, ATⅢ 으로서의 기능을 유지하고 있는 한, 천연의 ATⅢ 의 베어리언트여도 된다. 베어리언트에는 공지된 ATⅢ 의 호모로그나 인위적 개변체도 포함된다.

여기에서 말하는 「2 가 금속염」은, 본 발명이 속하는 기술분야에 있어서 2 가 금속염으로서 인식되는 금속염인 한 특별히 제한되지 않는다. 2 가 금속염으로는, 예를 들어, 2 가 금속 불화물, 2 가 금속 염화물, 2 가 금속 브롬화물, 2 가 금속 요오드화물, 2 가 금속 수산화물, 2 가 금속 시안화물, 2 가 금속 질산염, 2 가 금속 아질산염, 2 가 금속 차아염소산염, 2 가 금속 아염소산염, 2 가 금속 염소산염, 2 가 금속 과염소산염, 2 가 금속 과망간산염, 2 가 금속 아세트산염, 2 가 금속 탄산수소염, 2 가 금속 인산 이수소염, 2 가 금속 황산수소염, 2 가 금속 황화수소염, 2 가 금속 티오시안산염, 2 가 금속 산화물, 2 가 금속 황화물, 2 가 금속 과산화물, 2 가 금속 황산염, 2 가 금속 아황산염, 2 가 금속 티오황산염, 2 가 금속 탄산염, 2 가 금속 크롬산염, 2 가 금속 이크롬산염, 2 가 금속 인산 일수소염, 2 가 금속 인산염을 들 수 있다. 2 가 금속염으로는, 1 종만을 사용해도 되고, 2 종 또는 그 이상을 조합하여 사용해도 된다. 2 가 금속염은, 예를 들어, 2 가 금속 염화물, 2 가 금속 아세트산염, 및 2 가 금속 황산염으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 또는 그 이상의 금속염인 것이 바람직하다.

2 가 금속염은, ATⅢ 을 본 발명의 전처리제와 공존시켰을 때, 2 가의 금속 이온을 부여하는 것이어도 된다. 「ATⅢ 을 본 발명의 전처리제와 공존시켰을 때」란, 구체적으로는, 후술하는 단백질을 실활시키는 처리가 실시되고 있을 때를 말한다. 2 가 금속염은, 예를 들어, 수성 용매에 용해시켜 2 가의 금속 이온을 부여하는 것이어도 된다. 수성 용매로는, 물이나 완충액을 들 수 있다.

여기에서 말하는 「2 가 금속」은, 본 발명이 속하는 기술분야에 있어서 2 가 금속으로서 인식되는 금속인 한 특별히 제한되지 않는다. 「2 가 금속」이란, 이온화했을 때 2 가의 금속 이온을 부여하는 금속을 의미해도 된다. 2 가 금속으로는, 예를 들어, 베릴륨, 마그네슘, 칼슘, 스트론튬, 바륨, 라듐, 카드뮴, 니켈, 아연, 구리, 수은, 철, 코발트, 주석, 납, 망간을 들 수 있다. 2 가 금속으로는, 1 종만을 사용해도 되고, 2 종 또는 그 이상을 조합하여 사용해도 된다. 2 가 금속은, 예를 들어, 마그네슘, 칼슘, 망간, 및 아연으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 또는 그 이상의 금속인 것이 바람직하다.

2 가 금속염으로서, 구체적으로는, 예를 들어, 황산마그네슘 (MgSO₄), 예를 들어, 염화마그네슘 (MgCl₂), 아세트산마그네슘 (Mg(CH₃COO)₂), 염화칼슘 (CaCl₂), 아세트산칼슘 (Ca(CH₃COO)₂), 황산망간 (MnSO₄), 황산아연 (ZnSO₄) 을 들 수 있다. 본 발명의 전처리제는, 예를 들어, 2 가 금속염으로서 황산마그네슘 (MgSO₄) 만을 함유하고 있어도 된다. 또, 본 발명의 전처리제는, 예를 들어, 황산마그네슘 (MgSO₄) 에 더하여, 추가로 1 또는 그 이상의 다른 2 가 금속염을 함유하고 있어도 된다.

또, 본 발명의 전처리제는, 추가로 다른 성분을 함유하고 있어도 된다. 「다른 성분」은, 시약·진단 약학적으로 허용되는 성분이면 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, 시약이나 진단약에 배합하여 사용되는 성분을 사용할 수 있다. 여기에서 말하는 「다른 성분」으로는, 예를 들어, 알칼리 금속 염화물, 알칼리 금속 아세트산염, 알칼리 금속 황산염, 계면활성제, 및 각종 첨가제를 들 수 있다.

각종 첨가제로는, 예를 들어, 안정화제, 유화제, 삼투압 조정제, 완충제, 등장화제, 보존제, pH 조정제, 착색제, 부형제, 축합제, 활택제, 붕괴제를 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.

또, 본 발명의 전처리제의 제형은 특별히 제한되지 않는다. 본 발명의 전처리제는, 예를 들어, 액제로서 제공되어도 되고, 분말제, 과립제, 또는 정제 등의 용시 용해용 고형제로서 제공되어도 된다. 또, 본 발명의 전처리제는, 예를 들어, 본 발명의 전처리제를 웰 내에 유지하는 마이크로 플레이트로서 제공되어도 된다. 그와 같은 마이크로 플레이트는, 예를 들어, 액상으로 조제한 본 발명의 전처리제를 웰 내에 분주 (分注) 하여 건조시킴으로써 얻어진다. 또, 본 발명의 전처리제가 액제로서 제공되는 경우에는, 본 발명의 전처리제는, 동결 상태로 제공되어도 되고, 액체 상태 (융해 상태) 로 제공되어도 된다.

본 발명의 전처리제에 있어서, 2 가 금속염은, 염 상태로 존재하고 있어도 되고, 이온화된 상태로 존재하고 있어도 되며, 그 혼합물로서 존재하고 있어도 된다. 이들 어느 경우도 「본 발명의 전처리제가 2 가 금속염을 함유하는」것에 해당한다.

본 발명의 전처리제는, 2 가 금속염을 함유시키는 것 이외에는, 시약이나 진단약을 제조하는 데에 통상적으로 사용되는 것과 동일한 수법에 의해 제조할 수 있다.

본 발명의 전처리제에 있어서의 2 가 금속염의 농도는 특별히 제한되지 않고, 2 가 금속염의 종류나 본 발명의 전처리제의 사용량 등의 여러 조건에 따라 적절히 설정할 수 있다. 본 발명의 전처리제에 있어서의 2 가 금속염의 농도는, 예를 들어, 0.001 질량％ 이상, 0.01 질량％ 이상, 0.1 질량％ 이상, 1 질량％ 이상, 5 질량％ 이상, 10 질량％ 이상, 30 질량％ 이상, 또는 50 질량％ 이상이어도 된다. 본 발명의 전처리제에 있어서의 2 가 금속염의 농도는, 예를 들어, 100 질량％ 이하, 50 질량％ 이하, 30 질량％ 이하, 10 질량％ 이하, 5 질량％ 이하, 또는 1 질량％ 이하여도 된다.

본 발명의 전처리제의 사용량은 특별히 제한되지 않고, 2 가 금속염의 종류나 농도 등의 여러 조건에 따라 적절히 설정할 수 있다. 본 발명의 전처리제는, 예를 들어, ATⅢ 을 본 발명의 전처리제와 공존시켰을 때의 2 가 금속염에서 유래하는 2 가 금속 이온의 농도 (이하, 「처리시의 2 가 금속 이온 농도」라고도 한다) 가 이하에 예시하는 농도 범위가 되도록 사용할 수 있다. 「ATⅢ 을 본 발명의 전처리제와 공존시켰을 때의 농도」란, 구체적으로는, 후술하는 단백질을 실활시키는 처리가 실시되고 있는 반응계에서의 농도를 말한다. 처리시의 2 가 금속 이온 농도는, 본 발명의 전처리의 효과가 얻어지는 한 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어, 0.5 mM 이상인 것이 바람직하다. 처리시의 2 가 금속 이온 농도는, 예를 들어, 0.5 mM ∼ 100 mM 인 것이 바람직하고, 0.5 mM ∼ 50 mM 인 것이 보다 바람직하고, 0.5 mM ∼ 25 mM 인 것이 더욱 바람직하고, 5 mM ∼ 25 mM 인 것이 보다 더 바람직하고, 5 mM ∼ 12.5 mM 인 것이 특히 바람직하다. 또한, 본 발명의 전처리제에 2 종류 이상의 2 가 금속염이 함유되어 있는 경우에는, 여기에서 말하는 「처리시의 2 가 금속 이온 농도」는, 그것들 2 가 금속염에서 유래하는 2 가 금속 이온의 농도의 총합을 의미한다.

이와 같은 본 발명의 전처리제를 사용하여 ATⅢ 의 전처리를 실시함으로써, ATⅢ 을 리물루스 시험에 사용할 때의 반응 간섭 작용을 저감시킬 수 있고, 따라서, ATⅢ 의 리물루스 시험을 고정밀도로 실시할 수 있다.

(2) 본 발명의 키트

본 발명의 키트는, 본 발명의 전처리제를 구성 물품으로서 포함하는 리물루스 시약 키트이다. 본 발명의 키트는, 다른 구성 물품을 포함하고 있어도 된다. 여기에서 말하는 「다른 구성 물품」으로는, 예를 들어, 리물루스 시약, 리물루스 반응의 검출용 기질, 완충액, 증류수, 표준 물질 (Et 나 BG 등), 및 마이크로 플레이트를 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 이용하는 리물루스 시약은, 리물루스 시험의 측정 대상 물질에 대응한 캐스케이드 반응에 관여하는 단백질을 함유하고 있는 한, 특별히 한정되지 않는다. 리물루스 시약으로는, 예를 들어, 투구게 혈구 추출액 (LAL (라이세이트 시약)) 을 들 수 있다. LAL 은 투구게의 혈액을 원료로 하여 통상적인 방법에 의해 취득할 수 있다. LAL 은 적절히 분획 및/또는 정제 등을 하고 나서 이용하여도 된다. 투구게는 어느 종류의 투구게여도 된다. 투구게로는, 일본산 투구게인 타키프레우스·트리덴타터스 (Tachypleus tridentatus), 미국산 투구게인 리물루스·폴리페모스 (Limulus polyphemus), 그리고 동남아시아산 투구게인 카르시노스코르피우스·로튼디카우다 (Carcinoscorpius rotundicauda) 및 타키프레우스·기가스 (Tachypleus gigas) 를 들 수 있다. 예를 들어, 리물루스·폴리페모스 유래 라이세이트를 사용한 리물루스 시약으로는, 엔도스페시 (등록상표) ES-50M (생화학 공업 주식회사), 피로크롬 (어소시에이트 오브 케이프 코드 잉크), 피로텔 (등록상표) -T (어소시에이트 오브 케이프 코드 잉크), 피로텔 (등록상표) 멀티 테스트 (어소시에이트 오브 케이프 코드 잉크), 키네틱-QCL (론자 워커스 빌 잉크), 엔드 크롬-K (찰스 리버 래보래토리즈 잉크) 를 들 수 있다.

또, 리물루스 시약으로는, 인위적으로 재구성된 것도 예시할 수 있다.

재구성된 리물루스 시약은, 리물루스 시험의 측정 대상 물질에 대응한 캐스케이드 반응에 관여하는 단백질을 함유하도록 구성되어 있으면 특별히 제한되지 않는다. 캐스케이드 반응에 관여하는 단백질을 총칭하여 「인자」라고도 한다. 여기에서 말하는 「캐스케이드 반응」이란, 리물루스 시험의 측정 대상 물질의 존재에 의해 진행되는 일련의 반응을 말한다. 예를 들어, Et 등의 C 인자를 활성화하는 물질이 존재하는 경우, 동 물질에 의해 C 인자가 활성화되어 활성형 C 인자가 되고, 활성형 C 인자에 의해 B 인자가 활성화되어 활성형 B 인자가 되고, 활성형 B 인자에 의해 프로클로팅엔자임이 활성화되어 클로팅엔자임이 되는 일련의 반응이 진행된다. 즉, Et 등의 C 인자를 활성화하는 물질이 측정 대상 물질인 경우에는, 재구성된 리물루스 시약은, 캐스케이드계를 구성하는 인자로서, 예를 들어, C 인자, B 인자, 및 프로클로팅엔자임을 함유하고 있으면 된다. 또, 예를 들어, BG 등의 G 인자를 활성화하는 물질이 존재하는 경우, 동 물질에 의해 G 인자가 활성화되어 활성형 G 인자가 되고, 활성형 G 인자에 의해 프로클로팅엔자임이 활성 화되어 클로팅엔자임이 되는 일련의 반응이 진행된다. 즉, BG 등의 G 인자를 활성화하는 물질이 측정 대상 물질인 경우에는, 재구성된 리물루스 시약은, 캐스케이드계를 구성하는 인자로서, 예를 들어, G 인자 및 프로클로팅엔자임을 함유하고 있으면 된다. 캐스케이드 반응의 진행은, 예를 들어, 후술하는 리물루스 반응의 검출용 기질을 이용하여 클로팅엔자임의 존재를 검출함으로써 검출할 수 있다.

또, 후술하는 리물루스 반응의 검출용 기질로서, 캐스케이드 반응의 도중 단계를 검출할 수 있는 것을 이용하는 경우에는, 재구성된 리물루스 시약은, 당해 도중 단계까지 관여하는 인자를 함유하고 있으면 된다. 구체적으로는, 예를 들어, Et 등의 C 인자를 활성화하는 물질이 측정 대상 물질이고, 또한, 활성화 C 인자의 존재를 검출할 수 있는 리물루스 반응의 검출용 기질을 이용하는 경우에는, 재구성된 리물루스 시약은, C 인자를 함유하고 있으면 된다.

재구성된 리물루스 시약에 함유되는 각 인자는, 천연으로 얻어지는 것이어도 되고, 재조합 단백질이어도 된다.

천연의 각 인자는 상기 각종 투구게의 혈구 추출액 (LAL) 으로부터 취득할 수 있다. 이들 인자는 원하는 정도로 정제하여 사용할 수 있다. 정제는, 예를 들어, 공지된 수법 (Nakamura T. et al., J Biochem. 1986 Mar ; 99(3) : 847-57.) 에 의해 실시할 수 있다.

또, 각 인자는 숙주 세포에 발현시킴으로써 취득할 수 있다. 숙주 세포에 의한 발현은 통상적인 방법에 따라 실시할 수 있다. 예를 들어, 미즈무라 등 (국제 공개 제2012/118226호) 의 방법에 따라 실시할 수 있다. 각 인자의 아미노산 배열이나 그것을 코드하는 유전자의 염기 배열은, 공지된 데이터 베이스로부터 취득할 수 있다. 공지된 데이터 베이스로는, 예를 들어, NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 를 들 수 있다. 발현된 각 재조합 단백질은, 필요에 따라 원하는 정도로 정제하여 사용할 수 있다.

각 인자를 적절히 조합함으로써 재구성된 리물루스 시약이 얻어진다. 예를 들어, 재구성된 리물루스 시약에 함유되는 인자는, 모두 천연의 인자여도 되고, 모두 재조합 단백질이어도 되며, 그것들의 임의의 조합이어도 된다. 또, 재구성된 리물루스 시약은, 예를 들어, LAL 자체에, 혹은 LAL 을 적절히 분획 및/또는 정제 등을 한 것에, 각 인자를 적절히 조합함으로서 얻어진 것이어도 된다.

리물루스 반응의 검출용 기질 (이하, 간단히 「검출용 기질」이라고도 한다) 이란, 캐스케이드 반응의 진행을 검출하기 위한 기질을 말한다.

검출용 기질로는, 코아규로겐을 들 수 있다. 코아규로겐은, 캐스케이드 반응의 최종 산물인 클로팅엔자임의 검출 기질이다. 코아규로겐과 클로팅엔자임이 접촉됨으로써, 코아규린으로서 응고된다. 응고 반응의 진행은, 반응액의 탁도를 측정하는 것이나 겔의 형성을 관측함으로써 측정할 수 있다. 코아규로겐은 투구게 혈구 추출액 (LAL) 으로부터 회수할 수 있다. 또, 코아규로겐을 코드하는 유전자의 염기 배열은 밝혀져 있으며 (미야타 등, 단백질 핵산 효소 별책 No.29 ; P30-43 ; 1986), 통상적인 방법에 따라 유전자 공학적으로 코아규로겐을 생산할 수도 있다.

또, 검출용 기질로는, 합성 기질을 사용해도 된다. 합성 기질은 캐스케이드 반응의 진행을 검출하는 데에 바람직한 성질을 갖는 한 특별히 제한되지 않는다. 「캐스케이드 반응의 진행을 검출하는 데에 바람직한 성질」이란, 예를 들어, 클로팅엔자임의 존재를 검출하기 위한 성질이어도 되고, 캐스케이드 반응의 도중 단계를 검출하기 위한 성질이어도 된다. 「클로팅엔자임의 존재를 검출하기 위한 성질」로는, 클로팅엔자임의 효소 반응에 의해 발색되는 성질이나, 클로팅엔자임의 효소 반응에 의해 형광을 발하는 성질을 들 수 있다. 「캐스케이드 반응의 도중 단계를 검출하기 위한 성질」로는, 활성화 C 인자 등의 효소 반응에 의해 발색되는 성질이나, 활성화 C 인자 등의 효소 반응에 의해 형광을 발하는 성질을 들 수 있다. 합성 기질로는, 예를 들어, 일반식 X-Y-Z (식 중, X 는 보호기, Y 는 펩티드, Z 는 Y 와 아미드 결합된 색소이다) 로 나타내는 기질을 들 수 있다. 예를 들어, C 인자, B 인자, 및 프로클로팅엔자임을 함유하는 반응계에 Et 등의 C 인자를 활성화하는 물질이 존재하는 경우에는, 캐스케이드 반응의 결과로서 발생하는 클로팅엔자임의 효소 반응에 의해 Y-Z 간의 아미드 결합이 절단되어, 색소 Z 가 유리되어 발색되거나, 혹은 형광을 발한다. G 인자 및 프로클로팅엔자임을 함유하는 반응계를 이용하는 경우나, 캐스케이드 반응의 도중 단계를 검출하는 경우도, 각각 클로팅엔자임이나, 캐스케이드 반응의 도중 단계에서 발생하는 단백질에 의해 색소 Z 가 유리되면 된다. 보호기 X 로는, 특별히 제한되지 않고, 펩티드의 공지된 보호기를 바람직하게 사용할 수 있다. 그와 같은 보호기로는, t-부톡시카르보닐기, 벤조일기를 들 수 있다. 색소 Z 는, 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, 가시광하에서 검출되는 색소여도 되고, 형광 색소여도 된다. 색소 Z 로는, pNA (파라니트로아닐린), MCA (7-메톡시쿠마린-4-아세트산), DNP (2,4-디니트로아닐린), Dansyl (단실) 계 색소를 들 수 있다. 펩티드 Y 로는, Leu-Gly-Arg (LGR), Ile-Glu-Gly-Arg (IEGR) (배열 번호 1), Val-Pro-Arg (VPR), Asp-Pro-Arg (DPR) 를 들 수 있다. 이들 합성 기질은, 모두 클로팅엔자임의 존재를 검출하기 위해 사용해도 되고, 캐스케이드 반응의 도중 단계를 검출하기 위해 사용해도 된다. 또, 이들 합성 기질은, 검출 대상에 따라 바람직한 것을 선택하여 사용해도 된다. 예를 들어, 기질 특이성면에서는, 펩티드 Y 로서 LGR 을 함유하는 기질은 클로팅엔자임의 검출에 바람직하게 사용할 수 있고, 펩티드 Y 로서 VPR 또는 DPR 을 함유하는 기질은 활성화 C 인자의 검출에 바람직하게 사용할 수 있다. 유리된 색소 Z 는 색소의 성질에 따른 수법에 의해 측정하면 된다.

또한, 리물루스 시약으로서 투구게 혈구 추출액 (LAL) 을 사용하는 경우, LAL 에 원래 함유되는 코아규로겐을 검출용 기질로서 이용할 수 있다. 또, 적절히 선택한 검출용 기질을 LAL 과 조합하여 사용해도 된다.

리물루스 시약으로서 재구성된 리물루스 시약을 사용하는 경우, 적절히 선택한 검출용 기질이 재구성된 리물루스 시약과 조합하여 사용할 수 있다.

각 인자나 검출용 기질은, 혼합물로서 본 발명의 키트에 함유되어 있어도 되고, 각각 별개로, 또는 임의의 조합으로 별개로, 본 발명의 키트에 함유되어 있어도 된다.

이와 같은 본 발명의 키트를 사용하여 ATⅢ 의 전처리를 실시함으로써, ATⅢ 을 리물루스 시험에 사용할 때의 반응 간섭 작용을 저감시킬 수 있고, ATⅢ 의 리물루스 시험을 고정밀도로 실시할 수 있다.

(3) 본 발명의 전처리 방법

본 발명의 전처리 방법은, ATⅢ 을 본 발명의 전처리제와 공존시킨 상태에서 단백질을 실활시키는 처리에 제공하는 것을 포함하는, 리물루스 시험에 사용되는 ATⅢ 의 전처리 방법이다.

여기에서 말하는 「단백질을 실활시키는 처리」란, ATⅢ 을 실활시키는 처리이면 되고, 구체적으로는, 리물루스 시험을 저해하지 않을 정도로 ATⅢ 을 실활시키는 처리이면 된다. 단백질을 실활시키는 처리로는, 예를 들어, 열처리, 산처리, 알칼리 처리를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 단백질을 실활시키는 처리로는, 어느 하나의 처리를 단독으로 실시해도 되고, 2 또는 그 이상의 처리를 조합하여 실시해도 된다.

단백질을 실활시키는 처리는, 예를 들어, 물이나 완충액 등의 수성 용매 중에서 실시할 수 있다. 즉, 단백질을 실활시키는 처리는, 예를 들어, ATⅢ 과 본 발명의 전처리제를 수성 용매 중에서 공존시킨 상태에서 실시할 수 있다.

여기에서 말하는 「열처리」란, 본 발명의 전처리제와 공존시킨 ATⅢ 을 가열하는 처리를 말한다. 가열 방법은 특별히 한정되지 않지만, 히트 블록, 워터 배스, 에어 배스, 마이크로 웨이브 오븐 등의 기기를 사용하는 방법이 바람직하다. 또, 열처리 온도는, 단백질이 실활되는 한 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어, 통상적으로 50 ℃ 초과이다. 열처리 온도는, 예를 들어, 55 ℃ ∼ 100 ℃ 인 것이 바람직하고, 55 ℃ ∼ 95 ℃ 인 것이 보다 바람직하고, 60 ℃ ∼ 90 ℃ 인 것이 더욱 바람직하고, 65 ℃ ∼ 85 ℃ 인 것이 보다 더 바람직하고, 65 ℃ ∼ 75 ℃ 인 것이 특히 바람직하다. 또, 열처리 시간은, 단백질이 실활되는 한 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어, 1 분간 이상인 것이 바람직하다. 열처리 시간은, 예를 들어, 1 분간 ∼ 2 시간인 것이 바람직하고, 1 분간 ∼ 1 시간인 것이 보다 바람직하고, 5 분간 ∼ 30 분간인 것이 더욱 바람직하고, 5 분간 ∼ 20 분간인 것이 보다 더 바람직하고, 5 분간 ∼ 15 분간인 것이 특히 바람직하다.

또, 여기에서 말하는 「산처리」는, 본 발명의 전처리제와 공존시킨 ATⅢ 과 산을 접촉시키는 처리를 말한다. 산처리에 사용되는 산으로는, 예를 들어, 염산, 황산, 질산을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 이들 중에서는 염산이 바람직하다. 산의 첨가량은, 산의 종류 등의 여러 조건에 따라 적절히 설정할 수 있다. 산의 첨가량은, 예를 들어, 산처리시의 반응계에 있어서의 산농도가 0.001 N ∼ 1 N, 바람직하게는 0.01 N ∼ 0.5 N, 보다 바람직하게는 0.01 N ∼ 0.1 N 이 되는 양이면 된다. 산처리 시간은, 단백질이 실활되는 한 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어, 산처리에 통상적으로 사용되는 시간이면 된다. 산처리 시간은, 예를 들어, 0.1 초 ∼ 2 시간이어도 된다.

또, 여기에서 말하는 「알칼리 처리」는, 본 발명의 전처리제와 공존시킨 ATⅢ 과 알칼리를 접촉시키는 처리를 말한다. 알칼리 처리에 사용되는 알칼리로는, 예를 들어, 수산화나트륨이나 수산화칼륨을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 이들 중에서는, 수산화나트륨이 바람직하다. 알칼리의 첨가량은, 알칼리의 종류 등의 여러 조건에 따라 적절히 설정할 수 있다. 알칼리의 첨가량은, 예를 들어, 알칼리 처리시의 반응계에 있어서의 알칼리 농도가 0.001 N ∼ 1 N, 바람직하게는 0.01 N ∼ 0.5 N, 보다 바람직하게는 0.01 N ∼ 0.1 N 이 되는 양이면 된다. 알칼리 처리 시간은, 단백질이 실활되는 한 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어, 알칼리 처리에 통상적으로 사용되는 시간이면 된다. 알칼리 처리 시간은, 예를 들어, 0.1 초 ∼ 2 시간이어도 된다.

본 발명의 전처리 방법은, 단백질을 실활시키는 처리 이외의 공정을 포함하고 있어도 된다.

예를 들어, 단백질을 실활시키는 처리를 실시하기 전에, 적절히 ATⅢ 에 처리를 실시해도 된다. 예를 들어, ATⅢ 의 건조 분말을 미분화하는 등, ATⅢ 을 가공하는 처리를 실시할 수 있다. 또, 예를 들어, ATⅢ 을 희석 또는 농축시켜도 된다. 이들 처리는 본 발명의 전처리제와 공존시키기 전에 실시해도 되고, 본 발명의 전처리제와 공존시킨 후, 그리고 단백질을 실활시키는 처리를 실시하기 전에 실시해도 된다.

또, 예를 들어, 단백질을 실활시키는 처리를 실시한 후에는, 적절히 후처리를 실시해도 된다. 후처리는, 예를 들어, 전처리된 ATⅢ 을 리물루스 시험에 사용할 때, 리물루스 시험이 저해되지 않도록 하는 처리여도 된다. 예를 들어, 단백질을 실활시키는 처리로서 열처리를 실시한 경우에는, 처리물의 온도를 낮출 수 있다. 또, 예를 들어, 단백질을 실활시키는 처리로서 산처리를 실시한 경우에는, 알칼리에 의해 처리물을 중화할 수 있다. 또, 예를 들어, 단백질을 실활시키는 처리로서 알칼리 처리를 실시한 경우에는, 산에 의해 처리물을 중화할 수 있다. 또, 예를 들어, 처리물을 희석 또는 농축시켜도 된다.

이와 같은 본 발명 전처리 방법을 이용하여 ATⅢ 의 전처리를 실시함으로써, ATⅢ 을 리물루스 시험에 사용할 때의 반응 간섭 작용을 저감시킬 수 있고, 따라서, ATⅢ 의 리물루스 시험을 고정밀도로 실시할 수 있다.

(4) 본 발명의 측정 방법

본 발명의 측정 방법은, 본 발명의 전처리 방법에 의해 ATⅢ 을 전처리하는 것, 및 전처리된 ATⅢ 을 리물루스 시험에 사용하는 것을 포함하는, ATⅢ 중의 리물루스 시험의 측정 대상 물질을 측정하는 방법이다.

리물루스 시험은, 예를 들어, 공지된 수법에 의해 실시할 수 있다. 공지된 수법으로는, 예를 들어, 비색법, 비탁법, 겔화법을 들 수 있다.

리물루스 시험은, 구체적으로는, ATⅢ 과 리물루스 시약을 접촉시킴으로써 실시할 수 있다. ATⅢ 중에 리물루스 시험의 측정 대상 물질이 존재하는 경우에는, 캐스케이드 반응이 진행된다. 따라서, 캐스케이드 반응의 진행을 측정 함으로써, ATⅢ 중의 리물루스 시험의 측정 대상 물질을 측정할 수 있다. 리물루스 시험시에는, 각 인자는, ATⅢ 과 리물루스 시약을 접촉시키는 공정의 당초부터 반응계에 함유되어 있어도 되고, 순차적으로 반응계에 첨가되어도 된다.

캐스케이드 반응의 진행은, 검출용 기질을 이용하여 측정할 수 있다. 즉, 캐스케이드 반응의 진행은, 검출용 기질의 종류에 따라, 당해 기질의 반응 (발색이나 응고 등) 을 측정함으로써 측정할 수 있다. 검출용 기질은, 임의의 타이밍으로 반응계에 첨가해도 된다. 예를 들어, 검출용 기질은, ATⅢ 과 리물루스 시약을 접촉시키는 공정의 당초부터 반응계에 함유되어 있어도 되고, 당해 공정의 진행중 또는 완료 후에 반응계에 첨가되어도 된다. 또, 검출용 기질을 미리 함유하고 있는 리물루스 시약을 사용하는 경우에는, 검출용 기질을 반응계에 별도로 첨가하지 않아도 되다.

본 발명의 측정 방법은, ATⅢ 중에 리물루스 시험의 측정 대상 물질이 존재하는 경우에 캐스케이드 반응이 진행되는 한, 그 밖의 임의의 공정을 포함하고 있어 된다. 예를 들어, 본 발명의 측정 방법은, 상기 서술한 바와 같이, 반응계에 검출용 기질을 첨가하는 공정을 포함하고 있어도 된다. 또, 예를 들어, 본 발명의 측정 방법은, 측정에 의해 얻어진 데이터를 다른 데이터로 변환하는 공정을 포함하고 있어도 된다. 측정에 의해 얻어진 데이터를 다른 데이터로 변환하는 공정으로는, 예를 들어, 측정에 의해 얻어진 데이터에 기초하여, ATⅢ 중의 리물루스 시험의 측정 대상 물질의 양을 산출하는 공정을 들 수 있다.

본 발명의 측정 방법에 있어서, 반응은 물 혹은 완충액 등의 수성 용매 중에서 행해지는 것이 바람직하다.

본 발명의 측정법에 의하면, ATⅢ 을 리물루스 시험에 사용할 때의 반응 간섭 작용을 저감시킬 수 있고, 따라서, ATⅢ 의 리물루스 시험을 고정밀도로 실시할 수 있다.

또, 이와 같이 하여, 리물루스 시험의 측정 대상 물질에 의한 오염이 없는 것이 확인된 ATⅢ 이 얻어진다. 즉, 본 발명은 본 발명의 측정 방법에 의해 ATⅢ 중의 리물루스 시험의 측정 대상 물질을 측정하는 것을 포함하는, ATⅢ 을 제조하는 방법을 제공한다. 이와 같이 제조된 ATⅢ 은 주사제 등의 임의의 형태로 제공할 수 있다.

실시예

이하, 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 이들은 본 발명의 기술적 범위를 전혀 한정하는 것은 아니다. 또한, 실시예에 기재한 모든 시험에 있어서, 물, 시약, 플라스틱 제품, 및 유리 제품 등은, 엔도톡신이 검출되지 않는 것 및 리물루스 시약의 반응에 대한 반응 간섭 인자를 함유하지 않는 것이 보증된 것을 사용하였다.

＜Et 첨가 회수율의 정의＞

비색법 또는 비탁법으로 실시한 시험에 있어서는, 이하의 순서로 Et 첨가 회수율을 산출하였다. 즉, ATⅢ 에 이미 알려진 양의 엔도톡신을 첨가한 피검체의 리물루스 시험과 동시에, ATⅢ 대신에 등량의 물을 피검체로 한 리물루스 시험을 양성 대조로서 실시하였다. ATⅢ 을 함유하는 피검체의 흡광도 변화율 (mAbs/min) 의 값을 양성 대조의 흡광도 변화율의 값으로 나눈 값을 백분율 환산하여, Et 첨가 회수율로 하였다. 또한, ATⅢ 또는 물에 엔도톡신 오염이 있는 경우에는, 오염에 상당하는 값을 측정값에서 뺀 후에 Et 첨가 회수율을 산출하면 된다. 즉, Et 첨가 회수율이란, ATⅢ 에 의한 반응 간섭 작용이 없는 경우에 검출되어야 할 Et 량에 대한, ATⅢ 을 함유하는 피검체에 있어서 실제로 검출된 Et 량의 비율 (％) 을 의미할 수 있다.

＜참고예 1＞ 희석 가열법에 의한 ATⅢ 의 Et 첨가 회수 시험

원액, 또는 물로 4 배, 16 배, 64 배, 혹은 256 배로 희석한 50 Unit/㎖ 의 ATⅢ 제제 (노이아트 (등록상표) ; 주식회사 베네시스 ; 이하, 동일) 0.4 ㎖ 에, 0.5 EU/㎖ 로 조제한 Et (JPRSE : 일본 약국방 엔도톡신 표준품 ; 이하, 동일) 의 표준액 0.04 ㎖ 를 첨가하고, 시험관 믹서를 사용하여 1 분간 격렬하게 교반하였다. 그 후, 0.2 ㎖ 를 다른 용기에 분주하고, 히트 블록을 사용하여 70 ℃ 에서 10 분간 가열하였다. 그 후, 0.05 ㎖ 를 마이크로 플레이트에 분주하고, 비색법용의 Et 측정 시약 (엔도스페시 (등록상표) ES-50M ; 생화학 공업 주식회사 ; 이하, 동일) 0.05 ㎖ 를 첨가하였다. 이어서, 항온조 기능 및 교반 기능을 갖는 웰리더 (웰리더 MP-96 ; 생화학 공업 주식회사 ; 이하, 동일) 를 사용하여 1 분간 격렬하게 교반한 후, 37 ℃ 에서 30 분간 가온하면서 측정 파장 405 ㎚ 및 대조 파장 492 ㎚ 에 있어서의 흡광도의 시간 경과적 변화를 측정하고, Et 첨가 회수율을 산출하였다. 결과를 표 1 에 나타낸다.

표 1 에 나타내는 바와 같이, 희석 배율이 16 배 이하인 경우에는, Et 첨가 회수율이 10 ％ 미만이 되어, Et 를 양호한 정밀도로 검출할 수 없었다. 한편, 희석 배율이 64 배 이상인 경우에는, 거의 100 ％ 의 Et 첨가 회수율을 얻을 수 있었다. 이 결과는 희석 가열법에 관한 공지된 결과 (비특허문헌 1) 와도 대체로 일치하는 것이었다.

＜실시예 1＞ 황산마그네슘 또는 염화칼슘을 공존시켜 열처리한 경우의 Et 첨가 회수 시험

25 Unit/㎖ 의 ATⅢ 제제 (물로 2 배로 희석한 ATⅢ 제제) 0.9 ㎖ 에 0.5 EU/㎖ 의 Et 표준액 0.1 ㎖ 를 첨가하고, 시험관 믹서를 사용하여 1 분간 격렬하게 교반하였다. 그 후, 0.18 ㎖ 를 다른 용기에 분주하고, 15.6 mM, 125 mM, 250 mM, 500 mM, 혹은 1000 mM 의 MgSO₄ 수용액, 또는 15.6 mM, 56 mM, 125 mM, 250 mM, 혹은 500 mM 의 CaCl₂ 수용액을 0.02 ㎖ 첨가하고, 시험관 믹서를 사용하여 1 분간 격렬하게 교반하였다. 각 용액을 히트 블록을 사용하여 70 ℃ 에서 10 분간 가열한 후, 즉시 빙랭하였다. 각 용액을 실온까지 되돌린 후, 0.05 ㎖ 를 마이크로 플레이트에 분주하였다. 엔도스페시 ES-50M 을 0.05 ㎖ 첨가하고, 웰리더를 사용하여 1 분간 격렬하게 교반한 후, 37 ℃ 에서 30 분간 가온하면서 측정 파장 405 ㎚ 및 대조 파장 492 ㎚ 에 있어서의 흡광도의 시간 경과적 변화를 측정하고, Et 첨가 회수율을 산출하였다. 결과를 표 2, 3 에 나타낸다. 표 중, 「MgSO₄ 농도」및 「CaCl₂ 농도」는, 열처리시의 반응액 중에서의 농도를 나타낸다. 또, 본 실시예에 있어서의 ATⅢ 제제의 희석 배율은 약 2.5 배이다.

표 2, 3 에 나타내는 바와 같이, ATⅢ 및 Et 와 황산마그네슘 또는 염화칼슘을 공존시켜 열처리함으로써, 희석 가열법과 같이 64 배 이상으로 희석하지 않고도, 양호한 정밀도로 Et 를 검출할 수 있었다. 특히, 황산마그네슘의 농도가 12.5 mM 이상인 경우에, 양호한 정밀도로 Et 를 검출할 수 있었다.

＜실시예 2＞ 2 가 금속염의 종류의 검토

50 Unit/㎖ 의 ATⅢ 제제 0.2 ㎖ 에 0.5 EU/㎖ 의 Et 표준액 0.22 ㎖ 를 첨가하고, 시험관 믹서를 사용하여 1 분간 격렬하게 교반한 후, 물을 1.8 ㎖ 첨가하고, 다시 시험관 믹서를 사용하여 1 분간 격렬하게 교반하였다. 그 후, 0.1 ㎖ 를 다른 용기에 분주하고, 50 mM 또는 5 mM 로 조제한 각종 2 가 금속염의 수용액을 1/10 량 (0.011 ㎖) 첨가하고, 시험관 믹서를 사용하여 1 분간 격렬하게 교반하였다. 각 용액을 히트 블록을 사용하여 70 ℃ 에서 10 분간 가열한 후, 즉시 빙랭하였다. 각 용액을 실온까지 되돌린 후, 0.05 ㎖ 를 마이크로 플레이트에 분주하였다. 엔도스페시 ES-50M 을 0.05 ㎖ 첨가하고, 웰리더를 사용하여 1 분간 격렬하게 교반한 후, 37 ℃ 에서 30 분간 가온하면서 측정 파장 405 ㎚ 및 대조 파장 492 ㎚ 에 있어서의 흡광도의 시간 경과적 변화를 측정하고, Et 첨가 회수율을 산출하였다. 결과를 표 4 에 나타낸다. 표 중, 2 가 금속염 농도는, 열처리시의 반응액 중에서의 농도를 나타낸다. 또, 본 실시예에 있어서의 ATⅢ 제제의 희석 배율은 약 12 배이다.

표 4 에 나타내는 바와 같이, Mg(CH₃COO)₂, MgCl₂, Ca(CH₃COO)₂, MnSO₄, 또는 ZnSO₄ 를 ATⅢ 과 공존시켜 열처리한 경우에도 Et 를 검출할 수 있었다.

＜실시예 3＞ 열처리의 온도와 시간의 검토

50 Unit/㎖ 의 ATⅢ 제제 0.9 ㎖ 에 0.5 EU/㎖ 의 Et 표준액 0.1 ㎖ 를 첨가하고, 시험관 믹서를 사용하여 1 분간 격렬하게 교반하고, 0.18 ㎖ 를 다른 용기에 분주하였다. 그 후, 200 mM 의 CaCl₂ 수용액을 0.02 ㎖ 첨가하고, 시험관 믹서를 사용하여 1 분간 격렬하게 교반하였다. 각 용액을 빙상에 정치 (靜置), 또는 히트 블록을 사용하여 37 ℃, 50 ℃, 60 ℃, 70 ℃, 80 ℃ 혹은 90 ℃ 에서 5 분간, 10 분간 또는 20 분간 열처리 한 후에 즉시 빙랭하였다. 각 용액을 실온까지 되돌린 후, 0.05 ㎖ 를 마이크로 플레이트에 분주하였다. 엔도스페시 ES-50M 을 0.05 ㎖ 첨가하고, 웰리더를 사용하여 1 분간 격렬하게 교반한 후, 37 ℃ 에서 30 분간 가온하면서 측정 파장 405 ㎚ 및 대조 파장 492 ㎚ 에 있어서의 흡광도의 시간 경과적 변화를 측정하고, Et 첨가 회수율을 산출하였다. 결과를 표 5 에 나타낸다. 열처리시의 반응액 중에서의 CaCl₂ 농도는 20 mM 이다. 또, 본 실시예에 있어서의 ATⅢ 제제의 희석 배율은 약 1.2 배이다.

표 5 에 나타내는 바와 같이, 열처리 온도가 60 ℃ 이상인 경우에, Et 의 검출이 가능하였다. 또, 열처리 시간이 5 분간 이상인 경우에, Et 의 검출이 가능하였다. 또, 각 온도 (60 ℃, 70 ℃, 80 ℃, 또는 90 ℃) 에서 10 분간 가열한 결과로부터, 열처리 온도는 Et 첨가 회수율이 가장 높았던 70 ℃ 가 바람직한 것으로 생각된다.

＜참고예 2＞ 열처리 후에 2 가 금속염을 첨가하는 효과의 검토

물로 4 배 혹은 16 배로 희석한 50 Unit/㎖ 의 ATⅢ 제제 또는 물 0.9 ㎖ 에 0.5 EU/㎖ 의 Et 표준액 0.1 ㎖ 를 첨가하고, 시험관 믹서를 사용하여 1 분간 격렬하게 교반하였다. 그 후, 0.18 ㎖ 를 다른 용기에 분주하고, 빙상에 정치, 또는 히트 블록을 사용하여 70 ℃ 에서 10 분간 열처리 한 후에 즉시 빙랭하였다. 각 용액을 실온까지 되돌린 후, 물, 또는 7 mM, 28 mM, 혹은 112 mM 의 CaCl₂ 수용액을 0.02 ㎖ 첨가하고, 시험관 믹서를 사용하여 1 분간 격렬하게 교반한 후, 0.05 ㎖ 를 마이크로 플레이트에 분주하였다. 엔도스페시 ES-50M 을 0.05 ㎖ 첨가하고, 웰리더를 사용하여 1 분간 격렬하게 교반한 후, 37 ℃ 에서 30 분간 가온하면서 측정 파장 405 ㎚ 및 대조 파장 492 ㎚ 에 있어서의 흡광도의 시간 경과적 변화를 측정하고, Et 첨가 회수율을 산출하였다. 결과를 표 6 에 나타낸다.

표 6 에 나타내는 바와 같이, 열처리 후에 2 가 금속염을 첨가하는 방법에서는 Et 첨가 회수율이 10 ％ 미만이 되어, Et 를 양호한 정밀도로 검출할 수 없었다. 따라서, 2 가 금속염은 열처리 전에 ATⅢ 및 Et 와 공존시켜 둘 필요가 있는 것이 분명해졌다.

＜실시예 4＞ 산처리의 검토

50 Unit/㎖ 의 ATⅢ 제제 0.2 ㎖ 에 0.5 EU/㎖ 의 Et 표준액 0.22 ㎖ 를 첨가하고, 시험관 믹서를 사용하여 1 분간 격렬하게 교반하였다. 그 후, 물을 1.8 ㎖ 첨가하고, 다시 시험관 믹서를 사용하여 1 분간 격렬하게 교반하였다. 그 후, 0.1 ㎖ 를 다른 용기에 분주하고, 50 mM 혹은 5 mM 로 조제한 각종 2 가 금속염의 수용액을 1/10 량 (0.011 ㎖) 첨가하고, 시험관 믹서를 사용하여 1 분간 격렬하게 교반하였다. 그 후, 5 N, 2 N, 1 N, 0.5 N, 또는 0.1 N 의 염산을 0.011 ㎖ 첨가하고, 다시 시험관 믹서를 사용하여 1 분간 격렬하게 교반하였다. 그 후, 0.05 ㎖ 를 마이크로 플레이트에 분주하고, 엔도스페시 ES-50M 을 0.05 ㎖첨가하고, 웰리더를 사용하여 1 분간 격렬하게 교반한 후, 37 ℃ 에서 30 분간 가온하면서 측정 파장 405 ㎚ 및 대조 파장 492 ㎚ 에 있어서의 흡광도의 시간 경과적 변화를 측정하고, Et 첨가 회수율을 산출하였다. 결과를 표 7 에 나타낸다. 표 중, 2 가 금속염 농도 및 염산 농도는, 산처리시의 반응액 중에서의 농도 (개산) 를 나타낸다. 또, 본 실시예에 있어서의 ATⅢ 제제의 희석 배율은 약 14 배이다.

표 7 에 나타내는 바와 같이, 2 가 금속을 공존시킨 상태에서 산처리함으로써, 열처리한 경우와 동일하게 Et 를 검출할 수 있었다. 특히, 염산 농도가 0.01 N ∼ 0.1 N 인 경우에, Et 를 효율적으로 검출할 수 있었다.

＜실시예 5＞ 피로크롬 (비색법용의 Et 측정 시약) 을 사용한 시험

50 Unit/㎖ 의 ATⅢ 제제 0.1 ㎖ 에 0.4 EU/㎖ 의 Et 표준액 0.1 ㎖ 를 첨가하고, 시험관 믹서를 사용하여 1 분간 격렬하게 교반하였다. 그 후, 물 0.1 ㎖ 를 첨가하고, 시험관 믹서를 사용하여 1 분간 격렬하게 교반한 후, 25 mM 의 CaCl₂ 수용액 0.1 ㎖ 를 첨가하고, 다시 시험관 믹서를 사용하여 1 분간 격렬하게 교반하여, 0.2 ㎖ 를 ATⅢ 의 4 배 희석액으로서 다른 용기에 분주하였다. 나머지 0.2 ㎖ 에 물 0.2 ㎖ 를 첨가하고, 시험관 믹서를 사용하여 1 분간 격렬하게 교반한 후, 0.2 ㎖ 를 ATⅢ 의 8 배 희석액으로 하여 다른 용기에 분주하였다. 이 조작을 반복하여, ATⅢ 의 16 배 희석액 및 32 배 희석액도 조제하여, 각각을 다른 용기에 분주하였다. 각 용액을 히트 블록을 사용하여 70 ℃ 에서 10 분간 열처리한 후에 즉시 빙랭하였다. 각 용액을 실온까지 되돌린 후, 0.05 ㎖ 를 마이크로 플레이트에 분주하였다. 비색법용의 Et 측정 시약 (피로크롬 ; 어소시에이트 오브 케이프 코드 잉크) 0.05 ㎖ 를 첨가하고, 웰리더를 사용하여 1 분간 격렬하게 교반한 후, 37 ℃ 에서 60 분간 가온하면서 측정 파장 405 ㎚ 및 대조 파장 492 ㎚ 에 있어서의 흡광도의 시간 경과적 변화를 측정하고, Et 첨가 회수율을 산출하였다. 결과를 표 8 에 나타낸다.

표 8 에 나타내는 바와 같이, 비색법용의 Et 측정 시약으로서 엔도스페시 ES-50M 대신에 피로크롬을 사용한 경우에 있어서도, ATⅢ 제제의 희석 배율에 상관없이 Et 첨가 회수율은 거의 100 ％ 로, Et 를 양호한 정밀도로 검출할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 전처리법을 실시함으로써, 비색법용의 Et 측정 시약으로서 피로크롬을 사용한 경우에 있어서도, ATⅢ 과 공존하는 Et 의 고정밀의 측정이 가능한 것이 분명해졌다.

＜실시예 6＞ 피로텔-T (비탁법용 Et 측정 시약) 를 사용한 시험

50 Unit/㎖ 의 ATⅢ 제제 0.1 ㎖ 에 0.4 EU/㎖ 의 Et 표준액 0.1 ㎖ 를 첨가하고, 시험관 믹서를 사용하여 1 분간 격렬하게 교반하였다. 그 후, 물 0.1 ㎖ 를 첨가하고, 시험관 믹서를 사용하여 1 분간 격렬하게 교반한 후, 25 mM 의 CaCl₂ 수용액 0.1 ㎖ 를 첨가하고, 다시 시험관 믹서를 사용하여 1 분간 격렬하게 교반하여, 0.2 ㎖ 를 ATⅢ 의 4 배 희석액으로 하여 다른 용기에 분주하였다. 나머지 0.2 ㎖ 에 물 0.2 ㎖ 를 첨가하고, 시험관 믹서를 사용하여 1 분간 격렬하게 교반한 후, 0.2 ㎖ 를 ATⅢ 의 8 배 희석액으로 하여 다른 용기에 분주하였다. 이 조작을 반복하여, ATⅢ 의 16 배 희석액 및 32 배 희석액도 조제하여, 각각을 다른 용기에 분주하였다. 각 용액을 히트 블록을 사용하여 70 ℃ 에서 10 분간 열처리한 후에 즉시 빙랭하였다. 각 용액을 실온까지 되돌린 후, 0.1 ㎖ 를 마이크로 플레이트에 분주하였다. 비탁법용 Et 측정 시약 (피로텔 (등록상표) -T ; 어소시에이트 오브 케이프 코드 잉크) 0.1 ㎖ 를 첨가하고, 웰리더를 사용하여 1 분간 격렬하게 교반한 후, 37 ℃ 에서 60 분간 가온하면서 측정 파장 405 ㎚ 및 대조 파장 660 ㎚ 에 있어서의 흡광도의 시간 경과적 변화를 측정하고, Et 첨가 회수율을 산출하였다. 결과를 표 9 에 나타낸다.

표 9 에 나타내는 바와 같이, Et 측정 시약으로서 엔도스페시 ES-50M 대신에 피로텔-T 를 사용한 경우에 있어서도, ATⅢ 제제의 희석 배율에 상관없이 Et 첨가 회수율이 거의 100 ％ 로, Et 를 양호한 정밀도로 검출할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 전처리법을 실시함으로써, 리물루스 시약으로서 비탁법용 Et 측정 시약을 사용한 경우에 있어서도, ATⅢ 과 공존하는 Et 의 고정밀의 측정이 가능한 것이 분명해졌다.

＜실시예 7＞ 피로텔 멀티 테스트 (겔화법용 Et 측정 시약) 를 사용한 시험

50 Unit/㎖ 의 ATⅢ 제제 0.1 ㎖ 에 0.24 EU/㎖ 의 Et 표준액 0.1 ㎖ 를 첨가하고, 시험관 믹서를 사용하여 1 분간 격렬하게 교반하였다. 그 후, 물 0.1 ㎖ 를 첨가하고, 시험관 믹서를 사용하여 1 분간 격렬하게 교반한 후, 25 mM 의 CaCl₂ 수용액 0.1 ㎖ 를 첨가하고, 다시 시험관 믹서를 사용하여 1 분간 격렬하게 교반하여, 0.2 ㎖ 를 ATⅢ 의 4 배 희석액으로 하여 다른 용기에 분주하였다. 나머지 0.2 ㎖ 에 물 0.2 ㎖ 를 첨가하고, 시험관 믹서를 사용하여 1 분간 격렬하게 교반한 후, 0.2 ㎖ 를 ATⅢ 의 8 배 희석액으로 하여 다른 용기에 분주하였다. 이 조작을 반복하여, ATⅢ 의 16 배 희석액 및 32 배 희석액도 조제하여, 각각을 다른 용기에 분주하였다. 각 용액을 히트 블록을 사용하여 70 ℃ 에서 10 분간 열처리한 후에 즉시 빙랭하였다. 각 용액을 실온까지 되돌린 후, 0.1 ㎖ 를 바닥이 둥근 시험관에 분주하였다. 겔화법용 Et 측정 시약 (피로텔 (등록상표) 멀티 테스트 ; 어소시에이트 오브 케이프 코드 잉크) 0.1 ㎖ 를 첨가하고, 시험관 믹서를 사용하여 1 분 격렬하게 교반한 후, 히트 블록을 사용하여 37 ℃ 에서 1 시간 가온하였다. 그 후, 시험관을 천천히 전도시켜, 내용물이 유출되지 않는 견고한 겔을 형성하고 있는지 확인하였다. 결과를 표 10 에 나타낸다.

표 10 에 나타내는 바와 같이, 피로텔 멀티 테스트의 검출 한계인 0.03 EU/㎖ 이상의 Et 를 함유하는 ATⅢ 용액에서 내용물의 겔화가 확인되었다. 따라서, 본 발명의 전처리법을 실시함으로써, 리물루스 시약으로서 겔화법용 Et 측정 시약을 사용한 경우에 있어서도, ATⅢ 과 공존하는 Et 의 고정밀의 검출이 가능한 것이 분명해졌다.

＜실시예 8＞ 평행선 정량법을 사용한 시험 (1)

50 Unit/㎖ 의 ATⅢ 제제 0.475 ㎖ 에 1 EU/㎖ 의 Et 표준액 0.11 ㎖ 를 첨가하고, 시험관 믹서를 사용하여 1 분간 격렬하게 교반하였다. 그 후, 물 0.475 ㎖ 를 첨가하고, 시험관 믹서를 사용하여 1 분간 격렬하게 교반한 후, 500 mM 의 MgSO₄ 수용액 0.05 ㎖ 를 첨가하고, 다시 시험관 믹서를 사용하여 1 분간 격렬하게 교반하고, 용액을 히트 블록을 사용하여 70 ℃ 에서 10 분간 열처리한 후에 즉시 빙랭하였다. 용액을 실온까지 되돌린 후, 0.5 ㎖ 를 ATⅢ 의 2 배 희석액으로 하여 다른 용기에 분주하였다. 나머지 0.5 ㎖ 에 물 0.5 ㎖ 를 첨가하고, 시험관 믹서를 사용하여 1 분간 격렬하게 교반한 후, 0.5 ㎖ 를 ATⅢ 의 4 배 희석액으로 하여 다른 용기에 분주하였다. 이 조작을 반복하여, ATⅢ 의 8 배 희석액, 16 배 희석액 및 32 배 희석액도 조제하여, 각각을 다른 용기에 분주하였다. 또, ATⅢ 제제 대신에 엔도톡신 시험용 물을 사용하고, 본 발명의 전처리법을 실시하지 않고 조제한 동일한 희석 계열을 대조 시료로서 준비하였다. 각 용액 0.05 ㎖ 를 마이크로 플레이트에 분주하였다. 엔도스페시 ES-50M 을 0.05 ㎖ 첨가하고, 웰리더를 사용하여 1 분간 격렬하게 교반한 후, 37 ℃ 에서 30 분간 가온하면서 측정 파장 405 ㎚ 및 대조 파장 492 ㎚ 에 있어서의 흡광도의 시간 경과적 변화를 측정하였다. 결과를 표 11 및 도 1 에 나타낸다.

도 1 에 나타내는 바와 같이, ATⅢ 을 함유하는 시료의 희석 배율에 대한 측정값 및 대조 시료 (엔도톡신 표준액의 엔도톡신 시험용 물에 의한 2 배 희석 계열액) 의 엔도톡신 농도에 대한 측정값을 각각 양 로그 플롯하고, 평행선 정량법에 의해 평행성 검정을 실시하였다. 평행선 정량법의 전용 소프트웨어 (PL603 ; 생화학 공업 주식회사) 에 의해 통계학적으로 분석한 결과, 양자는 회귀 및 평행성이 성립하여, 시험에 적합하였다. 평행선 정량법에 의해 산출된 Et 농도 (0.275 EU/㎖) 를 대조 시료의 Et 농도 (0.232 EU/㎖) 로 나눠 산출한 Et 첨가 회수율은 118.5 ％ 가 되었다.

＜실시예 9＞ 평행선 정량법을 사용한 시험 (2)

50 Unit/㎖ 의 ATⅢ 제제 0.8 ㎖ 에 1 EU/㎖ 의 Et 표준액 0.1 ㎖ 를 첨가하고, 시험관 믹서를 사용하여 1 분간 격렬하게 교반하였다. 그 후, 물 0.02 ㎖ 를 첨가하고, 시험관 믹서를 사용하여 1 분간 격렬하게 교반한 후, 500 mM 의 MgSO₄ 수용액 0.08 ㎖ 를 첨가하고, 다시 시험관 믹서를 사용하여 1 분간 격렬하게 교반하고, 용액을 히트 블록을 사용하여 70 ℃ 에서 10 분간 열처리한 후에 즉시 빙랭하였다. 용액의 온도를 실온으로 되돌린 후, 0.5 ㎖ 를 ATⅢ 의 1.25 배 희석액으로 하여 다른 용기에 분주하였다. 나머지 0.5 ㎖ 에 40 mM 의 MgSO₄ 수용액을 0.5 ㎖ 첨가하고, 시험관 믹서를 사용하여 1 분간 격렬하게 교반한 후, 0.5 ㎖ 를 ATⅢ 의 2.5 배 희석액으로 하여 다른 용기에 분주하였다. 이 조작을 반복하여, ATⅢ 의 5 배 희석액, 10 배 희석액, 20 배 희석액도 조제하여, 각각을 다른 용기에 분주하였다. 또, ATⅢ 제제 대신에 엔도톡신 시험용 물을 사용하고, 본 발명의 전처리법을 실시하지 않고 조제한 동일한 희석 계열을 대조 시료로서 준비하였다. 각 용액 0.05 ㎖ 를 마이크로 플레이트에 분주하고, 엔도스페시 ES-50M 을 0.05 ㎖ 첨가하고, 웰리더를 사용하여 1 분간 격렬하게 교반한 후, 37 ℃ 에서 30 분간 가온하면서 측정 파장 405 ㎚ 및 대조 파장 492 ㎚ 에 있어서의 흡광도의 시간 경과적 변화를 측정하였다. 결과를 표 12 및 도 2 에 나타낸다.

도 2 에 나타내는 바와 같이, ATⅢ 을 함유하는 시료의 희석 배율에 대한 측정값 및 대조 시료 (엔도톡신 표준액의 엔도톡신 시험용 물에 의한 2 배 희석 계열액) 의 엔도톡신 농도에 대한 측정값을 각각 양 로그 플롯하고, 평행선 정량법에 의해 평행성 검정을 실시하였다. 평행선 정량법의 전용 소프트웨어 (PL603 ; 생화학 공업 주식회사) 에 의해 통계학적으로 분석한 결과, 양자는 회귀 및 평행성이 성립하여, 시험에 적합하였다. 평행선 정량법에 의해 산출된 Et 농도 (0.122 EU/㎖) 를 대조 시료의 Et 농도 (0.125 EU/㎖) 로 나눠 산출한 Et 첨가 회수율은 97.6 ％ 가 되었다.

＜실시예 10＞ 평행선 정량법을 사용한 시험 (3)

50 Unit/㎖ 의 ATⅢ 제제 472.5 ㎕ 에 20 EU/㎖ 의 Et 표준액 2.5 ㎕ 를 첨가하고, 시험관 믹서를 사용하여 1 분간 격렬하게 교반하였다. 다음으로, 물 6.25 ㎕ 를 첨가하고, 시험관 믹서를 사용하여 1 분간 격렬하게 교반한 후, 2 M 의 MgSO₄ 수용액 18.75 ㎕ 를 첨가하고, 다시 시험관 믹서를 사용하여 1 분간 격렬하게 교반하였다. 그 후, 히트 블록을 사용하여 용액을 70 ℃ 에서 20 분간 열처리한 후에 즉시 빙랭하였다. 용액의 온도를 실온으로 되돌린 후, 250 ㎕ 를 ATⅢ 의 1.06 배 희석액으로 하여 다른 용기에 분주하였다. 나머지 250 ㎕ 에 물을 250 ㎕ 첨가하고, 시험관 믹서를 사용하여 1 분간 격렬하게 교반한 후, 250 ㎕ 를 ATⅢ 의 2.12 배 희석액으로 하여 다른 용기에 분주하였다. 이 조작을 반복하여, ATⅢ 의 4.23 배 희석액, 8.47 배 희석액, 16.93 배 희석액도 조제하여, 각각을 다른 용기에 분주하였다. 또, ATⅢ 제제 대신에 엔도톡신 시험용 물을 사용하고, 본 발명의 전처리법을 실시하지 않고 조제한 동일한 희석 계열을 대조 시료로서 준비하였다. 각 용액 50 ㎕ 를 마이크로 플레이트에 분주하고, 엔도스페시 ES-50M 을 50 ㎕ 첨가하고, 웰리더를 사용하여 1 분간 격렬하게 교반한 후, 37 ℃ 에서 30 분간 가온하면서 측정 파장 405 ㎚ 및 대조 파장 492 ㎚ 에 있어서의 흡광도의 시간 경과적 변화를 측정하였다. 결과를 표 13 및 도 3 에 나타낸다.

도 3 에 나타내는 바와 같이, ATⅢ 을 함유하는 시료의 희석 배율에 대한 측정값 및 대조 시료 (엔도톡신 표준액의 엔도톡신 시험용 물에 의한 2 배 희석 계열액) 의 엔도톡신 농도에 대한 측정값을 각각 양 로그 플롯하고, 평행선 정량법에 의해 평행성 검정을 실시하였다. 평행선 정량법의 전용 소프트웨어 (PL603 ; 생화학 공업 주식회사) 에 의해 통계학적으로 분석한 결과, 양자는 회귀 및 평행성이 성립하여, 시험에 적합하였다. 평행선 정량법에 의해 산출된 Et 농도 (0.111 EU/㎖) 를 대조 시료의 Et 농도 (0.106 EU/㎖) 로 나눠 산출한 Et 첨가 회수율은 104.7 ％ 가 되었다.

따라서, ＜실시예 8＞ ∼ ＜실시예 10＞ 에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 전처리법을 실시함으로써, 생물학적 제제 기준에 기재되어 있는 평행선 정량법에 따라 시험한 경우에 있어서도, ATⅢ 과 공존하는 Et 의 고정밀의 측정이 가능한 것이 분명해졌다.

산업상 이용가능성

본 발명에 의하면, 리물루스 시험에 사용되는 ATⅢ 의 전처리를 실시함으로써, ATⅢ 을 리물루스 시험에 사용할 때의 반응 간섭 작용을 저감시킬 수 있고, 따라서, ATⅢ 의 리물루스 시험을 고정밀도로 실시할 수 있다. 또, 본 발명에 의하면, ATⅢ 의 리물루스 시험을 간편, 신속하고, 또한 염가로 실시할 수 있는 것으로 기대된다.

Claims

리물루스 시험에 사용되는 안티트롬빈 Ⅲ 용 전처리제로서,
2 가 금속염을 함유하고,
안티트롬빈 Ⅲ 을 리물루스 시험에 사용하기 전에, 그 안티트롬빈 Ⅲ 을 상기 전처리제와 공존시킨 상태에서 단백질을 실활시키는 처리에 제공하기 위해 사용되는 전처리제.
제 1 항에 있어서,
상기 2 가 금속염이, 2 가 금속 염화물, 2 가 금속 아세트산염, 및 2 가 금속 황산염으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 또는 그 이상의 금속염인 전처리제.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 2 가 금속염을 구성하는 2 가 금속이, 마그네슘, 칼슘, 망간, 및 아연으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 또는 그 이상의 금속인 전처리제.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
안티트롬빈 Ⅲ 을 상기 전처리제와 공존시켰을 때의 상기 2 가 금속염에서 유래하는 2 가 금속 이온의 농도가 0.5 mM 이상인 전처리제.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 리물루스 시험의 측정 대상 물질이 엔도톡신인 전처리제.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 기재된 전처리제를 함유하는 안티트롬빈 Ⅲ 용 리물루스 시약 키트.
안티트롬빈 Ⅲ 을 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 기재된 전처리제와 공존시킨 상태에서 단백질을 실활시키기는 처리에 제공하는 것을 포함하는, 리물루스 시험에 사용되는 안티트롬빈 Ⅲ 의 전처리 방법.
제 7 항에 있어서,
상기 단백질을 실활시키는 처리가 열처리 또는 산처리인 전처리 방법.
제 8 항에 있어서,
상기 열처리가 50 ℃ 초과의 온도에서 실시되는 전처리 방법.
제 8 항에 있어서,
상기 산처리에 사용되는 산이 염산인 전처리 방법.
제 7 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 기재된 전처리 방법에 의해 안티트롬빈 Ⅲ 을 전처리 하는 것, 및 전처리된 안티트롬빈 Ⅲ 을 리물루스 시험에 사용하는 것을 포함하는, 안티트롬빈 Ⅲ 중의 리물루스 시험의 측정 대상 물질을 측정하는 방법.
제 11 항에 기재된 방법에 의해 안티트롬빈 Ⅲ 중의 리물루스 시험의 측정 대상 물질을 측정하는 것을 포함하는, 안티트롬빈 Ⅲ 을 제조하는 방법.