CN104122396A - 维生素k依赖性蛋白s作为糖尿病标志物的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及维生素K依赖性蛋白S作为糖尿病标志物的应用。本发明提供了一种对于指示糖尿病的发生或发展有用的标志物――维生素K依赖性蛋白S,其在糖尿病患者血清中的含量显著高于正常人群,因此可用于诊断糖尿病或糖尿病患病风险。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体地说,本发明涉及一种维生素K依赖性蛋白S(Vitamin K-dependent protein S,VKDPS)用作检测糖尿病的蛋白质分子标记物的应用。
背景技术
根据国际糖尿病联盟(International Diabetes Federation,IDF)统计,20世纪90年代,全球糖尿病患者为1.00亿人,然而,到了2007年,该数字已经迅速增长到2.46亿人。预计到2025年,全球将有3.80亿人受到糖尿病的困扰。我国已经成为仅次于印度的糖尿病第二大国,人口老龄化以及居民生活方式的改变,使得患病率呈现明显的上升趋势。我国糖尿病的流行情况有以下几个特点,发病人群以2型糖尿病为主、经济发达程度和患病率相关、未诊断的糖尿病比例高于发达国际、男性患病风险高于女性、2型糖尿病患者的平均BMI为25kg/m2等。
糖尿病是一种典型的慢性病,由于血中胰岛素绝对或相对不足,导致血糖过高,出现糖尿,进而引起脂肪和蛋白质代谢紊乱,临床上可出现多尿、烦渴、多饮、多食,消瘦等表现,重者容易发生酮症酸中毒等急性并发症或血管、神经等慢性并发症。糖尿病的发生通常是由于内分泌系统的代谢紊乱而引发的终身性疾病,糖尿病的发生会随着病情的加重而导致全身多个脏器损伤,导致神经系统、心血管系统以及泌尿系统等多种系统的慢性损害,严重者会由于糖尿病的并发症而致残甚至死亡。糖尿病不仅给患者造成痛苦,同时也给家庭和社会造成沉重的负担。
因此,早诊断、早治疗以及早管理糖尿病患者,减少或延缓糖尿病并发症的发生、降低糖尿病的危害程度是糖尿病的防治重点。因此,利用先进的生物学手段找到早期诊断或预测糖尿病患病风险的标志物,为临床诊断提供依据是非常必要的。
发明内容
本发明的目的在于提供维生素K依赖性蛋白S(Vitamin K-dependent proteinS,VKDPS)用作检测糖尿病的蛋白质分子标记物的应用。
在本发明的第一方面,提供一种维生素K依赖性蛋白S作为糖尿病标志物的用途。
在一个优选例中,所述的维生素K依赖性蛋白S还包括其蛋白片段,该蛋白片段的氨基酸序列为维生素K依赖性蛋白S所特有。
在本发明的另一方面,提供一种维生素K依赖性蛋白S的用途,用于制备检测糖尿病的试剂。
在本发明的另一方面,提供一种特异性识别维生素K依赖性蛋白S的试剂的用途,用于制备检测糖尿病或区分糖尿病高危人群的试剂盒。
在一个优选例中,所述的特异性识别维生素K依赖性蛋白S的试剂是特异性抗维生素K依赖性蛋白S或其蛋白片段的抗体。
在本发明的另一方面,提供一种检测糖尿病的试剂盒,所述试剂盒包含容器,以及置于所述容器中的所述的特异性抗维生素K依赖性蛋白S或其蛋白片段的抗体;或包被有所述的特异性抗维生素K依赖性蛋白S或其蛋白片段的抗体的固相载体。
在一个优选例中,所述试剂盒还包含:ELISA检测抗体、ELISA底物(如TMB)、显色试剂。
在另一优选例中,所述试剂盒还包含:说明应用所述抗体检测糖尿病的方法的使用说明书。
本发明的其它方面由于本文的公开内容,对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、维生素K依赖性蛋白S的ELISA结果。纵坐标为维生素K依赖性蛋白S的在正常人群样本(N)和糖尿病人群(D)的血浆样本中含量。两组做T-test检验,p值=0.0177,*表示p<0.05。
图2、维生素K依赖性蛋白S的ELISA结果ROC曲线图。
具体实施方式
本发明人经过广泛的研究和筛选,最终获得一种对于指示糖尿病的发生或发展有用的标志物。所述的标志物是维生素K依赖性蛋白S(VitaminK-dependent protein S,VKDPS),其在糖尿病患者体液中的含量显著高于正常人群,因此可用于确定糖尿病或糖尿病患病风险。
维生素K依赖性蛋白S
维生素K依赖性蛋白S(Vitamin K-dependent protein S,VKDPS)Genebank登录号为GI:190289,NCBI登录号为:NP_000304,Swissprot登录号为:P07225,IPI登录号为:IPI00294004。维生素K依赖性蛋白S(Vitamin K-dependent proteinS,VKDPS)是一种非酶性的血浆糖蛋白,主要合成于肝脏。它以两种形式存在于血浆中:40%呈现游离态;60%在补体C4β结合蛋白形成复合物,从而提高C4β结合蛋白的稳定性。VKDPS作为辅助因子,依赖维生素K,能激活蛋白C,从而达到抑制血液凝固的作用。VKDPS是一种单链糖蛋白,分子量69000±2700Da,氨基酸组成中富含天门冬氨酸、谷氨酸和亮氨酸,等电点为5.0-5.5。VKDPS的主要功能是加速活化的蛋白质C(activated protein C,APC)灭活被激活的Ⅴ因子和Ⅷ因子,从而间接加速抗凝作用。VKDPS作为一种辅因子,在止血和抗凝的过程中有重要的生理意义。
基于本发明的新发现,维生素K依赖性蛋白S可良好地应用于作为糖尿病的分子标记物。检测方便、快捷且准确性高。
检测维生素K依赖性蛋白S所特有的蛋白质片段的氨基酸序列也包括在本发明内。可以通过质谱多反应监测技术来获知待测样本中的多肽含量。
编码所述的维生素K依赖性蛋白S的多核苷酸也包括在本发明内。可通过常规的检测核酸的方法来获知待测样品中所述的多核苷酸的含量。
检测多肽或核酸含量的方法是本领域人员所熟知的。例如,检测多肽可借助于质谱分析仪器等,或可通过Western Blot等方法。检测核酸包括PCR扩增、Northern Blot等方法。
维生素K依赖性蛋白S或其蛋白片段的用途
本发明人将正常健康对照组血浆和糖尿病患者的血浆样品以乙醇沉淀法分级—一体柱串联质谱分析策略对其中的蛋白质进行鉴定,成功在正常人血浆和糖尿病人血浆中都鉴定到了维生素K依赖性蛋白S,为后续ELISA实验验证提供了序列信息。通过酶联免疫吸附法,进一步证实并发现正常健康对照组与糖尿病患者组血浆中维生素K依赖性蛋白S的表达水平存在差异表达。
通过检测正常健康对照以及糖尿病病人血浆中维生素K依赖性蛋白S表达量,本发明人发现维生素K依赖性蛋白S在正常健康对照以及和糖尿病病人血浆中存在差异表达,维生素K依赖性蛋白S在糖尿病病人血浆中的表达水平显著高于正常健康对照血浆中的表达水平;通过MS/MS检测,搜库,查找蛋白质,buildsummary分析,ELISA验证,定量维生素K依赖性蛋白S,进一步证实并发现正常健康对照组、糖尿病患者组的维生素K依赖性蛋白S表达水平存在差异表达。
因此,本发明的第一个目的在于,提供一种维生素K依赖性蛋白S作为检测糖尿病发生或预测糖尿病发生的蛋白质分子标记物的应用。
因此,本发明提供了一种维生素K依赖性蛋白S作为糖尿病标志物的用途。本领域技术人员了解维生素K依赖性蛋白S是一种分布于体液的多功能蛋白,因此,在体液中的维生素K依赖性蛋白S可以作为分子标记物。作为本发明的优选方式,维生素K依赖性蛋白S作为糖尿病的血浆检测标志物。血浆检测取材方便、操作简单、便于复查,患者易于接受,评估预后,指导治疗。
基于本发明的新发现,可以利用维生素K依赖性蛋白S:(i)进行糖尿病的鉴别诊断、和/或易感性分析;(ii)评估相关人群的糖尿病治疗药物、药物疗效、预后,以及选择合适的治疗方法;(iii)早期评估相关人群糖尿病患病风险,早期监测早期预防。
其还可以用于制备特异性识别维生素K依赖性蛋白S的试剂,从而用于检测维生素K依赖性蛋白S的存在与否以及存在量,作为糖尿病的判断依据。
维生素K依赖性蛋白S的试剂和试剂盒
基于本发明的新发现,本发明还提供了特异性识别维生素K依赖性蛋白S的试剂。任何可识维生素K依赖性蛋白S试剂均包含在本发明中,用作检测糖尿病的标志物。所述的特异性识别维生素K依赖性蛋白S或其蛋白片段的试剂例如是特异性结合维生素K依赖性蛋白S的抗体或配体。
本发明还提供了一种特异性识别维生素K依赖性蛋白S的试剂的用途,用于检测糖尿病或糖尿病高危人群。
作为本发明的一种实施方式,所述的试剂是抗维生素K依赖性蛋白S的抗体;更特别的例如是多克隆抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如,纯化的抗原可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生,所述的动物如家兔,小鼠,大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应,包括但不限于弗氏佐剂等。
本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人,Nature256;495,1975;Kohler等人,Eur.J.Immunol.6:511,1976;Kohler等人,Eur.J.Immunol.6:292,1976;Hammerling等人,InMonoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas,Elsevier,N.Y.,1981)。
所述的抗体可用于免疫组织化学技术中,检测标本中的维生素K依赖性蛋白S水平,从而用于诊断糖尿病或判断患病风险。
利用所述的抗体,可以检测体液中维生素K依赖性蛋白S的水平,因而可用于检测糖尿病,可用于预测早期糖尿病的发生,或者用于制备检测糖尿病的制剂或试剂盒等,用于制备预测早期糖尿病的发生的制剂或试剂盒等。
本发明还提供了用于诊断糖尿病的试剂盒,该试剂盒包括:特异性识别维生素K依赖性蛋白S或其蛋白片段的试剂。所述的试剂例如是:单克隆抗体或多克隆抗体。
所述的试剂盒中还可含有:用于免疫组织化学分析的试剂,所述的试剂例如:第二抗体、染色剂、显色剂等。此外,所述的试剂盒中还可包括使用说明书等。
更具体地,所述的试剂盒可以是一种基于酶联免疫反应(ELISA)技术的试剂盒。用于检测糖尿病或预测早期糖尿病的发生。ELISA技术以及基于该技术的检测试剂对于本领域的技术人员来说是显而易见的。
更具体地,所述的特异性识别维生素K依赖性蛋白S或其蛋白片段的试剂也可固定于试纸上,制备成免疫胶体金试纸或类似检测材料。
综上所述,维生素K依赖性蛋白S(Vitamin K-dependent protein S,VKDPS)在糖尿病患者血清中显著升高,与糖尿病的发展有着密切关系,因此该蛋白作为一个分子标记物对其表达量进行检测可用于糖尿病发展的预测。
本领域技术人员了解维生素K依赖性蛋白S(Vitamin K-dependent proteinS,VKDPS)是一种非酶性的血浆单链酸性糖蛋白,分子量在80,000道尔顿,主要合成于肝脏,在内皮细胞和巨核细胞中也合成。它以两种形式存在于血浆中:40%呈现游离态;60%在补体C4β结合蛋白形成复合物,从而提高C4β结合蛋白的稳定性。VKDPS作为辅助因子,依赖维生素K,能激活蛋白C,从而达到抑制血液凝固的作用,促进纤维蛋白溶解,在止血和抗凝血的过程中有重要的生理意义。另外,VKDPS能与肝素等量结合,抑制肝素的抗凝作用。因此,在血清等体液中的维生素K依赖性蛋白S(Vitamin K-dependent protein S,VKDPS)作为本发明所述的分子标记物,这对于本领域的技术人员来说是显而易见的。
因此,制备其相应的抗体,具有意义;利用其抗体,可以用于检测维生素K依赖性蛋白S(Vitamin K-dependent protein S,VKDPS);相应的载维生素K依赖性蛋白S(Vitamin K-dependent protein S,VKDPS)的抗体,由于其能够用于检测体液中维生素K依赖性蛋白S(Vitamin K-dependent protein S,VKDPS)的水平,因而可用于检测糖尿病病程的发展,或者用于制备检测糖尿病的制剂或试剂盒等,用于制备检测糖尿病的发展的制剂或试剂盒等,这对于本领域的技术人员来说是显而易见的。制备ELISA或免疫胶体金试纸等常规的制剂或试剂盒,用于检测糖尿病,可用于检测糖尿病的发展,这对于本领域的技术人员来说也是显而易见的。
虽然有关维生素K依赖性蛋白S(Vitamin K-dependent protein S,VKDPS)的动态生物学功能及其与糖尿病发病的相关机制还有待进一步研究,但是将其作为糖尿病检测的标记物却是肯定的。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如Sambrook等人,分子克隆:实验室指南(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,2002)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数按重量计算。
实施例1、差异表达蛋白质的筛选方法1-乙醇沉淀法分级-一体柱串联质谱策略
本实施例中所有的实验用水均来自Milli-Q(Millipore,Bedford,MA,USA)超纯水装置;Dithiothreitol(DTT)、SDS、尿素、3-[(3-胆酰胺丙基)-二乙]-丙磺基(CHAPS)、Tris、碳酸氢铵(NH4HCO3)和Iodoacetamide(IAA)从Bio-Rad公司(HercμL es,CA,USA)购买;胰蛋白酶(Trypsin)购自Promega公司(Madison,WI,USA);甲酸(formic acid,FA)、三氟乙酸(Ttrifluoroacetic acid,TFA)和乙腈(Acetonitrile)购自Aldrich公司(MilWaukee,WI,USA);磷酸购自上海化学试剂公司。除乙腈为色谱纯外,其余的化学试剂均为分析纯。
糖尿病非肥胖病人血清和糖尿病肥胖病人血清样品由上海交通大学附属上海市第六人民医院糖尿病研究所提供。
在50μL血清样品中加入250μL溶液(100mM NaCl,10mM HEPES,pH7.4),用0.22μm滤膜在4℃10000g的转速下离心去除脂类;取260μL除脂后的血清样品加入182μL冷乙醇溶液,置于4℃立式摇床上混合1h,然后4℃16000g离心45min。上清即为高丰度组分,沉淀部分即为低丰度组分。将两个组分均进行低温冻干,然后各加入200μL2D裂解液进行溶解。取高丰度和低丰度组分各100μL,加入1μL1M DTT,混匀,37℃放置2.5h,冷却至室温后,加入5μL1M IAA,室温避光放置40min。经过上述处理的蛋白质完全变性,二硫键被打开,巯基被封闭。然后将每管溶液用3K的超滤膜,12000g离心超滤,除去溶液中的盐类和其他小分子化合物,使溶剂置换为100mM的碳酸氢铵溶液。完成上述所有操作之后,向两个组分分别加入20μg的胰蛋白酶(Trypsin),37℃水浴酶解24h,再用Millipore10K超滤膜超滤,除去酶和未被酶解的蛋白质,收集滤液、冻干,每管用60μL0.1%甲酸水溶液复溶,取1/3样品进行质谱分析。
一体柱串联质谱(IMDL-MS/MS)包括一个自动进样器、一个高压混合泵和一个用于二维液相色谱分离的Bi-phase整体柱。Bi-phase整体柱分为两段:前半段为强阳离子交换柱,后半段为C18反相柱(300μm ID;50mm length,Column Technology Inc,USA)。高效液相色谱溶液包括A:0.1%甲酸;B:0.1%甲酸,100%乙腈。酶解后的肽段混合物经自动进样器以无损失的模式进入到一体柱中,肽段混合物先经过一体柱的前半部分(即强阳离子交换柱部分),大部分肽段被结合在强阳离子交换柱上,未保留部分被冲到后半部分的C18反相柱上,然后用2-40%的B溶液冲洗120min,并进行质谱检测。在自动进样器中,以不同的pH梯度和无损失进样模式把100μL pH溶液进样到一体柱里,即把一部分肽段混合物从一体柱的前半部分(强阳离子交换柱部分)洗脱到后半部分(C18反相柱),2-40%的B溶液冲洗120min,并进行质谱检测;用不同pH溶液重复上述过程共11次。在整个过程中的质谱条件为:质谱扫描条件设定为一个400-2000w/z的全扫描(full scan)后面进行全扫描中前10个最高峰的MS/MS扫描,其中动态排除(dynamic exclusion)的设定是:重复次数(repeat count)为2,重复容忍时间(repeat duration)为30s,动态排除时间(exclusion duration)为90s。
实验中使用了27例血浆样品包括:10例正常人样本和17例糖尿病人样本。每组中,各自取出等体积血浆样本混匀成150μL血浆混合样品,分别进行上述实验操作。所有样本临床生理指标见表1。测定的临床指标分别为:性别(性别“1”表示男性;“2”表示女性;以下同),年龄,餐前血糖(FPG,mmol/l),餐前2小时(PG2H,mmol/l),血糖胰岛素(Insμlin,μU/ml),总甘油三酯(TG,mmol/l),总胆固醇(TC,mmol/l),高密度脂蛋白(HDL,mmol/l),低密度脂蛋白(LDL,mmol/l)。
表1、27例血浆样本临床生理指标
实施例2、质谱结果分析
将上述实施例中两次质谱检测得到的差异表达蛋白质原始数据用IPIhuman3.07查库,做Buildsummary,肽段筛选策略为Peptide FDR<=1%且Unipeptides>=2的参数,共鉴定到662个蛋白质。进行蛋白分析和Student’s TTest分析。
表2显示了2组血浆中维生素K依赖性蛋白S(Vitamin K-dependent proteinS,VKDPS)鉴定次数。根据表2中VKDPS鉴定次数,进行归一化处理,归一化的方法是用一个样本中一个蛋白质的鉴定次数/这个样本中所有蛋白质鉴定数量的总和×105,基于归一化之后的数据获得T检验结果。表2还包括T检验结果获得的P-值。
表2
P-值为0.012909,因此可以确定维生素K依赖性蛋白S作为进一步分析的蛋白标志物。
实施例3、维生素K依赖性蛋白S差异表达的酶联免疫吸附法验证
本实施例中使用的酶联免疫吸附试剂盒购于UscnUscnLifeScienceInc.Wuhan。运用双抗体夹心ELISA法定量测定人血浆中维生素K依赖性蛋白S的含量。样本信息如下表3所示,其中包括110例血浆样品包括:55例正常人群样本(N)、23例糖尿病高血压人群(DH)样本以及32例糖尿病(DM)无高血压人群样本。
血浆:用EDTA作为抗凝剂采集标本,并将标本在采集后的30分钟内于4℃,1000g,离心15分钟,取上清检测,或将上清置于-20℃或-80℃保存,避免反复冻融。
表3、ELISA实验110例血浆样本临床生理指标
应用ELISA方法检测维生素K依赖性蛋白S差异表达。应用的ELISA试剂盒购自Uscn Life Science Inc.Wuhan;产品名称:人维生素K依赖蛋白S(VKDPs)酶联免疫分析试剂盒;产品编号:E1971h,其中包含包被有抗VKDPs抗体的微孔板,以及下述的各种稀释液、标准品、检测溶液、洗涤液、底物溶液、终止液等。
1、使用前,将所有的试剂和标本缓慢均衡至室温(18-25℃),不能直接在37℃溶解。
2、标准品:每瓶标准品用标准品稀释液稀释至1mL,盖好后室温静置大约10分钟,同时反复颠倒/搓动以助溶解,其浓度为400ng/ml。准备8个稀释标准品的EP管,每个EP管中加入500μL的标准品稀释液,依次倍比稀释成400ng/ml,200ng/ml,100ng/ml,50ng/ml,25ng/ml,12.5ng/ml,6.25ng/ml,标准品稀释液(0ng/mL)直接作为空白孔。
3、检测稀释液A:用6mL蒸馏水或去离子水将6mL浓检测液A及B稀释至12mL,进行2倍稀释,稀释后的工作液不宜进行冷冻保存。
4、检测溶液A(DetectionA)及检测溶液B(DetectionB):DetectionA及DetectionB在使用前甩几下或少时离心处理,以使管壁或瓶盖的液体沉积到管底。临用前分别以检测稀释液A或B1:100稀释,稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制(100μl/孔),实际配制时应多配制0.1-0.2ml。充分混匀。
5、浓洗涤液:用480mL蒸馏水或去离子水将20mL浓洗涤液稀释至500mL,进行25倍稀释。
6、底物溶液:用灭菌的移液器吸头吸取所需体积的TMB至另一干净容器中使用。
操作步骤
实验前预测标本含量,如果标本浓度过高,应对标本进行稀释,使稀释后的标本符合试剂盒的检测范围,计算时再乘以相应的稀释倍数。
1、抗体包被:用纯化的抗体包被96孔微孔板,制成微孔中包被抗体的固相载体。
2、加样:分别设标准孔、待测样品孔、空白孔。设标准孔8孔,依次加入100μL不同浓度(400ng/ml,200ng/ml,100ng/ml,50ng/ml,25ng/ml,12.5ng/ml,6.25ng/ml)的标准品。空白孔加100μL,余孔加待测样品100μL,酶标板加上覆膜,37℃温育2小时。
3、弃去液体,甩干,不用洗涤。
4、每孔加检测溶液A工作液100μL(临用前一小时内配制),酶标板加上覆膜,37℃温育1小时。
5、弃去孔内液体,每孔用400μL的洗涤液洗涤,浸泡1-2分钟,轻拍将孔内液体拍干,重复洗板3次。最后一次洗涤后,要把孔内的洗涤液完全拍干。
6、每孔加检测溶液B工作液100μL,加上覆膜,37℃温育60分钟。
7、弃去孔内液体,甩干,洗板5次,每次浸泡1-2分钟,每孔用350μL洗涤液洗涤,甩干。
8、每孔加底物TMB溶液90μL,酶标板加上覆膜,37℃避光显色(反应时间控制在15-25分钟,不要超过30分钟。当标准孔的前3-4孔有明显的梯度蓝色,后3-4孔梯度不明显时,即可终止)。
9、每孔加终止溶液(2N H2SO4)50μL,终止反应,此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。如出现颜色不匀一,请轻轻晃动酶标板以使溶液混合均匀。
10、在确保酶标板底无水滴及孔内无气泡后,立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度(O.D.值)。
计算
各标准品及样本O.D.值扣除空白孔O.D.值后作图(八点图),设置复孔,取其平均值计算。以标准品的浓度为纵坐标(对数坐标),O.D.值为横坐标(对数坐标),在对数坐标纸上绘出标准曲线(最佳方程式应依回归方程计算的R2值来定,以R2值越趋近于1为好)。根据样品O.D.值,由标准曲线查出相应的浓度,乘以稀释倍数;或用标准物的浓度与O.D.值计算出标准曲线的回归方程式,将样品的O.D.值代入方程式,计算出样品浓度,再乘以稀释倍数,即为样品的实际浓度。
表4、酶联免疫吸附法测定正常人群和糖尿病人群
中维生素K依赖性蛋白S的含量
表4中,D1-D23对应于前述DH1-DH23,D24-D55对应于前述DM1-DM32。
对上述表4数据进行作图,结果如图1所示,可见两组之间存在统计学差异,P值小于0.05。
维生素K依赖性蛋白S的ELISA结果ROC曲线图如图2,根据该图,曲线下面积为:0.644,维生素K依赖性蛋白S之cut off=94.3050,灵敏度=0.5273,假阳性率=0.3091,特异度=0.6909。
因此,维生素K依赖性蛋白S可以作为糖尿病临床诊断的标志物。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (8)
1.一种维生素K依赖性蛋白S作为糖尿病标志物的用途。
2.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述的维生素K依赖性蛋白S还包括其蛋白片段,该蛋白片段的氨基酸序列为维生素K依赖性蛋白S所特有。
3.一种维生素K依赖性蛋白S的用途,用于制备检测糖尿病的试剂。
4.一种特异性识别维生素K依赖性蛋白S的试剂的用途,用于制备检测糖尿病或区分糖尿病高危人群的试剂盒。
5.如权利要求4所述的用途,其特征在于,所述的特异性识别维生素K依赖性蛋白S的试剂是特异性抗维生素K依赖性蛋白S或其蛋白片段的抗体。
6.一种检测糖尿病的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包含容器,以及置于所述容器中的权利要求6所述的特异性抗维生素K依赖性蛋白S或其蛋白片段的抗体;或包被有权利要求6所述的特异性抗维生素K依赖性蛋白S或其蛋白片段的抗体的固相载体。
7.如权利要求6所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包含:
ELISA检测抗体、ELISA底物、显色试剂。
8.如权利要求6所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包含:说明应用所述抗体检测糖尿病的方法的使用说明书。
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Citations (6)
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---|---|---|---|---|
WO2001056532A2 (en) * | 2000-02-04 | 2001-08-09 | The Scripps Research Institute | Neuroprotective, antithrombotic and anti-inflammatory uses of activated protein c (apc) |
CA2499458A1 (en) * | 2002-09-30 | 2004-04-15 | Socratech L.L.C. | Protein s protects the nervous system from injury |
US20040132688A1 (en) * | 2001-02-28 | 2004-07-08 | Griffin John H. | Plasma glucosylceramide deficiency as risk factor for thrombosis and modulator of anticoagulant protein C |
US20070077603A1 (en) * | 2005-07-12 | 2007-04-05 | Heeb Mary J | Elisa to detect multimeric forms of a protein |
CN102596246A (zh) * | 2009-08-20 | 2012-07-18 | Twi生物技术有限公司 | 诊断糖尿病及测定治疗疗效的方法 |
CN102901789A (zh) * | 2012-09-21 | 2013-01-30 | 中国药科大学 | 糖尿病肾病早期诊断的血清代谢标志物测定方法 |
-
2013
- 2013-04-23 CN CN201310143237.0A patent/CN104122396A/zh active Pending
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2001056532A2 (en) * | 2000-02-04 | 2001-08-09 | The Scripps Research Institute | Neuroprotective, antithrombotic and anti-inflammatory uses of activated protein c (apc) |
US20040132688A1 (en) * | 2001-02-28 | 2004-07-08 | Griffin John H. | Plasma glucosylceramide deficiency as risk factor for thrombosis and modulator of anticoagulant protein C |
CA2499458A1 (en) * | 2002-09-30 | 2004-04-15 | Socratech L.L.C. | Protein s protects the nervous system from injury |
US20070077603A1 (en) * | 2005-07-12 | 2007-04-05 | Heeb Mary J | Elisa to detect multimeric forms of a protein |
CN102596246A (zh) * | 2009-08-20 | 2012-07-18 | Twi生物技术有限公司 | 诊断糖尿病及测定治疗疗效的方法 |
CN102901789A (zh) * | 2012-09-21 | 2013-01-30 | 中国药科大学 | 糖尿病肾病早期诊断的血清代谢标志物测定方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
HOYU TAKAHASHI 等: "Plasma protein S in disseminated intravascular coagulation, liver disease, collagen disease, diabetes mellitus, and under oral anticoagulant therapy", 《CLINICA CHIMICA ACTA》 * |
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