CN106526193B

CN106526193B - 蛋白质gp1ba/vwf用作检测2型糖尿病的分子标记的应用

Info

Publication number: CN106526193B
Application number: CN201510571626.2A
Authority: CN
Inventors: 吴家睿; 曾嵘; 贾伟平; 李荣霞; 夏方莹; 周健
Original assignee: Shanghai Advanced Research Institute of CAS; Shanghai Sixth Peoples Hospital
Current assignee: Shanghai Advanced Research Institute of CAS; Shanghai Sixth Peoples Hospital
Priority date: 2015-09-10
Filing date: 2015-09-10
Publication date: 2018-05-15
Anticipated expiration: 2035-09-10
Also published as: CN106526193A

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及GP1BA蛋白质用作检测2型糖尿病的蛋白质分子标记物的应用。本发明首次发现GP1BA蛋白在2型糖尿病患者的血浆中的含量显著高于正常人群，采用GP1BA作为指标，预测2型糖尿病的发生，ROC曲线下面积为0.907，具有较高的诊断价值。本发明还进一步首次发现，将GP1BA蛋白和vWF蛋白联用，以GP1BA比上vWF的比值（GP1BA/vWF）作为指标，预测2型糖尿病的发生，ROC曲线下面积是0.973，指标诊断价值非常高。

Description

蛋白质GP1BA/VWF用作检测2型糖尿病的分子标记的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及GP1BA蛋白质用作检测2型糖尿病的蛋白质分子标记物的应用。

背景技术

(1)关于2型糖尿病

糖尿病是一种因体内胰岛素分泌绝对或者相对不足所导致的一系列临床综合症。糖尿病可以引起多种并发症，如低血糖症、酮酸中毒、非酮高渗性昏迷。严重的长期并发症包括：心血管疾病、慢性肾衰竭、视网膜病变、神经病变及微血管病变等。流行病学调查结果显示，目前我国糖尿病的患病率由10年前的3.2％上升到约5％，在上海、北京等发达地区糖尿病患病率达10％，其中，2型糖尿病占糖尿病患者总数的90-95％。国际糖尿病联盟(International Diabetes Federation，IDF)发布的“全球糖尿病概览”(the DiabetesAtlas)是国际上有关糖尿病全球患病情况和相关信息的权威参考书和重要的数据来源。随着生活水平的提高，平均寿命的延长，目前全球糖尿病患病人数呈直线上升趋势，根据IDF的最新数据，2013年全球约有3.87亿成年人患有糖尿病，占全世界人口的8.3％，其中中国的糖尿病患者人数居全球之首为9840万，约占全球糖尿病人总数的四分之一；其次是印度(6510万)、美国(2440万)、巴西(1190万)、俄罗斯(1090万)。至2035年，如果这些趋势仍在持续，则全球大约有5.92亿的人群，或每10名成年人中的1人将患有糖尿病。国际糖尿病联合会估计，到2030年中国糖尿病患者每年的医疗费用将达到280亿美元。然而我国单个病人的年度治疗费用远低于发达国家水平。美国平均每个糖尿病人花费7000美元，德国在4000美元左右，中国却不到1000美元，甚至低于巴西和俄国。由此看来与发达国家相比，中国达到理想的诊疗环境还需要一定的时间，而糖尿病所带来的一些临床并发症愈发明显，给病人以及患者家属带来了肉体上，精神上与经济上的巨大的负担。

(2)生物标志物

生物标志物的筛选已经成为目前生物医学领域研究的热点。一个具有临床应用价值的生物标志物不仅要具有足够的组织特异性用于疾病预测，而且在疾病早期还要有足够的灵敏度进行诊断。

近年来关于糖尿病相关生物标记物的发现多数是关于代谢小分子方面的研究，相比较而言，血浆蛋白质相关的糖尿病标记物的研究并不是很多。

(3)血浆蛋白质检测的重要意义

血浆蛋白质参与到机体免疫、物质运输、凝血-抗凝血和对生长信号调节等多种重要的生物过程中。人体器官的病理变化可导致血浆蛋白质在结构和数量上的改变，这种特征性的变化对疾病诊断和治疗方法的疗效监测有十分重要的意义。血浆蛋白质具有一系列重要的生理功能，血浆中特定蛋白质的浓度变化往往预示着某些疾病的发生。同时，血浆是取材容易、应用广泛的研究样品。部分血浆蛋白质的表达水平与其相应的mRNA水平的相关性很差。因此，监测血浆蛋白质的浓度变化对疾病的早期诊断、病因学的阐明以及药物疗效的监测都具有重要意义。

(4)关于蛋白质GP1BA和vWF

GP1BA，Platelet glycoprotein Ib alpha chain，uniprot号P07359，是血小板的一种表面膜蛋白，参与包括血液凝固、细胞粘附、血小板激活等生物学过程。同时，它是vWF的受体。vWF，von Willebrand factor，uniprot号P04275，是一类止血相关的血浆糖蛋白，vWF可同时与胶原纤维和血小板结合，当血管破裂时大量血小板以vWF为中介，粘附在胶原纤维上，形成血栓，得以止血。现有技术当中，并未见GP1BA和vWF与2型糖尿病关系的相关报道。

发明内容

为了克服现有技术中的缺陷，本发明的目的在于提供GP1BA蛋白在制备或筛选2型糖尿病诊断试剂中的用途。

本发明的另一目的在于提供特异识别GP1BA蛋白的试剂在制备2型糖尿病诊断试剂盒中的用途。

本发明的另一目的在于提供一种2型糖尿病诊断试剂盒。

本发明的另一目的在于提供GP1BA蛋白作为2型糖尿病标志物的用途。

本发明的另一目的在于提供一种2型糖尿病诊断方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明的第一方面，提供GP1BA蛋白在制备或筛选2型糖尿病诊断试剂中的用途。

较优的，所述GP1BA蛋白为生物标志物。

更优的，所述GP1BA蛋白为血清生物标志物。

将GP1BA蛋白用于制备2型糖尿病诊断试剂，是指将GP1BA蛋白作为一项2型糖尿病诊断指标应用于2型糖尿病诊断试剂的制备。在另一优选例中，直接将GP1BA蛋白作为标准品或阳性对照，用于样本血清中的GP1BA蛋白水平的检测。

将GP1BA蛋白用于筛选2型糖尿病诊断试剂，是指将GP1BA蛋白作为一项2型糖尿病诊断指标应用于2型糖尿病诊断试剂的筛选。较优的，可采用特异性识别GP1BA蛋白的试剂来检测样本血清中的GP1BA蛋白水平。

在另一优选例中，基于所述的GP1BA蛋白，筛选特异性结合GP1BA蛋白的抗体或配体，从而作为2型糖尿病诊断试剂。

较优的，所述用途是GP1BA蛋白与vWF蛋白共同作为生物标志物。

更优的，所述用途是GP1BA蛋白与vWF蛋白共同作为血清生物标志物。

在另一优选例中，将GP1BA蛋白水平与vWF蛋白水平的比值作为一项2型糖尿病诊断指标。

本发明的第二方面，提供了特异性识别GP1BA蛋白的试剂在制备检测2型糖尿病诊断试剂盒中的用途。

在另一优选例中，所述的特异性识别GP1BA蛋白的试剂选自特异性结合GP1BA蛋白的抗体或配体。

在另一优选例中，所述抗体包括包括单克隆抗体和多克隆抗体。

在本发明的第三方面，提供了一种2型糖尿病诊断试剂盒，所述的试剂盒中至少含有特异性识别GP1BA蛋白的试剂。

在另一优选例中，所述的特异性识别GP1BA蛋白的试剂选自特异性结合GP1BA蛋白的试剂的抗体或配体。

在另一优选例中，所述的试剂盒中还含有：特异性识别vWF蛋白的试剂。

在另一优选例中，所述的特异性识别vWF蛋白的试剂选自特异性结合vWF蛋白的试剂的抗体或配体。

在另一优选例中，所述的试剂盒中还含有：GP1BA蛋白和/或vWF蛋白。

在另一优选例中，所述的试剂盒中还含有：

免疫结合(如抗原抗体结合)试剂；或酶联免疫检测(ELISA)试剂。

在本发明的第四方面，提供了GP1BA蛋白作为2型糖尿病生物标志物的用途。

在另一优选例中，GP1BA蛋白与vWF蛋白共同作为2型糖尿病生物标志物。

较优的，所述生物标志物为血清生物标志物。

在本发明的第五方面，提供了一种诊断2型糖尿病的方法，包括检测样本血清中GP1BA蛋白的水平。

优选的，所述方法还包括检测样本血清中vWF蛋白的水平，将GP1BA蛋白的水平与vWF蛋白的水平的比值作为2型糖尿病的一项诊断指标。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

(1)本发明首次发现GP1BA蛋白在2型糖尿病患者的血浆中的含量显著高于正常人群，采用GP1BA作为指标，预测2型糖尿病的发生，ROC曲线下面积为0.907，具有较高的诊断价值。

(2)本发明还进一步首次发现，将GP1BA蛋白和vWF蛋白联用，以GP1BA比上vWF的比值(GP1BA/vWF)作为指标，预测2型糖尿病的发生，ROC曲线下面积是0.973，指标诊断价值非常高。

附图说明

图1.GP1BA在不同组内的定量情况。

图2.vWF在不同组内的定量情况。

图3.GP1BA/vWF在不同组内的定量情况。

图4.GP1BA用于2型糖尿病诊断的ROC曲线。

图5.vWF用于2型糖尿病诊断的ROC曲线。

图6.GP1BA/vWF用于2型糖尿病诊断的ROC曲线。

具体实施方式

本发明经过广泛而深入的研究，首次发现GP1BA蛋白在2型糖尿病患者的血浆中的含量显著高于正常人群，从而提示GP1BA蛋白在2型糖尿病的发生和发展过程中起到较为重要的作用。GP1BA蛋白可以作为2型糖尿病的一种诊断标志物，有助于2型糖尿病的易感性分析、诊断和治疗。根据人GP1BA蛋白设计的药物和诊断技术，可用于诊断和治疗人类的2型糖尿病。在此基础上完成了本发明。

GP1BA蛋白及其用途

GP1BA，Platelet glycoprotein Ib alpha chain，uniprot号P07359，是血小板的一种表面膜蛋白，参与包括血液凝固、细胞粘附、血小板激活等生物学过程。同时，它是vWF的受体。vWF，von Willebrand factor，uniprot号P04275，是一类止血相关的血浆糖蛋白，vWF可同时与胶原纤维和血小板结合，当血管破裂时大量血小板以vWF为中介，粘附在胶原纤维上，形成血栓，得以止血。

GP1BA的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：

MPLLLLLLLLPSPLHPHPICEVSKVASHLEVNCDKRNLTALPPDLPKDTTILHLSENLLYTFSLATLMPYTRLTQLNLDRCELTKLQVDGTLPVLGTLDLSHNQLQSLPLLGQTLPALTVLDVSFNRLTSLPLGALRGLGELQELYLKGNELKTLPPGLLTPTPKLEKLSLANNNLTELPAGLLNGLENLDTLLLQENSLYTIPKGFFGSHLLPFAFLHGNPWLCNCEILYFRRWLQDNAENVYVWKQGVDVKAMTSNVASVQCDNSDKFPVYKYPGKGCPTLGDEGDTDLYDYYPEEDTEGDKVRATRTVVKFPTKAHTTPWGLFYSWSTASLDSQMPSSLHPTQESTKEQTTFPPRWTPNFTLHMESITFSKTPKSTTEPTPSPTTSEPVPEPAPNMTTLEPTPSPTTPEPTSEPAPSPTTPEPTPIPTIATSPTILVSATSLITPKSTFLTTTKPVSLLESTKKTIPELDQPPKLRGVLQGHLESSRNDPFLHPDFCCLLPLGFYVLGLFWLLFASVVLILLLSWVGHVKPQALDSGQGAALTTATQTTHLELQRGRQVTVPRAWLLFLRGSLPTFRSSLFLWVRPNGRVGPLVAGRRPSALSQGRGQDLLSTVSIRYSGHSL。

vWF的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：

MIPARFAGVLLALALILPGTLCAEGTRGRSSTARCSLFGSDFVNTFDGSMYSFAGYCSYLLAGGCQKRSFSIIGDFQNGKRVSLSVYLGEFFDIHLFVNGTVTQGDQRVSMPYASKGLYLETEAGYYKLSGEAYGFVARIDGSGNFQVLLSDRYFNKTCGLCGNFNIFAEDDFMTQEGTLTSDPYDFANSWALSSGEQWCERASPPSSSCNISSGEMQKGLWEQCQLLKSTSVFARCHPLVDPEPFVALCEKTLCECAGGLECACPALLEYARTCAQEGMVLYGWTDHSACSPVCPAGMEYRQCVSPCARTCQSLHINEMCQERCVDGCSCPEGQLLDEGLCVESTECPCVHSGKRYPPGTSLSRDCNTCICRNSQWICSNEECPGECLVTGQSHFKSFDNRYFTFSGICQYLLARDCQDHSFSIVIETVQCADDRDAVCTRSVTVRLPGLHNSLVKLKHGAGVAMDGQDVQLPLLKGDLRIQHTVTASVRLSYGEDLQMDWDGRGRLLVKLSPVYAGKTCGLCGNYNGNQGDDFLTPSGLAEPRVEDFGNAWKLHGDCQDLQKQHSDPCALNPRMTRFSEEACAVLTSPTFEACHRAVSPLPYLRNCRYDVCSCSDGRECLCGALASYAAACAGRGVRVAWREPGRCELNCPKGQVYLQCGTPCNLTCRSLSYPDEECNEACLEGCFCPPGLYMDERGDCVPKAQCPCYYDGEIFQPEDIFSDHHTMCYCEDGFMHCTMSGVPGSLLPDAVLSSPLSHRSKRSLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMGCVSGCLCPPGMVRHENRCVALERCPCFHQGKEYAPGETVKIGCNTCVCQDRKWNCTDHVCDATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGECQYVLVQDYCGSNPGTFRILVGNKGCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEVNVKRPMKDETHFEVVESGRYIILLLGKALSVVWDRHLSISVVLKQTYQEKVCGLCGNFDGIQNNDLTSSNLQVEEDPVDFGNSWKVSSQCADTRKVPLDSSPATCHNNIMKQTMVDSSCRILTSDVFQDCNKLVDPEPYLDVCIYDTCSCESIGDCACFCDTIAAYAHVCAQHGKVVTWRTATLCPQSCEERNLRENGYECEWRYNSCAPACQVTCQHPEPLACPVQCVEGCHAHCPPGKILDELLQTCVDPEDCPVCEVAGRRFASGKKVTLNPSDPEHCQICHCDVVNLTCEACQEPGGLVVPPTDAPVSPTTLYVEDISEPPLHDFYCSRLLDLVFLLDGSSRLSEAEFEVLKAFVVDMMERLRISQKWVRVAVVEYHDGSHAYIGLKDRKRPSELRRIASQVKYAGSQVASTSEVLKYTLFQIFSKIDRPEASRITLLLMASQEPQRMSRNFVRYVQGLKKKKVIVIPVGIGPHANLKQIRLIEKQAPENKAFVLSSVDELEQQRDEIVSYLCDLAPEAPPPTLPPDMAQVTVGPGLLGVSTLGPKRNSMVLDVAFVLEGSDKIGEADFNRSKEFMEEVIQRMDVGQDSIHVTVLQYSYMVTVEYPFSEAQSKGDILQRVREIRYQGGNRTNTGLALRYLSDHSFLVSQGDREQAPNLVYMVTGNPASDEIKRLPGDIQVVPIGVGPNANVQELERIGWPNAPILIQDFETLPREAPDLVLQRCCSGEGLQIPTLSPAPDCSQPLDVILLLDGSSSFPASYFDEMKSFAKAFISKANIGPRLTQVSVLQYGSITTIDVPWNVVPEKAHLLSLVDVMQREGGPSQIGDALGFAVRYLTSEMHGARPGASKAVVILVTDVSVDSVDAAADAARSNRVTVFPIGIGDRYDAAQLRILAGPAGDSNVVKLQRIEDLPTMVTLGNSFLHKLCSGFVRICMDEDGNEKRPGDVWTLPDQCHTVTCQPDGQTLLKSHRVNCDRGLRPSCPNSQSPVKVEETCGCRWTCPCVCTGSSTRHIVTFDGQNFKLTGSCSYVLFQNKEQDLEVILHNGACSPGARQGCMKSIEVKHSALSVELHSDMEVTVNGRLVSVPYVGGNMEVNVYGAIMHEVRFNHLGHIFTFTPQNNEFQLQLSPKTFASKTYGLCGICDENGANDFMLRDGTVTTDWKTLVQEWTVQRPGQTCQPILEEQCLVPDSSHCQVLLLPLFAECHKVLAPATFYAICQQDSCHQEQVCEVIASYAHLCRTNGVCVDWRTPDFCAMSCPPSLVYNHCEHGCPRHCDGNVSSCGDHPSEGCFCPPDKVMLEGSCVPEEACTQCIGEDGVQHQFLEAWVPDHQPCQICTCLSGRKVNCTTQPCPTAKAPTCGLCEVARLRQNADQCCPEYECVCDPVSCDLPPVPHCERGLQPTLTNPGECRPNFTCACRKEECKRVSPPSCPPHRLPTLRKTQCCDEYECACNCVNSTVSCPLGYLASTATNDCGCTTTTCLPDKVCVHRSTIYPVGQFWEEGCDVCTCTDMEDAVMGLRVAQCSQKPCEDSCRSGFTYVLHEGECCGRCLPSACEVVTGSPRGDSQSSWKSVGSQWASPENPCLINECVRVKEEVFIQQRNVSCPQLEVPVCPSGFQLSCKTSACCPSCRCERMEACMLNGTVIGPGKTVMIDVCTTCRCMVQVGVISGFKLECRKTTCNPCPLGYKEENNTGECCGRCLPTACTIQLRGGQIMTLKRDETLQDGCDTHFCKVNERGEYFWEKRVTGCPPFDEHKCLAEGGKIMKIPGTCCDTCEEPECNDITARLQYVKVGSCKSEVEVDIHYCQGKCASKAMYSIDINDVQDQCSCCSPTRTEPMQVALHCTNGSVVYHEVLNAMECKCSPRKCSK。

现有技术当中，还没有将GP1BA作为2型糖尿病的分子标记的有关报道。

本发明通过实验发现，GP1BA在2型糖尿病人血浆中表达量显著高于正常人组。因此，本发明提供了一种GP1BA蛋白作为2型糖尿病标志物的用途。作为本发明的优选方式，GP1BA蛋白作为2型糖尿病的血浆检测标志物。血浆检测取材方便、操作简单、便于复查，患者易于接受，评估预后，指导治疗。

此外，本发明还进一步发现，2型糖尿病人血浆中，GP1BA表达量与vWF的表达量的比值(GP1BA/vWF比值)显著高于正常人组中的GP1BA/vWF比值。因此，本发明还提供了一种GP1BA蛋白与vWF蛋白联用作为2型糖尿病标志物的用途。

基于本发明人的上述新发现，可利用GP1BA蛋白作为诊断2型糖尿病的标志物：(i)进行2型糖尿病的鉴别诊断，和/或易感分析；(ii)评估相关人群的2型糖尿病治疗药物、药物疗效、患者预后，以及选择合适的治疗方法；(iii)评估相关人群2型糖尿病患病风险、检测并进行早期防治。

因此，本发明提供了GP1BA蛋白的用途，用于制备或筛选诊断(或检测)2型糖尿病的试剂或试剂盒。

检测试剂

可采用各种本领域已知的技术来检测GP1BA蛋白的存在与否及表达情况，这些技术均包含在发明中。例如，可用已有技术如Southern印迹法、Wester印迹法等，这些方法可结合使用。

本发明还提供用于在分析物中检测GP1BA蛋白的存在与否以及表达情况的试剂。优选的，当进行蛋白水平的检测时，可采取特异性识别GP1BA蛋白的抗体来确定GP1BA蛋白的存在与否。

利用特异性结合GP1BA蛋白的抗体来检测分析物中GP1BA蛋白表达情况的方法也是本领域人员熟知的技术。

可以通过本领域内技术人员已知的各种技术制备结合GP1BA蛋白的抗体，也可采用商业化的抗体。例如，纯化的GP1BA蛋白，可被施用于动物以诱导多克隆抗体产生。与之相似的，表达GP1BA蛋白的细胞可用来免疫动物来产生抗体。本发现的抗体也可以是单克隆抗体。此类克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature256；495,1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6:511,1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodiesand T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。

多克隆抗体的生产可用GP1BA蛋白免疫动物，如家兔、小鼠、大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。

在单克隆抗体或多克隆抗体上标记特异性的可检测信号也是本领域人员已知的技术，例如，可将辣根根过氧化物酶偶联于所述的特异性结合GP1BA蛋白的抗体，从而可通过显色反应来得知抗原抗体结合反应的发生与否。

一种检测待测样品中是否存在GP1BA蛋白的方法，是采用GP1BA蛋白的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与GP1BA蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在GP1BA蛋白。

检测试剂盒

本发明还提供了用于在分析物中检测GP1BA蛋白的存在与否以表达情况的试剂盒，该试剂盒包括：特异性结合GP1BA蛋白的抗体或配体。

此外，所述的试剂盒中还可包括免疫结合(抗原抗体结合)试剂或酶联免疫检测(如ELISA)试剂等；以及用于杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于：杂交液、酶、对照液、显色液、洗涤液等。

本发明的主要优点在于：

(1)首次揭示：GP1BA蛋白或GP1BA蛋白与vWF蛋白一起可以作为诊断2型糖尿病的标志物。

(2)首次制备出了特异性识别GP1BA蛋白的试剂，所述试剂特异性好，检测灵敏度高，准确性高，具有良好的临床应用价值。

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其它优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等

MOLECμLAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENTPROTOCOLS IN MOLECμLAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987 and periodicupdates；the series METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECμLAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

试剂及实验流程

(1)化学试剂

所有缓冲液均用Milli-Q水(Millipore，Bedford，MA，USA)配制。二硫苏糖醇(DTT)、碘代乙酰胺(IAA)、尿素(Urea)、十二烷基磺酸钠(SDS)、三(羟甲基)氨基乙烷-盐酸(Tris-HCl)等购自Bio-Rad公司(Hercules，CA，USA)；甲酸(Formic acid，FA)、碳酸氢铵(NH4HCO3)等购自Sigma公司(St.Lous，MO，USA)；HPLC级乙腈(ACN)和甲醇(Methanol)购自Fisher公司(Fair Lawn，NJ，USA)；胰酶(Trypsin)购自Promega公司(Madison，WI，USA)；TMTMass Tagging Kits(90066)购自Thermo Scientific公司(Waltham，MA，USA)。

(2)人类血浆样本的收集与制备

本发明共涉及到50例人类血浆样本：正常血糖(15例)，1型糖尿病(T1DM，20例)，2型糖尿病(T2DM，15例)。所有50例样本均来源于上海交通大学附属第六人民医院。人血液样品的获取严格遵照中国法律和伦理委员会的指导方针进行，每个病人都签署了知情同意书。

(3)高丰度蛋白质的去除

采用Agilent公司的MARS(multiple affinity removal system 5188-6411)去除7种人类血浆蛋白质高丰度组分(白蛋白，IgG，抗胰蛋白酶，IgA，转铁蛋白，结合珠蛋白)。具体操作为：取28μL加入400μL A液，采用0.22μm的超滤管，4℃，1000g，离心15min。用4mL A液平衡MARS柱子后，取过滤后的滤出液200μL于柱子上，4℃，100g，离心1min。加入300μL A液，4℃，100g，离心1min，将全部滤液转移至新离心管中。用2mL B液缓缓洗脱下结合在柱子上的高丰度蛋白质组分。再用4mL A液平衡柱子后，将剩余200μL左右血浆样品重复以上操作一次，将滤液合并到上步的离心管中，冻干，-80℃保存。

(4)蛋白质浓度荧光定量

去除高丰度后的50例血浆样本以及mix冻干后用300μL 2D裂解液(8M urea，40mMTris，65mM DTT)复溶，然后用荧光定量。具体操作为：蛋白质定量均采用色氨酸荧光法。取20μL蛋白质溶液加入至1mL尿素溶液(8M urea，20mM Tris-HCl，pH7.6)中。激发荧光波长设置为295nm，吸收测量荧光波长设置为350nm。标准品色氨酸倍比稀释后用于绘制标准曲线并计算样品中蛋白质浓度。样本中色氨酸平均含量按1.3％计算。

(5)溶液内酶解

溶液内酶解步骤依据于FASP酶解。根据荧光定量的结果，取14μg加入50μL 8M UA缓冲液(8M尿素，0.1M Tris-HCl，pH8.5)，分别置于10k超滤管(OMEGA filter，OD010C35)上，再加入2μL 1M DTT，并置于37℃温箱中1.5h。之后，向体系中加入10μL 1M IAA，室温暗反应30min。经过上述操作，蛋白质完全变性，二硫键被打开，巯基被封闭。此后，向体系中加入300μL 0.2M TEAB，于20℃，13000g离心15min。之后，弃掉滤液，再用200μL 0.2M TEAB缓冲液洗膜三次，超滤条件为4℃，13000g离心15min。最后，按质量比(胰酶：蛋白质＝1：25)向超滤管中加入100μL含有胰蛋白酶的0.2M TEAB，置于37℃摇床中，酶解16h。再按酶：蛋白质＝1：25向超滤管中加入胰蛋白酶继续酶解4h。酶解后的肽段混合物13000g离心收集滤出液，冻干-80℃保存，供后续实验使用。

(6)TMT体外同位素标记

TMT Mass Tagging Kits(Thermo Scientific，90066)共有六个通道(分别为126，127，128，129，130，131)，每个通道标记1个样本，其中126通道用于标记mix内参样本。50个样品根据预实验结果，每5个为一组，共标记10组，标记顺序如下表1。TMT标记步骤：先分别用14μL 0.2M TEAB buffer溶解酶解后肽段，43μL ACN溶解标记试剂；然后将标记试剂加入至肽段中，混匀室温放置1.5h，进行标记；最后加入8μL 5％羟胺终止反应15min，将每一组内6个通道肽段混合，最终合并好的14管样品加入ddH2O反复冻干三次，-80℃保存。

表1.样品标记信息

其中，N表示正常血糖，T1表示1型糖尿病人，T2表示2型糖尿病人

Group

126

127

128

129

130

131

G3

mix

N4

N5

N17

N23

N22

G4

mix

N2

N6

N7

N8

N9

G5

mix

N10

N11

N12

N13

N15

G7

mix

T1-7

T1-10

T1-18

T1-20

T1-23

G8

mix

T1-9

T1-11

T1-21

T1-26

T1-27

G9

mix

T1-1

T1-2

T1-4

T1-5

T1-6

G10

mix

T1-8

T1-13

T1-16

T1-24

T1-25

G11

mix

T2-1

T2-4

T2-13

T2-24

T2-30

G13

mix

T2-6

T2-8

T2-14

T2-15

T2-17

G14

mix

T2-19

T2-21

T2-23

T2-25

T2-27

(7)肽段脱盐

冻干后样品用900μL 0.2％TFA的水溶液充分溶解，每个样品取200μL用填有C18的stage-tip脱盐，平行操作两份。首先，填有两层C18的stage-tip需用100μL甲醇活化，于室温1500g离心2min，去滤液。之后，用100μL含0.2％TFA的80％乙腈洗填料，以最大限度去除污染物，离心条件同上。然后用100μL含0.2％TFA的水溶液平衡填料3次，室温1500g离心2min，去滤液。每个样品取200μL结合到stage-tip上，室温低速800g离心5min，以保证样品与C18填料充分结合。之后用100μL含0.2％TFA的水溶液洗填料3次，于室温2000g离心2min，以去除盐类等不能与C18填料结合的亲水成分。最后，用100μL含0.2％TFA的90％乙腈洗脱，离心条件同上，并收集滤液，冻干后供质谱分析使用。

(8)多维液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)分析

LC-MS/MS质谱检测是在nanoHPLC-Orbitrap Fusion(Thermo FisherScientific，San Jose，CA)系统上进行。液相色谱为Easy-nLC-1000系统(ThermoFisherScientific)；反相柱为实验室自制喷针反相柱(tip column，75μm×150mm，C18，3μm)；反相的洗脱液为0.1％甲酸的水溶液(A)和0.1％甲酸的乙腈溶液(B)。样品上样到反相柱上后经由流速为0.3μL/min的反相洗脱体系洗脱，有效洗脱梯度为：5min，4％B；150min，26％B，155min，40％B；160min，90％B，质谱分析时间为180min。从反相柱上洗脱下的肽段进入四极杆-静电场轨道阱-线性离子阱三合一组合式质谱Orbitrap Fusion进行分析，采用data-dependent的数据采集模式，以最大化采集速率(top speed)进行二级质谱图采集。动态排除设置为：若某母离子鉴定到1次，则在接下来的2min内不再对该质量母离子进行检测。母离子碎裂模式采取HCD模式，一级谱图和二级谱图分辨率分别设置为60000和15000(在200m/z时)。

(9)数据库搜索

质谱采集到的原始文件用Maxquant1.5.2.8软件进行分析，采用的数据库是Uniprot homo sapiens数据库。搜库参数设置如下：子离子(fragment ion)质量偏差20ppm以内，母离子(precursor ion)质量偏差6ppm以内，蛋白酶设置为胰蛋白酶，最大允许缺失酶切位点为2，固定修饰设置为半胱氨酸的羧甲基化(carbamidomethylation，+57Da)，可变修饰设置为甲硫氨酸的氧化(oxidation，+16Da)以及位于赖氨酸残基的游离氨基末端的TMT-6plex标记均设置为可变修饰，蛋白质和肽段的假阳性率(false discovery rate，FDR)设置为0.01。

(10)统计学及生物信息学分析

所有样品数据经过中位数矫正，然后除以内参样品，做对数处理。组间两两比较用秩和检验，经FDR矫正。所有数据分析和统计学检验都使用R安装包或者Excel完成。

实施例1.差异蛋白质分析与标志物寻找

差异蛋白质分析基于统计数值P值(P value)，它是当原假设为真时所得到的样本观察结果或更极端结果出现的概率。如果P值很小，说明原假设情况的发生的概率很小，而如果出现了，根据小概率原理，我们就有理由拒绝原假设，P值越小，我们拒绝原假设的理由越充分。总之，P值越小，表明结果越显著。标志物的诊断价值可以通过ROC曲线(受试者工作特征曲线)的曲线下面积判断，ROC曲线指受试者工作特征曲线是反映敏感性和特异性连续变量的综合指标，是用构图法揭示敏感性和特异性的相互关系，它通过将连续变量设定出多个不同的临界值，从而计算出一系列敏感性和特异性，再以敏感性为纵坐标、(1-特异性)为横坐标绘制成曲线，曲线下面积越大，诊断准确性越高。一般认为，曲线下面积高于0.9时诊断价值较高。

正常血糖组、2型糖尿病人组、一型糖尿病人组两两比较发现，GP1BA在2型糖尿病人血浆中表达量显著高于正常人组，正常血糖组中位数比上2型糖尿病人组中位数比值为0.49，秩和检验p值小于0.01，用GP1BA做受试者工作特征曲线(ROC曲线)，曲线下面积为0.907。而正常血糖组与一型糖尿病人组比较p值大于0.05。vWF在2型糖尿病人血浆中表达量低于正常人组，正常血糖组中位数比上2型糖尿病人组中位数比值为1.84，秩和检验p值小于0.05，用vWF做受试者工作特征曲线(ROC曲线)，曲线下面积为0.867。

用GP1BA比上vWF的比值(GP1BA/vWF)作为指标，ROC曲线下面积为0.973，作为标志物，该值表示该指标诊断价值非常高，正常血糖组中位数比上2型糖尿病人组中位数比值为0.19。

实施例2.GP1BA，vWF鉴定到的肽段列表

用质谱的方法，我们在血浆中鉴定到如下属于GP1BA，vWF的特征肽段，它们可以用于表征蛋白质GP1BA和vWF的血浆表达量。

表2.血浆中鉴定到的GP1BA肽段列表

GP1BA肽段	SEQ ID NO.
		AMTSNVASVQCDNSDKFPVYK	3
GLGELQELYLK	4
		LTSLPLGALR	5
TLPPGLLTPTPK	6
		WLQDNAENVYVWK	7

表3.血浆中鉴定到的vWF肽段列表

vWF肽段	SEQ ID NO.
		AEGLECTK	8
AFVLSSVDELEQQR	9
		AFVVDMMER	10
ALSVVWDR	11
		AMYSIDINDVQDQCSCCSPTR	12
APTCGLCEVAR	13
		AVVILVTDVSVDSVDAAADAAR	14
DGTVTTDWK	15
		EAPDLVLQR	16
EGGPSQIGDALGFAVR	17
		EYAPGETVK	18
GDSQSSWK	19
		GLRPSCPNSQSPVK	20
GLWEQCQLLK	21
		HIVTFDGQNFK	22
ICMDEDGNEK	23
		IEDLPTMVTLGNSFLHK	24
IGWPNAPILIQDFETLPR	25
		ILAGPAGDSNVVK	26
ILDELLQTCVDPEDCPVCEVAGR	27
		ILTSDVFQDCNK	28
LPGDIQVVPIGVGPNANVQELER	29
		LSEAEFEVLK	30
LSPVYAGK	31
		LVCPADNLR	32
QTMVDSSCR	33
		RLPGDIQVVPIGVGPNANVQELER	34
RPGDVWTLPDQCHTVTCQPDGQTLLK	35
		SVGSQWASPENPCLINECVR	36
TSACCPSCR	37
		VAQCSQKPCEDSCR	38
VEDFGNAWK	39
		VIVIPVGIGPHANLK	40
VKEEVFIQQR	41
		VSSQCADTR	42
VTGCPPFDEHK	43
		VTVFPIGIGDR	44
YAGSQVASTSEVLK	45

实施例3.GP1BA，vWF，GP1BA/vWF在不同组内的定量展示

如图1～图3所示，分别展示了GP1BA，vWF，GP1BA/vWF在不同组内的定量情况，其中纵坐标为质谱鉴定强度取对数后的值，它们的计算来源于表3内各个肽段的表达量，用于整体表征蛋白质的表达量信息。

具体的，如图1所示，GP1BA在2型糖尿病人血浆中表达量显著高于正常人组，而在一型糖尿病人血浆中表达量与正常人无显著差异。

如图2所示，vWF在2型糖尿病人血浆中表达量显著低于正常人组，而在一型糖尿病人血浆中表达量与正常人无显著差异。

如图3所示，在2型糖尿病人血浆中，GP1BA表达量与vWF的表达量的比值(GP1BA/vWF)显著高于正常人组；而在一型糖尿病人血浆中，GP1BA表达量与vWF的表达量的比值(GP1BA/vWF)与正常人无显著差异。

实施例4.GP1BA，vWF，GP1BA/vWF用于2型糖尿病诊断的ROC曲线

如图4～图6所示，分别展示了分别采用GP1BA，vWF，GP1BA/vWF作为2型糖尿病诊断指标时，所获得的ROC曲线。

具体的，如图4所示，采用GP1BA作为指标，预测2型糖尿病的发生，ROC曲线下面积为0.907，具有较高的诊断价值。

如图5所示，采用vWF作为作为指标，预测2型糖尿病的发生，ROC曲线下面积为0.867。

如图6所示，采用GP1BA比上vWF的比值(GP1BA/vWF)作为指标，预测2型糖尿病的发生，ROC曲线下面积是0.973，指标诊断价值非常高；与图4，图5比较看(比较曲线下面积值)，GP1BA比上vWF的比值作为指标，优于GP1BA或vWF作为诊断指标。

综上所述，本发明揭示了GP1BA/vWF具有作为2型糖尿病诊断的标志物的价值，并在具体实验中在不同人组(正常血糖组、一型糖尿病人组、2型糖尿病人组)血浆中鉴定到了属于这两个蛋白质GP1BA和vWF的特征肽段(表3)，该些特征肽段能用于表征蛋白质的表达量信息。

实施例5.抗体的制备

本发明的发明人把全长GP1BA蛋白(GeneBank登录号：GI：AB086948；uniprotID：P07359)注射入兔子体内，获取免疫血清。具体制备方法如下：

GP1BA蛋白与弗氏佐剂按照体积比以1:1混合后，注射到家兔，免疫量0.5mg，每隔2周免疫1次，免疫3次。经常规的亲和纯化后得到针对GP1BA蛋白的兔多克隆抗体。

免疫印迹实验显示：获得的兔多克隆抗体只识别GP1BA蛋白，基本不识别其它蛋白，可以作为检测2型糖尿病或2型糖尿病患病风险的检测试剂。

将所获得的抗GP1BA蛋白的多克隆抗体、二抗(常规)、显色试剂分别置于不同的容器中，将容器与使用说明书一起置于盒中，获得检测试剂盒。

此外，本发明的发明人还把全长vWF蛋白(GeneBank登录号：GI：AC005846；uniprotID：P04275)注射入兔子体内，获取免疫血清。具体制备方法如下：

vWF蛋白与弗氏佐剂按照体积比以1:1混合后，注射到家兔，免疫量0.5mg，每隔2周免疫1次，免疫3次。经常规的亲和纯化后得到针对vWF蛋白的兔多克隆抗体。

免疫印迹实验显示：获得的抗vWF蛋白的兔多克隆抗体只识别vWF蛋白，基本不识别其它蛋白，可以作为检测2型糖尿病或2型糖尿病患病风险的检测试剂。

因此，可将所获得的抗vWF蛋白的兔多克隆抗体也放入上述容器，获得检测试剂盒。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

Claims

1.GP1BA蛋白与vWF蛋白共同作为血清生物标志物在制备或筛选2型糖尿病诊断试剂中的用途，其中，GP1BA蛋白水平与vWF蛋白水平的比值作为一项2型糖尿病诊断指标。

2.特异性识别GP1BA蛋白与vWF蛋白的试剂在制备检测2型糖尿病诊断试剂盒中的用途，其中，GP1BA蛋白与vWF蛋白共同作为血清生物标志物，GP1BA蛋白水平与vWF蛋白水平的比值作为一项2型糖尿病诊断指标。