CN114199846B - 一种基于肽-寡核苷酸共轭识别的铅（ii）荧光生物传感器及其应用 - Google Patents

一种基于肽-寡核苷酸共轭识别的铅（ii）荧光生物传感器及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于肽‑寡核苷酸共轭识别的铅（II）荧光生物传感器及其应用，属于食品安全检测技术领域；本发明所述荧光生物传感器是由炔烃修饰的铅结合多肽和荧光基团FAM修饰的叠氮铅适配体组成的缀合物。本发明主要以铅离子适配体和铅离子结合肽为材料，通过点击化学合成肽‑寡核苷酸缀合物，以增强其和铅（II）离子的亲和力。实现了铅离子检测超灵敏和高选择性测定的需求，同时通过等温滴定微量热法(ITC)等手段对其与铅离子的结合性能进行了一定的研究。最后应用于梭子蟹中的铅离子检测，表明本发明在对在食品安全领域的实际应用方面具有重要意义。

Description

一种基于肽-寡核苷酸共轭识别的铅（II）荧光生物传感器及 其应用
技术领域
本发明涉及食品安全检测技术领域，尤其是涉及一种基于肽-寡核苷酸共轭识别的铅（II）荧光生物传感器及其应用。
背景技术
铅是一种广泛分布于自然界的重金属污染物，具有普遍性、高毒性、生物蓄积性、隐蔽性、持久性等特点。由于已经引起了世界许多地区的严重健康问题，铅受到高度关注。铅毒性的临床表现从轻微症状到危及生命的并发症。其中含铅废水、废渣和废气等污染物的不合理排放已成为食品铅污染的重要来源，长期暴露对神经系统、骨骼造血机能、消化系统、生殖系统等均有危害，影响人体正常的代谢功能。因此，对于食品中铅的检测被认为是一项必不可少的任务。采用气相色谱-质谱（GC-MS）、高效液相色谱-质谱（HPLC-MS）、电感耦合等离子体-质谱（ICP-MS）、感应耦合等离子体-原子发射光谱（ICP-AES）等仪器，是检测和定量不同环境下重金属的经典方法。这些技术在同时测定各种元素的重金属离子浓度方面是通用的，在适用范围也可以提供非常低的检测限。然而，基于仪器的分析需要非常昂贵的设备、训练有素的操作员和耗时的样品制备;因此，几乎不可能实时应用这些方法进行现场分析。
除了基于仪器的分析外，还有各种传感器来识别目标金属离子。生物传感器被称为检测环境和城市污染的有力工具之一。生物传感器是将生物或生化信号转换为可测量的电信号的装置，是检测食品和环境中化学品或有害物质的宝贵工具。与传统技术相比，生物传感器具有多种优点，包括可移植性、小型化、复杂基质中污染物的检测能力、检测速度快和可靠性好。生物识别元件被认为是生物传感器中最重要的一部分，用于重金属检测的生物识别元件多种多样，主要分为抗体、抗菌肽、噬菌体、适配体、细胞和生物模拟材料等。它的质量直接决定检测的特异性和灵敏度。生物识别元件的选择往往会对生物传感器的特异性和灵敏度产生重要的影响。因而对新型生物识别元件的研究至关重要。
众多研究表明，肽与寡核苷酸的缀合物与未修饰的寡核苷酸或肽相比，其生物活性更强，不易被水、核酸酶和蛋白酶降解，而且具有极高的序列特异性和选择性等特点，尤其在针对重金属离子的检测过程中，肽寡核苷酸的缀合物通过和重金属离子结合过程中的构象变化，可以猝灭或增强修饰在其中的荧光基团的荧光强度，并且增强与重金属离子的亲和力，因而在设计基于DNA适配体的肽-寡核苷酸缀合物以提高适配体检测性能方面有重要意义，目前还未有报道利用由炔烃修饰的铅结合多肽和荧光基团FAM修饰的叠氮铅适配体组成的缀合物作为生物传感器进行铅（II）离子的检测。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种基于肽-寡核苷酸共轭识别的铅（II）荧光生物传感器及其应用。本发明主要以叠氮铅适配体和铅结合多肽为材料，通过化学合成肽-寡核苷酸缀合物，以增强其和铅（II）离子的亲和力，实现了铅离子检测超灵敏和高选择性测定的需求，同时通过等温滴定微量热法 (ITC)等手段对其与铅离子的结合性能进行了一定的研究。最后应用于梭子蟹中的铅离子检测，证明本发明在食品安全领域的实际应用方面具有重要意义。
本发明的技术方案如下：
一种基于肽-寡核苷酸共轭识别的铅（II）荧光生物传感器，所述荧光生物传感器是由炔烃修饰的铅结合多肽和荧光基团FAM修饰的叠氮铅适配体组成的缀合物。
进一步的，所述适配体序列如SEQ ID NO.1=5’- GGGAGGGTGGGTGGGA-3’所示；
所述多肽序列如SEQ ID NO.2= KVSATDADDDG所示。
进一步的，荧光基团FAM修饰的叠氮铅适配体为FAM- GGGAGGGTGGGTGGGA -Azide(N3)（合成公司为上海捷瑞生物工程有限公司）
进一步的，炔烃修饰的铅结合多肽为KVSATDADDDG-Alkyne（N→C）。（合成公司为上海捷瑞生物工程有限公司）
进一步的，所述铅（II）荧光生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）无水硫酸铜与 THPTA（三(3-羟丙基三唑甲基)胺）混合均匀，为溶液A；
（2）在容器A中加入荧光基团FAM修饰的叠氮铅适配体，与炔烃修饰的铅结合多肽混合；优选的，荧光基团FAM修饰的叠氮铅适配体100μM， 炔烃修饰的铅结合多肽100μM；
（3）在容器A中加入PB缓冲液、溶液A、L-抗坏血酸钠；优选的，使用现配的L-抗坏血酸钠；
（4）在容器A中加入超纯水，室温下搅拌反应；优选的，使用磁力搅拌，搅拌转速为700 r/min，过夜。
进一步的，所述步骤（1）中，无水硫酸铜与三(3-羟丙基三唑甲基)胺的摩尔比为1:1。
进一步的，所述步骤（2）中，荧光基团FAM修饰的叠氮铅适配体与炔烃修饰的铅结合多肽摩尔比为1:2。
上述基于肽-寡核苷酸共轭识别的铅（II）荧光生物传感器的应用，所述荧光生物传感器用于检测铅（II）离子。
进一步的，使用所述荧光生物传感器检测铅（II）离子的方法包括以下步骤：
（1）将铅离子溶液加入到含荧光生物传感器的水溶液中，并在20-40℃静置反应10-60分钟；
（2）然后用荧光分光光度计检测样品在520nm附近发射波长下的荧光光谱，激发波长在480 nm附近，扫描速度1000-1500 nm/min，计算铅（II）离子浓度。
进一步的，上述基于肽-寡核苷酸共轭识别的铅（II）荧光生物传感器的应用，检测铅（II）离子浓度之前需要以已知浓度的铅（II）离子溶液制备标准曲线；所述标准曲线方程为Y = 0.15X-2.03，R2= 0.9977；已知浓度的铅（II）离子溶液的浓度分别为0、50nM、100nM、150nM、200nM、250nM、300nM、350nM。
进一步的，上述基于肽-寡核苷酸共轭识别的铅（II）荧光生物传感器的应用，所述铅（II）离子浓度的检测限为10-20nM。
进一步的，上述基于肽-寡核苷酸共轭识别的铅（II）荧光生物传感器的应用，所述荧光生物传感器用于检测水产品中的铅（II）离子残留，更进一步的，所述水产品为梭子蟹。
本发明有益的技术效果在于：
本发明提供了一种新的识别元件：肽-寡核苷酸缀合物，以增强与铅（II）离子的亲和力，以荧光基团FAM修饰的叠氮铅适配体和炔烃修饰的铅结合多肽为原料，通过点击化学反应合成了FAM修饰的肽-寡核苷酸，实现了铅离子检测超灵敏和高选择性测定的需求，在没有铅（II）离子的情况下，FAM修饰的肽-寡核苷酸处于无规卷曲状态，伴随着强烈的荧光强度，当铅（II）离子加入系统时，FAM修饰的肽-寡核苷酸会形成G-四链体结构，G-四链体的连G末端和荧光基团FAM之间的光致电子转移（PET）使荧光强度显著降低。最后，也将该传感器用于梭子蟹中的铅离子检测，检测结果与国标中的方法所得到的结果类似，证明了该传感器的优良性能。所构建的检测方法具有操作简单、选择性和特异性高等优点，对在食品安全领域的实际应用方面具有重要意义。
本发明利用肽寡核苷酸缀合物作为识别元件构建铅（II）离子响应的生物传感器，可提高与铅（II）离子的亲和力。
本发明直接将荧光基团FAM修饰在肽-寡核苷酸缀合物上，可直接用于铅（II）离子的检测中，简化了实验操作。
附图说明
图1为为基于肽-寡核苷酸的生物传感器检测铅离子的原理图；
图2中，A为实施例1制得肽-寡核苷酸的飞行质谱图，B为实施例1制得得肽-寡核苷酸的丙烯酰胺凝胶电泳图；
图3中，A为铅离子和铅适配体结合的等温滴定微量热图，B为铅离子和铅多肽结合的等温滴定微量热图，C为铅离子和肽-寡核苷酸缀合物结合的等温滴定微量热图；
图4中，A为不同铅离子浓度条件下检测荧光强度图谱，B为不同铅离子浓度条件下的标准曲线（其中，以铅离子的浓度为横坐标，荧光猝灭率为纵坐标，标准曲线为Y =0.15X-2.03，R2= 0.9977），C为对铅离子及其他多种离子检测结果。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。
面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明中所述的适量，为本领域内普通技术人员根据国家技术规范和生产实际情况所决定的用量。本发明中所述的原料如无特殊说明，均为商业购得。
图1为结合的肽-寡核苷酸缀合物对铅离子的检测原理图，首先将修饰了荧光基团FAM的叠氮铅适配体和炔烃修饰的铅结合多肽通过点击化学的方法得到肽-寡核苷酸缀合物，然后对肽-寡核苷酸缀合物进行清洗纯化。在没有铅（II）离子的情况下，肽-寡核苷酸处于无规卷曲状态，伴随着强烈的荧光强度，当铅（II）离子加入系统时，肽-寡核苷酸会形成G-四链体结构，G-四链体和荧光基团FAM之间的光致电子转移（PET）使荧光强度显著降低。因此，荧光强度是由铅（II）离子浓度决定的，铅（II）离子浓度越高，荧光强度降低越多。因此，可以通过测定荧光强度并计算荧光的猝灭率来实现对铅（II）离子的测定。
实施例1
肽-寡核苷酸缀合物的制备：包括以下步骤
（1）预先取100μL无水硫酸铜（100mmol/L）与100μL的三(3-羟丙基三唑甲基)胺（100mmol/L）1:1混合均匀，备用；
（2）EP管中加入荧光基团FAM修饰的叠氮铅适配体（100μM，20μL，溶于超纯水中）以及加入炔烃修饰的铅结合多肽（200μM，20μL，溶于超纯水）混合；
（3）然后加入PB（pH=7）缓冲液（100mmol/L）300μL和预先混合的114μL无水硫酸铜/三(3-羟丙基三唑甲基)胺以及加入现配的L-抗坏血酸钠（100 mM，16μL）；
（4）最后加入超纯水，使反应体系总量为1.5mL。该体系置于磁力搅拌器上，搅拌转速为700r/min，在室温下反应过夜。所得肽-寡核苷酸缀合物的飞行质谱图如图2A所示，丙烯酰胺凝胶电泳图如图2B所示。
如图2所示，在飞行质谱图中铅肽-寡核苷酸缀合物分子量为6574 g/mol，高于叠氮修饰铅离子适配体的理论分子量为5443 g/mol，表明铅肽-寡核苷酸缀合物的制备成功（图2A）。丙烯酰胺凝胶电泳图（图2B），3号泳道为RP-HPLC分离后的肽-寡核苷酸缀合物，可以看出其分子量要高于铅离子寡核苷酸，同样可以证明肽-寡核苷酸缀合物的成功合成和纯化。
实施例2
为了验证本发明的肽-寡核苷酸缀合物对于铅离子有良好的结合性能，使用等温滴定微量热法 (ITC) 研究肽-寡核苷酸缀合物和铅离子的结合能力：包括以下步骤：
由实施例1制得的肽-寡核苷酸缀合物，将肽-寡核苷酸缀合物在ITC缓冲液（10 mMTris-HCl，pH 6）配置为50μM，实验在 25 ℃下进行。用 1mM 的氯化铅溶液滴定50 μM 的铅离子结合多肽、适配体、肽-寡核苷酸缀合物。在 2 μL 进样之间以 150 秒的间隔进行滴定。每个样品的第一次进样被排除在数据拟合之外。使用单点结合模型并 ORIGIN7 进行数据分析。
如图3所示分别为铅适配体(图3A)、铅结合多肽(图3B)以及肽-寡核苷酸缀合物(3C)和铅离子的等温滴定微量热图。结果表明，Pb2+能诱导肽-寡核苷酸缀合物形成更稳定的空间结构，铅肽-寡核苷酸缀合物结合常数Ka为1.76*106M-1。要优于铅适配体和铅离子结合肽，表明肽-寡核苷酸缀合物和铅离子有更优良的结合性能。
实施例3
实施例1所制备的肽-寡核苷酸缀合物荧光传感器检测铅（II）离子的方法：
（1）将铅离子溶液加入到实施例1制备的肽-寡核苷酸缀合物水溶液中，并在25℃静置反应40分钟。
（2）然后用荧光分光光度计检测样品在520nm发射波长下的荧光光谱(图4A)，激发波长480 nm，扫描速度1200 nm/min。计算铅（II）离子浓度。
检测目标产物铅（II）离子浓度之前需要以已知浓度的铅（II）离子溶液制备标准曲线(图4B)，标准曲线为：Y = 0.15X-2.03，R2= 0.9977；已知浓度的铅（II）离子溶液的浓度分别为0、50nM、100nM、150nM、200nM、250nM、300nM、350nM。铅（II）离子的检测限为12.4nM。
特异性是生物传感器最重要的特性之一，为了验证本实验方法的特异性，本发明申请所构建的肽寡核苷酸缀合物荧光传感器对铅（II）离子、钠（I）离子、钾（I）离子、钙（II）离子、镁（II）离子、镉（II）离子等多种离子的响应。结果用荧光猝灭率（ΔI）表示ΔI=（I0-I）/I，I0为未加入待测离子样品的荧光强度，I为加入待测离子样品的荧光强度。结果如图4C所示，铅（II）离子引起的荧光信号猝灭率远远高于其他离子。结果表明，本发明对铅（II）离子具有良好的特异性，这主要是因为肽寡核苷酸缀合物具有良好的特异性和生物传感器的合理设计。
实施例4实际测试例
实际样品检测及加标回收率测试：
用实施例3所述方法对市售梭子蟹样品中的铅离子含量进行测定，再用本方法和原子吸收光谱法分别进行加标回收率测试。将梭子蟹样品通过离子水彻底清洗，并用榨汁机将梭子蟹肉均质化。然后在均质梭子蟹肉中加入不同量的铅离子标准溶液（80、120、160nM）并充分混合。从不同的混合物中称取总共1.0 g 均质化的铅离子加标梭子蟹肉样品，以及 5 mL HNO3加入消化管中，放置在可调式电热炉上消解，直至获得澄清溶液。溶剂蒸发后，用Tris-HCl（1M）将消化样品的 pH 值调至 7，并用Tris-HCl缓冲液（pH = 7）稀释至总体积为 10 mL制备梭子蟹加标检测溶液，然后稀释至合适浓度后，加入荧光基团FAM修饰的肽-寡核苷酸缀合物溶液反应40min，然后用原子吸收光谱仪以及荧光分光光度计检测样品的铅离子浓度以及测定回收率和相对标准差（RSD），结果见表1。
表1.本实验方法与原子吸收检测方法对梭子蟹样品中铅离子的检测结果比较
Figure SMS_1
可见，两种方法检测结果一致，无明显差异，且可以看到回收率在85.16%～92.26%，说明本发明稳定，灵敏，准确，适用梭子蟹样品中铅离子的检测。
结合以上实施例1-4可以得出结论：
本发明利用肽寡核苷酸缀合物作为识别元件构建铅（II）离子响应的生物传感器，可提高与铅（II）离子的亲和力。
本发明直接将荧光基团FAM修饰在肽-寡核苷酸缀合物上，可直接用于铅（II）离子的检测中，简化了实验操作。
检测结果证明了该传感器的优良性能。所构建的检测方法具有操作简单、选择性和特异性高等优点，对在食品安全领域的实际应用方面具有重要意义。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，不能以此限定本发明的保护范围，即大凡依本发明权利要求书及发明内容所做的简单的等效变化与修改，皆仍属于本发明专利申请的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海理工大学
<120> 一种基于肽-寡核苷酸共轭识别的新型铅（II）荧光生物传感器及其应用
<130> 2021
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工
<400> 1
gggagggtgg gtggga 16
<210> 2
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<400> 2
Lys Val Ser Ala Thr Asp Ala Asp Asp Asp Gly
1 5 10

Claims (6)

1.一种基于肽-寡核苷酸共轭识别的铅（II）荧光生物传感器在检测铅(II)离子中的应用，其特征在于，所述荧光生物传感器是由炔烃修饰的铅结合多肽和荧光基团FAM修饰的叠氮铅适配体组成的缀合物；
荧光基团FAM修饰的叠氮铅适配体为FAM- GGGAGGGTGGGTGGGA -叠氮，炔烃修饰的铅结合多肽为KVSATDADDDG-炔烃；
所述铅（II）荧光生物传感器的制备方法包括以下步骤：
（1）无水硫酸铜与三(3-羟丙基三唑甲基)胺混合均匀，为溶液A；
（2）在容器A中加入荧光基团FAM修饰的叠氮铅适配体，与炔烃修饰的铅结合多肽混合；
（3）在容器A中加入PB缓冲液、溶液A、L-抗坏血酸钠；
（4）在容器A中加入超纯水，室温下搅拌反应，制备得到肽-寡核苷酸缀合物；
使用等温滴定微量热法ITC研究所述肽-寡核苷酸缀合物和铅离子的结合能力，包括以下步骤：
将所述肽-寡核苷酸缀合物在ITC缓冲液中配置为50μM，实验在25℃下进行，ITC缓冲液为10mM Tris-HCl pH=6；用1mM的氯化铅溶液滴定50μM的所述铅结合多肽、所述铅适配体、所述肽-寡核苷酸缀合物；在2μL进样之间以150秒的间隔进行滴定；每个样品的第一次进样被排除在数据拟合之外；使用单点结合模型和ORIGIN7进行数据分析；使用所述荧光生物传感器检测铅（II）离子的方法包括以下步骤：
（a）将铅离子溶液加入到含荧光生物传感器的水溶液中，并在20-40℃静置反应10-60分钟；
（b）然后用荧光分光光度计检测样品在520nm附近发射波长下的荧光光谱，激发波长在480 nm附近，扫描速度1000-1500 nm/min，计算铅（II）离子浓度。
2.根据权利要求1所述的基于肽-寡核苷酸共轭识别的铅（II）荧光生物传感器在检测铅(II)离子中的应用，其特征在于，所述步骤（1）中，无水硫酸铜与三(3-羟丙基三唑甲基)胺的摩尔比为1:1。
3.根据权利要求2所述的基于肽-寡核苷酸共轭识别的铅（II）荧光生物传感器在检测铅(II)离子中的应用，其特征在于，所述步骤（2）中，荧光基团FAM修饰的叠氮铅适配体与炔烃修饰的铅结合多肽摩尔比为1:2。
4.根据权利要求3所述的基于肽-寡核苷酸共轭识别的铅（II）荧光生物传感器在检测铅(II)离子中的应用，其特征在于，检测铅（II）离子浓度之前需要以已知浓度的铅（II）离子溶液制备标准曲线；所述标准曲线方程为Y = 0.15X-2.03，R2 = 0.9977；已知浓度的铅（II）离子溶液的浓度分别为0、50nM、100nM、150nM、200nM、250nM、300nM、350nM。
5.根据权利要求4所述的基于肽-寡核苷酸共轭识别的铅（II）荧光生物传感器在检测铅(II)离子中的应用，其特征在于，所述铅（II）离子浓度的检测限为10-20nM。
6.根据权利要求1所述的基于肽-寡核苷酸共轭识别的铅（II）荧光生物传感器在检测铅(II)离子中的应用，其特征在于，所述荧光生物传感器用于检测水产品中的铅（II）离子残留。
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