CN109765203B

CN109765203B - 一种“荧光-稳定同位素”双模态对三硝基甲苯的检测方法

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Publication number: CN109765203B
Application number: CN201811264443.6A
Authority: CN
Inventors: 吕弋; 胡建煜; 刘睿
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2018-10-29
Filing date: 2018-10-29
Publication date: 2021-07-16
Anticipated expiration: 2038-10-29
Also published as: CN109765203A

Abstract

本发明的目的是提供一种对三硝基甲苯（TNT）的“荧光‑稳定同位素”双模态检测方法。该分析方法包括聚胸腺嘧啶‑核酸适配体探针（AptTNT‑T30）和荧光检测和稳定同位素检测双模态检测。本发明的原理是：TNT核酸适配体（AptTNT）序列可以和目标TNT分子特异性结合进行端基保护，避免核酸外切酶切割，可以使5’端的聚胸腺嘧啶序列（T30）作为模板原位合成铜纳米粒子。合成的铜纳米粒子可以进行双模态的检测：在荧光检测模式下可进行快速荧光检测;铜纳米粒子硝酸消解后，在稳定同位素检测模式下可用电感耦合等离子体质谱仪进行高灵敏稳定定量分析，可以分别满足TNT的实地快速检测和高灵敏准确检测。

Description

一种“荧光-稳定同位素”双模态对三硝基甲苯的检测方法

技术领域

本发明属于分析化学的检测领域，涉及爆炸物的荧光（Fluorimetry）和稳定同位素(Metal stable isotope)传感领域，特别涉及一种基于聚胸腺嘧啶脱氧核糖核酸（Poly-T ssDNA）作为模板原位合成铜纳米粒子（CuNPs）的荧光-稳定同位素双模态对三硝基甲苯（TNT）检测方法。

背景技术

三硝基甲苯（TNT），作为最典型的化学爆炸物之一，已经广泛应用于军工、矿业、反恐和民用领域。同时，TNT属于高度有毒物质，对动植物和人体有严重的毒理学威胁。广泛应用导致的TNT对土壤、水体的严重污染威胁着生态系统生存。另外，日益严峻的全球安全形势和反恐需求，对于TNT的快速、高灵敏分析检测也越发重要。

目前对TNT的检测主要使用离子迁移率光谱法、高效液相色谱法和表面增强拉曼光谱法等，这些方法虽然得到了长期发展，但仍面临着成本高、耗时长、前处理环节复杂和灵敏度差强人意的问题，限制了实际使用场景。近年来报道较多的对TNT的荧光检测法，利用荧光材料对TNT的快速特异性响应，可以实现快速实地检测。但传统荧光光谱法受限于光漂白效应和基质效应，难以实现长时间稳定准确定量分析，因此在对TNT分析领域，仍然需要一种既可以对TNT实现快速便捷实地检测，又可以保证准确稳定高灵敏定量的方法。

近年来， Poly-T ssDNA作为模板原位还原合成铜纳米粒子的荧光传感方法因其操作简单、耗时较短、成本较低、无需额外化学标记、适用范围广等特点已经引起广泛关注，成功建立了对核酸、核酸酶、蛋白质、金属离子和生物小分子的检测方法。相较于荧光传感，PolyT ssDNA在还原剂抗坏血酸(Ascorbic acid, AA)的作用下直接原位特异性的还原生成具有荧光性质的CuNPs，通过荧光强度的快速响应进行实地分析。同时铜纳米粒子硝酸消解后也可利用电感耦合等离子体质谱仪（Inductive Coupled Plasma MassSpectrometry, ICPMS）进行稳定同位素检测，利用ICPMS检出限低（大部分元素都可以达到pg mL^-1级别）、基体效应小、线性范围广（高达九个数量级）、稳定性优异的优点可以实现相较于荧光传感更高灵敏度更高稳定性的准确分析。

本发明将以上对PolyT CuNPs 双模态检测方法引入TNT分析检测中，构筑了一种既可以在荧光检测模式下实现快速实地分析；又可以在稳定同位素检测模式下实现高灵敏稳定的定量分析（检出限可达到0.32ppt）的TNT双模态检测方法。因而，提高了TNT检测的适用范围，提供了一种新的分析方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种 “荧光-稳定同位素”双模态检测方法，及其在TNT检测方面的应用。

本发明的原理是：通过在核酸外切酶Ⅰ（ExoⅠ）的存在下，在3’端的TNT核酸适配体（Aptamer）序列可以和目标TNT分子特异性结合进行端基保护，避免ExoⅠ从3’端进行切割，因而在AA作为还原剂存在下可以使5’端的PolyT序列作为模板原位合成CuNPs；反之，当3’端的TNT适配体未与TNT结合时，无法进行端基保护，在ExoⅠ存在下发生酶切反应，则另一端的PolyT序列也被酶切，无法合成CuNPs。合成的CuNPs可以进行双模态的检测：在荧光检测模式下可进行快速荧光检测;CuNPs硝酸消解后，在稳定同位素检测模式下可用ICPMS进行高灵敏稳定定量分析，可以分别满足TNT的实地快速检测和高灵敏准确检测。通过不同浓度的TNT引起的不同荧光强度的变化和铜元素同位素强度的变化进行线性回归分析，即可以对TNT进行双模态检测。

为实现上述目的。本发明提供如下技术方案：

本发明制备双模式PolyT CuNPs原理是：将可以原位合成CuNPs的Poly-T ssDNA和核酸适配体结合，构筑序列(AptTNT-PolyT)底物。氨基功能化的AptTNT-T30可以与羧基修饰的磁性微球(MBs)通过羧氨反应组装在一起（MBs-AptTNT-PolyT）。样品TNT在缓冲溶液中和AptTNT- PolyT反应后再与ExoⅠ酶反应，随后加入AA还原和硫酸铜溶液作为铜源即可快速合成PolyT CuNPs。

对CuNPs的双模态检测方法分别为：在荧光检测模式下利用荧光光谱仪进行检测，在360nm波长的光激发下，CuNPs发射出660nm的红色荧光；在稳定同位素检测模式下利用ICPMS进行检测，以⁶³Cu同位素作为检测对象进行高灵敏定量分析。通过不同浓度的TNT引起的660nm荧光强度信号和⁶³Cu同位素强度值进行线性回归分析，即可对TNT样品进行双模态检测分析。

其中TNT样品浓度范围为0.23ppb-22.85ppb（荧光检测模式）和0.0056ppb-4.54ppb（稳定同位素检测模式）；TNT与Apt-T30反应所用缓冲溶液为PBS溶液(8.1mMNa₂HPO₃, 1.9mM NaH₂PO₃,145mM NaCl, pH=7.2-7.4)，时间为60-90min,温度为20-25℃；Apt-T30与ExoⅠ反应所用缓冲溶液为NEBuffer 3，时间为90-120min，温度为37℃；Apt-T30与AA和硫酸铜的反应缓冲溶液为MOPS(10 mM MOPS, 2mM MgCl2, 150mM NaCl, pH=7.6)，温度为20-25℃，时间为3-5min，在荧光检测模式和稳定同位素检测模式下可分别达到0.17ppb和0.30ppt的检出限。

本发明具有如下有益效果：本发明提供了一种可以实现双模式对TNT进行分析的方法，满足了现场快速检测和长时间稳定高灵敏检测两种应用情景，分别实现了PPB（ngmL^-1）和PPT（pg mL^-1）级别的检出限。利用具有荧光性质的PolyT CuNPs简单易合成的特点，本发明在荧光检测模式下具有操作简便、成本低廉、相应快速的优势，可以实现对TNT的快速现场检测；另外，利用ICPMS对稳定同位素检测的检出限低（大部分元素都可以达到pgmL^-1级别）、基体效应小、线性范围广（高达九个数量级）、稳定性优异的优点，对TNT的检测大大提高了灵敏度和长时间稳定性，对ppt浓度级别的TNT都能有较好响应，同时在60天的时间里信号不发生衰减，可以实现长时间稳定高灵敏检测。

附图说明

本发明采用的基于PolyT-CuNPs对TNT的双模态分析性能研究

图1 为本发明分析方法的机理和现象证明图

图2 为本发明分析方法对TNT的特异性示意图

图3 为本发明分析方法在荧光检测模式和稳定同位素检测模式下的分析性能示意图

图4 为本发明分析方法对实际水样进行检测的回收率结果图

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下属实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中所用到的水均为超纯水，经Milli-Q超纯水净化系统处理而成。下述实例中所有样品在使用前均未进行纯化。

本发明按以下具体步骤进行：

荧光检测模式：

a.核酸适配体和待测TNT的复合

a1 取10μL、10μM的核酸适配体-聚胸腺嘧啶底物（AptTNT-PolyT）和10μL待测TNT溶液在EP管中反应，时间为60-90min,温度为20-25℃，其中底物和待测TNT均溶解于PBS缓冲液中，

a2 待测TNT分子和底物中核酸适配体部分复合，形成端基保护作用；

b. 核酸外切酶1（ExoⅠ）对复合物进行酶解反应，

b1 在复合后的溶液中加入ExoⅠ酶40U，再加入25μL NEBuffer 3，并转移至PCR仪中反应，

b2在37℃下反应90-120min即酶解完全，再升温至85℃反应15min使酶失活；

c. PolyT-CuNPs原位合成

c1 将失活后的溶液从PCR仪中取出，加入160μL MOPS缓冲液和10μL、20μM的抗坏血酸水溶液，在孵育器中振荡1min,25℃,

c2 再加入35μL、1mM的硫酸铜水溶液，在孵育器上轻微振荡5min即完成PolyT-CuNPs的合成;

d. 酶标仪测定

d1 将反应后的溶液加入荧光测量板，并放入酶标仪,

d2 用340nm的激发波长、660nm的发射波长检测荧光,

d3 将所测得荧光强度代入线性方程计算浓度。

稳定同位素检测模式：

a.氨基化的AptTNT-PolyT和羧基化磁性微球的复合

a1 取10μL羧基化磁性微球与500μL 0.1M EDC咪唑溶液（pH=7.0）于EP管中振荡孵育30min，活化羧基，温度为37℃，

a2 在磁力架上将反应后的溶液磁性分离，析出上清液，用咪唑溶液清洗三次，

a3 取10μL、10μL的5’氨基化的AptTNT-PolyT底物和活化后的磁性微球反应，加入500μL 咪唑溶液振荡孵育，时间为90-120min,温度为20-25℃，

a4 反应后再次在磁力架上，用咪唑溶液清洗三次；

a5 再用1%的牛血清蛋白（BSA）溶液对磁性微球进行封闭，条件为90min、20-25摄氏度振荡孵育；

a6 封闭结束后在磁力架上用去离子水清洗三次，溶解于10μL PBS中，4摄氏度冷冻保存；

b. 连接磁性微球的核酸适配体和待测TNT的复合

b1 取10μL的连接磁性微球的核酸适配体和10μL待测TNT溶液在孵育器中剧烈振荡反应，时间为60-90min,温度为20-25℃，其中底物和待测TNT均溶解于PBS缓冲液中，

b2 待测TNT分子和底物中核酸适配体部分复合，形成端基保护作用；

c. 核酸外切酶1（ExoⅠ）对复合物进行酶解反应，

c1 在复合后的溶液中加入ExoⅠ酶40U，再加入25μL NEBuffer 3，

c2在37℃下反应90-120min即酶解完全，反应在孵育器中剧烈振荡进行，

c3 转移至PCR仪中，升温至85℃反应15min使酶失活；

d.PolyT-CuNPs原位合成

d1 将失活后的溶液从PCR仪中取出，加入160μL MOPS缓冲液和10μL、20μM的抗坏血酸水溶液，在孵育器中振荡1min,25℃,

d2 再加入35μL、1mM的硫酸铜水溶液，在孵育器上轻微振荡5min即完成PolyT-CuNPs的合成;

d3 加入20% HNO₃200μL，在孵育器中剧烈振荡消解CuNPs，反应温度为25-30℃，时间为30-60min；

e.ICPMS测定

e1 将硝酸消解后的溶液稀释至4mL，并转移至EP管,

e2 在ICPMS中对63Cu、65Cu同位素进行检测，STD模式,

d3 以63Cu为标准，对所测得强度代入线性方程计算浓度。

下面结合说明书附图做进一步的说明，但本发明分析方法并不限于下述实施例。

实施例1、是否形成端基保护对TNT检测的对比实验

为了确定TNT和AptTNT-T30适配体端形成端基保护是合成PolyT CuNPs的关键，以AptTNT-T30探针为例，对TNT进行响应，对比在ExoⅠ酶存在下，有无端基保护形成对合成荧光性质的Poly-CuNPs的影响。实验中，加入TNT样品200nM，ExoⅠ40U，激发波长340nm，发射波长660nm。由图1可以看出，在没有TNT样品存在时，无端基保护形成，加入ExoⅠ酶后和AptTNT-T30发生酶切反应，荧光信号响应明显减弱，接近于空白，无法形成PolyT CuNPs,而加入失活的ExoⅠ酶时，无酶切反应发生荧光响应恢复；而在TNT样品存在下，和AptTNT-T30发生端基保护反应，加入了ExoⅠ酶的体系和未加入ExoⅠ的体系都有近似的荧光信号相响应，证明端基保护阻止了ExoⅠ的酶切作用，形成了PolyT CuNPs。因而，本实施例充分证明了利用端基保护，形成的PolyT CuNPs的荧光性质是TNT定量检测的重要依据。

实施例2、探究本发明分析方法对TNT的特异性检测

本实施例利用“荧光-稳定同位素”双模态对三硝基甲苯的检测方法对多种干扰物（其他常见爆炸物、金属离子、氨基酸和生物酶类）的检测，探究了本发明分析方法对TNT的特异性检测能力。

1.对TNT和其他干扰物的检测

利用上述具体步骤，分别在荧光检测模式和稳定同位素检测模式下对TNT和多种干扰物进行检测。

其中，荧光检测模式下，先将10μL、10μM AptTNT-T30底物和10μL待测物在PCR仪中反应。其中，待测TNT浓度为20nM,其他干扰物为1mM，反应条件为25℃，90min。再加入25μLNebuffer 3缓冲液和40U ExoⅠ进行酶解反应。PCR反应条件为37℃，120min。酶解反应结束后升温至85℃反应15min使酶失活。最后加入10μL 20mM的抗坏血酸溶液和35mL 1mM硫酸铜溶液，反应5min，在酶标仪中用340nm的激发光检测660nm的发射光强度。

稳定同位素检测模式下，先按上述步骤合成磁性微球功能化的AptTNT-T30底物，并和10μL待测物在孵育器中剧烈振荡反应。其中，待测TNT浓度为20nM,其他干扰物为1mM，生物酶的浓度均为50U·μL，反应条件为25℃，90min。再加入25μL Nebuffer 3缓冲液和40UExoⅠ进行酶解反应。反应条件为37℃，120min。酶解反应结束后升温至85℃反应15min使酶失活。最后加入10μL 20mM的抗坏血酸溶液和35mL 1mM硫酸铜溶液，反应5min。在磁力架上磁性分离后，再加入20%HNO₃消解，在25℃下反应30min，再用ICPMS检测63Cu信号。

2. 检测结果

检测的特异性：如图2所示，在荧光检测模式和稳定同位素检测模式下，除了TNT作为待测物能够有显著信号增强外，其他常见爆炸物（三过氧化三丙酮 TATP,苦味酸 PA，黑索金 RDX，奥克托金 HMX，3-硝基甲苯，1，3-二硝基苯酚，2，4-二硝基甲苯 DNT，硝基苯酚，4-硝基甲苯）、金属离子（铅、镍、锌离子）、氨基酸（甘氨酸、酪氨酸、胱氨酸）和生物酶（核酸外切酶3、核酸外切酶4、凝血酶）都不能引起明显的荧光信号和稳定同位素信号，证明本发明提出的利用“荧光-稳定同位素”双模态对三硝基甲苯的检测方法具有很高的特异性。

实施例3、探究本发明分析方法对TNT的灵敏性检测

本实施例探究了荧光检测模式和稳定同位素检测模式下，对TNT检测的灵敏度和线性。

1. 本发明分析方法对TNT的灵敏性检测

荧光检测模式下，先将10μL、10μM AptTNT-T30底物和10μL不同浓度的TNT在PCR仪中反应。其中，待测TNT浓度为20nM,其他干扰物为1mM，反应条件为25℃，90min。再加入25μLNebuffer 3缓冲液和40U ExoⅠ进行酶解反应。PCR反应条件为37℃，120min。酶解反应结束后升温至85℃反应15min使酶失活。最后加入10μL 20mM的抗坏血酸溶液和35mL 1mM硫酸铜溶液，反应5min，在酶标仪中用340nm的激发光检测660nm的发射光强度。

稳定同位素检测模式下，先按上述步骤合成磁性微球功能化的AptTNT-T30底物，并和10μL不同浓度的TNT在孵育器中剧烈振荡反应。反应条件为25℃，90min。再加入25μLNebuffer 3缓冲液和40U ExoⅠ进行酶解反应。反应条件为37℃，120min。酶解反应结束后升温至85℃反应15min使酶失活。最后加入10μL 20mM的抗坏血酸溶液和35mL 1mM硫酸铜溶液，反应5min。在磁力架上磁性分离后，再加入20%HNO₃消解，在25℃下反应30min，再用ICPMS检测63Cu信号。

对荧光信号和稳定同位素信号分别进行线性回归分析，计算线性范围和检出限。

2. 检测结果

由图3可见，根据浓度与响应信号成正比的关系，得到了TNT浓度与响应信号的线性关系。在荧光检测模式下，当TNT浓度在1-100nM内荧光响应信号呈线性关系，线性相关系数为0.994，计算出检出限为0.17ppb （ng mL^-1）;在稳定同位素检测模式下，当TNT浓度在0.05 to 2.0 nM内时63Cu信号与TNT浓度呈线性关系，相关系数为0.989，计算出检出限为0.30ppt (pg mL^-1)。证明本分析方法具有良好的灵敏度。

3. 稳定同位素模式下对TNT的长时间稳定检测

在上述条件下，加入TNT样品1nM，分别在第0-60天，每个十天进行一次检测，如图3所示发现ICPMS信号没有明显变化，证明稳定同位素检测模式具有优异的长时间稳定检测能力。

实施例4、探究本发明分析方法对实际水样中TNT的检测

1. 样品采集：水体样本1-4采自长江四川省宜宾市区段；5-8采集自重庆市北碚区顺安爆破器材有限公司排水渠。

2. 样品前处理：将采集水样用200μM滤膜过滤，再用去离子水稀释20倍，并分别加入TNT标准样品至终浓度5 nM。

3. 荧光检测模式和稳定同位素检测模式下分别对TNT进行检测：

荧光检测模式下，先将10μL、10μM AptTNT-T30底物和10μL待测水体样本在PCR仪中反应。其中，待测TNT浓度为20nM,其他干扰物为1mM，反应条件为25℃，90min。再加入25μLNebuffer 3缓冲液和40U ExoⅠ进行酶解反应。PCR反应条件为37℃，120min。酶解反应结束后升温至85℃反应15min使酶失活。最后加入10μL 20mM的抗坏血酸溶液和35mL 1mM硫酸铜溶液，反应5min，在酶标仪中用340nm的激发光检测660nm的发射光强度。

稳定同位素检测模式下，先按上述步骤合成磁性微球功能化的AptTNT-T30底物，并和10μL待测水体样本在孵育器中剧烈振荡反应。反应条件为25℃，90min。再加入25μLNebuffer 3缓冲液和40U ExoⅠ进行酶解反应。反应条件为37℃，120min。酶解反应结束后升温至85℃反应15min使酶失活。最后加入10μL 20mM的抗坏血酸溶液和35mL 1mM硫酸铜溶液，反应5min。在磁力架上磁性分离后，再加入20%HNO₃消解，在25℃下反应30min，再用ICPMS检测63Cu信号。

分别把荧光和稳定同位素检测结果代入线性方程中算得检测浓度结果。

4．检测结果

结果见图4，荧光模式和稳定同位素模式下均可得到88%-110%回收率的检测结果，证明本发明分析方法具有实际样品分析检测能力。

Claims

1.一种可以检测三硝基甲苯（TNT）的分析方法，其特征在于：

（1）所述分析方法包括聚胸腺嘧啶-核酸适配体探针，即AptTNT-PolyT，和荧光检测和稳定同位素检测；

（2）所述分析方法AptTNT-PolyT探针序列为5’-TTT TTT TTT TTT (……) TTTTTTTTTTTT CTC GGT TGT GGT GTT AGT TGG TAC TGC GCC TCC GTC GTC CTG TCA CTC TGCTGC AGC GCG CGA GCC ATA CAC TAT ACA CCT TAA AAT ATA GTT GCC TAG G-3’；

（3）所述分析方法AptTNT-PolyT探针序列中，5’端TTT TTT TTT TTT (……) TTTTTTTTTTTT序列为聚胸腺嘧啶核酸序列，在抗坏血酸和硫酸铜的作用下快速原位合成铜纳米粒子；

（4）所述分析方法AptTNT-PolyT探针序列中，3’端CTC GGT TGT GGT GTT AGT TGG TACTGC GCC TCC GTC GTC CTG TCA CTC TGC TGC AGC GCG CGA GCC ATA CAC TAT ACA CCTTAA AAT ATA GTT GCC TAG G序列为核酸适配体序列，在PBS溶液中和待测TNT分子特异性结合生成三明治结构，形成端基保护，不被ExoⅠ酶切割；

（5）该分析方法包括：a.荧光光谱传感分析，即TNT和AptTNT-PolyT探针反应形成端基保护后，可以不被ExoⅠ酶切割，在抗坏血酸和硫酸铜作用下快速原位合成铜纳米粒子，利用铜纳米粒子特异性荧光光谱，记录下不同浓度的发射光信号，采用线性回归分析，即可对待测TNT样品进行荧光定量检测；b.稳定同位素检测，即TNT和AptTNT-PolyT探针反应形成端基保护后，可以不被ExoⅠ酶切割，在抗坏血酸和硫酸铜作用下快速原位合成铜纳米粒子，在硝酸消解后转换成大量铜离子，利用电感耦合等离子体质谱仪对铜元素稳定同位素进行高灵敏定量，记录下不同浓度的同位素质谱强度信号，采用线性回归分析，即可对TNT样品进行高灵敏稳定检测。

2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于：

（1）所述分析方法中在荧光检测模式下TNT进样量浓度范围为1-100nM，在稳定同位素检测模式下TNT进样量浓度范围为0.25-20nM；

（2）所述分析方法中TNT与AptTNT-PolyT反应所用缓冲溶液为PBS溶液，所述PBS溶液由8.1mM Na₂HPO₃, 1.9mM NaH₂PO₃,145mM NaCl组成，且pH=7.2-7.4，时间为60-90min,温度为20-25℃；

（3）所述分析方法中AptTNT-PolyT与ExoⅠ反应所用缓冲溶液为NEBuffer 3，时间为90-120min，温度为37℃；

（4）所述分析方法中AptTNT-PolyT与抗坏血酸和硫酸铜的反应缓冲溶液为MOPS；所述MOPS溶液由10 mM MOPS, 2mM MgCl2, 150mM NaCl组成，且pH=7.6，温度为20-25℃，时间为3-5min；

（5）所述分析方法中在荧光检测模式和稳定同位素检测模式下对TNT的检出限可达到0.17ppb和0.30ppt ，且单位分别为ng mL^-1和pg mL^-1。

3.根据权利要求1或2所述的分析方法，其特征在于：在荧光检测模式下利用荧光光谱仪进行检测，在360nm波长的光激发下，CuNPs发射出660nm的红色荧光；在稳定同位素检测模式下利用ICPMS进行检测，以⁶³Cu同位素作为检测对象进行高灵敏定量分析。