CN117309847B - 一种基于磁性核壳型纳米球的三硝基甲苯检测传感器 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于磁性核壳型纳米球的三硝基甲苯检测传感器，涉及硝基化合物检测技术领域，所述三硝基甲苯检测传感器包括apt/Fe3O4@PDA‑Co2+固体粉末和氯醌酸/H2O2化学发光体系，所述apt/Fe3O4@PDA‑Co2+固体粉末以核壳型Fe3O4@PDA‑Co2+纳米球为球心，然后在Fe3O4@PDA‑Co2+纳米球表面负载三硝基甲苯的适配体。本发明所合成的材料具有良好的磁性、便于分离回收且具有较高化学发光催化性能，检测后，重新负载适配体即可，可以实现多次重复利用；灵敏度高，线性范围较宽，既可实现较低浓度TNT的检测，也可实现接近微克级含量的精确检测。
Description
技术领域
本发明涉及纳米生物学技术领域，具体涉及一种基于磁性核壳型纳米球的三硝基甲苯检测传感器。
背景技术
三硝基甲苯（TNT）作为一种军用炸药，是陆军仓库、弹药评估设施、炮兵靶场和军械处理场土壤的主要污染物（J Hazard Mater., 2023;443(Pt B):130290）。除了军事用途，三硝基甲苯还是合成增塑剂、杀虫剂、除草剂及燃料等产品的重要化工原料（Environ.Earth Sci., 859(1):012096），在产品粉碎、过筛、配料等生产过程中，不可避免会有排放与泄露，从而对生态坏境产生潜在的危害。TNT传统的检测方法主要有高效液相色谱-质谱法（GC-MS）（化学分析计量，2018,27(02):68-71）、气相色谱法（绿色科技， 2019(24):3）等，新型检测方法有荧光法（Nat nanotechnology., 2012, 7(9): 583-586）、电化学法（J.Am. Chem.Soc., 2017. 139(1): p.186-192）、拉曼光谱法（ACS Catal., 2013. 3(7):p.1448-1453）等，这些检测方法都有各自的缺点，比如前处理较为复杂、耗费时间、需要昂贵的大型仪器，不方便进行现场的检测以及需要专业的技术人员操作等，化学发光法（Sensors and Actuators B: Chemical., 2015, 220: 516-521）作为新型爆炸物检测方法具有分析快、灵敏度高、检测限低、检测范围宽、仪器设备简单、检测时无须外部光源、背景信号低且信噪比低等诸多优点。因此本研究选取化学发光法进行实验，便于对三硝基甲苯的现场检测，然而化学发光传感器的检测方法大部分都涉及到标记技术，标记过程复杂且耗时，限制了该方法的实际应用。
适配体传感器属于生物传感器，它将对生物物质敏感的元件和物理传导技术有效结合在一起，发展了一种新型的能将待测物浓度转换为其他信号进行检测的分析方法。与传统的抗体相比，适配体与目标分子具有更高的结合常数和更好的识别特异性，两者间的结合作用力更强，结合更牢固；适配体目前已经可以商品化量产，制备方法简单快捷，可以大量快速合成，产量和纯度均可以满足科研的要求；此外适配体的稳定性很好，与容易变性的抗体相比，适配体不容易变质，更易保存，简化了传感器的制备过程。比如Kong等人（Kong, Weijun, et al. "Highly chemiluminescent magnetic beads for label-freesensing of 2, 4, 6-trinitrotoluene." Analytical chemistry 89.13 (2017): 7145-7151.）通过简单的方法先后将化学发光试剂ABEI和金属离子催化剂（Co2+）负载到磁珠表面，制备具有高强度化学发光信号的双功能化纳米材料，在体系中加入三硝基甲苯的适配体，基于纳米材料与适配体对三硝基甲苯的竞争性结合，构建无需标记的化学发光传感器检测三硝基甲苯，该传感器检测范围约0.05~25 ng/ml，检出限为17 pg/ml，且选择性较高。然而该技术在将化学发光试剂ABEI和金属离子催化剂负载到磁珠表面前需要对磁珠表面进行表面处理，制备得到的传感器在TNT检测过程中，磁珠表面的Co2+随适配体一起掉落，使得该技术制备的传感器只能使用一次，不能回收反复使用；此外，该传感器的线性检测范围较窄，TNT很容易超过其检测上限，不利于较大范围的精确检测。
发明内容
针对现有技术中的上述问题，本发明提供一种基于磁性核壳型纳米球的三硝基甲苯检测传感器，以解决现有三硝基甲苯检测传感器不能回收反复使用以及线性检测范围较窄的技术问题。
本发明采用的技术方案如下：
一种基于磁性核壳型纳米球的三硝基甲苯检测传感器，所述三硝基甲苯检测传感器包括apt/Fe3O4@PDA-Co2+固体粉末和氯醌酸（以下简称：DDBQ）/H2O2化学发光体系，所述apt/Fe3O4@PDA-Co2+固体粉末以核壳型Fe3O4@PDA-Co2+纳米球为球心，然后在Fe3O4@PDA-Co2+纳米球表面负载三硝基甲苯的适配体。
本发明的原理在于：以纳米四氧化三铁粒子（Fe3O4）为核，通过多巴胺（DA）自聚集为聚多巴胺（PDA）在其表面形成核壳结构的Fe3O4@PDA纳米球；加入二价钴离子（Co2+）后，PDA表面的邻苯二酚基团能够通过螯合作用将Co2+固定在材料表面，合成Fe3O4@PDA-Co2+纳米球。Fe3O4@PDA-Co2+纳米球作为催化剂加入到DDBQ/H2O2的化学发光体系中，可催化产生大量活性氧自由基增强化学发光信号。以Fe3O4@PDA-Co2+纳米球作为固相载体和传感界面，在其表面附着TNT的适配体，此时apt将阻断材料上Co2+的催化位点，减少体系产生的活性自由基，显著猝灭CL信号。利用TNT与apt特异性结识别后能使CL信号恢复，目标物越多，信号强度恢复得越高的原理，构建一种无标记化学发光适配体传感器实现对环境中TNT的痕量检测。
更优地，所述三硝基甲苯检测传感器的制备方法包括如下步骤：
（1）制备核壳型Fe3O4@PDA-Co2+纳米球：
在Tris-HCl缓冲溶液中加入Fe3O4和多巴胺，于室温下机械搅拌6小时制得Fe3O4@PDA纳米球溶液，将该溶液用超纯水和乙醇交替洗涤后分散于超纯水中，高速离心分离后置于干燥箱真空干燥，得到Fe3O4@PDA粉末，研磨备用；
称取一定量Fe3O4@PDA粉末溶于CoCl2·6 H2O溶液中，于室温下机械搅拌0.5 h制得Fe3O4@PDA-Co2+纳米球溶液，用超纯水和乙醇交替洗涤后分散于超纯水中，将溶液高速离心分离后置于干燥箱真空干燥，得到Fe3O4@PDA-Co2+粉末，研磨备用；
（2）负载三硝基甲苯的适配体：
将三硝基甲苯的适配体溶于PBS缓冲液中，并加入Fe3O4@PDA-Co2+纳米球溶液，使得混合溶液在恒温震荡箱中30~40℃下震荡反应3 h后，用超纯水清洗并干燥，即可得到apt/Fe3O4@PDA-Co2+固体粉末；
（3）配制DDBQ/H2O2化学发光体系。
更进一步地，步骤（1）中相关反应条件为：Tris-HCl缓冲溶液的使用浓度为10 mM，pH=8.5，常温保存；Fe3O4和多巴胺的质量比为1∶1。
更进一步地，步骤（1）中Fe3O4和多巴胺的反应后处理条件：高速离心机转速为8000rpm，时间为10 min ，Fe3O4@PDA粉末的干燥条件为60~80℃下真空干燥8 h。
更进一步地，步骤（1）中Fe3O4@PDA-Co2+纳米球的干燥时间为8 h。
更进一步地，步骤（2）中，所述适配体的浓度为2 μg/ml，置于冰箱-20℃保存，Fe3O4@PDA-Co2+的浓度为0.1 μg/ml，使用前超声分散5 min ；适配体溶液和Fe3O4@PDA-Co2+的体积比为1∶1。
更进一步地，步骤（3）中，所用的DDBQ浓度为2.5 mM，用30% DMF溶液稀释，冰箱4℃保存；所用的H2O2的浓度为900 mM，每次实验现配现用。
上述任意一项所述的基于磁性核壳型纳米球的三硝基甲苯检测传感器，所述三硝基甲苯检测传感器的使用步骤如下：先将apt/Fe3O4@PDA-Co2+固体粉末使用PBS缓冲液分散备用，而后将apt/Fe3O4@PDA-Co2+缓冲液与待测样品按照体积比为1∶1的比例在37℃下恒温震荡孵育0.5小时，用PBS缓冲液清洗后加超纯水分散，然后设置化学发光仪器参数，将DDBQ/H2O2化学发光体系与TNT/apt/Fe3O4@PDA-Co2+溶液先后投入化学发光仪器的石英小孔板中，立刻盖上检测器盖子，读取数据。
更进一步地，所述PBS缓冲溶液的浓度为0.01 M，pH=7。
综上所述，相比于现有技术，本发明具有如下优点及有益效果：
1、本发明所合成的材料具有良好的磁性、便于分离回收且具有较高化学发光催化性能，检测后，重新负载适配体即可，可以实现多次重复利用；
2、本发明操作简单、检测快速、成本低廉，其提供的传感器无需标记，选择性良好；
3、灵敏度高，线性范围较宽，为0.025至500 ng/ml，既可实现较低浓度TNT的检测，也可实现接近微克级含量的精确检测，为环境中痕量以及痕量以上的TNT的检测分析提供了一个新方法。
附图说明
图1为本发明提供的无标记化学发光适配体传感器检测TNT的原理图；
图2为实施例1制备的Fe3O4@PDA-Co2+材料的扫描电镜图（SEM）；
图3为不同材料在发光体系中的发光情况曲线图；
图4为检测不同的试剂的发光情况柱状图；
图5为传感器体系的浓度-化学线性研究图，其中A为传感器体系的浓度-化学发光信号图，B为CL与TNT浓度的对数之间线性关系图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图以及各实施例和验证例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例和验证例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，即所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
在这里专用的词“实施例”，作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。本法实施例中性能指标测试，除非特别说明，采用本领域常规试验方法。本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明公开的内容。
除非另有说明，否则本文使用的技术和科学术语具有本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义；作为本发明中的其它未特别注明的原材料、试剂、试验方法和技术手段均指本领域内普通技术人员通常使用的原材料和试剂，以及通常采用的实验方法和技术手段。
实施例1
如图1，为本发明提供的无标记化学发光适配体传感器检测TNT的原理图；
本实施例针对本发明提供的传感器的制备、可行性、选择性、检出范围等进行了讨论，具体内容如下：
（1）Fe3O4@PDA-Co2+纳米球的制备
将1 g Fe3O4纳米材料和1 g多巴胺溶解在500 ml Tris-HCl缓冲溶液（10 mM，pH=8.5）中，连续机械搅拌6 h，使用超纯水、乙醇交替洗涤三次，制得Fe3O4@PDA纳米球溶液，将该溶液置于干燥箱60℃真空干燥8小时，得到Fe3O4@PDA粉末，研磨备用。称取1.1897 gCoCl2·6 H2O于容量瓶中用上述Tris-HCl溶液定容至50 ml，制备50 mM的Co2+溶液，于该Co2+溶液中加入50 mg Fe3O4@PDA粉末，连续机械搅拌0.5 h制备Fe3O4@PDA-Co2+纳米球溶液，使用超纯水、乙醇交替洗涤三次，40℃下真空干燥8 h制得Fe3O4@PDA-Co2+纳米球粉末，研磨备用。其SEM如图2所示。
（2）配制DDBQ/H2O2化学发光体系并验证其发光情况
移取100 μL 900 mM H2O2溶液和100 μL 2.5 mM DDBQ溶液于300 μL石英小孔板中，立即使用RFL-1化学发光仪检测其发光信号。待测定结束以后，加入超纯水将催化剂及石英小孔板清洗3次。
（3）Fe3O4纳米材料催化化学发光验证
检测时，移取100 μL 900 mM H2O2溶液和100 μL 2.5 mM DDBQ溶液于300 μL石英小孔板中，再移取100 μL 0.1 μg/mL Fe3O4分散液加入后立即使用RFL-1化学发光仪检测其发光信号。待测定结束以后，使用磁铁进行磁性分离弃去废液，加入超纯水将催化剂及石英小孔板清洗3次。
（4）Fe3O4@PDA纳米球催化化学发光验证
检测时，移取100 μL 900 mM H2O2溶液和100 μL 2.5 mM DDBQ溶液于300 μL石英小孔板中，再移取100 μL 0.1 μg/mL Fe3O4@PDA分散液加入后立即使用RFL-1化学发光仪检测其发光信号。待测定结束以后，使用磁铁进行磁性分离弃去废液，加入超纯水将催化剂及石英小孔板清洗3次。
（5）Fe3O4@PDA-Co2+纳米球催化化学发光验证
检测时，移取100 μL 900 mM H2O2溶液和100 μL 2.5 mM DDBQ溶液于300 μL石英小孔板中，再移取100 μL 0.1 μg/mL Fe3O4@PDA-Co2+分散液加入后立即使用RFL-1化学发光仪检测其发光信号。待测定结束以后，使用磁铁进行磁性分离弃去废液，加入超纯水将催化剂及石英小孔板清洗3次。
（6）Fe3O4@PDA-Co2+ /apt纳米球催化化学发光验证
配制2 μg/mL apt溶液，取2 mL该溶液与2 mL Fe3O4@PDA-Co2+纳米球溶液混合，于恒温震荡箱中37℃连续震荡反应3 h，用0.01 M pH=7 的PBS缓冲溶液清洗2次，得到Fe3O4@PDA-Co2+ /apt，并用2 mL缓冲液分散备用。本实施例所用的apt（适配体），为(N)Trp-His-Trp-Gln-Arg-Pro-Leu-Met-Pro-Val-Ser-Ile-Lys(C)多肽序列。
检测时，移取100 μL 900 mM H2O2溶液和100 μL 2.5 mM DDBQ溶液于300 μL石英小孔板中，再移取100 μL 0.1 μg/mL Fe3O4@PDA-Co2+ /apt分散液加入后立即使用RFL-1化学发光仪检测其发光信号。待测定结束以后，使用磁铁进行磁性分离弃去废液，加入超纯水将催化剂及石英小孔板清洗3次。
（7）化学发光适配体传感器的构建
配制2 μg/mL apt溶液，取2 mL该溶液与2 mL Fe3O4@PDA-Co2+纳米球溶液混合，于恒温震荡箱中37℃连续震荡反应3 h，用0.01 M pH=7 的PBS缓冲溶液清洗2次，得到apt/Fe3O4@PDA-Co2+，并用2 mL该缓冲液分散备用。本实施例所用的apt（适配体），为(N)Trp-His-Trp-Gln-Arg-Pro-Leu-Met-Pro-Val-Ser-Ile-Lys(C)多肽序列。
配制不同浓度的TNT溶液，各自取1 mL和1 mL apt/Fe3O4@PDA-Co2+溶液混合，在37℃下恒温震荡孵育0.5 h，用上述PBS缓冲液清洗两次后，加1 mL超纯水分散。设置化学发光仪器参数，DDBQ和H2O2溶液依次取100 μL加到仪器中的石英小孔板中，最后加入100 μLTNT/apt/Fe3O4@PDA-Co2+溶液，立刻盖上检测器盖子，读取数据。
如图3所示，为（2）~（7）测得的发光情况曲线图，不难看出相较于Fe3O4@PDA-Co2+纳米球催化化学发光，Fe3O4和Fe3O4@PDA的发光均较弱，Co2+明显增强了Fe3O4@PDA的发光情况，然而适配体与传感器的结合使得化学发光信号甚至降至基准线以下，而在TNT存在时，其化学发光信号明显升至基准线以上，说明TNT的存在能够使得体系重新恢复化学发光信号。这验证了本发明的原理猜想。
如图4所示，将（7）中的TNT替换为其他的待测样品，可以看出，本发明所得的传感器对于TNT的检测具有明显的特异性。
如图5所示，将（7）中的TNT浓度进行替换研究，可以看出，在0.025-500.0 nM范围内，随着TNT浓度的不断增大，化学发光信号（CL）逐渐升高（如图5（A）所示），且在该范围内CL与TNT浓度的对数之间呈现出良好的线性关系，其线性关系如图5（B）所示。其中线性方程为y=293.19808 log C(TNT)+800.14886。
以上施例和验证例仅表达了本申请的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。
Claims (9)
1.一种基于磁性核壳型纳米球的三硝基甲苯检测传感器，其特征在于，所述三硝基甲苯检测传感器包括apt/Fe3O4@PDA-Co2+固体粉末和氯醌酸/H2O2化学发光体系，所述apt/Fe3O4@PDA-Co2+固体粉末以核壳型Fe3O4@PDA-Co2+纳米球为球心，然后在Fe3O4@PDA-Co2+纳米球表面负载三硝基甲苯的适配体。
2.如权利要求1所述的基于磁性核壳型纳米球的三硝基甲苯检测传感器，其特征在于，所述三硝基甲苯检测传感器的制备方法包括如下步骤：
（1）制备核壳型Fe3O4@PDA-Co2+纳米球：
在Tris-HCl缓冲溶液中加入Fe3O4和多巴胺，于室温下机械搅拌6小时制得Fe3O4@PDA纳米球溶液，将该溶液用超纯水和乙醇交替洗涤后分散于超纯水中，高速离心分离后置于干燥箱真空干燥，得到Fe3O4@PDA粉末，研磨备用；
称取一定量Fe3O4@PDA粉末溶于CoCl2·6 H2O溶液中，于室温下机械搅拌0.5 h制得Fe3O4@PDA-Co2+纳米球溶液，用超纯水和乙醇交替洗涤后分散于超纯水中，将溶液高速离心分离后置于干燥箱真空干燥，得到Fe3O4@PDA-Co2+粉末，研磨备用；
（2）负载三硝基甲苯的适配体：
将三硝基甲苯的适配体溶于PBS缓冲液中，并加入Fe3O4@PDA-Co2+纳米球溶液，使得混合溶液在恒温震荡箱中30~40℃下震荡反应3 h后，用超纯水清洗并干燥，即可得到apt/Fe3O4@PDA-Co2+固体粉末；
（3）配制氯醌酸/H2O2化学发光体系。
3.如权利要求2所述的基于磁性核壳型纳米球的三硝基甲苯检测传感器，其特征在于，步骤（1）中相关反应条件为：Tris-HCl缓冲溶液的使用浓度为10 mM，pH=8.5，常温保存；Fe3O4和多巴胺的质量比为1∶1。
4.如权利要求2所述的基于磁性核壳型纳米球的三硝基甲苯检测传感器，其特征在于，步骤（1）中Fe3O4和多巴胺的反应后处理条件：高速离心机转速为8000 rpm，时间为10 min ，Fe3O4@PDA粉末的干燥条件为60~80℃下真空干燥8 h。
5.如权利要求2所述的基于磁性核壳型纳米球的三硝基甲苯检测传感器，其特征在于，步骤（1）中Fe3O4@PDA-Co2+纳米球的干燥时间为8 h。
6.如权利要求2所述的基于磁性核壳型纳米球的三硝基甲苯检测传感器，其特征在于，步骤（2）中，所述适配体的浓度为2 μg/ml，置于冰箱-20℃保存，Fe3O4@PDA-Co2+的浓度为0.1 μg/ml，使用前超声分散5 min ；适配体溶液和Fe3O4@PDA-Co2+溶液的体积比为1∶1。
7.如权利要求2所述的基于磁性核壳型纳米球的三硝基甲苯检测传感器，其特征在于，步骤（3）中，所用的氯醌酸浓度为2.5 mM，用30% DMF溶液稀释，冰箱4℃保存；所用的H2O2的浓度为900 mM，每次实验现配现用。
8.如权利要求1~7任意一项所述的基于磁性核壳型纳米球的三硝基甲苯检测传感器，其特征在于，所述三硝基甲苯检测传感器的使用步骤如下：先将apt/Fe3O4@PDA-Co2+固体粉末使用PBS缓冲液分散备用，而后将apt/Fe3O4@PDA-Co2+缓冲液与待测样品按照体积比为1∶1的比例在37℃下恒温震荡孵育0.5小时，用PBS缓冲液清洗后加超纯水分散，然后设置化学发光仪器参数，将氯醌酸/H2O2化学发光体系与TNT/apt/Fe3O4@PDA-Co2+溶液先后投入化学发光仪器的石英小孔板中，立刻盖上检测器盖子，读取数据。
9.如权利要求8所述的基于磁性核壳型纳米球的三硝基甲苯检测传感器，其特征在于，所述PBS缓冲液的浓度为0.01 M，pH=7。
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