CN105842457A - 一种检测磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的试剂盒及检测方法 - Google Patents

一种检测磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于铜离子催化性质的检测磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican‑3，GPC3)的试剂盒及检测方法，所述试剂盒主要包括抗体功能化的氧化铜纳米探针和检测用试剂，所述抗体功能化的氧化铜纳米探针由氧化铜纳米颗粒表面修饰GPC3抗体并用BSA(牛血清白蛋白)封闭制得，氧化铜纳米颗粒与抗体的质量用量比为1：0.0015～0.03；所述检测用试剂由包被液、洗涤液、封闭液、显色液和终止液组成；本发明的有益效果主要体在：本发明是利用铜离子的催化性质来实现对蛋白质的检测，方法简单、经济、效果良好，不需要用到成本高、对环境条件敏感的生物酶。

Description

一种检测磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的试剂盒及检测方法
(一)技术领域
本发明涉及一种基于铜离子催化性质的检测磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican-3，GPC3)的试剂盒及检测方法。
(二)背景技术
生物酶是一种高效的生物催化剂，由于其高底物特异性和高催化活性，生物酶已被广泛应用于医学、生物技术、化学工业、环境科学以及其他领域。过氧化物酶是生物酶其中的一类，能够活化过氧化氢(H2O2)发生许多化学反应并应用于分析诊断等领域，例如辣根过氧化物酶(HRP)。然而这些生物酶稳定性较差，容易受到pH和温度等环境条件的影响，从而引发酶的变性或失活。而且生物酶还具有制备麻烦、提纯和储存成本高等问题。近年来有许多研究工作致力于构建过氧化物模拟酶，包括氯化血红素、卟啉、纳米材料模拟酶等。与生物酶相比，这些过氧化物模拟酶具有合成简单、稳定性好、价格便宜、容易储存等优点。GPC3是一种存在于细胞膜表面的硫酸乙酰肝素糖蛋白，在原发性肝细胞癌中特异性高表达，而在肝硬化、肝炎组织、癌旁组织、正常肝组织中低表达或不表达。GPC3被认为是肝细胞癌新的癌症标志物。实现对GPC3的特异性、高灵敏检测具有重要的意义。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种可实现对特异性蛋白的高灵敏检测的检测磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的试剂盒及检测方法。
本发明采用的技术方案是：
一种检测磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的试剂盒，主要包括抗体功能化的氧化铜纳米探针和检测用试剂；
所述抗体功能化的氧化铜纳米探针由氧化铜纳米颗粒表面修饰GPC3抗体并用BSA(牛血清白蛋白)封闭制得，氧化铜纳米颗粒与抗体的质量用量比为1：0.0015～0.03；
所述检测用试剂由包被液、洗涤液、封闭液、显色液和终止液组成，所述包被液为的pH7.4、6.7mM磷酸缓冲液；所述洗涤液组成如下：135mM氯化钠，2.7mM氯化钾，0.05％吐温-20，溶剂为pH7.4、50mM磷酸缓冲液；所述封闭液为1％BSA溶液；所述显色液组成如下：1.33mM TMB，1.33M过氧化氢，溶剂为0.2M、pH4.0的醋酸缓冲液；所述终止液为2M硫酸溶液。
本发明中，铜离子也具有类似过氧化物酶的催化活性，而且其催化活性不受底物浓度的影响，可通过提高H2O2的浓度来提高铜离子的催化效率。由于氧化铜纳米颗粒溶解可产生铜离子，所以利用抗体功能化的氧化铜纳米颗粒可实现对特异性蛋白的高灵敏检测。这种基于铜离子催化的方法与基于生物酶的方法相比，更简单、经济、有效。
具体的，所述抗体功能化的氧化铜纳米探针由如下方法制备得到：纳米氧化铜颗粒加入浓度10mM、pH7.4的磷酸缓冲液中超声分散均匀，再缓慢加入浓度为150ug/mL的GPC3抗体，震荡反应2～4小时，氧化铜纳米颗粒与GPC3抗体的质量比为1:0.0015～0.03，加入BSA至其终浓度为1％，封闭1～2h，保存于4℃冰箱备用。
本发明还涉及一种利用所述试剂盒检测磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的方法，所述方法如下：
(1)包被：将待测蛋白样品用包被稀释液稀释，分别取50μL加入96孔板中，37℃静置2h，弃去孔中液体，用洗涤液洗3遍；
(2)封闭：将200μL封闭液加至各反应孔并置于37℃2h，封闭结束后用洗涤液洗3遍；
(3)孵育纳米生物探针：各反应孔加入50μL抗体功能化的氧化铜纳米颗粒稀释液，37℃静置1h后，弃去孔中液体，用洗涤液洗5遍；
(4)氧化铜溶解：各反应孔加入50μL 50mM盐酸，37℃反应半小时；
(5)显色反应：各反应孔加入显色缓冲液150μL，37℃反应10min，然后加50μL终止液终止反应；
(6)检测：测量各孔溶液在450nm波长处的吸收值或者测量其在350～600nm波长范围内的吸收光光谱；
(7)标准曲线绘制：取梯度浓度的GPC3标准溶液，按照前述步骤(1)～(6)方法进行检测，绘制标准曲线；
(8)结果判定：根据待测蛋白样品的检测结果，对照标准曲线，获得待测蛋白样品的浓度数据。
本发明方法是利用抗体功能化的氧化铜纳米探针来识别目标蛋白，然后利用盐酸溶解氧化铜纳米探针并产生铜离子，通过铜离子的催化显色反应来间接检测目标蛋白。
本发明的有益效果主要体在：本发明是利用铜离子的催化性质来实现对蛋白质的检测，方法简单、经济、效果良好，不需要用到成本高、对环境条件敏感的生物酶。
(四)附图说明
图1为铜离子催化活性验证图，a为TMB溶液，b为TMB加H2O2的溶液，c为TMB加铜离子的溶液，d为TMB加H2O2与铜离子的溶液；图2为不同浓度铜离子催化TMB与H2O2反应后用H2SO4终止后的溶液吸收光谱图；
图3为铜离子的催化性质用于GPC3检测的原理示意图；
图4为抗体功能化氧化铜纳米探针用于GPC3检测的可行性考察；图中，a为CuO NPs-BSA，b为CuO NPs-BSA+GPC3，c为CuO NPs-Ab，d为CuO NPs-Ab+GPC3；
图5为分别对GPC3、BSA、HSA、EA以及Hb进行检测并考察对应的信号增强情况；
图6为检测不同浓度GPC3时，溶液在350～600nm波长范围内的吸收光谱图；
图7为检测不同浓度GPC3时，溶液在450nm波长处的吸收变化情况以及标准曲线。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：铜离子的催化性质及其应用
抗体功能化氧化铜纳米探针的制备：
1mg氧化铜(粒径小于50nm)加入1mL磷酸缓冲液(10mM、pH7.4)超声分散均匀。缓慢加入50μL 150μg/mL的GPC3抗体(1G12，Santa CruzBiotechnology，Inc.)，震荡反应3小时。加入BSA至其终浓度为1％，封闭1h，得到抗体功能化的氧化铜纳米探针(CuO NPs-Ab)。
同时按照上述方法，省去抗体修饰的步骤得到仅封闭BSA的氧化铜纳米探针(CuO NPs-BSA)作为参照。
铜离子的催化性质：
图1为铜离子催化活性验证图，a为TMB溶液，b为TMB加H2O2的溶液，c为TMB加铜离子的溶液，d为TMB加H2O2与铜离子的溶液。由图可见，TMB与H2O2的反应速率很低，只有加入类似催化剂的铜离子时，反应速率才得到很大提高，所以铜离子具有类似过氧化物酶的催化活性。从图2结果可以看出，随着铜离子浓度的增大，TMB与H2O2的反应速率也会随着增大，从而溶液的吸收和颜色变化越明显。
蛋白检测原理验证：
图3为铜离子的催化性质用于GPC3检测的原理示意图。利用抗体功能化的氧化铜纳米探针来识别目标蛋白，然后通过盐酸溶解氧化铜产生铜离子，通过铜离子的催化显色反应来间接检测目标蛋白。由于一个氧化铜纳米探针能够产生许多的铜离子，从而达到了信号放大的效果。
分别用CuO NPs-Ab与CuO NPs-BSA作为纳米生物探针来进行GPC3的检测(5ng/mL)，对方法的可行性进行考察，结果见图4。结果显示，目标蛋白是通过抗体进行识别，也只有目标蛋白存在时，检测信号才会显著增大。
特异性实验：
分别用BSA(牛血清白蛋白)、HSA(人血清白蛋白)、EA(卵白蛋白)与Hb(血红蛋白)代替GPC3进行检测，并测量对应的信号增强情况，结果见图5。结果显示，由于GPC3抗体对其对应的目标蛋白的特异性识别，该方法对GPC3的检测具有较好的特异性。
实施例2：磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)的检测
(1)溶液配制
蛋白包被稀释液：6.7mM的磷酸缓冲液(pH7.4)；
洗涤液：50mM的磷酸缓冲液(pH7.4)+135mM氯化钠+2.7mM氯化钾+0.05％(w/w)吐温-20；
封闭液：1％(w/w)BSA溶液；
显色液：0.2M的醋酸缓冲液(pH4.0)+1.33mM TMB+1.33M H2O2；
终止液：2M硫酸溶液。
(2)检测方法
包被：将50μg待测蛋白样品用200μL包被稀释液溶解稀释，分别取50μL加入96孔板中并置于37℃下2h，弃去孔中液体，用洗涤液洗3遍；
封闭：将200μL封闭液加至各反应孔并置于37℃2h，封闭结束后用洗涤液洗3遍；
孵育纳米生物探针：将制备好的抗体功能化的氧化铜纳米颗粒溶液稀释后每孔加50μL，置于37℃1h；弃去孔中液体，用洗涤液洗5遍；
氧化铜溶解：各反应孔加入50μL 50mM盐酸反应半小时，使氧化铜溶解成铜离子；
显色反应：各反应孔加入显色缓冲液150μL，37℃反应10min，然后加50μL终止液终止反应；
检测：测量各孔溶液在450nm波长处的吸收值或者测量其在350～600nm波长范围内的吸收光光谱；
标准曲线绘制：取梯度浓度的GPC3标准溶液，按照前述步骤进行检测，绘制标准曲线；
结果判定：根据待测蛋白样品的检测结果，对照标准曲线，获得待测蛋白样品的浓度数据。
检测不同浓度目标蛋白(GPC3)时，溶液在350～600nm波长范围内的吸收光谱图参见图6，溶液在450nm波长处的吸收变化情况以及标准曲线参见图7，结果显示可检出0.2pg/mL的GPC3。
结论：
基于生物酶检测方法的缺点：生物酶稳定性较差，容易受到pH和温度等环境条件的影响，从而引发酶的变性或失活。而且生物酶还具有制备麻烦、提纯和储存成本高等问题。
本发明方法优点：(1)基于铜离子的类似于过氧化物酶的催化性质，其催化活性不受底物浓度的影响，可通过提高H2O2的浓度来提高铜离子的催化效率，从而提高检测灵敏度。(2)利用抗体功能化的氧化铜纳米探针来识别目标蛋白，然后通过盐酸溶解氧化铜产生铜离子，通过铜离子的催化显色反应来间接检测目标蛋白。由于一个氧化铜纳米探针能够产生许多的铜离子，从而达到了信号放大的效果。与基于生物酶的检测方法相比，该检测方法更简单、经济、有效。

Claims (3)

1.一种检测磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的试剂盒，主要包括抗体功能化的氧化铜纳米探针和检测用试剂；
所述抗体功能化的氧化铜纳米探针由氧化铜纳米颗粒表面修饰GPC3抗体并用BSA封闭制得，氧化铜纳米颗粒与抗体的质量用量比为1：0.0015～0.03；
所述检测用试剂由包被液、洗涤液、封闭液、显色液和终止液组成，所述包被液为的pH7.4、6.7mM磷酸缓冲液；所述洗涤液组成如下：135mM氯化钠，2.7mM氯化钾，0.05％吐温-20，溶剂为pH7.4、50mM磷酸缓冲液；所述封闭液为1％BSA溶液；所述显色液组成如下：1.33mMTMB，1.33M过氧化氢，溶剂为0.2M、pH4.0的醋酸缓冲液；所述终止液为2M硫酸溶液。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述抗体功能化的氧化铜纳米探针由如下方法制备得到：纳米氧化铜颗粒加入浓度10mM、pH7.4的磷酸缓冲液中超声分散均匀，再缓慢加入浓度为150ug/mL的GPC3抗体，震荡反应2～4小时，氧化铜纳米颗粒与GPC3抗体的质量比为1:0.0015～0.03，加入BSA至其终浓度为1％，封闭1～2h，保存于4℃冰箱备用。
3.一种利用权利要求1所述试剂盒检测磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的方法，所述方法如下：
(1)包被：将待测蛋白样品用包被稀释液稀释，分别取50μL加入96孔板中，37℃静置2h，弃去孔中液体，用洗涤液洗3遍；
(2)封闭：将200μL封闭液加至各反应孔并置于37℃2h，封闭结束后用洗涤液洗3遍；
(3)孵育纳米生物探针：各反应孔加入50μL抗体功能化的氧化铜纳米颗粒稀释液，37℃静置1h后，弃去孔中液体，用洗涤液洗5遍；
(4)氧化铜溶解：各反应孔加入50μL50mM盐酸，37℃反应半小时；
(5)显色反应：各反应孔加入显色缓冲液150μL，37℃反应10min，然后加50μL终止液终止反应；
(6)检测：测量各孔溶液在450nm波长处的吸收值或者测量其在350～600nm波长范围内的吸收光光谱；
(7)标准曲线绘制：取梯度浓度的GPC3标准溶液，按照前述步骤(1)～(6)方法进行检测，绘制标准曲线；
(8)结果判定：根据待测蛋白样品的检测结果，对照标准曲线，获得待测蛋白样品的浓度数据。
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