CN109790561B - 利用基本上不含凝固蛋白原的鲎阿米巴样细胞溶解物检测内毒素的方法 - Google Patents

利用基本上不含凝固蛋白原的鲎阿米巴样细胞溶解物检测内毒素的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及使用显色测定法检测样品中内毒素的方法，该方法包括：(a)使样品与包含鲎阿米巴样细胞溶解物(LAL)和显色底物的试剂接触；(b)测量在样品中存在内毒素时由显色底物的变化引起的显色效应；其中LAL基本上不含凝固蛋白原。该方法还涉及包含基本上不含凝固蛋白原的LAL的组合物和试剂盒，以及制备它们的方法。

Description

利用基本上不含凝固蛋白原的鲎阿米巴样细胞溶解物检测内 毒素的方法
序列表
本申请包含序列表，该序列表已经以ASCII格式电子提交，并且其全部内容通过引用并入本文。在2017年9月5日创建的所述ASCII拷贝命名为0132-0023WO1_SL.TXT，大小为1,055字节。
发明领域
本发明涉及使用显色测定法检测样品中内毒素的方法，该方法包括：(a)使样品与包含鲎阿米巴样细胞溶解物(LAL)和显色底物的试剂接触；(b)测量在样品中存在内毒素时由显色底物的变化引起的显色效应，其中LAL基本上不含凝固蛋白原。该方法还涉及包含基本上不含凝固蛋白原的LAL的组合物和试剂盒，以及制备它们的方法。
背景技术
革兰氏阴性菌内毒素是一种生物热原，当其被引入静脉内时引起发热。内毒素，也称为脂多糖(LPS)，存在于革兰氏阴性菌的外膜中，例如沙门氏菌(Salmonella)，大肠杆菌(Escherichia coli)，志贺氏菌(Shigella)和奈瑟氏菌(Neisseira)。内毒素引发的毒性机制是由脂多糖的脂质部分引起的。例如，当生物体内的细菌发生溶解时，进入血流的脂质的反应可以一直到补体系统的激活。该脂质部分导致不同细胞因子的释放，例如白细胞介素1和8。肿瘤坏死因子的产生也可以被激活。产生的感染与炎症过程有关，并且可能对感染的生物体构成很大的危险。白细胞介素1是生物体作为免疫反应和对抗炎症而释放的一系列细胞因子。该信号导致嗜中性粒细胞向感染发生的地方迁移，产生趋化性。这有利于吞噬作用的发生；然而，在某些情况下，根据个体免疫系统的状态和感染程度，内毒素可能导致全身性脓毒血症，以及脓毒血症带来的风险。众所周知，在许多情况下，革兰氏阴性菌在高等哺乳动物中引起多器官衰竭甚至全身感染导致死亡。由于与内毒素相关的不利影响，制药行业和医疗保健界对内毒素的早期和敏感检测至关重要。
鲎阿米巴样细胞溶解物(LAL)试验在20世纪70年代作为检测内毒素的方法在商业上引入。LAL衍生自蝎鲎(horseshoe crab)，美洲鲎(Limulus polyphemus)的血细胞或阿米巴样细胞。最初的LAL测试构成了丝氨酸蛋白酶的级联，其由痕量水平的内毒素触发，在反应结束时达到凝胶凝块。因子C通常作为酶原存在，是该凝血级联的引物。在体内，因子C是完美的生物传感器，它提醒蝎鲎存在革兰氏阴性入侵者。止血终点诱捕入侵者，杀死它并限制进一步的感染。
可以改良LAL测试以使用不同的方法来测量阿米巴样细胞对内毒素的反应。这些方法包括所谓的凝胶-凝块法，比浊法和显色法。在国际药典中推荐这些LAL测试作为检测用于生产药物和最终产品的原料中的细菌毒素的方法。这些测试对于化妆品工业和食品生产也是有用的，因为它是FDA(食品和药品管理局)推荐的用于检测热原的方法。
发明概述
本文提供了使用显色测定法检测样品中的内毒素的方法，所述显色测定法包含基本上不含凝固蛋白原的鲎阿米巴样细胞溶解物(LAL)。
本文的实施方式涉及使用显色测定法检测样品中的内毒素的方法，该方法包括：(a)使样品与包含鲎阿米巴样细胞溶解物(LAL)和显色底物的试剂接触；(b)测量在样品中存在内毒素时由显色底物的变化引起的显色效应，其中LAL基本上不含凝固蛋白原。
在一些实施方式中，显色底物是共价键合至多于三个氨基酸的对＝硝基苯胺。在一些实施方式中，显色底物是Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA(SEQ ID NO:1)。在一些实施方式中，由于酶促反应导致显色底物的变化。在一些实施方式中，酶促反应是从多肽切割发色团。在一些实施方式中，通过检测380nm-420nm处的吸光度来测量显色效应。在一些实施方式中，通过检测405nm处的吸光度来测量显色效应。
在一些实施方式中，试剂是液体。在一些实施方式中，试剂是水性液体。在一些实施方式中，将试剂冻干，然后在与样品接触之前在水性液体中重建。
在一些实施方式中，将LAL冻干，然后在与样品接触之前重建。在一些实施方式中，将显色底物冻干，然后在与样品接触之前重建。
在一些实施方式中，所述样品是生物样品。在一些实施方式中，样品选自：胃肠外剂型，疫苗，抗生素，治疗性蛋白质，治疗性核酸，治疗性抗体和生物学产品。在一些实施方式中，通过SDS-PAGE测量并通过Western印迹确认，相对于LAL中的总蛋白质，基本上不含凝固蛋白原的LAL具有小于5重量％的凝固蛋白原。在一些实施方式中，相对于LAL中的总蛋白质，基本上不含凝固蛋白原的LAL具有小于2重量％的凝固蛋白原。在一些实施方式中，相对于LAL中的总蛋白质，基本上不含凝固蛋白原的LAL具有小于0.5重量％的凝固蛋白原。在一些实施方式中，使用单个比色皿光谱法，多个比色皿光谱法或酶标仪进行显色测定。
在一些实施方式中，该方法还包括将显色效应与标准品进行比较以确定样品中内毒素的量。
在一些实施方式中，本公开内容涉及使用显色测定法检测生物样品中的内毒素的方法，该方法包括：(a)使生物样品与包含鲎阿米巴样细胞溶解物(LAL)和Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA(SEQ ID NO:1)的水性试剂接触；(b)测量样品中内毒素存在下从Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA(SEQ ID NO:1)酶促切割pNA所引起的405nm处吸光度的变化；其中LAL基本上不含凝固蛋白原。
在一些实施方式中，本公开的方法具有增加的灵敏度。在一些实施方式中，该方法具有>0.001EU/mL内毒素的灵敏度。
在一些实施方式中，本公开内容的方法涉及包含鲎阿米巴样细胞溶解物(LAL)和显色底物的组合物，其中LAL基本上不含凝固蛋白原。在一些实施方式中，显色底物是Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA(SEQ ID NO:1)。在一些实施方式中，将LAL和显色底物冻干。在一些实施方式中，LAL和显色底物在水溶液中。
在一些实施方式中，本公开内容的方法涉及试剂盒，其包含：(a)鲎阿米巴样细胞溶解物(LAL)，其中LAL基本上不含凝固蛋白原；(b)显色底物；(c)使用LAL和显色底物检测内毒素的说明书。
在一些实施方式中，LAL是冻干的。在一些实施方式中，LAL在水溶液中。在一些实施方式中，LAL和显色底物在单个容器中。在一些实施方式中，试剂盒还包括含有LAL的无菌容器。在一些实施方式中，无菌容器是无菌小瓶。在一些实施方式中，试剂盒还包含对照标准品内毒素。
在一些实施方式中，本公开内容涉及制备基本上不含凝固蛋白原的鲎阿米巴样细胞溶解物(LAL)的方法，该方法包括：(a)提供包含LAL的组合物，其中LAL包含凝固蛋白原；(b)调整缓冲液；(c)使用20kDa至50kDa的过滤器对(b)的组合物进行切向流过滤，从而分离出基本上不含凝固蛋白原的LAL。
在一些实施方式中，TFF以350ml/分钟至500ml/分钟的流速进行。在一些实施方式中，缓冲液是Tris缓冲液或MES缓冲液。在一些实施方式中，缓冲液的pH为约7.0至8.0。在一些实施方式中，过滤器是切向流过滤(TFF)。在一些实施方式中，TFF过滤器是改性聚醚砜(mPES)膜过滤器。
附图说明
本技术的前述和其它特征和方面可基于如下实施方式的描述并如附图所示更好理解。附图纳入本文且形成说明书的一部分，其进一步用于说明本技术的原理。
图1：内毒素相关级联的示意图，包括浊度和显色分析点。
图2：包含常规LAL与基本上不含凝固蛋白原的LAL的样品的比较显示在多个起始(onset)毫光密度(mOD)值下的分离增加。EU/ml＝每毫升内毒素单位。
图3：比较标准LAL(L)和两性洗涤剂(Z)的浓度对反应速度的影响。增加L和Z的浓度可提高每种标准品的反应速度。随着反应速度的增加，空白和最低标准品(0.005EU/ml)之间的分离消失。
图4：比较基本上不含凝固蛋白原的LAL(L-co)和两性洗涤剂(Z)的浓度对反应速度的影响。增加L-co和Z的浓度会增加每种标准品的反应速度。对于所有制剂保持至少200秒的分离。用增加的两性洗涤剂配制的L-co实现了具有可接受的分离(数据未显示)的0.001EU/ml的灵敏度。
图5：在(A)200mOD和(B)50mOD下各种浓度的L-co和显色底物的反应时间。图5C总结了相对于使用L的测定，使用L-co的测定有增加的灵敏度、反应时间和分离。
图6：(A)三个单独批次的L-co的反应时间，使用70％L-co制剂和30％显色底物，50mOD(分离范围：732秒至211秒)。
图7：(A)经过切向流过滤(TFF)(30kDa)的LAL样品的SDS-PAGE凝胶分析，并且TFF产物在还原条件下进行三次运行。第三次运行后，未观察到凝胶凝块。凝胶凝块数据表示为“+”固体凝胶凝块，“-”无凝胶凝块，“-/+”软凝胶凝块。(B)切向流过滤(30kDa)产物的Western印迹分析在还原条件下进行三次运行。抗体稀释度如下：α-凝固蛋白原1:1,000，α-凝固酶原1:10,000，α-寿司(sushi)3 1:100。
图8：(A)使用α-凝固蛋白原的Western印迹分析对凝固蛋白原进行定量。(B)将图8(A)的数据绘制成标准曲线。数据表明约33％的总LAL蛋白是凝固蛋白原。
图9：凝固蛋白原的SDS-PAGE。当在还原条件下运行33次时，存在三个凝固蛋白原条带。蛋白质测序证实三个条带是凝固蛋白原片段。A＝凝固蛋白原1：pos 21 GDPNVPTCLC(SEQ ID NO:2)；B＝凝固蛋白原2：pos 39 KVIVSQEKTD(SEQ ID NO:3)；C＝凝固蛋白原3：pos 67 GFSIFGGHPA(SEQ ID NO:4)。
图10：在50mOD下在十周内测定两个单独批次的L-co的稳定性。数据表明L-co在10周内稳定。
图11：使用蛋白质染色的SDS-PAGE和蛋白质印迹分析，测试来自隆萨(Lonza)，国际查尔斯河实验室(Charles River Laboratories International)和开普科协会有限公司(Cape Cod，Inc.(ACC))的市售LAL中凝固蛋白原的存在。这证实来自所有三个供应商的LAL含有凝固蛋白原。
发明详述
应当理解，这里示出和描述的特定实现是示例，并且不旨在以任何方式限制本申请的范围。
本文提及的公开的专利，专利申请，网站，公司名称和科学文献在此通过引用整体并入，其程度如同每个具体和单独地指出通过引用并入。本文引用的任何参考文献与本说明书的具体教导之间的任何冲突都应以有利于后者的方式解决。同样，本领域理解的单词或短语的定义与本说明书中具体教导的单词或短语的定义之间的任何冲突都应以有利于后者的方式解决。
如在本说明书中所使用的，单数形式“一”，“一个”和“该”具体地还包括它们所指的术语的复数形式，除非内容另有明确说明。本文所用术语“约”表示近似于，在某范围内，大致，或在周围。当术语“约”与数值范围联用时，其通过延伸所示数值的上下边界来修改该数值范围。通常，本文所用术语“约”通过20％的变化对所列数值进行向上或向下修改。
除非另外定义，否则本文使用的技术和科学术语具有本申请所属领域的技术人员通常理解的含义。这里参考本领域技术人员已知的各种方法和材料。本文引用的任何文献的公开内容均以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方式中，本发明涉及检测内毒素的方法。术语“内毒素”通常是指与革兰氏阴性菌的外膜相关的脂多糖复合物。术语“内毒素”偶尔用于指任何细胞相关的细菌毒素。内毒素是指与细胞相关的脂多糖，而外毒素是指由细菌分泌的毒素，并且在性质上主要是多肽。
内毒素的生物活性与脂多糖(LPS)有关。脂多糖是革兰氏阴性菌细胞壁外膜的一部分。无论生物体是否是致病性的，脂多糖总是与革兰氏阴性菌相关。毒性与脂质组分(脂质A)相关，并且免疫原性与多糖组分相关。革兰氏阴性菌的细胞壁抗原(O抗原)是LPS的多糖成分。此外，LPS可以在动物中引发多种炎症反应。
动物体内的革兰氏阴性菌在生长过程中会释放出微量的内毒素。这可能导致天然免疫力的刺激。已知在实验室中生长的年轻培养物可以以可溶形式释放少量内毒素。但在大多数情况下，内毒素仍然与细胞壁缔合，直到生物体解体。细菌生物体的解体可以由自溶，补体和溶菌酶介导的外部裂解以及细菌细胞的吞噬消化产生。细菌内毒素在人体肠道中很丰富。内毒素浓度升高与许多病症有关，包括一些代谢综合征疾病。代谢综合征疾病包括例如动脉粥样硬化，胰岛素抵抗，糖尿病和肥胖症。内毒素水平升高也与脂肪肝和克罗恩病有关。当以高水平存在时，内毒素也可能从胃肠道泄漏。内毒素是一种潜在的炎症抗原，内毒素的泄漏可导致全身性炎症反应。
与经典的细菌外毒素相比，内毒素的作用效率较低并且特异性较低，因为它们不会发挥酶促作用。内毒素是热稳定的(煮沸30分钟不会使内毒素不稳定)，但据报道某些强氧化剂如超氧化物，过氧化物和次氯酸盐可以中和它们。由于这些是强氧化剂，因此它们不是特别适合用于治疗组合物来中和内毒素。
本发明的内毒素可以源自革兰氏阴性菌。示例性革兰氏阴性菌包括但不限于：大肠杆菌属(Escherichia spp.)，志贺氏菌属(Shigella spp.)，沙门氏菌属(Salmonellaspp.)，弯曲杆菌属(Campylobacter spp.)，奈瑟氏球菌属(Neisseria spp.)，嗜血杆菌属(Haemophilus spp.)，嗜水气单胞菌属(Aeromonas spp.)，弗朗西斯菌属(Francisellaspp.)，耶尔森氏菌属(Yersinia spp.)，克雷伯氏菌属(Klebsiella spp.)，博德特氏菌属(Bordetella spp.)，军团菌属(Legionella spp.)，棒状杆菌属(Corynebacteria spp.)，柠檬酸杆菌属(Citrobacter spp.)，衣原体属(Chlamydia spp.)，布鲁氏菌属(Brucellaspp.)，假单胞菌属(Pseudomonas spp.)，螺杆菌属(Helicobacter spp.)和弧菌属(Vibriospp.)。革兰氏阴性菌也可以是肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，假单胞菌科(Pseudomonadaceae)，奈瑟菌科(Neisseriaceae)，韦荣氏球菌科(Veillonellaceae)，拟杆菌科(Bacteroidaceae)，弧菌科(Vibrionaceae)，巴斯德菌科(Pasteurellaceae)和梭杆菌科(Fusobacteriaceae)的那些。在一些实施方式中，内毒素来自沙门氏菌或大肠杆菌属。
如本文所用，术语“内毒素活性”是指可引起毒性(包括致热原性和败血症性休克)的革兰氏阴性菌的部分。已发现归因于内毒素的毒性作用与存在于革兰氏阴性菌外膜中或源自革兰氏阴性菌外膜的脂多糖分子的糖基化脂质A部分有关。
术语“脂多糖”(LPS)是指由脂质和通过共价键连接的多糖(糖磷脂)组成的大分子。LPS由三部分组成：1)O抗原；2)核心寡糖，和3)脂质A。O抗原是与核心寡糖连接的重复聚糖聚合物，并且包含LPS分子的最外部结构域。核心寡糖直接连接脂质A并且通常含有糖，例如庚糖和3-脱氧-D-甘露辛糖酸(也称为KDO，酮-脱氧辛糖酸)。脂质A是与多种脂肪酸连接的磷酸化葡糖胺二糖。脂肪酸将LPS锚定在细菌膜中，其余的LPS从细胞表面突出。如果LPS发生突变或移除，可能会导致细菌死亡。
内毒素活性存在于LPS的脂质A结构域部分中。当细菌细胞被免疫系统裂解时，含有脂质A的膜片段释放到循环中，引起发热(致热原性)，腹泻和潜在的致命性休克(称为内毒素或脓毒血症性休克)。LPS的毒性通过与哺乳动物免疫系统的B细胞和巨噬细胞的相互作用由脂质A表达，该过程导致促炎细胞因子(主要是肿瘤坏死因子(TNF))的分泌，其可能对宿主产生致命的后果。脂质A还可“体外”激活人T淋巴细胞(Th-1)以及“体内”激活小鼠CD4+和CD8+T细胞，这一特性允许宿主的免疫系统对LPS的可变大小碳水化合物链产生特异性的回忆IgG抗体应答。在这些基础上，LPS最近被认为是“体内”的T细胞依赖性抗原。因此，在一些实施方式中，本发明的方法涉及检测脂质A。
在一些实施方式中，使用显色测定法检测内毒素。如本文所用，显色测定法测量或检测在内毒素存在下显色底物(即色原体)中吸光度的变化。在一些实施方式中，显色底物中吸光度的变化是由酶活性引起的。在一些实施方式中，术语“显色底物”是指酶活性之前和之后的底物。例如，如果显色底物是被酶切割产生肽和发色团的肽-发色团，则术语“显色底物”是指肽-发色团，裂解的肽和释放的发色团。在一些实施方式中，可以使用合成的色原体。在一些实施方式中，可以使用天然产生的色原体。在一些实施方式中，显色底物是合成肽。在一些实施方式中，底物非常敏感，即它们可以检测非常低的酶活性。
包含显色底物的试剂检测低酶浓度的能力使得它们可用于例如在研究或质量控制程序中寻找与内毒素相关的某些酶活性的存在。有时，在对某种酶制剂的反应中，天然(即酶的天然底物)和合成的显色底物之间缺乏对应性。在一些实施方式中，显色底物的选择性较低，即与天然底物相比，其对相关酶的反应性较低。
术语“显色底物”是指在内毒素存在下改变其吸收光谱(例如颜色变化)的测定中的底物，例如化合物或多肽。显色底物是指在特定波长下(i)吸收和/或(ii)不吸收的底物。因此，例如，根据本公开，显色底物可能在特定波长下最初不吸收(例如，在可见光波长下不吸收)，然后在内毒素存在下，开始在指定波长下吸收(例如，在可见光波长处)。或者，例如，显色底物在特定波长下最初吸收(例如，在可见光波长下吸收)，然后在内毒素存在下，在指定波长下不吸收(例如，在可见光波长下不吸收)。在一些实施方式中，显色底物可以在不存在内毒素的情况下在给定波长下吸收，然后在内毒素存在下以不同波长吸收。在一个或多个特定波长下吸光度特征的变化，即显色效应，可以与内毒素的存在相关联。
在一些实施方式中，显色底物是显色肽底物。在一些实施方式中，显色肽底物最初是无色的。在一些实施方式中，显色肽底物最初具有颜色，例如可见光谱中的颜色(约390-700nm)。在一些实施方式中，当显色肽底物被酶切割时，可发生颜色变化，例如发色团释放，导致所得产物的颜色变化。在一些实施方式中，裂解改变了产物的光学性质，其与未裂解的底物的光学性质不同并且可以通过分光光度法测量。可以与肽底物偶联的显色基团的非限制性实例是：对-硝基苯胺(pNA)，5-氨基-2-硝基苯甲酸(ANBA)，7-氨基-4-甲氧基香豆素(ANC)，醌酰胺(QUA)，5-氨基间苯二甲酸二甲酯(DPA)及其衍生物。荧光底物包括但不限于Z-Gly-Pro-Arg-AMC[Z＝苄氧基羰基；AMC＝7-氨基-4-甲基香豆素]，高香草酸，4-羟基-3-甲氧基苯乙酸，还原吩噁嗪，还原苯并噻嗪，试卤灵β-D-吡喃半乳糖苷，荧光素二半乳糖苷(FDG)，荧光素二葡糖苷酸及其结构变体(美国专利5,208,148；5,242,805；5,362,628；5,576,424和5,773,236，通过引用并入)，4-甲基伞形基β-D-吡喃半乳糖苷，羧基伞形基β-D-吡喃半乳糖苷和氟化香豆素β-D-吡喃半乳糖苷(美国专利5,830,912，通过引用并入)。
非限制性显色测定是基于因子C/因子B级联的酶活性测定。因子C是级联中的第一个组分，是由内毒素结合激活的蛋白酶酶原。在一些实施方式中，显色测定法使用重组形式的因子C(rFC)。在该途径中，因子B被因子C激活。因子B将凝固酶原激活成凝固酶。在一些实施方式中，凝固酶原影响显色底物中的显色变化。在一些实施方式中，显色测定法是LAL测定法，例如来自隆萨(Lonza)的终点显色LAL测定法。
在一些实施方式中，显色测定法是LAL测定法，其中LAL内毒素反应的初始部分激活凝固酶原，后者又酶促裂解来自合成底物的对-硝基苯胺(pNA)，产生黄色。
酶原+内毒素→酶
底物+H2O+酶→肽+pNA(黄色)
在一些实施方式中，革兰氏阴性菌内毒素可间接催化LAL中酶原的活化。初始激活速率可以通过存在的内毒素浓度来确定。
在一些实施方式中，由于酶促反应而导致显色底物的变化。在一些实施方式中，酶促反应导致肽键断裂，从而从多肽切割发色团取代基(例如，p-NA)。例如，活化的酶可以催化从无色肽底物(例如Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA(SEQ ID NO:1))释放pNA。在一些实施方式中，肽底物是共价键合至多于三个氨基酸的对硝基苯胺。在一些实施方式中，显色底物是Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA(SEQ ID NO:1)。在一些实施方式中，显色测定法测量游离pNA。在一些实施方式中，显色测定法在380nm至410nm，例如400nm至410nm，或405nm的吸光度下光学测量游离pNA。测量吸光度的方法是本领域技术人员所熟知的。在一些实施方式中，使用单个比色皿光谱法，多个比色皿光谱法或酶标仪进行显色测定以测量吸光度。
在用终止试剂终止反应后，可以在380nm至410nm，例如405nm下光学测量游离pNA。从含有已知量的内毒素标准品的溶液的吸光度值的标准曲线计算样品中内毒素的浓度。
用于检测内毒素的一种标准显色测定法包括使样品与试剂接触，其中所述试剂包含鲎阿米巴样细胞溶解物(LAL)。在一些实施方式中，试剂是液体，例如水性液体。或者，可以将试剂冻干，然后在与样品接触之前在水性液体例如无菌水或缓冲溶液中重建。在一些实施方式中，试剂是液体。在一些实施方式中，试剂是水性液体。在一些实施方式中，将试剂冻干，然后在与样品接触之前在水性液体中重建。在一些实施方式中，将LAL冻干，然后在与样品接触之前在水性液体中重建。在一些实施方式中，将显色底物冻干，然后在与样品接触之前在水性液体中重建。在一些实施方式中，冻干允许在显色测定中更长和/或更稳健地储存试剂，LAL和/或显色底物。例如，在一些实施方式中，相对于显色测定中的非冻干试剂、LAL和/或显色底物，冻干试剂、LAL和/或显色底物允许大于20％，大于30％，大于40％，大于50％，大于60％，大于70％，大于80％，大于90％或大于100％稳定时间增加。本文中使用的“稳定性”是指用于其预期目的的测定，即用于以相同速度和灵敏度检测内毒素。例如，如果非冻干试剂稳定3周，则稳定6周的冻干试剂的稳定时间将具有“100％增加”。
本公开提供了用于检测样品中的内毒素的改进方法。术语“样品”可包括任何物质，化合物，工具或仪器。然而，出于实际目的，样品可包括与生物有机体接触的物质，化合物，工具或仪器，所述生物有机体包括例如哺乳动物，人，驯养动物或动物园动物。术语“样品”可以指任何医疗装置，药物和生物技术产品，其中内毒素来源(从原材料接收到制造过程结束)可能使样品不适合与脑脊髓液或心血管系统接触。在一些实施方式中，术语样品是指在体内与脑脊液或心血管系统接触的医疗装置，例如与人接触。在一些实施方式中，术语样品是指生物样品。在一些实施方式中，样品选自：胃肠外剂型，疫苗，抗生素，治疗性蛋白质，治疗性核酸，治疗性抗体和生物学产品。
术语“鲎阿米巴样细胞溶解物”(LAL)是指来自蝎鲎(horseshoe crab)，美洲鲎(Limulus polyphemus)的血细胞(阿米巴样细胞)的水性提取物。来自蝎鲎(horseshoecrab)的血细胞的水性提取物包含凝固蛋白原，凝固蛋白原是血淋巴的凝胶形成蛋白，其通过固定它们来阻碍侵入物的扩散。例如参见Iwanaga S等,J.Biochem.98:305–318(1985)和Iwanaga S等,J.Biochem.95(6):1793–1801(1984)。
蝎鲎的凝血级联系统涉及止血和宿主防御。该级联导致凝固蛋白原(一种可溶性蛋白质)转化为不溶性凝固素凝胶。凝固酶从凝固蛋白原中切除片段肽C，引起单体的聚集。
术语“凝固蛋白原”是指Iwanaga(1984)和Iwanaga(1985)中发现的多肽链，其是单个175残基的多肽链，其在Arg-18和Arg-46后被包含在血细胞中并且由细菌内毒素(脂多糖)激活的凝固酶切割。切割释放凝固素的两条链A和B，其通过两个二硫键与肽C连接。凝胶形成由凝固素分子的互连产生。二级结构预测表明C肽形成α-螺旋，其在凝固蛋白原向凝固素凝胶的蛋白水解转化过程中释放。β-折叠结构和分子中发现的16个半胱氨酸似乎产生对酸和热稳定的紧密蛋白质。
虽然凝固蛋白原对于凝胶形成(例如，凝固测定)是重要的，但本公开发现它在显色测定中不是必需的。本公开发现，相对于包含具有天然存在量的凝固蛋白原的LAL的显色测定，包含基本上不含凝固蛋白原的LAL的显色测定实现了增加的速度，灵敏度和分离水平。因此，在一些实施方式中，本发明涉及包含基本上不含凝固蛋白原的LAL的显色测定。
在一些实施方式中，LAL基本上不含凝固蛋白原。在阅读本公开后，本领域技术人员将理解，不同量的凝固蛋白原的减少将导致显色测定(例如LAL测定)中的速度，灵敏度和/或分离水平的增加。在一些实施方式中，术语“基本上不含”是指通过蛋白质染色的SDS-PAGE测量并通过Western印迹确认，相对于LAL中的总蛋白质，LAL具有小于50重量％，小于40重量％，小于30重量％，小于20重量％，小于10重量％，小于5重量％，小于2重量％，小于1重量％或小于0.5重量％的凝固蛋白原。在一些实施方式中，术语“基本上不含”是指通过SDS-PAGE测量并通过Western印迹确认，相对于LAL中的总蛋白质，LAL具有小于10重量％或小于5重量％的凝固蛋白原。
在一些实施方式中，术语基本上不含凝固蛋白原的LAL是指相对于未除去凝固蛋白原的LAL中凝固蛋白原的量，除去LAL中至少60重量％，至少70重量％，至少80重量％，至少90重量％，至少95重量％，至少97重量％，至少98重量％，至少99重量％或至少99.5重量％的凝固蛋白原。
在一些实施方式中，显色测定法确定样品中内毒素的存在或不存在。在其他实施方式中，显色测定可以量化样品中内毒素的量。在一些实施方式中，该方法还包括将样品中内毒素的显色效应与已知的内毒素标准品进行比较，以确定样品中内毒素的量。
在一些实施方式中，本公开内容涉及使用显色测定法检测生物样品中的内毒素的方法，该方法包括：(a)使生物样品与包含鲎阿米巴样细胞溶解物(LAL)和Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA(SEQ ID NO:1)的水性试剂接触；(b)测量样品中内毒素存在下从Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA(SEQ ID NO:1)酶促切割pNA所引起的405nm处吸光度的变化；其中LAL基本上不含凝固蛋白原。
通过从LAL中除去凝固蛋白原，显色测定可以具有增加的灵敏度。在一些实施方式中，本公开的方法具有增加的灵敏度。在一些实施方式中，该方法的灵敏度小于0.05EU/mL，小于0.03EU/mL，小于0.01EU/mL，小于0.008EU/mL，小于0.006EU/mL，小于0.005EU/mL，小于0.004EU/mL，小于0.003EU/mL，小于0.002EU/mL，或小于0.001EU/mL。
本发明还涉及包含(1)基本上不含凝固蛋白原的LAL和(2)显色底物的组合物。在一些实施方式中，组合物中的显色底物包含pNA。在一些实施方式中，组合物中的显色底物是Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA(SEQ ID NO:1)。在一些实施方式中，组合物包含60重量％至80重量％的基本上不含凝固蛋白原制剂的LAL，和20重量％至40重量％的显色底物。在一些实施方式中，组合物包含约6重量％至约25重量％的基本上不含凝固蛋白原的LAL。在一些实施方式中，组合物包含70重量％的基本上不含凝固蛋白原制剂的LAL和30重量％的显色底物。在一些实施方式中，组合物包含70重量％的基本上不含凝固蛋白原制剂的LAL和30重量％的Ac-lle-Glu-Ala-Arg-pNA(SEQ ID NO:1)。在一些实施方式中，如本文所述的组合物在单个容器，例如单个小瓶中。在一些实施方式中，将本文所述的组合物冻干。例如，本公开内容具体描述了一种冻干组合物，其包含70重量％的基本上不含凝固蛋白原制剂的LAL和30重量％的Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA(SEQ ID NO:1)。
在一些实施方式中，本发明涉及显色测定试剂盒。试剂盒可包括通常与LAL显色测定相关的一种或多种组分，包括含有LAL和显色底物的试剂。在一些实施方式中，本公开内容的方法涉及试剂盒，其包含：(a)鲎阿米巴样细胞溶解物(LAL)，其中LAL基本上不含凝固蛋白原；(b)显色底物；(c)使用LAL和显色底物检测内毒素的说明书。在一些实施方式中，试剂盒包含各种试剂，每种试剂具有其中去除了不同量的凝固蛋白原的LAL。
该试剂盒可包含一个或多个容器。在一些实施方式中，LAL和显色底物在单个容器中。在一些实施方式中，LAL和显色色底物在两个不同的容器中。在一些实施方式中，试剂盒包括含有LAL的无菌容器。在一些实施方式中，试剂盒包含重建缓冲液，其可以重建LAL和/或显色底物用于测定。在一些实施方式中，无菌容器是无菌小瓶。在一些实施方式中，试剂盒还包含对照标准品内毒素，其可用作阳性内毒素对照，或可用于在标准品中定量内毒素的量。在一些实施方式中，试剂盒包含一种或多种浓度的一种以上对照标准品内毒素。
本领域技术人员可以理解，可以使用不同的方法从LAL中除去凝固蛋白原。这些方法中的每一种可以在效率，纯化速率，成本和努力方面不同，但是在本领域技术人员的知识范围内。本公开内容包括使用切向流过滤使LAL基本上不含凝固蛋白原的改进方法。切向流过滤(TFF)是指交叉流过滤，其中大部分进料流切向地穿过过滤器的表面，而不是进入过滤器。本公开发现，通过使用TFF，在过滤过程中基本上洗掉包含大部分LAL蛋白(其可污染过滤器)的渗余物，并将凝固蛋白原过滤到渗透物中。在一些实施方式中，TFF是连续过程，不同于分批死端过滤。
在一些实施方式中，本公开内容涉及使LAL基本上不含凝固蛋白原的方法，然后包括使LAL经历TFF的方法。在一些实施方式中，在TFF之前将LAL置于缓冲液中。在一些实施方式中，缓冲液是Tris缓冲液或MES缓冲液。在一些实施方式中，缓冲液的pH为约6.0至约9.0，或约7.0至约8.0。
在TFF中可以使用各种膜。在一些实施方式中，膜是10至80kDa过滤器，或20至50kDa过滤器。因此，在一些实施方式中，本公开内容涉及制备基本上不含凝固蛋白原的鲎阿米巴样细胞溶解物(LAL)的方法，该方法包括：(a)提供包含LAL的组合物，其中LAL包含凝固蛋白原；(b)调整缓冲液；(c)使用20kDa至50kDa过滤器对(b)的组合物进行切向流过滤并收集渗余物，从而分离出基本上不含凝固蛋白原的LAL。
在本文公开的方法中使用的膜可包括但不限于改性聚醚砜(mPES)，聚砜(PS)和聚醚砜(PES)。在一些实施方式中，使用改性聚醚砜(mPES)膜过滤器，采用TFF进行使LAL基本上不含凝固蛋白原的方法。可以调节LAL穿过膜的流速以优化从LAL中去除凝固蛋白原。在一些实施方式中，TFF以200ml/分钟至800ml/分钟，300ml/分钟至600ml/分钟，或350ml/分钟至500ml/分钟的流速进行。
实施例
实施例1
采用切向流过滤纯化LAL
从蝎鲎(horseshoe crab)的血细胞(阿米巴样细胞)中提取的鲎阿米巴样细胞溶解物(LAL)获自隆萨(瑞士巴塞尔)。对LAL进行中空纤维改性的聚醚砜(mPES)膜过滤器(SpectrumLabs)用于切向流过滤(TFF)以除去凝固蛋白原。使用30kDa MWCO mPES过滤器，科尔帕默(Cole Parmer)Masterflex泵管和适当的泵和背压阀设置TFF系统。用LAL试剂水(LRW)冲洗系统，然后在室温下使用1N NaOH去除热原1小时。在去除热原后使用LRW冲洗系统，然后使用TFF缓冲液平衡系统。
用TFF缓冲液(50mM Tris和77mM NaCl，室温下pH 7.4-7.5)以1:10至1：8的比例稀释LAL，然后以430ml/分钟的流速加入过滤器中，同时保持5-8psi的跨膜压(TMP)直至渗透物中收集总体积的90％。然后用TFF缓冲液以1:10至1：8的比例进一步稀释渗余物，然后加入过滤器中。重复渗余物稀释并处理LAL直至渗余物的体积与LAL的初始体积相同。在渗透物中收集凝固蛋白原，而其余的蛋白则保留在渗余物中。渗透物和渗余物的SDS-PAGE和蛋白质印迹分析显示渗余物中凝固蛋白原显著减少。
在TFF优化过程中，还使用包含50mM MES和77mM NaCl(pH 6.2)的缓冲液。然而，用Tris缓冲液观察到从LAL中除去的总蛋白质的百分比最高。
在用于TFF之前，使用来自隆萨的标准KQCL试剂盒测试所有缓冲液的内毒素。
实施例2
凝固蛋白原的定量
通过对LAL渗余物进行SDS-PAGE/蛋白质凝胶染色并将原始LAL中20kD凝固蛋白原条带的带密度与TFF渗余物中凝固蛋白原条带(如果有的话)进行比较，对LAL中剩余的凝固蛋白原进行半定量评估。参见例如图7A。
另外，使用α-凝固蛋白原抗体进行Western印迹，然后比较20kD凝固蛋白原条带的带密度。参见例如图7B。
通过在还原条件下在SDS-PAGE凝胶上运行LAL渗透物(含有凝固蛋白原)，然后对三个条带进行测序来确认凝固蛋白原的身份。参见图9。通过蛋白质测序确认三条带中的每一条为凝固蛋白原片段。
两种定量方法均证实本发明从LAL中除去了相当大百分比的凝固蛋白原。
使用Western印迹分析测定LAL中凝固蛋白原的量。图8A。Western印迹分析的结果符合标准曲线。图8B。结果表明，LAL中约662ng/2000ng，或约33％的总蛋白质是凝固蛋白原。
实施例3
基本上不含凝固蛋白原的LAL的稳定性
研究了基本上不含凝固蛋白原的LAL的稳定性。将基本上不含凝固蛋白原的LAL样品储存1、2、3、4、5、6、7、8、9和10周。在指定时间段结束时，将基本上不含凝固蛋白原的LAL样品与LAL显色试剂在96孔板中混合，并置于培养板读数器中，该读数器测量405nm处的吸光度。随着时间的推移自动监测反应的黄色。
在存在内毒素的情况下，溶解物将切割显色底物，导致溶液变黄。改变所需的时间与存在的内毒素的量成反比。在图10中发现每个样品达到50mOD所需的时间。数据表明基本上不含凝固蛋白原的LAL在至少10周内是稳定的。
实施例4
凝固蛋白原的去除改善了分离
研究了从LAL中去除凝固蛋白原对多个起始mOD分离的影响。常规LAL与基本上不含凝固蛋白原的LAL的比较显示，当使用基本上不含凝固蛋白原的LAL时，每个起始mOD时分离增加。通过使用基本上不含凝固蛋白原的LAL来增加分离，可以在较低起始mOD设置下在较短时间内实现测定的目标灵敏度。当使用基本上不含凝固蛋白原的LAL制备制剂时，在26分钟内可以实现0.005EU/ml的目标灵敏度，分离368秒。当使用常规LAL时，在32分钟内达到0.005EU/ml的灵敏度，但在50mOD时仅有67秒的分离。
数据表明从LAL中去除凝固蛋白原可以改善分离。
实施例5
LAL制剂和基本上不含凝固蛋白原的LAL制剂的显色检测
在LAL制剂中以20％，30％，40％和50％浓度测试LAL样品和基本上不含凝固蛋白原的LAL样品，标准品为0.005EU/ml，0.05EU/ml，0.5EU/ml，5EU/ml和50EU/ml。另外，还测试了各种浓度的两性洗涤剂。图3和图4。数据表明，增加基本上不含凝固蛋白原和两性洗涤剂的LAL浓度增加了LAL和基本上不含凝固素原的LAL制剂对每种标准品的反应速度。然而，随着反应速度根据LAL制剂的增加而增加，空白和最低标准品(0.005EU/ml)之间的分离消失，而对于所有基本上不含凝固蛋白原的LAL制剂，保持至少200秒的分离。用增加的两性洗涤剂配制的基本上不含凝固蛋白原的LAL在可接受的分离下达到0.001EU/ml的灵敏度。(数据未显示)。
实施例6
基本上不含凝固蛋白原的LAL与显色底物的比例
在200mOD和50mOD下研究了基本上不含凝固蛋白原的LAL与显色底物的最佳比例。图5A和图5B。数据表明，70％LAL制剂和30％显色底物的比例导致最快的反应时间。当观察三种不同批次的基本上不含凝固素原的LAL时，证实了这一观察结果。图6A。
对于相关领域的普通技术人员来说显而易见的是，在不脱离任何实施例的范围的情况下，可以对这里描述的方法和应用进行其他合适的修改和调整。以下实施例仅用于说明目的而不是限制性的。
应当理解，虽然本文已说明和描述了某些实施例，但权利要求不限于所描述和示出的部件的特定形式或布置。在说明书中，已经公开了说明性实施例，并且虽然采用了特定术语，但它们仅用于一般性和描述性意义，而不是用于限制的目的。根据上述教导，实施方式的修改和变化是可能的。因此，应该理解，实施方式可以不同于具体描述的方式实施。
虽然上面描述了各种实施方式，但应理解它们只是本技术的说明和例子，不是为了限制。对本领域技术人员显而易见的是，可以在不偏离本技术的精神和范围的情况下对本发明的形式和细节作出各种修改和变化。因此，本技术的宽度和范围不应受限于任何上述实施方式，而应仅根据所附权利要求书及其等同项来定义。还将理解本文所述和所引用的各参考文献的各实施方式的各特征可与任何其它实施方式的特征组合使用。本文引用的所有专利和公开均通过引用全文纳入本文。

Claims (36)

1.一种使用显色测定法检测样品中的内毒素的方法，所述方法包括：
a.使样品与包含鲎阿米巴样细胞溶解物和显色底物的试剂接触；
b.测量在样品中存在内毒素时由显色底物的变化引起的显色效应；
其中，所述鲎阿米巴样细胞溶解物基本上不含凝固蛋白原，所述基本上不含凝固蛋白原包括通过蛋白质染色的SDS-PAGE测量，相对于鲎阿米巴样细胞溶解物中的总蛋白质，凝固蛋白原少于0.5重量％。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述底物是共价键合至多于三个氨基酸的对硝基苯胺。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述显色底物是Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA。
4.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述显色底物的变化由于酶促反应而发生。
5.如权利要求4所述的方法，其中，所述酶促反应是从多肽切割发色团。
6.如权利要求1或2所述的方法，其中，通过测量380nm-420nm处的吸光度来完成测量显色效应。
7.如权利要求1或2所述的方法，其中，通过测量405nm处的吸光度来完成测量显色效应。
8.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述试剂是液体。
9.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述试剂是水性液体。
10.如权利要求1或2所述的方法，其中，将所述试剂冻干，然后在与所述样品接触之前在水性液体中重建。
11.如权利要求1或2所述的方法，其中，将鲎阿米巴样细胞溶解物冻干，然后在与所述样品接触之前重建。
12.如权利要求1或2所述的方法，其中，将显色底物冻干，然后在与所述样品接触之前重建。
13.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述样品是生物样品。
14.如权利要求13所述的方法，其中，所述生物样品选自：疫苗，抗生素，治疗性蛋白质，治疗性核酸和治疗性抗体。
15.如权利要求1或2所述的方法，其中，使用单个比色皿光谱法，多个比色皿光谱法或酶标仪进行显色测定。
16.如权利要求1或2所述的方法，所述方法进一步包括：将所述显色效应与标准品进行比较以确定所述样品中的内毒素的量。
17.一种使用显色测定法检测生物样品中的内毒素的方法，所述方法包括：
a.使生物样品与包含鲎阿米巴样细胞溶解物和Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA的水性试剂接触；
b.测量样品中内毒素存在下，从Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA酶促切割pNA引起的405nm处吸光度的变化；
其中，所述鲎阿米巴样细胞溶解物基本上不含凝固蛋白原，所述基本上不含凝固蛋白原包括通过蛋白质染色的SDS-PAGE测量，相对于鲎阿米巴样细胞溶解物中的总蛋白质，凝固蛋白原少于0.5重量％。
18.如权利要求17所述的方法，其中，所述方法具有小于或等于0.001EU/mL内毒素的灵敏度。
19.一种组合物，其包含鲎阿米巴样细胞溶解物和显色底物，其中所述鲎阿米巴样细胞溶解物的一部分凝固蛋白原已通过过滤去除，其中，所述鲎阿米巴样细胞溶解物基本上不含凝固蛋白原，所述基本上不含凝固蛋白原包括通过蛋白质染色的SDS-PAGE测量，相对于鲎阿米巴样细胞溶解物中的总蛋白质，凝固蛋白原少于0.5重量％。
20.如权利要求19所述的组合物，其中，所述显色底物是Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA。
21.如权利要求19或20所述的组合物，其中，所述鲎阿米巴样细胞溶解物和显色底物是冻干的。
22.如权利要求19或20所述的组合物，其中，所述鲎阿米巴样细胞溶解物和显色底物在水性溶液中。
23.如权利要求19或20所述的组合物，其中，所述组合物包含70％鲎阿米巴样细胞溶解物和30％显色底物。
24.一种试剂盒，其包括：
a.鲎阿米巴样细胞溶解物，其中所述鲎阿米巴样细胞溶解物基本上不含凝固蛋白原，所述基本上不含凝固蛋白原包括通过蛋白质染色的SDS-PAGE测量，相对于鲎阿米巴样细胞溶解物中的总蛋白质，凝固蛋白原少于0.5重量％；
b.显色底物；和
c.使用鲎阿米巴样细胞溶解物和显色底物检测内毒素的说明书。
25.如权利要求24所述的试剂盒，其中，所述鲎阿米巴样细胞溶解物是冻干的。
26.如权利要求24或25所述的试剂盒，其中，所述鲎阿米巴样细胞溶解物在水性溶液中。
27.如权利要求24或25所述的试剂盒，其中，所述鲎阿米巴样细胞溶解物和所述显色底物在单个容器中。
28.如权利要求24或25所述的试剂盒，还包括包含鲎阿米巴样细胞溶解物的无菌容器。
29.如权利要求28所述的试剂盒，其中，所述无菌容器是无菌小瓶。
30.如权利要求24或25所述的试剂盒，还包括对照标准品内毒素。
31.一种制备鲎阿米巴样细胞溶解物的方法，其中所述鲎阿米巴样细胞溶解物基本上不含凝固蛋白原，所述基本上不含凝固蛋白原包括通过蛋白质染色的SDS-PAGE测量，相对于鲎阿米巴样细胞溶解物中的总蛋白质，凝固蛋白原少于0.5重量％，所述方法包括：
使用20kDa至50kDa过滤器对包含鲎阿米巴样细胞溶解物和缓冲液的组合物进行切向流过滤，其中鲎阿米巴样细胞溶解物包含凝固蛋白原，从而分离基本上不含凝固蛋白原的鲎阿米巴样细胞溶解物。
32.如权利要求31所述的方法，其中，所述切向流过滤以350ml/分钟至500ml/分钟的流速进行。
33.如权利要求31或32所述的方法，其中，所述缓冲液是Tris缓冲液或MES缓冲液。
34.如权利要求31或32所述的方法，其中，所述缓冲液的pH为7.0至8.0。
35.如权利要求31或32所述的方法，其中，所述过滤器是改性聚醚砜膜过滤器、聚砜膜过滤器或聚醚砜膜过滤器。
36.如权利要求31或32所述的方法，其中，所述过滤器是改性聚醚砜膜过滤器。
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