JPH02502786A - 精製された工業酵素及びその調製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 精製された工業酵素及びその調製方法 本発明はバシラス属菌株の発酵から精製された工業ｕＭ及びその調製方法に関す る。

バシラス属の細菌は多種の細胞外酵素、例えばアミラーゼ、プロテアーゼ、グル コサミン及びリパーゼを生成する（Ｅ、Ｇ、ブリースト（Ｐｒｉｅｓｔ）著、Ｂ ａｃｔ、　Ｒｅｖ、　４１巻、７１１〜７５３頁（１９７７年）を参照のこと） 、これらの酵素は多くの用途をもち、例えばそれらは洗剤に使用され、または食 品及び飲料に適用されるグルコシロップの製造に使用される。今日、バシラス属 は、また外来タンパク質の生産用の宿主細胞系として使用される（Ｗ。

Ｅ、ワークマン（Ｗｏｒｋｍａｎ）、Ｊ、Ｈ，マクリンデン（ＭｃＬｉｎｄｅｎ ）及びり、Ｈ，ディーン（Ｄｅａｎ）著、Ｃｒ１ｔ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｔｅｃ ｈｎ、　３巻、１９９１（１９８６年）を参照のこと）、クローニング用にバシ ラス属を使用する主要な目的の一つは、タンパク賞分泌系を利用して外来タンパ ク賞を培地に移行し、それにより精製を容易にすることである。

ダラム陽性バシラス属は比較的簡単な構造の細胞壁を有する。

２０〜６０ｎ−の厚さの一つの連続層が細胞質膜を包囲しくＡ、Ｍ。

グラウェー）　（Ｇｌａｕｅｒｔ）及びＭ、Ｊ、ソーンレイ　（Ｔｈｏｒｎｌｅ ｙ）著、Ａｎｒ＋、　Ｒｅｖ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　２３巻、１５９〜１９ ８頁（１９６９年）を参照のこと）、そのほぼ半分がペプチドグリカンである。

壁の他の半分はペプチドグリカンに共有結合される種々の負に荷電された重合体 （云ゆるアニオン性重合体）の一つによりつくられている。

ペプチドグリカンはオリゴペプチド側鎖で置換された多糖である。ポリマー主鎖 は交互の配列で現われβ−（１−４）連鎖されたグルコシド結合により連結され た、Ｎ−アセチルグリコサミン及びその３−０−Ｄ−ラクチルエーテル誘導体、 Ｎ−アセチルムラミン酸により形成される。Ｎ−アセチルムラミン酸のラクチル 残基中のヒドロキシル基の殆どはＬ−アラニン、Ｄ−イングルタミン酸、メソ− ジアミノピメリン酸及びＤ−アラニンを逐次含む短かいペプチド鎖により置換さ れ、その最後の成分は隣接鎖中のジアミノピメリン酸のε−アミン基に大きな程 度で連鎖される（Ｈ，Ｇ、シュレーゲル（Ｓｃｈ　Ｉｅｇｅｌ）著、Ａｌｇｅｍ ｅｉｎｅ　Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌａｇｉｅ。

Ａｕｆｌａｇｅ　５、（１９８１年）を参照のこと）。

また、細胞壁はペプチドグリカンの他にアニオン性重合体を含む。それらは細胞 壁の実質的な部分（６０％まで）を含むことがあり（Ｄ、　Ｃ，エルウッド（Ｅ ｌｌｗｏｏｄ）及びＰ、　Ｗ、テムペスト（Ｔｅｍｐｅｓｔ）著、Ａｄｖ、　Ｍ ｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ　　７巻、８３〜１１７頁（１９７２年） 、Ｆ、Ｊ、クリュイセン（Ｋｒｕｙｓｓｅｎ）　、Ｗ、Ｒ。

デ・ボア（ｄｅ　Ｂｏａｒ）及びＪ、　Ｔ、　Ｍ、ウォウターズ（Ｗｏｕｔｅｒ ｓ）著、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　　１４４巻、２３８〜２４６頁（１９８ ０年）を参照のこと）、それらの負に荷電された基の性質に基いて二つの類に分 けることができる。重合体の主鎖の一部としてホスフェート基を含むティコ酸類 が最も多数である。この群の細胞壁重合体内に大きな構造上の相違がある。一般 に、ホスホジエステル基、ポリオール残基及び／または糖残基を有する全ての重 合体がティコ酸類として分類される（Ｊ、バラディレィ　（Ｂａｄｄｉｌｅｙ） 著、Ｅｓ５ａｙｓ　ＢｉｏｃｈｅｒＱ、　　７巻、３−５〜？？頁、（１９７２ 年）を参照のこと）。アニオン性酸の第二群はテイチコロン酸（ｔｅｉｃｈｕｒ ｏｎ　１ｃａｃｉｄ）類を含む。これらのアニオン性重合体の構造はティコ酸類 の構造より良く知られていない。バシラス、スブチリス＜Ｂ。

５ｕｂｔｉｌｉｓ　　枯草菌）　　（Ｗ、　Ｒ，デ・ボアの博士論文、アムステ ル・ダム大学（１９７９年）、Ｊ、ライト（Ｗｒ　ｉｇｈｔ）及びＪ、　Ｅ、　 ヘッケルズ（Ｈｅｃｋｌｓ）著、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　１４７巻、１８７〜 １８９頁（１９７５年）を参照のこと）及びバシラス・リケニホルミス（Ｂ、　 １ｉｃｈｅｎｉｆｏｒ＋５ｉｓ）　　（Ｍ、　Ｒ，ライフリイ　（Ｌｉｆｅｌｙ ）　、Ｅ、タレリ　（Ｔａｒｅｌｌｉ）及びＪ、パンディレィ著、Ｂｉｏｃｈｅ ｍ、　　Ｊ、　　１９１巻、３０５〜３０８頁（１９８０年）を参照のこと）に 於いて、テイチュロンは類は殆ど等モル量のＤ−グルクロン酸及びＮ−アセチル ガラクトサミンからなる。

バチラス属菌株の共通の代謝の特徴の一つは、増殖中の細胞壁重合体の損失、即 ち一般に細胞壁ターンオーバーと称される現象である（Ｗ、Ｒ，デ・ボアの博士 論文、アムステルダム大学（１９７９年）　、Ｗ、Ｒ，デボア、Ｆ、Ｊ、クリュ イセン及びＪ。

Ｔ、Ｍ、ウォウターズ著、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１４０巻、５０〜６０ 頁（１９８１年）、Ｐ、　Ｄ、メイヤー（Ｍｅｙｅｒ）の博士論文、アムステル ダム大学（１９８５年）、Ａ、Ｌ、コック（Ｋｏｃｋ）及びＲｏＪ、ドイル（Ｄ ｏｙｌｅ）著、ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｒｅｖ、　　３２巻、２４７ 〜２５４頁（１９８６年）を参照のこと）、細胞壁ターンオーバーは細胞の正常 な生理学の一部であると考えられ、バシラス属の多くの菌株に現われることが示 されている。細胞壁ターンオーバーの一つの結果が、培地中へのペプチドグリカ ン、ティコ酸及びテイチュロン酸の放出である。これらの重合体の分子量は変化 し得るが、細胞外タンパク質と同じ範囲の分子量をもつ複合体を生成し得る。そ れ故、バシラス属の菌株による発酵に於いて生成された細胞外タンパク質の精製 方法（例えば、限′外濾過）は、しばしば分子量による分離に基礎をおくもので あり、一つの単一画分中に細胞壁重合体及び所望の細胞外タンパク質の蓄積をも たらすようである。バシラス属により生産された幾つかの酵素調製物の分析は、 実際に極めて有意な量の全ての三重合体の存在を示し、ティコ酸が主成分である ことを示した。

驚くことに、酵素調製物中の細胞壁重合体を除去するとこれらの酵素の幾つかの 難点のある性質が消失したこと及び酵素調製物中のこれらの細胞壁重合体の存在 が下記の理由により望ましくないようであることが明らかになった。

−これらの成分は直接の免疫原活性により、またはその他の免疫原成分のアジュ バントとして作用することにより生産物のアレルゲン性の一因となり得る（Ｋ、 Ｗ、クノックス（にｎｏ×）及びＡ。

Ｊ、つ４７ケン（Ｗｉｃｋｅｎ）著、Ｂａｃｔ、　Ｒｅｖ、　３７　（２）巻、 ２１５〜２５７頁（１９７３年）を参照のこと）。

−最終の酵素調製物中のそれらの高濃度のために、それらは酵素安定性（例えば カチオン結合性により）及び酵素の限外濾過性（おそらく一層低い最終酵素濃度 に導く）に対して逆効果を有することがある。

一菌株の酵素／タンパク質生産性がプロテアーゼ／アミラーゼ生産に現在使用さ れる菌株よりも低い場合（例えばバシラス属による異種酵素の生産中）、酵素と 細胞壁重合体の比は一層望ましくないものであり、細胞壁重合体の除去が精製中 に必要である。

−ティコ酸を含むタンパク賞調製物が洗剤溶液に添加される時に曇りの形成を生 じることがある。

細胞壁重合体からタンパク質を精製する方法は工業規模で適用可能である必要が ある。工業規模は１００（１以上のマツシュ（ｗａｓｈ）を適用するものとして 、本明細書で定義される。

従って、本発明の目的は、細胞壁重合体を実質的に含まない工業的な細胞外タン パクｔ（例えば酵素）を提供すること及びこのような生成物を調製する方法を提 供することである。

本発明に従って、このようなタンパク質（例えば酵素）の有用性が、細胞壁重合 体を例えばイオン交換クロマトグラフィーにより除去することにより改良し得る ことが見い出された。このようにして、細胞壁重合体を実質的に含まないバシラ ス属菌株を用いた発酵により工業的な細胞外酵素を得ることができる。

本発明は特に細胞壁重合体を実質的に含まない精製された工業的α−アミラーゼ 、特に工業的な熱安定なアミラーゼの生産に適用し得る。

好ましい態様に於いて、１　ｏ２　ＴＡＵ当り０．２ミリモル未満のティコ酸、 １０’　ＴＡＵ当り０．１ミリモル未満のグルコサミン、１０”　ＴＡｔＪ当り ０．０３ミリモル未満のムラミン酸、１０６ＴＡＵ当り０．２ミリモル未満のジ アミノピメリン酸、１０’ＴＡＵ当り０．１ミリモル未満のガラクトサミン及び １０″ＴＡＵ当り０．１ミリモル未満のグルクロン酸を含む工業的α−アミラー ゼが提供される。ＴＡＵ　（熱安定なアミラーゼ活性の単位）は、後に定義され る。

また本発明は特に精製された工業的プロテアーゼ、更に特にアルカリ媒体中で活 性な工業的プロテアーゼに通用し得る。

本発明は、細胞壁重合体をイオン交換クロマトグラフィーにより大きな程度に除 去することについて以下に言及することにより、例示も目的で更に説明される。

酵素を生産するバシラス・リケニホルミスの発酵培養液が酵素活性、タンパク質 含量及び細胞壁重合体濃度に関して分析される。最終試料がイオン交換クロマト グラフィーにより特別の回収工程に於いて処理される０例えば、強度のある巨大 網状の（＋＋ａｃｒｏ−ｒｅｔｉｃｕｌａｒ）アクリル樹脂を含むカラムが使用 され、溶離剤としてｐＨ５〜７の溶液が使用される。この方法はティコ酸の約９ ０％をイオン交換カラムに結合して細胞壁重合体をアミラーゼ酵素から分離する のに極めて有効であり、イオン交換カラムからティコ酸を後の工程で完全に溶離 し得ることがわかった。イオン交換処理した試料及び未処理試料がアレルゲン性 、酵素の性質及び調製物の濾過特性に関して比較される。

特別の回収工程の前に、試料のｐＨが約５〜７のｐＨに調節される。

ｐｏは通常約０．１〜濃厚の範囲の規定度の酢酸もしくはその他の適当な酸また は緩衝剤の添加の如き便利な手段により変更し得る。

イオン交換工程中に、試料はパンチ式であるいはカラム中に連続に通してイオン 交換ＰＪ脂と組合せられてもよく、この場合接触は通常約５〜６０分、好ましく は１０〜３０分保たれる。市販のキャリヤーに結合されたＱＡＨの如きアニオン 交換吸着剤が使用される。

多種の担体及び吸着剤が固体キャリヤー即ち固体担体として使用し得る。このよ うな固体キャリヤーは、適当な細孔の大きさをもつ、ガラス及びシリカゲルの如 き無機キャリヤー、アガロース、セルロース、デキストラン、ポリアミド、ポリ アクリルアミド、三官能アクリ−レートと種々のヒドロキシル化モノマーとのビ ニルコポリマー等の如き有機の合成もしくは天然産のキャリヤーを含む、市販の キャリヤーは、セファデフクス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ、商標）、トリスアクリル（ Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ、商標）、ウルトロゲル（Ｕｌｔｒｏｇｅ！。

商！り、グイノスフェアーズ（Ｄｙｎｏｓｐｈｅｒｅｓ、商標）、マクロソーブ （Ｍａｃｒｏｓｏｒｂ、商標）、ＸＡＤ樹脂その他の商品名で販売されている。

アミラーゼ酵素活性はＴＡＩＪ単位で表わされる０本明細書中に使用される熱安 定なアミラーゼ活性（ＴＡＵ）の一単位は、標準条件（ｐＨ６，６，３０℃）下 で可溶性澱粉（１００％の乾燥物質）を毎分１．０■の速さで加水分解して生成 物とする酵素の量であり、その生成物は既知強度のヨウ素溶液との反応後に下記 のヨウ素澱粉アミラーゼ試験に記載された着色規準の６２ｏｎ−に於ける光学密 度に等しい光学密度を示す。

プロテアーゼ活性は、英国特許第１５１９１４８号に記載されるように測定され 、ＡＤＵ　（アルカリ性デルフト車位）で表わされる。

一層純粋なタンパク′ｊｉｌｉｉ製物を得ることの他に、驚（ことに発酵培養液 の限外濾過挙動が改善される。更に、未精製酵素溶液の場合、限外濾過による濃 縮中に通常、不活性物質の沈殿が生成され、それにより細胞壁重合体が除去され る。イオン交換処理の後、保持物（ｒｅ　ｔｅｎ　ｔａ　ｔｅ）は透明のまま留 まり、こうして粘稠な最終生成物の労力を要する濾過工程の必要を防ぐ、また未 処理酵素液の貯蔵後の洗剤配合物中の曇りの形成がこの処理により避けることが できる。最後に、イオン交換クロマトグラフィーにより精製された発酵培養液か ら得られたタンパク質調製物の免疫原性は著しく減少する。

本発明を以下の試験方法、分析技術及び実施例により更に説明する。

ヨウ素゛　　アミラーゼ試 熱安定な細菌アミラーゼは澱粉をデキストリン及びマルトースに加水分解する。

ヨウ素が、一定時間反応させる度にヨウ素を加水分解産物に添加し、生じた色の 吸光度を分光光度計により測定する。着色規準に等しい吸光度について必要とさ れる時間が酵素の活性の関数である。

旦 一トリスーマレイン酸塩緩衝剤ｐｏｓ、６トリス（ヒドロキシメチル）アミノメ タン１２．１２ｇ、マレインａ１１．６ｇ及び塩化カルシウムニ水和物１０．０ 　ｇを蒸留水に溶解した。０．５０ＯＮの水酸化ナトリウム溶液、１９０＊の添 加後、溶液を１！にした。

一合成水道水（ＳＴＷ）緩衝剤溶液蒸留水０．９５１に、下記の物質を連続に添 加した。０．１９８Ｍの塩化カルシウム溶液１０．ｉ、０．０６８９Ｍの塩化マ グネシウム溶液１０．（ｌｄ、０．２５０Ｍの重炭酸ナトリウム溶液１〇−及び トリス−マレイン酸塩緩衝剤２〇一５０倍に希釈したトリス−マレイン酸塩緩衝 剤中の可溶性澱粉（メルク（Ｍｅｒｃｋ）　）の２％（Ｗ／Ｖ）溶液。

−蒸留水ＩＩ当りヨウ素２２ｇ及びヨウ化カリウム４４ｇを含むヨウ素原液。

一希釈ヨウ素溶液：蒸留水に溶解されたヨウ素原ＷＬ４−及びヨウ化カリウム４ ０ｇ、ｉ留水を添加して１１にした。

−０，０ＩＮのＨＣｊ！１１当り塩化コバルト（ＩＩ）六水和物２５０ｇ及び重 クロム酸カリウム３８．４　ｇを含む着色規準液。

１立 酵素試料をＳＴＷ緩衝剤溶液に溶解し、同溶液で２〜３ＴＡＵ／ｄの濃度に希釈 する９時間０で開始して、正確に１０−の試料溶液を２％体／Ｖ）の澱粉溶液２ ０−に添加する。３０℃で培養１１分後に、溶液ＩＮ＆を希釈ヨウ素熔ｆｉ５． １中に移す、蒸留水をブランクとして用いて１（２）のキュベント中で、光学密 度を直ちに６２０＊ｍで測定する。着色規準の読みより低い読みが見られるまで 、移しついで測定する操作を１分間隔で繰り返す。

着色規準の吸光度に等しい吸光度に達するのに必要とされる時間Ｔがグラフによ り確立される。

培養溶液中に存在する熱安定なアミラーゼ活性単位（ＴＡＵ単位）が、４００／ Ｔ（４００は培養溶溶中の可溶性澱粉の■数であり、Ｔは必要とされる反応時間 （分）である）から計算される。

ンパク　　　の゛ ビュウレット法（Ｈ，Ｕ、ベルグメイヤー（Ｂｅｒｇｗ＋ｅｙｅｒ）著、°酵素 分析法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　ｅｎｚｙａ＋ａｔｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ）″ 、第三版、■巻、８６〜８８頁（１９７４年））に従って、５％（−／Ｖ）のト リクロロ酸酸沈殿後にタンパク賞含量を測定する。ウシ血清アルブミンを標準と して使用する。

孟ヱユ葭倉ｌ皇貫主 ティコ酸の含量を”Ｐ−ＮＭＲで測定する。

ペプチドグリカン成分、即ちグルコサミン、ムラミン酸及びジアミノピメリン酸 並びにテイチュロン酸成分、即ちガラクトサミン　びグルクロン　の１ ペプチドグリカン成分、即ちグルコサミン、ムラミン酸及びジアミノピメリン酸 並びにテイチュロン酸成分、即ちガラクトサミン及びグルクロン酸を、以下のよ うに測定する。試料ＩＮ１を冷却した水で５倍に希釈し、２０００”ｇで４℃で ２０分間遠心分離する。上澄液をデカントし、石油エーテル（沸点範囲６０〜８ ０℃）５−で２回抽出する。二つの液体の界面で層を形成した変性タンパク賞が 水相中に含まれる。抽出試料を水中で０℃に冷却し１／１０容量の１００％（ｉ 、ｌ／Ｖ）　）リクロロ酢酸を添加する。４℃で６０分培養後、沈殿を４℃で遠 心９幼（２０分、２０００”ｇ）により除去し、試料をニトロセルロースフィル ター（０，６μ−）で濾過する。濾液を等容量のエーテルで３回抽出してトリク ロロ酢酸を除去する。濃硫酸中の加水分解後に、エーテル抽出試料を、Ａ、　Ｈ ，ウィアーダ（Ｗｉａｒｄａ）　、Ｗ、　Ｓ、アレン（ＡＩｉｅｎ）及びＲ。

パーマ（Ｖａｒｍａ）著、Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｓｏ、５７Ｓ、２６８頁（ １９７４年）に実質的に従って、ハーミン（ｈａｒｍｉｎｅ）試薬（シグマ（Ｓ ｊｇｍａ）社により市販される）を用いてグルクロン酸について測定する。

ペプチドグリカン成分及びガラクトサミンの測定に関して、エーテル抽出試料を 気密に栓をした管中で６ＮのＨＣｆｆｉ中で１１０℃で１７時間加水分解する。

）ｌｃｊ！を窒素ガス流により４０℃で１．５時間除去する。クエン酸塩緩衝剤 をベースとする溶離系を用いアミノ酸分析装置（コントロン、リクイマット（Ｋ ｏｎｔｒｏｎ＋　１ｉｑｕｉ＋ＩＩａｔ）■）を使用してムラミン酸、グルコサ ミン、ジアミノピメリン酸及びガラクトサミンを測定した。

大菫皿エ イオン交換クロマトグラフィーによる精製により発酵培養液から得られたα−ア ミラーゼに関して、細胞壁重合体の含量の減少、タンパク質に暴く特異的なα− アミラーゼ活性の増加、乾燥重量基準の特異的なα−アミラーゼ活性の増加、限 外濾過挙動の改良びアレルゲン　の′小 マキサミル（Ｍａｘａｍｙｌ　％商標）、即ちギストープロシーズ（Ｇｉｓｔ− ｂｒｏｃａｄｅｓ）から入手し得るバシラス・リケニホルミスの市販調製物及び 表１に記載された幾つかの不純物を含む発酵培養液Ａを精製してマキサミル（商 標）を含む回収試料Ａ−１を得た。

α−アミラーゼ活性、タンパク賞含量、及び細胞壁重合体のティコ酸、ペプチド グリカン及びティチェロン酸の含量を、上記の分析方法により発酵培養液への細 胞外液体、及び回収試料Ａ−１について測定した。

表１は、細胞外液体がタンパク質（α−アミラーゼ）の他にまた細胞壁成分、即 ちペプチドグリカン、ティコ酸及びティチェロン酸を含むことを示す０回収中に これらの細胞壁成分がα−アミラーゼ活性により共分割する（ｃｏ−ｆｒａｃｔ ｉｏｎａｔｅ）ことが明らかである。

回収試料Ａ−１を、以下のようにして特別の回収工程中でイオン交換クロマトグ ラフィーにより処理した。クイックフィツト（ｑｕｉｃｋｆｉｔ）ガラスカラム （高さ３３．５ｃｍ、直径５．０ｃｍ）を使用した。床容量は６７９−であり、 カラムにＩＲＡ９５８　（アンバーライト（Ａ＊ｂｅｒｌ　ｉ　ｔｅ）、ローム ・アンド・ハース（Ｒｏｈｍ　　ａｎｄＢａａｓ））を充填した。該カラふ中の 流量は２．１４床容量／時間であった。試料Ａ−１のｐＨを酢酸で６．１に調節 し、試料１００ｇをカラム中にポンプ輸送し、続いて緩衝剤（５０ミリモルの酢 酸ナトリウム、ｐＨ＝６．１）　　１１００一ついで溶離剤（５０ミリモルの酢 酸ナトリウム及び１モルの塩化ナトリウム、ｐＨ＝６．１）　　１２００−をポ ンプ輸送した。１００Ｎｉの諸百分を集め、生成物は第三百分と第七画分との間 に存在した。この５００−の生成物をＰＭＩＯ膜を備えたアミコン（Ａ＋５ｉｃ ｏｎ）攪拌セル中の限外濾過により６倍に濃縮した。イオン交換クロマトグラフ ィー及び限外濾過後のα−アミラーゼ活性の収率は９９％以上であった。Ａ−１ の得られた精製画分をＡ−２と称した。

イオン交換処理試料及び未処理試料を上記のように細胞壁成分について分析した ０表２は、イオン交換クロマトグラフィー後に試料中の細胞壁重合体の著しい減 少があることを示す。

試料Ａ−１及びＡ−２のタンパク質含量を、ビュウレット法に従ってトリクロロ 酢酸沈殿後に測定した。ウシ血清アルブミンを標準として使用した０表２はイオ ン交換クロマトグラフィー精製工程がＡ−１に比較してＡ−２のタンパク質中の 特異的なα−アミラーゼ活性の１０％増加をもたらしたことを示す。

Ａ−１及びＡ−２１０ｇを含む二つの試料を１００℃で１６時間乾燥して乾燥重 量値を得た０表２は、イオン交換クロマトグラフィー精製工程後に、乾燥重量基 準の特異的な活性が増加することを示す、これは細胞壁重合体及び非アミラーゼ タンパク質の除去による。

試料Ａ−１及びＡ−２の限外濾過挙動が第１図に示される。八−２の限外濾過の 流量に増加がある。また、第１図は−ＮＳ厚なα−アミラーゼ調製物を得ること ができることを示す。

生理食塩水中に溶解された試料Ａ−１及びＡ−２を、モルモット（投薬群当り８ 匹の動物）当り０．１または１．０μｇのタンパク質の投薬量で皮肉経路により ２週間毎の間隔で３回投与した。

体重２５０〜３５０ｇの雌のモルモット、多゛ンキンーノ１−トレイーパーブラ イト（Ｄｕｎｋｉｎ−Ｈａｒｔｌｅｙ−Ｐｉｒｂｒｉｇｈｔ）源は、０ＬＡＣ１ ９７６Ｌｔｂ−ビセスタ−（Ｂｉｃｅｓｔｅｒ）　、英国により供給された。

動物を個々に収容し、ＬＣ−２３Ｂ型ホープ・ファームズ（ＨｏｐｅＦａｒｍｓ ）ペレット及び水道水を随時供給した。

長五二盆択 １．３回目の皮肉注射の１週間後に取り出した血液からの血清の逐次希釈液を、 循環抗体の定量測定に関する同種受動皮層アナフィラキシ−（ＰＣＡ）試験で試 験した。

２．３回目の皮肉注射の２週間後に、モルモットを酵素（１μｇの酵素の等量で ）の気管内投与により抗原投与し、呼吸応答を目視で記録した。

適当な対照を試験の全段階で使用した。

■ ＰＣＡ試験の結果は、以下のとおりであった。

１、抗体力価１） Ａ−１７，８（６，７〜８．８）　　　　９．６　（８，９〜１０．４）Ａ−２ １，０（−２，３〜４．２）　　　９．３　（８，５〜１０．１）１）示された 値は、希釈液（２の累乗として表わされる）及び最大応答の５０％を誘導する９ ５％の信頼区間を表わす、負の値は、血清の濃縮が５０％の応答を得るのに必要 とされることを示す。

１．０μｇの投薬量では二つの試験物質に対する応答の間に殆ど差異がなかった が、これは広い経験に基いておそらく超過最適投与量により得られるプラト一応 答を反映する。一方、試験物質の０．１μｇの投薬量は一層相違を正確に見分け るものであり、Ａ−２処理モルモットに関して血清中の極めて低い抗体力価をも たらすことがわかった。二つの試験物質を、０．１μｇの投薬量から血清の逐次 希釈液に関するＰＣＡ試験の合計値についてのプロビット法による平行線分析を 行なうことにより比較した時、２５・４（２３・ｈ〜２７・１）の非常に有意な 効力比がＡ−１とＡ−２の間に見られた。これば、試料Ａ−２及びＡ−１のｉＰ ｔ製方法の間の唯一の相違であるイオン交換技術の通用がこれらの調製物の免疫 原性を有意に減少し得ることを示す。

２、呼吸応答 ０〜７０尺度で記録された平均呼吸応答は０．１μｇの投薬量でＡ−１処理群よ りもＡ−２処理群で低かった（夫々０．９対２．６）。

大丘Ｍ主 イオン交換クロマトグラフィーによるアミラーゼを含む洗剤を含む溶′　の　　 のノ　の減小 土２０００ＴＡＵ／ｇのマキサミル（商標）培養液濾液をアンバーライトＴＲＡ ９５８を含むカラムに通した。その後、１０％ＮａＣｊ！溶液を用いて、アンバ ーライトＩＲＡ９５８を再生した。

ティコ酸を含まないマキサミル（商標）溶液を１５０００ＴＡｔＪ／ｇの最終生 成物に濃縮し、その後プロピレングリコールを用いて５０％（屓／Ｖ）に安定化 した。

処理及び未処理の最終酵素溶液を、曇り怒受性の洗剤混合物（水中、非イオン性 ポリエチレンオキサイドアルコール（１６％（−／ν））、ドデシルベンゼンス ルホン酸ナトリウム（３，５％（警／Ｖ））、エタノール（５％（訂ν））、及 びギ酸ナトリウム（３％（Ｗ／Ｖ）　）を含む）に添加し、４３℃で５０時間貯 蔵した。ＩＲＡ９５８で処理されなかった試料はひどい沈殿形成を示したが、一 方イオン交換により処理された試料中に沈殿は見られなかった。

１上皿ｌ イオン交換クロマトグラフィーによる精製により発酵培養液か′６゛れたプロー アーゼの　フ辞　４　の４．の゛小英国特許第１５１９４１８号に記載されたよ うにして得られたマキサカル（Ｍａｘａｃａｌ、　　商標）の発酵培養液（Ｐ− １）に於いて、アルカリ性プロテアーゼ活性及びタンパク質含量を、上記の分析 方法により測定した。ＹＭＩＯ膜による限外濾過の後に、細胞壁重合体を含むピ ルベートケタールの存在を’Ｈ−ＮＭＲにより測定した。

試料Ｐ−１を、実施例１に実質的に記載されたようなイオン交換クロマトグラフ ィーにより特別な回収工程中で処理した。Ｐ−１から得られた精製画分ＣＰ−２ ）中に、細胞壁重合体を含むピルベートケタールは全く検出できなかった。

試料Ｐ−１及びＰ−２のタンパク質含量を、実施例１に記載し。

たようにして測定した０表３は、イオン交換精製工程がまたＰ−１に較べてＰ− ２のタンパク質に基いて特異的なプロテアーゼ活性の５％増加をもたらしたこと を示す。

、表−」− Ｔａｂｌ、ｅＩ工Ｉ Ｌ用〆　　　　　メ＝　濃度因子 第　　１　　図 国際調査報告 １−１−１Ｉ−ｓ−＋Ａ、、に、ｉ＋、、ＰＣＴ／ＮＬ　８Ｂ１０００６３国際 調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）細胞壁重合体を実質的に含まないバシラス属菌株の発酵により得られた工 業的細胞外タンパク質。 （２）酵素である、請求の範囲（１）記載の工業的細胞外タンパク質。 （３）α−アミラーゼである、請求の範囲（２）記載の工業的酵素。 （４）熱安定なアミラーゼである、請求の範囲（３）記載の工業的α−アミラー ゼ。 （５）１０６ＴＡＵ当り０．２ミリモル未満のテイコ酸、１０６ＴＡＵ当り０． １ミリモル未満のグルコサミン、１０６ＴＡＵ当り０．０３ミリモル未満のムラ ミン酸、１０６ＴＡＵ当り０．２ミリモル未満のジアミノピメリン酸、１０６Ｔ ＡＵ当り０．１ミリモル未満のガラクトサミン及び１０６ＴＡＵ当り０．１ミリ モル未満のグルクロン酸を含むことを特徴とする請求の範囲（３）または（４） 記載の工業的α−アミラーゼ。 （６）プロテアーゼである、請求の範囲（２）記載の工業酵素。 （７）アルカリ性媒体中で活性である、請求の範囲（６）記載の工業的プロテア ーゼ。 （１８）細胞壁重合体がイオン交換により細胞外タンパク質から除去されること を特徴とする請求の範囲（１）〜（７）のいずれかの項記載の工業タンパク質の 調製方法。 （９）タンパク質が酵素である、請求の範囲（８）項記載の精製された工業タン パク質の調製方法。