PL232758B1 - Zastosowanie białka bakteriofagowego wiążącego endotoksyny - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie białka bakteriofaga wiążącego endotoksynę (przez lipid A), w postaci ligandu do usuwania endotoksyn z preparatu lub pomiarów stężenia endotoksyn.

Jednym z kryteriów stawianych preparatom podawanym pozajelitowo jest spełnianie norm dotyczących zawartości substancji gorączkotwórczych, tzw. pirogenów. W związku z tym istotny jest zarówno pomiar stężenia tych cząsteczek w preparatach, jak również sposoby ich usuwania z preparatów pochodzenia naturalnego. Regulacje te w znacznej mierze definiują opracowania farmakopeal-ne. Na przykład preparat przeznaczony do podania dożylnego w objętości 10 ml (w ciągu 1 h) dla osoby o masie ciała 80 kg nie może zawierać więcej niż 40 U/ml endotoksyn (na podstawie: Farmakopea Polska VIII 2008).

Jednym z ważnych pirogenów są endotoksyny Gram-ujemnych bakterii. O ile same bakterie można łatwo usunąć lub zniszczyć w różnych procedurach sterylizacji, endotoksyny są cząsteczkami termoopornymi i odpornymi na działanie wielu czynników chemicznych. Endotoksyny (lipopolisachary-dy, LPS, lipooligosacharydy, LOS) składające się z części polisacharydowej oraz lipidowej są amfifilo-wymi cząsteczkami umiejscowionymi na powierzchni komórki bakterii Gram - ujemnej (Holst i współpr. 1996). Stanowią one integralne, a zarazem unikatowe składniki błony zewnętrznej bakteryjnej osłony komórkowej i są niezbędne do funkcjonowania i przeżywaIności bakterii. Pokrywając około 70% jej powierzchni, chronią mikroorganizm przed obronnymi mechanizmami zainfekowanego makroorgani-zmu, kwasami żółciowymi i hydrofobowymi antybiotykami. Odgrywają istotną rolę, jako czynnik wirulencji bakterii, w przypadkach posocznicy i wstrząsu septycznego (Holst i współpr. 1996). Stanowią także tzw. wzorce molekularne patogenów (PAMP - patogen associated molecular pattern) rozpoznawane przez elementy wrodzonego układu odpornościowego, np. przez receptor Toll-podobny 4 (TLR4). Niezależnie od pochodzenia LPS, cząsteczka ta, wyizolowana z gładkich form bakterii, zbudowana jest z trzech części: łańcucha O-swoistego - polimeru złożonego z powtarzających się pod-jednostek oligosacharydowych, zawierających od jednej do ośmiu reszt cukrowych. Łańcuch O-swoisty determinuje serologiczną swoistość LPS (swoistość O-antygenową); oligocukru rdzenia -regionu o ograniczonej zmienności, w którym można wyróżnić część dystalną względem lipidu A, nazywaną rdzeniem zewnętrznym lub regionem heksozowym oraz część proksymalną względem lipidu A (rdzeń wewnętrzny, region heptozowy).; oraz lipidu A, kotwiczącego tę cząsteczkę w błonie zewnętrznej ściany komórkowej bakterii Gram-ujemnych (Holst i współpr. 1996). Lipid A jest połączony z regionem rdzeniowym wiązaniem ketozydowym pomiędzy cząsteczką Kdo i GIcN na końcu nieredu-kującym szkieletu cukrowego lipidu A, podstawionego kwasami tłuszczowymi oraz grupami fosforanowymi wraz z podstawnikami. Przypisywane lipopolisacharydowi aktywności biologiczne są ściśle powiązane z cechami strukturalnymi tego regionu, który stanowi centrum toksyczności lipopolisacharydu.

Określenie endotoksyna w świecie medycznym, wiąże się nierozerwalnie z terminami takimi jak posocznica i wstrząs septyczny. Posocznice oraz wstrząs septyczny są groźnymi powikłaniami w przypadku zakażeń zarówno Gram-ujemnymi jak i Gram-dodatnimi bakteriami. Do tego typu powikłań dochodzi w sytuacji, gdy pewne składniki ściany komórkowej bakterii dostaną się do krwiobiegu, gdzie rozpoznane przez system odpornościowy wywołują wewnątrzustrojową reakcję zapalną. Składnikami tymi są egzotoksyny, lipopolisacharydy w przypadku bakterii Gram-ujemnych oraz peptydogli-kan i kwas tejchojowy w przypadku bakterii Gram-dodatnich. Podejrzewa się, że poza środowiskiem zewnętrznym, drugim potencjalnym źródłem bakterii jest układ pokarmowy, zasiedlany przez populację Gram-ujemnych bakterii. Wzrost przepuszczalności ścian jelita związany z niektórymi schorzeniami może być przyczyną translokacji bakterii do krwiobiegu podczas różnorodnych medycznych i chirurgicznych zabiegów (Ulmer i współpr. 2002). Stan pacjenta, u którego identyfikuje się żywe, namna-żające się w krwiobiegu bakterie oraz towarzyszące temu objawy kliniczne nazywany jest posocznicą. Lipopolisachryd ujawnia swoje biologiczne aktywności w chwili pojawienia się tej cząsteczki w krwiobiegu. Tego typu infekcjom sprzyja ogólne osłabienie organizmu, a w tym i układu immunologicznego. Do częstych zakażeń dochodzi u pacjentów z urazami powypadkowymi, u chorych poddanych zabiegom chirurgicznym, z cewnikami wprowadzonymi do naczyń krwionośnych i pęcherza moczowego lub poddanych immunosupresji. Zastosowanie antybiotyku w chwili rozpoznania zakażenia bakteryjnego, prowadzi jedynie do zabicia patogenu, antybiotyki bowiem nie inaktywują endotoksyny, a według niektórych doniesień wzmagają jej uwalnianie z powierzchni ściany komórkowej bakterii. W pełni aktywna biologicznie endotoksyna pojawia się w krwiobiegu oddziałując ze znajdującymi się w krwi komórkami i białkami. Zarówno dzielące się jak i martwe bakterie Gram-ujemne uwalniają do krwio- biegu endotoksynę w formie wolnego lipopolisacharydu lub w postaci kompleksów z białkiem OMP (outer membrane protein). Kompleksy LPS ze znajdującymi się w surowicy białkami ostrej fazy reagują z receptorami na powierzchni makrofagów/monocytów, limfocytów i komórek śródbłonka naczyń krwionośnych indukując syntezę i uwalnianie aktywnych produktów, takich jak czynnik martwicy nowotworu - TNF-a (tumor necrosis factor), interleukiny 1,6,8, prostaglandyny, leukotrieny, czynnik aktywujący płytki krwi - PAF (platelet-activating factor), tlenek azotu i wolne rodniki tlenowe. Sposób w jaki endotoksyna ujawnia niebezpieczną dla zainfekowanego organizmu aktywność biologiczną czyni z tej cząsteczki nietypową toksynę. Najważniejszą rolę odgrywa tu zaangażowanie składników układu odpornościowego. Lipopolisacharyd, w kontakcie z komórkami układu odpornościowego, stymuluje je do efektywnego zahamowania infekcji. Sytuacja staje się niebezpieczna podczas uogólnionych zakażeń bakteryjnych, kiedy komórki docelowe LPS oddziałują z dużą liczbą cząsteczek endotoksyny we krwi. Dochodzi wtedy do nadprodukcji mediatorów, obniżenia ciśnienia krwi, wysokiej gorączki, rozsianego wewnątrznaczyniowego krzepnięcia krwi i śmiertelnego wstrząsu septycznego (Ulmer i współpr. 2002). Człowiek jest jednym z gatunków najbardziej wrażliwych na działanie endotoksyny. Stężenie 10 pg/ml lipopolisacharydu w plazmie może wskazywać na rozwój posocznicy. Za prawidłowe stężenie uznaje się 2,401 pg/ml. Stężenie endotoksyny we krwi u osób z objawami posocznicy wynosi 5 - 500 pg/ml (Kaca 1996, Kilink i współpr. 1996).

Ze względu na opisane powyżej aktywności biologiczne, endotoksyny są niepożądanym zanieczyszczeniem preparatów farmaceutycznych, w szczególności tych podawanych pozajelitowo. W związku z tym ich poziom jest stale monitorowany, a sposoby oznaczania poziomu endotoksyn oraz oczyszczania preparatów z endotoksyn stanowią szybko rozwijający się kierunek badań prowadzonych w firmach biotechnologicznych. Do powszechnych sposobów usuwania endotoksyn z roztworów należą ultrafiltracja, matryce sorpcyjne, jak żywice chromatograficzne i żywice jonowymienne.

Najbardziej popularnym testem do oznaczania poziomu endotoksyn bakteryjnych jest test LAL (limulous amoebocyte lysate test) i jednocześnie jak na razie jedynym testem zalecanym przez Farmakopeę Europejską i Polską do badania obecności endotoksyn bakteryjnych. Test LAL wykorzystuje zdolność endotoksyny do aktywacji kaskadowej reakcji od proenzymu-koagulogenu do enzymu koagulazy przy użyciu lizatu Limulus amoebocyte (LAL). W diagnostyce jest szeroko stosowany do wykrywania endotoksyn przy endotoksemii, w surowicach pacjentów, zanieczyszczeniach endo-toksyną preparatów podawanych w iniekcjach, a także w skażeniach nią sprzętu medycznego. Do testu LAL stosuje się odpowiednie zestawy odczynników, a szczegóły zalecanych procedur opisane zostały przez Farmakopeę Europejską i Polską [na podstawie: Farmakopea Polska VIII 2008)]. Odróżnia się trzy podstawowe sposoby postępowania: sposób żelowy, turbidymetryczny oraz test LAL z użyciem substratu chromogenicznego S-2423. Test LAL, ze względu na pochodzenie składników aktywnych (izolacja ze Skrzypłocza), jest typowym testem biologicznej aktywności nieodnoszącym się bezpośrednio do fizykochemicznych parametrów roztworów, w tym do stosunków molarnych. Sposób pozyskiwania przekłada się także na relatywnie wysoki koszt pojedynczego oznaczenia.

Innym sposobem wykrywania i izolacji endotoksyn są testy oparte na wiązaniu endotoksyn do specyficznych ligandów bakteriofagowych, których biologiczną funkcją jest wiązanie do bakteryjnych receptorów powierzchniowych, w tym LPS. Takim białkiem jest białko 12 (białko p12) bakteriofaga T4, ulokowane w ogonku bakteriofagowym, którego naturalną rolą jest właśnie wiązanie m.in. do LPS w przebiegu infekcji komórki bakteryjnej przez bakteriofaga. Ta właściwość została wykorzystana do wytworzenia złóż wiążących endotoksyny: EndoTrap (Hyglos) oraz do wytworzenia testów obecności endotoksyn w preparatach: EndoLISA (Hyglos). W dostępnych dokumentach patentowych opisano zastosowanie białek bakteriofagowych w celu identyfikacji endotoksyn w preparacie, usuwania endo-toksyn z preparatu oraz oczyszczania komórek bakteryjnych. Spośród białek bakteriofagowych uwzględniono także białka główki bakteriofagowa do zastosowania w wiązaniu komórek bakteryjnych w przypadku bakteriofagów nieposiadających ogonków. W zebranych dokumentach wymieniono białka kapsydowe główki bakteriofaga jako znajdujące zastosowanie w wiązaniu i identyfikacji endotoksyn. Jednakże, białka bakteriofagowego gp23 będącego przedmiotem oczekiwanego wynalazku nie uwzględniono w ww. dokumentach patentowych, a wymienione białka cechują się naturalnie oczekiwaną zdolnością wiązania LPS ze względu na ich funkcję w kapsydzie polegającą na wiązaniu do bakteryjnych receptorów.

Dokument EP1695085 B1 (WO2005062051 A1 ) opisuje sposób detekcji endotoksyn w próbce polegający na inkubacji próbki z białkiem występującym w bakteriofagach i zdolnym do związania składników ściany komórkowej. Sposób detekcji endotoksyny składający się z etapów: a) zmieszania próbki zawierającej endotoksynę z powierzchnią opłaszczoną substancją wiążącą endotoksynę, b) inkubacji białek bakteriofaga (białek ogonka bakteriofaga lub białek główki bakteriofaga z ogonkiem lub białkami płaszcza bakteriofaga bez ogonka) z endotoksynę zimmobilizowaną na powierzchni, c) detekcji białek bakteriofagowych związanych do endotoksyn z użyciem metod spektroskopowych, ELISA, chemicznych lub enzymatycznych reakcji wykrywania endotoksyn lub ich składników. W przedstawionym sposobie zastosowano białko ogonka bakteriofaga mające homologię w przynajmniej 60% z białkiem p12 bakteriofaga T4. Białko p12 pochodziło z fagów: T4, K3, T2, Ox2, RB32-33, AR1, PP01 lub RB69. Wymieniono, że szczególnie korzystne są krótkie białka ogonka bakteriofaga. Dodatkowo dokument ten wspomina również, że jako białka wiążące endotoksynę mogą być także użyte białka główki bakteriofaga bez ogonka, w szczególności białko PhiX 174. Zastosowane tu białka bakteriofagowe wiążą się da konserwatywnych regionów endotoksyn, regionu rdzenia LPS lub lipidu A.

Dokument EP1516188B1 (WO2004001418) opisuje sposób identyfikacji endotoksyn i ich usuwania z próbki polegające na inkubacji próbki z białkiem występującym w bakteriofagach i zdolnym do związania składników ściany komórkowej. Sposób detekcji endotoksyny wg. cytowanego dok u-mentu, składa się z etapów: a) inkubacji próbki z białkiem występującym w bakteriofagach i zdolnym do związania składników ściany komórkowej oraz b) detekcji endotoksyn związanych do białek bakteriofaga. Detekcję wykonuje się z użyciem metod spektroskopowych. W sposobie zastosowano przepływową kolumnę chromatograficzną oraz zastosowano białko p1 2 bakteriofaga T4, jako cząsteczkę wiążącą LPS. W dokumencie CA2450572 do oczyszczania komórek bakteryjnych lub ich składników zastosowano białko p12 z bakteriofaga T4, p12 z T2 (GenBank Accession number X56555) wiążące się z bakteriami typu coli. Zastosowane białka ogonka bakteriofaga mogły być uzyskane metodą rekom-binacyjną lub oczyszczone z użyciem standardowych metod separacji chromatograficznych. W dokumencie zaznaczono, że LPS jest receptorem dla białek ogonka fagów T2, T4, K3.

Dokument EP1399551B1 (WO2003000888A2) opisuje metodę oczyszczania komórek bakteryjnych i składników komórkowych poprzez wiązanie do bakteriofaga lub jego białek zimmobilizowanych na nośniku. Do białek bakteriofagowych zastosowanych w celu oczyszczania bakterii należą białka płaszcza i/lub białka ogonka bakteriofagowego. Białka ogonka rozpoznają tutaj składniki bakteryjne: białka powierzchniowe lub lipopolisacharyd bakterii Gram-ujemnych.

Dokument CA2490467 (US8329392B2) opisuje sposób detekcji endotoksyn, obejmujący etap inkubacji próbki z p12 lub innym białkiem ogonka bakteriofaga podobnym do p12, które wiąże się do konserwatywnego regionu endotoksyny.

Wytwarzanie białka stanowiącego element aktywnych systemów opartych na p1 2 lub białkach homologicznych wymaga pozyskania aktywnej, prawidłowo skonformowanej formy tego białka, ponieważ wiadomo, że tylko taka forma jest zdolna do wiązania LPS. Poza prawidłową strukturą II- i lll-rzędową w wypadku tego białka musi powstać także poprawna struktura IV-rzędowa, czyli właściwie złożony trimer. Dopiero jego wytworzenie pozwala na powstanie charakterystycznych kieszeni wiążących. Zarówno naturalna oligomeryzacja jak i ogólna charakterystyka białka powodują, że utrzymywanie jego rozpuszczalnej natywnej formy, szczególnie w większych stężeniach jest trudne technicznie. Ponadto wiadomo, że białko p12 poza wiązaniem endotoksyn jest zdolne do wiązania niektórych białek powierzchniowych Escherichia coli oraz bakterii pokrewnych, ponieważ receptorami do których p12 wykazuje powinowactwo są również białka z rodziny Omp. Nie są dostępne żadne dane, które pozwalałyby wykluczyć lub tylko ocenić narażenie testów opartych na p12 na niepożądaną kontaminację białkami bakteryjnymi.

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie białka wiążącego endotoksyny zawierającego sekwencję przedstawioną jako Sekw. Nr 1 lub jej fragment posiadający powinowactwo do endotoksyn do izolowania endotoksyn z roztworów. Korzystnie, białko według wynalazku jest stosowane do usuwania endotoksyn z preparatu lub pomiarów stężenia endotoksyn.

Białko wiążące endotoksyny o wyżej wspomnianym zastosowaniu jest białkiem, którego ekspresja jest łatwa i wydajna oraz, które do podjęcia swojej aktywności nie wymaga osiągnięcia formy zoligomeryzowanej. Jest to białko kapsydu bakteriofaga T4, w przypadku którego Twórcy nieoczekiwanie stwierdzili zdolność do silnego wiązania endotoksyn bakteryjnych przez region lipidu A, tj. centrum aktywności biologicznej LPS.

Gp23 jest białkiem obecnym na powierzchni kapsydu bakteriofaga T4 (gene product 23) znanym jako główne białko kapsydowe tworzące zewnętrzną powierzchnię główki bakteriofaga T4. W główce fagowej, białko gp23 buduje 155 heksamerów, których funkcją, w odróżnieniu od p12 nie jest wiązanie do powierzchni bakterii w przebiegu infekcji, ale utworzenie głównej części powierzchni główki fagowej. Optymalną metodą otrzymywania gp23 jest jego koekspresja z gp31, które naturalnie towarzyszy w jego fałdowaniu. Nieoczekiwanie, podczas badań nad ekspresją oraz oddziaływaniem różnych białek bakteriofaga T4 z endotoksynami bakteryjnymi, stwierdzono, że gp23 zdolne jest do silnego oddziaływania z lipooiigosacharydem E. coli B, zawierającym lipid A charakterystyczny dla większości bakterii Gram-ujemnych. Wskazaniem dla tej ciekawej właściwości były problemy z uzyskaniem ww. białka w formie wolnej od endotoksyny (oczyszczanie) oraz wyniki oddziaływania pomiędzy gp23 a LOS E. coli B uzyskane przy użyciu termoforezy kapilarnej i powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR, aparat Biacore). Zidentyfikowana zdolność do wiązania endotoksyn przez białko bakteriofagowe gp23 ma potencjalne zastosowanie w oczyszczaniu preparatów z endotoksyn lub oznaczaniu ich stężenia.

SZCZEGÓŁOWY OPIS WYNALAZKU

Wynalazek dotyczy zastosowania białka gp23 - białka kapsydu bakteriofaga do usuwania endotoksyn z preparatów lub oznaczenia stężenia endotoksyn. Białko gp23 jest zdolne do wiązania endotoksyn przez region lipidu A. Znane zastosowania białek bakteriofagowych do detekcji i separacji endotoksyn z preparatów różnią się od przedmiotowego wynalazku sposobem wykonania oznaczenia endotoksyn, metodami immobilizacji i detekcji. Białka stosowane w stanie techniki wiążą konserwatywne regiony endotoksyny, lipid A lub oligocukier rdzenia. Jednakże charakteryzowane w tych dokumentach białko o właściwościach wiążących endotoksynę to białko p12 będące białkiem ogonka bakteriofagowego, którego naturalną funkcją jest wiązanie do powierzchni bakterii w przebiegu infekcji bakterii przez bakteriofaga. Dotychczas nie opisano natomiast zastosowania białka gp23 w identyfikacji, oznaczeniu i ekstrakcji endotoksyn. Dodatkowo, brak jest w stanie techniki jakichkolwiek doniesień na temat odkrytego przez twórców oddziaływania białka gp23 z lipopolisacharydami.

Białko gp23 zostało zastosowane w tej formie, w jakiej występuje ono w dojrzałej główce bakteriofagowej, tzn. usunięto z niego N-końcowy fragment obecny na wczesnych etapach wytwarzania i dojrzewania białka o Sekw. Nr 1:

AEIGGDHGYNATNIAAGQTSGAVTQIGPAVMGMVRRAIPNLIAFDICGVQPMNSPTGQVFALRAVYGKDPVAA

G AKE AFH PM YG PDAM FSGQG AAKKFP ALAASTQTTVGDIYTH FFQETGTVYLQASVQVTIDAGATDAAKLDAEIK

KQ,MEAGALVEIAEGMATSIAELQEGFNGSTDNPWNEMGFRIDKQVIEAKSRQLKAAYSIELAQDLRAVHGMDAD AELSGILATEIMLEINREWDWiNYSAQVGKSGMTLTPGSKAGVFDFQDPIDIRGARWAGESFKALLFQIDKEAVEI ARQTG RGEG N Fil ASRN WNV LASV DTG ISYAAO.G LATG FSTDTTKSVF AGV LGGKYRVYIDQYAKQDYFTVG YKG PNEMDAGIYYAPYVALTPLRGSDPKNFQPVMGFKTRYGIGINPFAESAAQAPASRIQSGMPSILNSLG

Białko zostało wytworzone w rekombinacyjnym systemie ekspresyjnym Escherichia coli B i oczyszczone przez techniki chromatograficzne z powstającego w toku produkcji typowego zanieczyszczenia endotoksynami. W porównaniu z innymi białkami główki T4 oczyszczanymi równolegle, t.j. z gp24, gphoc i gpsoc, usunięcie endotoksyn z preparatu gp23 było wyraźnie trudniejsze i wymagające większej liczby kroków lub czasu w zastosowanych metodach.

Zaobserwowane problemy skłoniły Twórców wynalazku do zbadania oddziaływania białka gp23 z endotoksynami. Zdolność LOS E. coli B do tworzenia kompleksów z białkami bakteriofaga T4 oceniano przy użyciu termoforezy kapilarnej (Przykład 2) oraz techniki powierzchniowego rezonansu plazmonów (SPR) (Przykład 3). Analizę termoforezy (zjawisko poruszania się cząsteczki w gradiencie temperatury i wpływu na ten parametr ewentualnego oddziaływania danej cząsteczki z ligandem) wykonano dla natywnego LOS E. coli B w formie rozpuszczalnych kompleksów z trójetyloaminą oraz wyznakowanych fluorescencyjnie 4 białek bakteriofaga T4: Soc, Hoc, gp23c, gp24c. Uzyskane krzywe wiązania przedstawiono na Fig. 2. Z otrzymanych krzywych zależności znormalizowanych wartości fluorescencji od stężenia LOS wynika, że oddziaływanie zachodzi jedynie dla białek Soc i gp23. Na podstawie otrzymanych wyników obliczono stałą dysocjacji KD, która w przypadku białka Soc wynosi 32,3 μΜ, a w przypadku białka 23-72 nM.

Zdolność LOS E. coli B do tworzenia kompleksów z białkami bakteriofaga T4 oceniano również przy użyciu techniki powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR). Stosowano różne rekombi- nowane białka bakteriofagowe oraz LOS E. coli B. Dodatkowo przygotowano de-O-acylowaną formę LOS (LOS-OH), poddając LOS deacylacji przy pomocy bezwodnej hydrazyny.

Otrzymane wyniki pokazały, że białko 23 silnie wiąże LOS E. coli B (Kd=1.4 x 10-9 M). Wynik analizy SPR jest zbliżony do wyniku otrzymanego metodą termoforezy. Dodatkowo oddziaływanie LOS z białkiem 23 zależne jest od kwasów tłuszczowych lipidu A. Usunięcie 4 z 6 kwasów tłuszczowych z LOS całkowicie uniemożliwia jego związanie przez białko 23. Parametry kinetyczne wyznaczone dla kompleksu LOS-23 wskazują na tworzenie się trwałego i mocnego kompleksu. Zidentyfikowanie tak silnego czynnika wiążącego lipid A LOS/LPS może mieć znaczenie praktyczne. Białko 23 może być wykorzystywane jako czynnik wychwytujący cząsteczki LOS/LPS z próbek (detoksyfikacja próbek przy użyciu chromatografii powinowactwa) lub czynnik do pomiaru stężenia endotoksyn w preparatach farmaceutycznych lub wodzie.

Na Fig. 1 zaprezentowano punkty pomiarowe oraz dopasowane krzywe wiązania dla oddziaływania wybranych białek bakteriofaga z LOS E. coli B. Stężenie LOS podano w nM. Analizę wykonano przy pomocy termoforezy kapilarnej.

Na Fig. 2 przedstawiona została analiza SPR oddziaływania rekombinowanego białka bakteriofaga T4 gp 23c z LOS E. coli B (A) oraz LOS-OH E. coli B (B). Białko gp 23c immobilizowano na chipie CMS. Podczas analizy kinetyki oddziaływania stosowano roztwory LOS w HBS-P z dodatkiem 2% trójetyloaminy o różnych stężeniach: 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3,125 nM oraz LOS-OH o stężeniu, 50 nM (B). Do obliczenia parametrów kinetycznych zastosowano model Langmuira 1:1.

PRZYKŁADY P r z y k ł a d 1. Otrzymywanie gp23.

Białko rekombinowane, które następnie wykorzystano do wiązania LOS pochodzenia bakteryjnego, przygotowano według ustalonej metodyki (Miernikiewicz i współpr. 2012). W skrócie, wykorzystano wektor ekspresyjny zawierający odpowiednią część genu 23, kodującą fragment białka występujący w dojrzałej formie główki T4, wraz z obecną po stronie 5' sekwencją kodującą standardową metkę powinowactw, tu: GST. Powstająca fuzja N-końcowa białka gp23 z metką GST była izolowana na typowych złożach powinowactwa, a następnie uwalniana proteolitycznie i dodatkowo oczyszczana przez chromatografię sitową oraz chromatografię powinowactwa LPS. Produkt końcowy stanowiło oczyszczone białko gp23. P r z y k ł a d 2. Ocena wiązania endotoksyny do gp23 przy użyciu termoforezy kapilarnej.

Analizę termoforezy (zjawisko poruszania się cząsteczki w gradiencie temperatury i wpływu na ten parametr ewentualnego oddziaływania danej cząsteczki z ligandem) wykonano dla wyznakowanych fluorescencyjnie 4 białek bakteriofagowych oraz natywnego LOS E. coli B w formie rozpuszczalnych kompleksów z trójetyloaminą. LOS E. coli B wyizolowano przy pomocy ekstrakcji wodno--fenolowej i oczyszczano przy pomocy dializy i ultrawirowania. Testowano następujące białka bakteriofaga T4: (1) Soc, stężenie 22.9 μM, objętość 120 μ( (2) Hoc, stężenie 35.6 μM, objętość 120 μ!, (3) 23c stężenie 30.9 μΜ, 120 μ( (4) 24c stężenie 22.6 μΜ, 120 μΚ Białka znakowano znacznikiem fluorescencyjnym NT-647 (zestaw do znakowania NanoTemper RED, #L001, NanoTemper Technologies). Białka stosowano w stałym stężeniu wynoszącym ok. 20 nM w układzie z 13 seryjnymi rozcień-czeniami LOS E. coli B w stosunku 1:1, rozpoczynając od stężenia 158 μM (białko Soc) lub 176 μΜ (białko Hoc, 23, 24). Próbki wprowadzano do standardowych szklanych kapilar i po krótkim czasie inkubacji wykonywano pomiary termoforezy przy pomocy aparatu Monolith NT.115. Uzyskane krzywe wiązania przedstawiono na Fig. 1. Z otrzymanych krzywych zależności znormalizowanych wartości fluorescencji od stężenia LOS wynika, że oddziaływanie zachodzi jedynie dla białek Soc i gp23. Na podstawie otrzymanych wyników obliczono stałą dysocjacji KD, która w przypadku białka Soc wynosi 32,3 μ, a w przypadku białka 23-6,52 μΜ. P r z y k ł a d 3. Ocena wiązania endotoksyny do gp23 przy użyciu techniki SPR.

Analizy oddziaływania rekombinowanego białka gp23 bakteriofaga T4 z endotoksyną E. coli B prowadzono wykorzystując aparat Biacore T200 (GE Healthcare). Białko immobilizowano na chipie CM5 przy pomocy standardowych procedur stosując reakcję grup aminowych białka z grupami karboksylowymi chipa CM5 indukowaną odczynnikami EDC/NHS. Ilość jednostek (RU, ang. response units) immobilizowanego białka zależna była od masy cząsteczkowej i celu prowadzonego doświadczenia (identyfikacja oddziaływania, kinetyka i powinowactwo oddziaływania). Analizę oddziaływań prowadzono w buforze HBS o pH 7.3 przy przepływie 30 μ/min. Jako regenerator stosowano 0.5% SDS. Roztwory LOS przygotowywano rozcieńczając roztwór wyjściowy LOS w HBS (166 μM) z 2% trietyloaminą. Kanał referencyjny stanowił niemodyfikowany kanał chipa CM5. Oddziaływanie LOS E. coli B z białkiem 23. W celu analizy kinetyki oddziaływania białka 23 z LOS na kanale chipa CM5 immobilizowano 1000 RU białka. Analizę prowadzono w buforze HBS przy przepływie 30 μΙ/min. dla roztworów LOS o następujących stężeniach: 50,25, 12.5, 6.25,3.125 nM. Wyznaczono następujące stałe kinetyczne dla kompleksu LOS-23: Kd=1.4 χ 10 9 M, ka= 8.4 χ 104 1/Ms, kd= 1.18 χ 10 4 1/s. Wyznaczone parametry wykazały, że białko 23 bardzo silnie oddziałuje z LOS E. coli B (Fig. 2A). Dodatkowo w celu identyfikacji regionu LOS zaangażowanego w ww. oddziaływanie przygotowano de-O-acylowany LOS (LOS-OH, tzn. LOS pozbawiony estrowo związanych kwasów tłuszczowych) i zbadano oddziaływanie LOS-OH z białkiem 23. LOS-OH nie wiązał się do białka 23, co wskazuje na hydrofobowy charakter interakcji LOS-23, zależny od obecności kompletu kwasów tłuszczowych lipidu A (Fig. 2B).

Wykorzystanie białka 23 do izolacji LOS

Białko 23 zostało zimmobilizowane (i) na standardowej bazie do tworzenia złóż powinowactwa do chromatografii (np. agarozie, sefarozie) lub (ii) na powierzchni stałej, jak płytka plastikowa, płytka detekcyjna. Następnie preparat zawierający endotoksyny (LPS lub LOS) był przepuszczany przez (i) złoże chromatograficzne zawierające białko 23 lub (ii) nad stałą powierzchnią wiążącą białko 23. W obu wypadkach nastąpiło związanie endotoksyn przez białko 23 a w wyniku tego w preparatach ubyło endotoksyn. Wyrażało się to obniżeniem ich aktywności biologicznej w preparatach poddanych oddziaływaniu z białkiem 23 zimmobilizowanym na złożu lub na powierzchni stałej (patrz Tabela 1).

Tabela 1

Wyniki usuwania endotoksyn (LPS, LOS) z preparatów je zawierających przez inkubację ze złożem zawierającym białko 23 oraz przez inkubację z płytką pokrytą białkiem 23.

Referencje:

Holst O, Ulmer AJ, Brade H, Flad HD, Rietschel ET. Biochemistry and celi biology of bacterial endotoxins. FEMS Immunol Med Microbiol. 1996,16(2):83-104.

Ulmer, A.J.; Rietschel, E.Th., Zahringer, U.; and Heine, H. Lipopolysaccharide: Structure, Bioac-tivity, Receptors. Trends in Glycoscience and Glycotechnology. 2002,14: 53-68 Kaca W. Use of the Limulus test (LAL) to detect endotoxins. Postępy Hig Med Dosw. 1996; 50(5): 447-57.

Klink M, Kaca W. Neutrophil activation by bacterial endotoxins. Postępy Hig Med Dosw. 1996; 50(4): 333-50.

Miernikiewicz PI, Owczarek B, Piotrowicz A, Boczkowska B, Rzewucka K, Figura G, Letarov A, Kulikov E, Kopciuch A, Switała-Jeleń K, Oślizło A, Hodyra K, Gubernator J, Dąbrowska K. Recombi-nant expression and purification of T4 phage Hoc, Soc, gp23, gp24 proteins in native conformations with stability studies. PLoS One. 2012;7(7):e38902. EP 1695085 EP 1516188 CA 2450572 EP 1399551 CA 2490467

Wykaz sekwencji

Sekw. Nr 1:

AEIGGDHGYNATNIAAGQTSGAVTQIGPAVMGMVRRAIPNLIAFDICGVQPMNSPTGQVFALRAVYGK DPVAAGAKEAFHPMYGPDAMFSGQGAAKKFPALAASTQTTVGDIYTHFFQETGTVYLQASVQVTIDAG AT DAAKL DAEIKKQMEAGALVEIAEGMAT SIAELQEG FNG ST DN PWNEMGFRIDKQVIEAKSRQLKAA YSIELAQDLRAVHGMDADAELSGILATEIMLEINREVVDWINYSAQVGKSGMTLTPGSKAGVFDFQDP IDIRGARWAGESFKALLFQIDKEAVEIARQTGRGEGNFIIASRNVVNVLASVDTGISYAAQGLATGFS TDTTKSVFAGVLGGKYRVYIDQYAKQDYFTVGYKGPNEMDAGIYYAPYVALTPLRGSDPKNFQPVMGF KTRYGIGINPFAESAAQAPA3RIQSGMPSILNSLG

Claims (2)

Zastrzeżenia patentowe

1. Zastosowanie białka wiążącego endotoksyny zawierającego sekwencję przedstawioną jako Sekw. Nr 1 lub jej fragment posiadający o powinowactwo do endotoksyn do izolowania endotoksyn z roztworów.

2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że białko jest stosowane do usuwania endotoksyn z preparatu lub pomiarów stężenia endotoksyn.